نویسندگان
1 دانشجوی دکترای میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات تهران، ایران
2 دانشیار بیوتکنولوژی صنعتی، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی، تهران، ایران
3 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Over production of xylanase, enzyme from microbial resources was always considered by researchers. The present study was conducted to evaluate the effects of inductive mutagenesis, classical type, on enhanced xylanase production from Bacillus mojavensis in order to access to potent mutants with high capacity of production.
Materials and methods: Bacillus mojavenis PTCC20 1723, by proving its potentiality to produce xylanase, was used as a wild strain for over production of the enzyme by classical mutagenesis. After using mutagens such as UV and nitrous acid, screening of different mutants was accomplished. Initial screening was based on the enhanced H/C21 ratios of the colonies in comparison with that of the wild strain on xylan containing agar medium.
Results: Among numerous screened colonies, seventy two mutants with H/C ratio bigger than the parental strain, (H/C≥1.6), were isolated. At the next step, enzyme production of mutants was compared with that of the parental strain in liquid cultures. Overall, among 67 screened mutants, 2 mutants, which produced 319.58 and 330.56 IU/mL xylanase, were selected. These mutants produced 3.3 & 3.45 times more enzyme than the native strain, with preliminary production level of 95.73 IU/mL.
Discussion and conclusion: These mutants, as superior ones & resulted from the classical mutagenesis, were selected as the best strains.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
جهشزایی تصادفی فرآیندی است که در آن، با بهکار بردن عوامل شیمیایی و فیریکی جهشزا، تغییراتی در ویژگیهای محصولات تولید شده توسط ژنها ایجاد میشود. گاهی محصول اساساً تولید نمیشود و یا محصولاتی غیر طبیعی تولید میشوند. ولی گاهی این فرآیند منجر به افزایش تولید محصول در مقایسه با سویه جهش نیافته یا والد میشود (1 و 2). گزیلاناز، آنزیم اصلی در تجزیه گزیلان، دومین بیوپلیمر فراوان در جهان پس از سلولز است که با حمله به پیوندهای بتا یک به چهار گزیلان باعث شکستن اسکلت اصلی میشود (3 و 4). گزیلانازها کاربردهای فراوانی در صنایع، از جمله سفید شویی کاغذ، فرآوری نان، هضم غذای دام و طیور و غیره دارد و تولید آن به طور انبوه مورد نیاز است (5-9). از آنجا که تولید آنزیم از منابع تولید کننده آن، که بیشتر باکتریها و قارچها هستند، نمیتواند به لحاظ کمیت و ویژگیهای کیفی آن جوابگوی نیازهای تجاری باشد، تغییر ژنتیکی سویههای تولید کننده آنزیمی در ازای تولید بیشتر و یا تغییر کیفییت محصول تولیدی مد نظر است. به طور کلی بهبود سویهها به لحاظ صنعتی و استفاده از روشهای جهشزایی تصادفی فرآیندی است که در صورت موفقیت، قابلیت تولید را تا چندین برابر افزایش میدهد و این افزایش در میزان تولید آنزیم گزیلاناز بسیار بیشتر و کارآمدتر از روشهای پر هزینه دیگری نظیر کلونینگ و سایر روشهای ژنتیکی نظیر جهشزایی هدفدار است، که شاید با توجه به محدودیت و ویژگیهای ذاتی خود سویه یا میزبان بیان کننده یک ژن در نهایت کارایی چندانی نداشته باشند (7 و 10). پژوهشهای اندکی در رابطه با افزایش میزان تولید آنزیم گزیلاناز از منشا باکتریایی یا قارچی و با استفاده از روشهای جهشزایی کلاسیک انجام شده است. بیشتر پژوهشهای انجام شده بر روی کلونینگ ژن گزیلاناز متمرکز شده که میزان تولید را میتواند تا حد محدودی افزایش دهد. زیرا محدودیت سویههای وحشی تولید کننده و میزبان بیان کننده ژن پس از کلونینگ، خود مانع از تولید بیش از حد محصول کلون شده میشود، ضمن اینکه روشهای بر پایه کلونینگ و یا جهش هدفدار گرانتر نیز هستند. در حالی که ایجاد جهش با اشعه فرا بنفش و یا مواد شیمیایی، نه تنها ارزانتر و راحتتر بوده بلکه میتواند نتایجی به مراتب بهتر در افزایش تولید محصول مورد نظر نسبت به سایر روشهای ژنتیکی گران قیمتتر ارایه دهد (1 و 5). مرور مقالات نشان میدهد تا بهحال به تولید گزیلاناز توسط جهشیافتههای باسیلوس موجاونسیس اشارهای نشده است. در این مطالعه، از روش کلاسیک ایجاد جهشهای القایی با استفاده از اشعه [1]UV و اسید نیترو بهعنوان ابزاری در بهبود سویه استفاده شد. نتایج به دست آمده در میزان تولید آنزیم از سویههای جهش یافته مقایسه شده و در نهایت، بهترین سویه با بیشترین میزان تولید آنزیم برگزیده شد.
مواد و روشها
میکروارگانیسم
سویه میکروبی Bacillus mojavensis PTCC1723 [2] به شکل لیوفیلیزه از مرکز منطقهای میکروارگانیسمهای صنعتی ایران تهیه شد. برای تجدید کشت باکتری اقدامات لازم انجام و با انتفال سویه به محیط غنی برین هارت اینفوژین آگار مرحله احیای آن با موفقیت انجام شد.
برای بررسی توانایی باسیلوس موجاونسیس PTCC 1723 در تولید آنزیم گزیلاناز[3]، از سوبسترای اختصاصی آنزیم گزیلاناز استفاده شد. محیط اختصاصی گزیلان آگار، حاوی گزیلان خالص پوسته جو، تهیه شده از شرکت فلوکا[4]، با اسیدیته 7 و ترکیبات زیر (گرم در لیتر) تهیه شد: گزیلان خالص 5، پپتون 5، عصاره مخمر 5، سولفات منیزیم هفت آبه 2/0، دیپتاسیم هیدروژن فسفات 1 و آگار 15.
کشت نقطه ای از باکتری وحشی بر روی محیط اختصاصی تهیه شد. درچنین محیط کشتی، میکروارگانیسم مولد آنزیم گزیلاناز، هاله شفاف ناشی از تجزیه گزیلان تولید میکند. برای رویت بهتر هالهها، پلیتها با محلول 1/0 درصد قرمز کنگو به مدت 15 دقیقه رنگ آمیزی و سپس، با محلول کلرید سدیم یک مولار چندین بار شسته شدند (6، 7 و 11).
تهیه سوسپانسیون باکتریایی
از کشت 24 ساعته باسیلوس به میزان یک لوپ وارد 50 میلیلیتر از محیط غنی لوریا برتانی حاوی (گرم در لیتر): تریپتون 10، پپتون 5 و کلرید سدیم 10 شد. گرماگذاری برروی شیکر انکوباتور به مدت 18 ساعت در 37 درجه سانتیگراد با دور rpm 160 انجام شد. سپس، 10 میلیلیتر از کشت مایع در دورrpm9000 به مدت 5 دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ شد تا بیوماس جدا شود. بیوماس در 10 میلیلیتر از محیط سترون لوریا برتانی و در شرایط استریل حل شد. بهطوری که کدورت سوسپانسیون به دست آمده در طول موج 625 نانومتر معادل 08/0 تا 1/0، برابر نیم درجه مک فارلند شود. به این شکل سوسپانسیونی حاوی حدود 108×5/1 سلول در هر میلیلیتر به دست آمد (12-14).
تیمار با اشعه فرابنفش
از سوسپانسیون باکتریایی یاد شده سری رقتهایی مختلف از 1-10 تا 9-10 تهیه و از هر رقت به میزان 50 میکرولیتر در پلیت کشت داده شد. پلیتهای نوترینت آگار برای شمارش تعداد کلونیهای بازمانده و پلیتهای گزیلان آگار اختصاصی برای مشاهده هاله هیدرولیز کلونیهای جهشیافته و مقایسه شاخص H/C[5]کلونیهای جهش یافته با باکتری والد استفاده شدند (15). از لامپ اشعه فرابنفش میله ای شکل فیلیپس 30 وات با طول موج 280 نانومتر برای ایجاد جهش استفاده شد. پلیتها در فاصله 20 سانتیمتری لامپ قرار داده شدند (16). بازه زمانی اشعه دهی از صفر تا 400 ثانیه در نظر گرفته شد و پلیتهای کشت شده با فواصل 30 ثانیهای از معرض اشعه دهی فرا بنفش خارج شدند. برای جلوگیری از فعال شدن سیستم ترمیم نوری، پلیتها در کیسههای نایلونی سیاه رنگ و در یک جعبه مقوایی قرار داده شدند. پس از 24 ساعت پلیتهای اشعه دیده از انکوباتور 37 درجه سانتیگراد و شرایط تاریکی خارج شده تا کلونیهای ظهور یافته بر روی پلیتها شمارش شوند. پلیت یا نمونه متعلق به زمان صفر که همان نمونه شاهد و بدون تیمار با اشعه فرابنفش است، برای تعیین تعداد کلونیهای اولیه و تیمار نشده استفاده شد. در نهایت، براساس شمارش تعداد کلونیهای بازمانده در پلیتها منحنی میزان مرگ- میزان بازماندگان در اثر عامل جهشزا ترسیم شدکه نشان دهنده تغییر تعداد بازماندگان در مقابل زمان است (1، 15، 17 و 18).
تیمار با اسید نیترو
غلظت 2/0 مولار از نیتریت سدیم در بافر استات 2/0 مولار و اسیدیته 5/5 تهیه و پس از سترون شدن با فیلتر 2/0 میکرون به عنوان محلول پایه اسید نیترو در تمام مراحل بعدی جهشزایی استفاده شد (15). سوسپانسیون باکتریایی با کدورت نیم درجه مک فارلند تهیه و 10 میلیلیتر از آن وارد ارلنی شد که حاوی 10 میلیلیتر محلول اسید نیترو دربافر استات بود. این ارلن در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. برای ارزیابی تاثیر اسید نیترو بر سلولهای باکتریایی، تحت شرایط سترون، از سوسپانسیون سلولی سویه وحشی هر 5 دقیقه یکبار، تا 75 دقیقه، به میزان 5/0 میلیلیتر نمونهگیری شد و به لولههای حاوی5/4 میلیلیتر بافر سدیم فسفات 05/0 مولار با اسیدیته 7 انتقال یافت. از بافر سدیم فسفات برای توقف اثر اسید نیترو روی سلولها استفاده شد (16). سپس، از لولههای یاد شده، 5/0 میلیلیتر نمونه گرفته و به درون لولههای حاوی سرم فیزیولوژی استریل برده شد. پس از هم زدن تمامی لولهها، از هر لوله 50 میکرولیتر بر روی پلیتهای نوترینت آگار و گزیلان آگار استریل کشت داده شد. پلیتهای نوترینت آگار برای شمارش تعداد کلونیهای بازمانده و پلیتهای گزیلان آگار برای مشاهده هاله هیدرولیز کلونیهای دچار جهش و مقایسه شاخص قطر هاله کلونیهای جهش یافته با سویه والد در نظر گرفته شدند. پلیتها پس از کشت، به انکوباتور37 درجه سانتیگراد منتقل و پس از 24 ساعت برای شمارش تعداد کلونیهای باقی مانده خارج شدند (16 و 19).
به عنوان کنترل، از سوسپانسیون باکتریایی سویه وحشی و تیمار نشده با اسید نیترو استفاده شد.
منحنی دوز بقا
معمولاً برای افزایش اطمینان از موثر بودن جهشهای ایجاد شده، ضریب مرگ سلولها در اثر عامل جهشزا بین 99 تا 99/99 درصد در نظر گرفته میشود. ابتدا با تعیین منحنی مرگ میکروارگانیسم در اثر هریک از عوامل جهشزا، زمان تیمار برای فرایند جهشزایی بهینه شد (20). پس از تیمار سوسپانسیون باکتریایی با اشعه فرابنفش و اسید نیترو، با شمارش تعداد کلونیهای تشکیل شده، منحنی دوز- بقا در مقابل زمان رسم شد. مدت زمانی که 99/99 درصد سلولها دچار مرگ شدهاند به عنوان زمان بهینه ایجاد جهش در نظر گرفته شد (16). از آن پس مراحل جهشزایی با اشعه فرابنفش و اسید نیترو چندین مرتبه تکرار شد و کلونیهای جهشیافته به دست آمده وارد مرحله غربالگری کیفی و کمی شدند.
غربال اولیه جهشیافتگان بر اساس شاخص قطر هاله
در این مرحله از غربالگری از شاخص نیمه کمی قطر هاله، برای انتخاب کلونیهایی که تولید آنزیم آنها بیش از سویه وحشی است استفاده شد. شاخص قطر هاله با تقسیم قطر هاله شفاف ناشی از هیدرولیز گزیلان بر قطر کلونی به دست آمد. پس از خالصسازی جهشیافتگان، از هر یک از کلونیها بر روی محیط گزیلان آگار، دوباره کشت نقطهای داده شد و شاخص قطر هاله کلونیها باشاخص قطر هاله باکتری شاهد مقایسه شد. کلونیهایی که نسبت شاخص قطر هاله آنها از سویه والد بزرگتر بود به عنوان کلونیهای بالقوه پر تولید بررسی و سنجش بیشتر شدند.
غربال ثانویه جهشیافتهها بر اساس میزان تولید آنزیم گزیلاناز در کشت مایع
جهشیافتگان برگزیده شده از مرحله اول به لحاظ میزان تولید آنزیم در محیط کشت مایع سنجش شدند تا میزان تولید آنزیم در آنها با میزان تولید آنزیم سویه وحشی مقایسه شود.برای این منظور در ارلنهای 250 میلیلیتری مقدار 50 میلیلیتر محیط تولید پایه آنزیم گزیلاناز حاوی (گرم در لیتر): گزیلان خالص 5، پپتون 5، عصاره مخمر 5، سولفات منیزیم هفت آبه 2/0 و دیپتاسیم هیدروژن فسفات 1 تهیه شد. برای تنظیم اسیدیته از محلول 10 درصدکربنات سدیم سترون استفاده شد که به طور جداگانه و پس از اتوکلاو محیطهای تخمیری به آنها اضافه شد. اسیدیته محیطها روی 7 تنظیم شد (21).
سوسپانسیونهای باکتریایی تازه از جهشیافتهها با کدورتی معادل 5/0 درجه مک فارلند تهیه و برای تلقیح آماده شدند. سپس، از محیطهای پیش کشت متعلق به هر یک، به میزان (v/v) 2 درصد وارد محیطهای تخمیری شد. ارلنهای محیط کشت تولید آنزیم به مدت 96 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتیگراد با دور rpm 160 قرار داده شد. از هر ارلن در فواصل زمانی 24 ساعت نمونهگیری انجام شد. نمونههای گرفته شده با انتقال به لولههای اپندورفدر دور rpm 9000 به مدت 10 دقیقه در سانتریفوژ دارای یخچال با دمای4 درجه سانتیگراد سانتریفوژ شد. از عصاره شفاف رویی بهعنوان منبع آنزیم گزیلاناز خام برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده شد (21 و 22). از کشت سویه والد در همان شرایط به عنوان شاهد استفاده شد.
سنجش فعالیت آنزیم گزیلاناز
از محلول (w/v) 5/0 درصد گزیلان خالص پوسته جو در بافر سدیم فسفات05/0 مولار، اسیدیته 7، به عنوان سوبسترا استفاده شد. میزان 5/0 میلیلیتراز سوبسترا به همراه 5/0 میلیلیتر ازمحلول آنزیمی، که به میزان مناسبی در بافر فوق رقیق شده بود، به مدت 20 دقیقه در 40 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. فعالیت آنزیمی با سنجش میزان قندهای احیا کننده آزاد شده با استفاده از معرف دینیترو سالیسیلیک اسید محاسبه شد (23 و 24). از منحنی استاندارد قند د-گزیلوز برای تعیین غلظت قندهای آزاد شده استفاده شد. یک واحد از فعالیت آنزیمی برابر با مقداری از آنزیم در نظر گرفته شد که موجب آزاد شدن یک میکرومول قند د-گزیلوز از سوبسترای به کار رفته در واکنش در هر دقیقه میشد (25).
نتایج
همانگونه که در شکل شماره 1 مشاهده میشود، باکتری والد با نشان دادن هاله شفاف نارنجی رنگ حاصل از تجزیه گزیلان به عنوان تولید کننده آنزیم گزیلاناز معرفی و شناخته شد. قطر کلونیهای 24 ساعته باکتری از سویه وحشی حداقل 15 میلیمتر و حداقل قطرناشی از هاله هیدرولیز 25 میلیمتر بود در نتیجه شاخص قطر هاله آن معادل 6/1 به دست آمد.
شکل 1- ظهور هالههای نارنجی رنگ شفاف تجزیه گزیلان در اثر تولید آنزیم گزیلانازدر سویه وحشی
منحنی مرگ سلولی باسیلوس موجاونسیس در اثر اشعه فرابنفش
در شکل 2 منحنی مرگ سلولهای باسیلوس موجاونسیس در اثر اشعه فرابنفش مشاهده میشود. بررسی نمودار نشان میدهد پس از 200 ثانیه 99/99 درصد سلولها از بین رفتهاند. در واقع در منحنی نشان داده شده که در زمان 210 ثانیه احتمال دسترسی به کلونیهای جهشیافته در اثر اشعه بالاست. بنابراین، از این پس کلونیهایی که پس از 210 ثانیه مجاورت با اشعه زنده ماندند، از نظر وقوع جهش مطلوب غربال اولیه و ثانویه شدند.
شکل 2- تاثیر تابش اشعه فرابنفش بر میزان زنده ماندن سلولهای باسیلوس موجاونسیس PTCC 1723.
نقاط نمایش داده شده بر اساس میانگین دادهها در سه تکرار رسم شده است.
منحنی مرگ سلولی باسیلوس موجاونسیس در اثر اسید نیترو
در شکل 3 منحنی مرگ سلولهای باسیلوس موجاونسیس در اثرتیمار بااسید نیترو مشاهده میشود.
با دقت به نمودار برای تعیین دوز بهینه جهشزایی اسید نیترو روی باسیلوس موجاونسیس، زمان بهینه تیمار با اسید نیترو 52 دقیقه به دست آمد که طی آن 99/99 درصد سلولها از بین رفتند.
در واقع طبق منحنی نشان داده شده که در زمان 52 دقیقه احتمال دسترسی به کلونیهایی که در اثر اسید نیترو دچار جهش شده اند حداکثر است. بنابراین، از این پس کلونیهایی که پس از 52 دقیقه تیمار با اسید نیترو زنده ماندند، از نظروقوع جهش مطلوب غربال اولیه و ثانویه شدند.
شکل 3-تاثیر محلول اسید نیتروبر میزان زنده ماندن سلولهای باسیلوس موجاونسیس PTCC 1723.
نقاط نمایش داده شده بر اساس میانگین دادهها در سه تکرار رسم شده است.
شکل 4- نتیجه غربالگری اولیه. الف) شاخص قطر هاله در جهشیافتههای اشعه فرابنفش، ب) فراوانی جهشیافتههای اشعه فرابنفش از نظر شاخص قطر هاله، ج) شاخص قطر هاله در جهشیافتههای اسید نیترو، د) فراوانی جهشیافتههای اسید نیترو از نظر شاخص قطر هاله.
نقاط نمایش داده شده بر اساس میانگین دادهها در سه تکرار رسم شده است.
شکل 5- نتیجه غربالگری ثانویه. الف) تولید آنزیم در جهشیافتههای اشعه فرابنفش، ب) فراوانی جهشیافتههای اشعه فرابنفش از نظر تولید آنزیم، ج) تولید آنزیم در جهشیافتههای اسید نیترو، د) فراوانی جهشیافتههای اسید نیترو از نظر تولید آنزیم
نقاط نمایش داده شده در نمودار الف و ج بر اساس میانگین دادهها در سه تکرار رسم شده اند.
نتایج غربال اولیه جهشیافتگان
طی انجام مرحله اول جهشزایی، در مجموع 72 کلونی با جهش مثبت غربال شد که شاخص قطر هاله بزرگتری در مقایسه با باکتری وحشی از خود نشان دادند. همانگونه که در شکل 4 مشاهده میشود. تعداد 36 سویه پس از تیمار با اشعه فرا بنفش و نیز تعداد 36 سویه پس از تیمار با اسید نیترو با شاخص قطر هاله بزرگتر از سویه وحشی از میان تعداد بیشماری از جهشیافتگان غربال شدند. بر اساس شکل 4 قسمت الف و ج، جهشیافته شماره 17 با شاخص قطر هاله برابر با 2/3 از بین تیمار شدههای اشعه فرابنفش و جهشیافته شماره 43 با شاخص قطر هاله برابر با 3 از بین تیمار شدههای اسید نیترو، بهطور مشخصی شاخص قطر هاله بزرگتری را نشان دادند.
گزینش جهشیافته پر تولید:
در راستای انجام آزمایشهای تاییدی و در مرحله غربالگری ثانویه، میزان کمی تولید آنزیم در جهشیافتگان مطلوب سنجش و با میزان آنزیم تولید شده توسط باکتری وحشی مقایسه شد.نتایج این مقایسه در شکل 5 گنجانده شده است. از بین 36 جهشیافته به دست آمده از تیمار با اشعه فرابنفش سویه جهشیافته شماره 17 به عنوان جهشیافته برتر با میزان تولید آنزیمی IU/mL56/330 توانست نسبت به باکتری والد، با میزان تولید اولیه IU/mL 73/95، افزایش تولید 45/3 برابری را نشان دهد.
از طرفی همانگونه که در شکل 5 بارز است چندین سویه جهش یافته با میزان تولید آنزیم بالاتری از باکتری وحشی نیز به دست آمدند، از جمله جهشیافته پر تولید شماره 43 که ناشی از تیمار سویه والد با اسید نیترو بود؛ زیرا توانست افزایش تولید 3/3 برابری را نسبت به آن نشان دهد. در نتیجه این سویه نیز به لحاظ میزان آنزیم تولید شده که معادلIU/mL 58 /319 است دارای ارزش و اهمیت بوده و نگهداری شد. از آنجا که بیشترین میزان تولید آنزیم در سویه والد 48 ساعت پس از گذشت فرایند تخمیر به دست آمد ملاک سنجش و مقایسه میزان تولید آنزیم برای سویههای جهشیافته نیز همان 48 ساعت در نظر گرفته شد. اگر چه نمونهبرداری و سنجش میزان تولید آنزیم برای جهشیافتگان نیز در زمانهای 24، 48 و 96 ساعته انجام شد، جهشیافتگان نیز بالاترین میزان تولید آنزیم را همانند سویه والد پس از گذشت 48 ساعت نشان دادند.
طبق شکل 6 قسمت الف و ب ضریب همبستگی بین نتایج حاصل از غربالگری اولیه و ثانویه در تیمار با اشعه فرابنفش و اسید نیترو (هر دو با فاکتور آلفا کوچکتر از 001/0) به ترتیب برابر 853/0 و 793/0 بود که نشان دهنده همبستگی قوی بین نتایج این دو مرحله است. ضریب تشخیص همبستگی این دو به ترتیب برابر 727/0 و 636/0 محاسبه شد که نشان میدهد در 7/72 درصد موارد میتوان با دانستن نسبت شاخص قطر هاله کلونیهای جهشیافته ناشی از تیماربا اشعه فرابنفش، مقدار آنزیم قابل تولید توسط آنها را در غربالگری ثانویه به درستی حدس زد. این احتمال در مورد جهشیافتگان ناشی از اسید نیترو6/63 درصداست. در هر دو مرحله نیمه کمی و کمی، سویهها اختلاف مشابهی را با والد نشان میدهند. بهعلاوه در مرحله دوم اختلاف جهشیافتگان با سوش والد خیلی نمایانتر است. در نهایت جهشیافتگانی که میزان تولید آنزیم آنها کمتر از سویه وحشی بود و یا افزایش تولید آنزیم در آنها خیلی چشمگیر نبوده کنار گذارده شدند.
شکل 6- همبستگی بین نتایج حاصل از غربالگری اولیه و ثانویه. الف) تیمار با اشعه فرابنفش، ب) تیمار با اسید نیترو
بحث و نتیجهگیری
همانگونه که مشاهده میشودفراوانی جهشیافتگان با شاخص قطر هاله 2 تا 2/2 بیش از بقیه است و حدود 45 جهشیافته با این حد از شاخص قطر هاله حاصل شده است. در شکل 4 و 5 قسمت ب و دال واضح است که فراوانی آن دسته از جهشیافتگان مطلوب که نسبت به والد تنها 5 تا 10 درصد افزایش تولید آنزیم داشتند، بالاست. این کلونیها دارای جهشهای کوچک هستند و احتمال دستیابی به چنین جهشهایی در یک فرایند جهشزایی زیاد است، اگر چه افزایش میزان تولید آنزیم در آنها در مقایسه با باکتری وحشی خیلی چشمگیر نیست اما میتوان با روشهای بهبود سویهای و ایجاد جهشهای پی در پی در آنها به نتایج مطلوبی در بالاتر بردن توانایی تولید محصول دست یافت. از طرفی دیگر، احتمال دست یافتن به جهشیافتگانی با توانایی تولید آنزیم بسیار بیشتر، نسبت به باکتری وحشی، در اولین مرحله بسیار اندک و نیازمند تکرار آزمایشهای طولانی مدت است بهطوریکه ممکن است زمان زیادی صرف دسترسی به چنین جهشیافتگانی شودکه به اصطلاح جهشهای بزرگ گفته میشود. اگرچه افزایش تولید محصول در آنها نسبت به باکتری والد بسیار چشمگیر است اما همانطور که در شکل 5 ملاحظه میشود فراوانی این جهشیافتگان بسیار کمتر است. مقایسه افزایش تولید آنزیم در جهشیافتگان گویای آن است که تاثیر اشعه فرا بنفش در مقایسه با اسید نیترو در ایجاد جهشهای مطلوب و کلونیهای پر تولید بیشتر بوده است (شکل 4- قسمت ب و دال). نتایج قطعیتر را میتوان با مقایسه نسبت فراوانی جهشیافتگانی که میزان آنزیم بیشتری نسبت به باکتری وحشی تولید میکنند و ناشی از تیمار با اشعه فرا بنفش هستند ابراز داشت. همانگونه که در شکل 5- قسمت ب و دال مشاهده میشود، نسبت فراوانی جهشیافتگان با میزان تولید آنزیم بین 100 تا 130 واحد بیش از سایر مقادیر است و در این میان، این افزایش تولید، فراوانی بیشتری را در میان جهشیافتگان تیمار یافته با اشعه فرا بنفش به خود اختصاص داده است. مقایسه قسمت الف و ج شکل 4 و 5 با یکدیگر میرساند که دقیقا آن دسته از جهشیافتگان با شاخص قطر هاله بزرگتر از باکتری والد لزوماً آنزیم بیشتری نیز تولید کرده اند و ضریب همبستگی این دو آزمایش بسیار نزدیک شده است. در واقع با دقت به منحنی توزیع فراوانی جهشیافتگان با شاخص قطر هاله بزرگتر از والد در شکل 4 قسمت ب و دال و مقایسه آن با منحنی توزیع فراوانی جهشیافتگان پر تولید در قسمت بو دال شکل 5 متوجه میشویم که بیش از 70 درصد تـوزیع فراوانی جهشیافتگان با شاخص قطر هاله بالاتر، با نحوه توزیع فراوانی جهشیافتگان پر تولید مطابقت میکند. ضریب همبستگی مرحله نیمه کمی و مرحله غربال ثانویه بسیار نزدیک به هم بوده و این میرساندکه نتایج برآمده به قدری دقیق بوده که حتی میتوان گفت نیازی به انجام روش تاییدی نبوده است؛ به عبارتی دیگر اگر چه شاخص قطر هاله یک روش نیمه کمی است، اما نتایج برگرفته از روش کمی کاملاً با آن مطابقت میکند. منحنی توزیع فراوانی کل جهشیافتگان به دست آمده در حالت تمام شماتیک یک منحنی ناقوسی شکل است. در نمودارهای شکل 4 و 5 توزیع فراوانی جهشیافتگان منفی با شاخص قطر هاله کمتر از باکتری والد و توزیع فراوانی کلونیهای بدون جهش نشان داده نشده است. این کلونیها در همان مرحله اول از غربالگری حذف شده و میزان تولید آنزیم در آنها سنجش نشده است. بنابراین، توزیع فراوانی مشاهده شده در مورد جهشیافتگان، فقط متعلق به فراوانی جهشیافتگان مطلوب است که دقیقاً پس از باکتری والد و با میزان تولید بیشتر در نمودارهای شکل 4 و 5 مشخص شده اند. اما آنچه در این مورد مهم جلوه میکند نحوه توزیع این فراوانی است. فراوانی جهشیافتگانی که میزان شاخص قطر هاله آنها بالاتر از 6/1 است در شکل 4 قسمت الف و ج گنجانده شده است. نحوه توزیع فراوانی کلونیهای با شاخص قطر هاله بالاتر دقیقاً مشابه توزیع جهشیافتگانی است که آنزیم بیشتری نسبت به والد طبق شکل 5 قسمت الف و ج تولید میکنند. نتایج قطعیتر را میتوان با دقت به شکل 6 متوجه شد.
شایان ذکر است افزایش تولید گزیلاناز همواره مورد توجه پژوهشگران بوده و برای دستیابی به مقادیر هر چه بالاترآنزیم، محققان به راههای گوناگونی متوسل شده اند. عدهای نظیر آنچه به اختصار در جدول شماره 1 یاد شده است در جستجوی میکروارگانیسمهایی هستند که ذاتا توانایی تولید گزیلاناز بالایی را دارند و به طور طبیعی و دست نخورده مقادیر مناسبی از آنزیم را تولید میکنند (26-28). برخی دیگر به دنبال بالا بردن میزان تولید از سویههای میکروبی طی بهینهسازی ترکیبات محیط کشت و شرایط تخمیری هستند (30 و 29). به عنوان مثال، گزیلاناز باسیلوس موجاونسیس 137 بومی، جداسازی شده از خاک مزرعه پنبه در حوالی کاشان، با تولید اولیه حدود IU/mL 68/194، طی بهینهسازی ترکیبات محیط کشت و شرایط تخمیر به میزانی معادل IU/mL 466/302 افزایش یافت (21). همچنین، در سویه 137-12p از گونه ای از استرپتومایسس، با به کارگیری روشهای بهینهسازی ترکیبات محیط کشت و شرایط تخمیر، افزایش تولید آنزیم تا حدود 27 واحد به دست آمد (3).
جدول 1- مقادیر آنزیم گزیلاناز تولید شده از میکروارگانیسمهای مختلف
|
نام محقق |
سال |
نام میکروارگانیسم |
تولیدگزیلاناز (IU/mL) |
|
الیویرا و همکاران[6] (31) |
2006 |
Penicillium janthinelum CRC 87M-115 |
8/54 |
|
پورنا و همکاران[7] (26) |
2006 |
Bacillus pumilus |
500 |
|
کاپورو همکاران[8] (27) |
2008 |
MK001 سویهBacillus pumilus |
1300 |
|
ینگو همکاران[9] (7) |
1995 |
Bacillus v1-4 |
52 |
|
کوردییرو وهمکاران[10] (30) |
2002 |
Bacillus thermoglucosidasius |
17 |
|
اخوان سپهی وهمکاران[11] (21) |
2011 |
Bacillus mojavensis |
466/302 |
|
سریدوی و همکاران[12] (28) |
2011 |
Trichoderma sp CDC-140 |
495 |
|
پورسوکو همکاران[13] (23) |
2013 |
Streptomyces Sp.CA24 |
255 |
|
آنامالی و همکاران[14] (33) |
2009 |
Bacillus subtilis |
238 |
|
دویودی و همکاران[15] (4) |
2009 |
Penicillium oxalicumسویه جهشیافته SAUE-3.510 |
5/488 |
|
تحقیق حاضر |
2013 |
Bacillus mojavensisجهشیافته شماره 17 |
56/330 |
از طرفی برخی دیگر نظیر آنچه در جدول شماره 1 و مثالهای زیر عنوان شده است با ایجاد جهش در سویههای میکروبی سعی در بالا بردن میزان تولید داشتند (4). بر اساس گزارش تاسنیم و همکارانش[xvi] در سال 2003 تولیدگزیلاناز از آسپرژیلوسنایجر سویه جهش یافته GCBCX-20، طی روشهای جهشزایی با مواد شیمیایی به حدود IU/mL 200 افزایش یافت، که توانسته بود 7/1 برابر بیش از سویه والد آنزیم تولید کند (2). در تحقیقی مشابه در سال 2011 عبدل عزیز و همکارانش[xvii] توانستند با به کار گیری اشعه فرابنفش با طول موج 254 نانومتر به سویه ای جهش یافته از Streptomyces pseudogriseolus دسترسی یابندکه بتواندگزیلاناز را تا 160 درصد بیش از سویه والد تولید کند (11). همچنین، در بررسی که توسط اکرام الحق و همکارانش[xviii] در سال 2008 انجام شد نتایج برآمده در روند افزایش تولید آنزیم پس از تیمار قارچ آسپرژیلوس نایجر با جهشزای شیمیایی نیتروزوگوانیدین[xix] بسیار کارآمد گزارش شد؛ زیرا منجر به جداسازی سویه جهشیافته RH12 با تولید آنزیم به مقدار IU/mL31/172 شد که افزایش 65/1 برابری را نسبت به قارچ وحشی نشان داد. سپس، آنها توانستند آنزیم گزیلاناز تولید شده را ضمن بهینه سازی ترکیبات محیط کشت و شرایط تخمیری در نهایت به IU/mL86/289 برسانند که 7/2 برابر نسبت به میزان اولیه افزایش تولید داشت (5). در گزارشی دیگردر سال 2009 تولید گزیلاناز و سلولاز از قارچ والد نروسپورا کراسا[xx]توسط محققانی چون رحیم و همکارانش[xxi] بررسی شد. این محققان با به کار گیری روش جهشزایی کلاسیک و به کار بردن عواملی نظیر اشعه فرابنفش با طول موج 254 نانومتر به یک سویه جهش یافته دست یافتند که اگر چه توانایی بیشتری در تولید این دو آنزیم را دارد اما این افزایش تولید در مقایسه با سویه والد خیلی چشمگیر نبود (34). همچنین، محققان از این روشها در بالا بردن میزان تولید دیگر آنزیمهای با ارزش صنعتی و بیوتکنولوژیکی نظیر پروتئازها (13)، لیپاز (20)، آمیلازها (12-15 و 35) سلولازها (10، 34 و 36-39)، پولولاناز (40)، کیتیناز (18)، ال- آسپاراژیناز (41) و سایر آنزیمهای با ارزش از جهش کلاسیک بهره جسته اند. گرایش در استفاده از این روشها در بالا بردن تولیدات میکروبی با ارزش دیگر نظیر اسید کلاوولانیک (1)، ملانین (42)، استوئین (19)، باسیتراسین (43)، بیواتانل (16)، تولید زایلیتول و اتانل (44) و دیگر متابولیتهای ضد میکروبی نیز مشاهده میشود (45).
همانگونه که در جدول شماره 1 مقایسه شده است، سویه جهشیافته باسیلوس موجاونسیس شماره 17 با تولید آنزیم IU/mL 56/330 قابلیت بالایی برای استفاده در فرایندهای تجاری دارد. هدف از این مراحل رسیدن به جهشیافته پرتولید بوده تا با اعمال فرایند بهینهسازی شرایط تخمیر و ترکیبات محیط کشت بتوان میزان تولید آنزیم را بیش از بیش بالا برد. بنابراین، پرتولیدترین جهشیافته (جهشیافته شماره 17) انتخاب شده تا برای انجام مراحل بعدی تحقیقات از آن استفاده شود و میزان تولید آنزیم بالاتر رود.
تشکر و قدردانی
به این وسیله از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران بابت تهیه امکانات و تجهیزات لازم برای انجام این پروژه صمیمانه سپاسگزاری میشود. همچنین، از سرکار خانم سپیده شکری به دلیل همکاریهای ارزندهشان در انجام آزمایشها تشکر و قدردانی ویژه میشود.
[1]- Ultra Violet Light
[2]- PTCC: Persian Type Culture Collection
[3]- Xylanase
[4]- Fluka
[5]-H/C: Hallow zone diameter/ Colony diameter
[6]- Oliveira et al
[7]- Poorna et al
[8]- Kapoor et al
[9]- Yang et al
[10]- Cordeiro et al
[11]- Akhavan Sepahi et al
[12]- Sridevi et al
[13] - porsuk et al
[14]- Annamali et al
[15]-Dwiwdei et al
[xvi]- Tasneem et al
[xvii]- Abdel-Aziz et al
[xviii]- Haq et al
[xix]- Nitrosoguanidine
[xx]- Neurospora crassa
)