نویسندگان
1 دانشجوی کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، ایران
2 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه شهرکرد، ایران
3 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: the use of lactic acid bacteria in fermented dairy products due to their effects participation in flavor, texture and most probiotic properties goes back to centuries ago. Optimal amount of lactic starter culture in the production of lactic acid in the production of cheese and yogurt are used.
Materials and methods: Isolation of Lactobacillus in MRS medium from various samples was performed.Then, The variation of different characteristics in terms of the ability of Lactobacilli to produce CO2 from glucose, the ability to grow at pH 2.5 to 8.5, different concentration of NaCl, 1.5 to 10.0 (percent w / v) and temperatures of 15 ° c, 45° c, the ability to move, indole and H2S production were also studied. The production of lactic acid was assayed in skim milk by titration with %1 NaOH. L-lactate isomer was investigated using UK Randox kit.
Results: In this study, from 30 samples of different indigenous yoghurt and cheese 43 gram-positive, catalase-negative, oxidase negative lactobacilli were isolated. All isolates were resistant to pH 2.5 and 30 and %69 of the isolated were sensitive to 7.5 and %10 concentration of salt respectively. Most of lactic acid production with %1.8 and L-lactate 6.8 g/l were consididered for one isolated. This isolated bacillus based on biochemical tests was identified as Lactobacillus acidophilus.
Discussion and conclusion: The amount of lactic acid production at temperature 37°C was found to be higher than the temperature 25°C criteria that were statistically significant at %1 level. The optimal production of lactic acid in the native isolates and tolerance to appropriate pH and salt tolerance, these properties and studies are provided complementary knowledge to be used in the food industry.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
باکتریهایاسیدلاکتیک [1](LAB) گروه هتروژنیازباکتریهایگرممثبتهستندکهبراساس مجموعهایازویژگیهایریختشناسی،متابولیکو فیزیولوژیکدریکگروهبسیاربزرگقرارگرفتهاند.اگرچه هستهمرکزیاینگروهبسیاربزرگرا جنسهای لاکتوباسیلوس[2]، پدیوکوکوس[3]، لوکونوستوک[4]، لاکتوکوکوس[5]تشکیلمیدهند،بهمرورجنسهای دیگریبهاینگروهاضافهشدندتاجاییکهامروزه باکتریهای اسید لاکتیکحدود20جنسرادربرمیگیرند (1). لاکتوباسیلوسها از مهمترین جنسهای این خانواده محسوب میشوند که به تنهایی شامل 80 جنس شناخته شده اند. این جنس یک گروه ناهمگن، شامل گونههایی با تنوع وسیعی از خصوصیتهای فنوتیپی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی است. ناهمگونی این گروه، به دلیل وجود 32 تا 55 در صد مجموع بازهای G-C در DNA گونههای این جنس است، که این مقدار، دو برابر میزان معمول و قابل قبول برای طبقه بندی یک جنس تک است. لاکتوباسیلها، گرممثبت، میکروآئروفیل بهشکلمیلههایبلند، باریکوگاهیخمیدهتاکوتاههستندوبیشتربهشکلباسیلهایکوچکترکورینهفرمیاکوکوباسیلمشاهدهمیشوند. ارلا-جنسن[6]، طی تحقیقاتی که انجام داد، توانست لاکتوباسیلها را به سه زیر جنس ترموباکتریوم، استرپتوباکتریوم و بتاباکتریوم تقسیم کند. جنس لاکتوباسیلوس شامل گونههایی است که میتوانند در هر سه گروه قرار گیرند و این موضوع در حقیقت اساس طبقه بندی به سه گروه است. لاکتوباسیلهابخش مهمیاز گروهبزرگباکتریهایتولیدکنندهاسیدلاکتیکهستند و ازاجزای اصلی فلورمیکروبیمحصولاتلبنی، کشتآغازگرمحصولاتلبنی تخمیریوانواعغذاهایتخمیریدیگرمانندسوسیسو کالباسشناخته میشوند.اینباکتریهادرطعمفرآوردههای غذاییدخالتدارندوبهشکلپروبیوتیکهایغذاییاستفاده میشوند (2). اسیدلاکتیکمهمترینمحصول آنهاازتخمیرکربوهیدراتهامحسوبمیشود. اسیدلاکتیکبهدوشکل فعالنوری L(+) و D(-)، وجوددارد.بهدلیلمصرففراواناسیدلاکتیکومشتقاتآندرصنایع غذایی،نساجی،دارویی،آرایشی،شیمیاییوبهویژه پلیمری، اهمیت توجه و بررسی تولید این اسید آلی پر کاربرد توسط باکتریهای اسید لاکتیک از اهمیت زیادی برخوردار است (3).
استان چهارمحال و بختیاری دارای تنوع وسیعی از محصولات لبنی بومی است و بههمیندلیل میتواندبستریمناسببرایبررسیتنوعزیستی،بهویژهدر سطحمیکروبهای اسید لاکتیکباشد. شرایطزیستیمنحصربهفرد،تنوع، گستردگیوازهمهمهمترنبود سابقهبررسیهایمشابه،برلزومانجامپژوهشهایبیشتر براییافتنباکتریهایدارایپتانسیلصنعتیوهمچنین باکتریهایجدیددراینمناطقتاکیددارد.هدفازانجاماین پژوهش،بررسیماست و پنیرهای بومی و سنتی مناطق مختلف استان چهارمحال و بختیاری ازنظر وجود لاکتوباسیلها، دستیابیبهجدایههایجدید و با کارآیی بالاتر در تولید اسید لاکتیک برایتحقیقهای آینده بود.
مواد و روشها
جمعآورینمونهها
30نمونهماست و پنیر بومیازدامداریهای سنتی 11منطقهمختلف استان چهارمحال و بختیاری تهیهوباشرایط استریلدردمای4درجه سانتیگراد بهآزمایشگاهمنتقل شدند.
جداسازی
همهنمونههابلافاصلهپسازانتقالبهآزمایشگاه ورتکسشده، و یک سی سی از رقتهای 1-10و 4- 10ازهرنمونهدرمحیطآگارMRS[7] به شکل کشت خطی در سطح محیط کشت داده شدند. پلیتهابرایمدت48ساعتدردردمای 37 درجه سانتیگراد و به شکل هوازی گرمخانهگذاریشدند (4).
شناسایی
پسازپایانزمانانکوباسیون،کلونیهای غیر مشابهکهاز لحاظشکل،اندازه،کدریاشفافبودنوسایرویژگیهایظاهریمتفاوتبودند بهشکلجداگانهکشت داده شدند.ازتک کلونیهایخالصبرداشت شد وبهروشگرمرنگآمیزیشدند. سپس،آزمایشهای اکسیدازوکاتالازانجامشد (5). آزمون حرکت،تولیداندولوسولفیدهیدروژننیزانجامشد (6). تواناییرشددردماهایمختلف 15 و 45 درجه سانتیگراد پس از 24 ساعت، تحملبهغلظتنمکهایمختلف 5/1، 5/2، 0/5، 5/7 و 0/10 (درصد، وزنی/حجمی)، تولیدگازازگلوکزدرمحیطMRSبراثحاویلولهدورهام، توانایی رشد دراسیدیته های 5/2، 5/4، 0/6 و 5/8آزمایش شدند (7 و 8).
تعیینفعالیتاسیدیسویهها
سویههایجداشدهجوان24ساعته، بهمیزانیک درصد (وزنی/حجمی) بهمحیط شیر بدون چربی 10 درصد (وزنی/ حجمی) استریلتلقیحشدهودردمای37 درجه سانتیگراد به مدت 72 ساعت انکوبهشدند. در بازههای زمانی 24 ساعتهتغییراتاسیدیتهو درصد تولید اسیدلاکتیک به روش تیتراسیون با سود یک درصد برایهرسویهاندازهگیریشد (9). سویهای که بیشترین تولید اسیدلاکتیک در محیط شیر بدون چربی داشت انتخاب و مقدار فرم انانتیومری
L-لاکتات با استفاده از کیت آنزیمی رندوکس انگلستان اندازهگیری شد (10). بدین شکل که 10 میکرولیتر سوسپانسیون حاصل از رشد باکتری در محیط شیر بدون چربی و پس از پایان زمان گرمخانهگذاری 72 ساعته، با 1000 میکرولیتر از محلول آنزیم لاکتات پراکسیداز و معرف TOOS(N-اتیل-N-2-هیدروکسی-3-سولفوپروپیل-m-تولوئیدن) کیت مخلوط کرده و جذب نوری حاصل در طول موج 550 نانومتر اندازه گیری شد. همگی آزمونها سه بار تکرار شدند.
تحلیل آماری
برای انجام تحلیلهای آماری از نرم افزار SPSS17.0.0و آزمونهای آماری ANOVA و t-Testاستفاده شد.
نتایج
همه کلونی تک سفید تا کرمی با قطر 1 تا 5/1 سانتیمترجداسازی شده، رنگ آمیزی گرم مثبت و شامل 23 باسیل طویل 2 تا 6 میکرومتر و 20 باسیل کوتاه و خمیده با طول 2 تا 4 میکرومتر بودند. آزمایش کاتالاز و اکسیداز برای همه باسیلها منفی بود. همچنین، آزمایش حرکت، تولیدسولفید هیدروژن و اندول برای همه جدایهها منفی مشاهده شد. همه جدایه فاقد توانایی تولید دی اکسیدکرین از گلوکز بودند. میزان جذب نوری جدایهها پس از گرمخانهگذاری 24 ساعته در دمای 37 درجه سانتیگراد در محیطهای تنش نمک و اسید و باز، به دست آمد و پس از تهیه رقت، جذب نهایی محاسبه شد. نتایج به دست آمده نشان میدهد که جدایههای خالص شده فاقد توانایی رشد در اسیدیته 5/2 بودند و در اسیدیته 5/4 توانایی رشد را داشتند. بهترین رشد سویهها در اسیدیته 5/6 و به نسبت کمتر در اسیدیته 5/8 بود که قابلیت تحمل و رشد مناسبی داشتند. جدایههایی که بیشترین مقاومت و رشد را در اسیدیتههای مختلف از جمله اسیدیته برابر 50/8 داشتند در شکل 1 و میزان رشد ایزوله 25Y- در اسیدیته های مختلف در شکل 2 آمده است. اختلاف مورد مشاهده بین جدایههای شاخص از نظر آماری در سطح 5 درصد معنا دار است(P value <0.05).
شکل 1- نمودار حداکثر رشد بهترین جدایههای مقاوم در اسیدیتههای مختلف در محدوده 50/2 تا 50/8 پس از 24 ساعت
شکل 2- نمودار حداکثر رشد ایزوله 25Y- در اسیدیته های مختلف در محدوده 50/2 تا 50/8 پس از 24 ساعت
جدایههای جداسازی شده توانایی مقاومت و رشد در غلظت نمک 5/1 و 5/2(درصد، وزنی/حجمی) را داشته و به خوبی در این محیط رشد کردند. تنها 2 جدایه تحمل به غلظت نمک 0/5 درصد کمتری داشته و در حقیقت کمابیش به این غلظت نمک حساس بودند. میزان رشد باکتریها و مقاومت سویهها در غلظتهای نمک 5/7 و 0/10 درصد در همه جدایهها کاهش یافته به طوریکه به ترتیب 13 و 35 سویه از کل 43 سویه جداسازی شده، به غلظت 5/7 و 0/10 درصد نمک حساس بوده و فاقد توانایی تحمل و رشد در این غلظتهای بالای نمک بودند. بهترین جدایههای مقاوم به غلظتهای مختلف نمک در شکل 3 و نمودار رشد جدایه 25Y- در غلظتهای مختلف نمک در شکل 4 آمده است. اختلاف مورد مشاهده بین جدایههای شاخص در سطح 5 درصد معنا دار است
(P value <0.05).
شکل 3- نمودار حداکثر رشد جدایههای شاخص مقاوم به غلظتهای مختلف نمک پس از 24 ساعت
شکل 4- نمودار حداکثر رشد جدایه 25Y- در غلظتهای مختلف نمک پس از 24ساعت
نتیجهآزمایشتواناییرشددردماهای 15 و 45 درجه سانتیگراد نشانداد 30 جدایه توانایی رشد در دمای 45 درجه سانتیگراد داشتند و 13 جدایه نیز قادر به رشد در دمای 15 درجه سانتیگراد بودند. نتایج به دست آمده مشخص کرد که همه جدایههای جداسازی شده توانایی تولید اسید لاکتیک در محیط شیر بدون چربی را داشته و توانستند پس از گذشت 24 ساعت میزان در خور توجهی اسید تولید کنند. همچنین با توجه به آزمایشهای انجام شده مشخص شد که لاکتوباسیلوسهای جداسازی شده توانایی بهتری در تولید اسید با توجه به شرایط دمایی 37 نسبت به 25 درجه سانتیگراد دارند. این اختلاف در تولید اسید لاکتیک در بیشتر جدایهها در سطح یک درصد معنا دار است. در جدایههای 3Ch- و 6Y-و 15Y- اختلاف در تولید اسید لاکتیک در دو دمای مذکور معنا دار نبود. بیشترین میزان تیتر اسیدلاکتیک در دمای 25 درجه سانتیگراد پس از گذشت 72 ساعت برابر با 481/0 درصد و اسیدیته 63/4 مربوط به جدایه 25Y- بود که همین جدایه بیشترین تولید اسیدلاکتیک را در دمای 37 درجه سانتیگراد دارد. پس از گرمخانهگذاری محیط شیر بدون چربی همراه با این سویه توانست اسیدیته شیر را تا حدود 64/3 کاهش دهد و در نهایت 81/1 درصد اسیدلاکتیک تولید نماید. میزان تیتر اسید لاکتیک برای جدایههایی که بیشترین تولید را در محیط شیر بدون چربی و دو دمای25 و 37 درجه سانتیگراد به ترتیب در جدول 1 و 2 نشان داده شده است. مقدار درصد اسیدلاکتیک در دماهای 25 و 37 درجه سانتیگراد برای جدایه 25Y- در شکل 5 آمده است. اختلاف در میزان اسید لاکتیک تولید شده در دو دمای مختلف از نظر آماری در سطح یک درصد معنا دار است (P value <0.01). اندازهگیری فرمL-لاکتات تولید شده، این مقدار برابر با 8/6 گرم بر لیتر بود که از مقدار اسید لاکتیک کل تیتر شده توسط سود یک درصد کمتر بوده و مشخص شد که سویه جداسازی شده هر دو فرم انانتیومری L وD اسیدلاکتیک را تولید کند. نتایج تخمیر قندها در جدایه 25Y- در جدول 3 آمده است.
جدول 1- جدایههایی با بیشترین تولید اسیدلاکتیک و میزان تیتر اسید در دمای 25 درجه سانتیگراد
نمونه |
|
24 |
48 |
72 |
||||||
تیتر با NaOH 1 درصد |
درصد اسیدلاکتیک |
اسیدیته |
تیتر با NaOH 1 درصد |
درصد اسیدلاکتیک |
اسیدیته |
تیتر با NaOH 1 درصد |
درصد اسیدلاکتیک |
اسیدیته |
||
7Ch- |
باسیل کوتاه |
76/1 |
136/0 |
93/5 |
05/3 |
369/0 |
59/4 |
67/3 |
481/0 |
63/4 |
25Y- |
باسیل کوتاه |
66/1 |
188/0 |
97/5 |
01/2 |
181/0 |
78/5 |
36/2 |
244/0 |
41/5 |
29Y- |
باسیل کوتاه |
64/2 |
295/0 |
24/5 |
47/2 |
264/0 |
18/5 |
31/3 |
415/0 |
87/4 |
جدول 2- جدایههایی با بیشترین تولید اسیدلاکتیک و میزان تیتر اسید در دمای 37 درجه سانتیگراد
نمونه |
کد |
24 |
48 |
72 |
|||||||
تیتر با NaOH 1 درصد |
درصد اسیدلاکتیک |
اسیدیته |
تیتر با NaOH 1 درصد |
درصد اسیدلاکتیک |
اسیدیته |
تیتر با NaOH 1 درصد |
درصد اسیدلاکتیک |
اسیدیته |
|||
3Ch- |
باسیل کوتاه |
40/1 |
072/0 |
00/6 |
64/3 |
12/6 |
23/4 |
89/9 |
60/1 |
71/3 |
|
6Ch- |
باسیل کوتاه |
14/2 |
205/0 |
58/5 |
51/5 |
811/0 |
27/4 |
25/9 |
48/1 |
91/3 |
|
25Y- |
باسیل کوتاه |
57/2 |
282/0 |
26/5 |
83/6 |
049/1 |
15/4 |
16/11 |
83/1 |
64/3 |
|
شکل 5- نمودار درصد اسیدلاکتیک تولید شده در جدایه 25Y- پس از 72 ساعت در دو دمای 25 و 37 درجه سانتیگراد
جدول 3- نتایج تخمیر قندها در جدایه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس
قند |
سلوبیوز |
لاکتوز |
گالاکتوز |
مالتوز |
مانیتول |
مانوز |
ملیبیوز |
رافینوز |
سالیسین |
سوکروز |
ترهالوز |
ریبوز |
سوربیتول |
ایزوله 25y- |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
بحث و نتیجهگیری
اهمیتباکتریهایاسیدلاکتیکدربحثصنعتوسلامت هرروزبیشترمیشود. دراینبینکشورمایکیاز واردکنندههایسویههایمختلف باکتریهای اسید لاکتیک وفرآوردههایآنهاطیسالهایگذشتهبودهاست.هدفازاینتحقیق، شناسایی لاکتوباسیلها و اندازهگیری میزان اسیدلاکتیک تولید شده توسط این سویههای بومی جداسازی شده از ماست و پنیر سنتی مناطقمختلف استان چهارمحال و بختیاری بودهاستتاامکانبررسیو دستیابیبهباکتریهای دارایقابلیتصنعتیمناسبدرزمینههایمختلفراایجاد کند.
اسیدی یا بازی بودن یک محیط تأثیر زیادی بر ثبات و فعالیت مولکولهای بزرگ نظیر آنزیمها دارد. از این رو جای تعجب نیست که رشد و متابولیسم میکروارگانیسمها به وسیله اسیدیته تحت تأثیر قرار میگیرد. به دلیل این که باکتریهای اسید لاکتیک در نتیجه فرآیند متابولیسم تولید انرژی، قادر به تولید مقدار زیادی اسید هستند، میتوان نتیجه گرفت که این باکتریها به طور مکرر تحت شرایط تنش اسید قرار میگیرند.
مقاومت به اسید و باز
سویههای جداشده از نمونههای لبنی استان چهارمحال و بختیاری توانایی چشمگیری در تحمل به شرایط اسیدی و قلیایی داشتند و توانستند در اسیدیته 5/4، 0/6 و 5/8 به خوبی رشد کنند. این درحالی است که همه جدایه فاقد توانایی رشد در اسیدیتههای خیلی اسیدی (5/2) بودند. با وجود اینکه 4 جدایه توانایی رشد در اسیدیته 5/4 را داشته و کدورت در خور توجه در این اسیدیته ایجاد کردند، برخی از باکتریهای اسیدلاکتیک در اسیدیتههای نزدیک به 2/3، برخی دیگر تا اسیدیتههای 6/9 و بیشتر آنها در اسیدیتههای بین 0/4 و 5/4 رشد میکنند(11). همه جدایههای جداسازی شده در این تحقیق نیز دامنه وسیعی در مقاومت و رشد تحت اسیدیتههای اسیدی و کمی بازی از خود نشان دادند. توانایی رشد دراسیدیتههای پایین در بین باکتریهای اسیدلاکتیک متفاوت است که این نتیجه در راستای تحقیقهای انجام شده توسط ایبورهما و همکاران[viii] است (12). بهترین رشد سویههای جداسازی شده در اسیدیته 6 بود که همه سویهها حداکثر رشد را داشتند همچنین همه جدایهها توانستند رشد در خور توجه در اسیدیته 5/8 نشان دهند. این مشاهدات نشان میدهد که بهینه رشد باکتریهای اسیدلاکتیک در رنج اسیدیته 6 تا 4/6 است. این نتیجه با نتایج گزارش شده توسط شده توسط پانسار و همکاران[ix] مطابقت دارد (13). در اسیدیتههای پایین نزدیک به 4، با تولید اسید و خروج آن از سلول باکتری به محیط، اسیدیته سلول باکتری بالاتر از محیط اطراف باکتری میشود. در نتیجه پروتونها به درون سلول نفوذ کرده و باکتری برای بیرون راندن این پروتونها احتیاج به انرژی دارد که این عمل باعث کند شدن رشد میشود. اگر اسیدیته خارجی خیلی پایین (در حدود 5/2 تا 3) باشد و غلظت اسید خارج سلولی بالا باشد، فشار وارده به سلول به میزان زیادی افزایش مییابد و بنابراین اسیدیته سیتوپلاسم نیز کاهش یافته و میزان آن به سطحی میرسد که دیگر رشد ممکن نیست و احتمالا سلول باکتری میمیرد (14). رولو و همکاران[x]، 3 مکانیسم مختلف برای مقاومت اسیدیته پیشنهاد کرده اند این مکانیسم ها شامل ATPase–H+، مسیر دآمینازشدن آرژنین و واکنش گلوتامات دکربوکسیلاز است. پمپ ATPase –H+ ، پروتونها را از طریق هیدرولیز ATP از سلول بیرون میراند و هرچقدر که میزان اسید تولید شده بیشتر و درحقیقت اسیدیته پایینتر رود، فعالیت این پمپ نیز افزایش مییابد و ATP بیشتری مصرف میشود. درنتیجه به رشد سلول خسارت وارد میشود و رشد کند و حتی متوقف میشود (15).
مقاومت به نمک طعام
نمک طعام یک عامل دخیل اصلی در پنیر است که تأثیر عمده بر روی ترکیب، فلور میکروبی، رسیدن، بافت، طعم و کیفیت آن دارد (16). مقاومت به نمک یکی از ویژگیهای اساسی برای باکتریهای آغازگر مورد استفاده در صنعت پنیرسازی است که سویههای جداسازی شده در این تحقیق با توجه به مقاومت به غلظتهای نمکی میتوانند کاربرد فراوانی داشته باشند. بر اساس نتایج بدست آمده سویهها ی جداسازی شده بومی توانایی خوبی برای رشد در محیطهای با غلظتهای نمکی متفاوت نشان داند و توانستند به نمک طعام با غلظت 5/1 و 5/2 درصد (وزنی/حجمی) مقاومت کنند. بهترین رشد در غلظت نمکی 5/1 درصد است و این نتیجه مشابه یافتههای هوگو و همکاران و الزته و آر.اس.[xi] بود (8 و 17). آتاسور و ادی گزل[xii] نیز گزارش کردند که همگی باکتریهای اسیدلاکتیک جداشده از سوسیس در غلظت 5/2 و 4 درصد نمک رشد کردند (7). بررسیهای ساندرز[xiii] بر روی لاکتوکوکوس لاکتیس نشان داد که تحت شرایط تنش 5/2 درصد نمک (مقدار نمک موجود در برخی از انواع پنیر)، میزان رشد از 25 تا 50 درصد نسبت به شرایط بدون تنش کاهش مییابد و همچنین سنتز پروتئینها تا حدود 50 درصد تنزل میکند. درحالیکه در باکتریهای مقاوم به غلظتهای بالاتر نمک، سنتز حداقل 12 پروتئین تحریک میشود که این پروتئینها به نام پروتئینهای تحریکی- نمکی شناخته میشوند. همچنین این باکتریها میتوانند به وسیله شوک حرارتی نیز تحریک شوند. ClpP یکی از پروتئینهای شوک حرارتی است که حین تنش نمک تحریک میشود و پس از 10 دقیقه قرار گرفتن در محیط غلظت نمک 5/2 درصد، 4 پیچش اضافی در ساختمان این پروتئین ایجاد میشود. این موضوع مطرح شده است که در سویههای مقاوم به نمک لاکتوکوکوس لاکتیس، اجتماع نامناسب پروتئینهای غشا، باعث ایجاد یک سد دفاعی برای تحمل به نمک در باکتری است (18).
تحمل دمایی
باکتریهای اسیدلاکتیک دامنه تحمل دمایی متفاوتی دارند. از باکتریهای سایکروتروف با دامنه دمایی 25 تا 30 درجه سانتیگراد، باکتریهای مزوفیل با رنج دمایی 30 تا 40 درجه سانتیگراد و همچنین ترموفیلها با بهینه دمای رشد 55 تا 75 درجه سانتیگراد گسترده هستند. باکتریهای اسیدلاکتیک جداسازی شده از نمونههای لبنی استان دارای رنج دمایی متفاوتی هستند. این جدایهها به خوبی در دمای37 و 30 درجه سانتیگراد رشد کردند. از بین سویههای جداسازی شده 13 سویه جداسازی شده شامل باسیلهای کوتاه و بلند توانایی رشد در دمای 15 درجه سانتیگراد را داشتند و 30 جدایه در دمای 45 درجه سانتیگراد رشد کردند. این نشان میدهد که باکتریهایاسیدلاکتیک جداسازی شده از نمونههای ماست و پنیر بومی استان چهارمحال و بختیاری بیشتر از گونههای مزوفیل بودند. این نتیجه مغایر با گزارشی است که در آن گونههایمزوفیل گونههای غالب باکتریهای اسید لاکتیک در پنیرلیقوانهستند (19).
فعالیتاسیدیسویهها
ازمهمترینشاخصهایدخیلدر مقبولیتفرآوردههایلبنی تخمیری از جمله ماست و پنیر،خصوصیتهایبافتیآنهااست که شروع لخته شدن کازئین شیر با اضافه کردن کشتهای آغازگر و تولید اسید لاکتیک و در نهایت پایین آمدن اسیدیته تا محدوده 6/4 آغاز میشود. نخستینوظیفهکشتآغازگرتبدیلتخمیریقندشیربه تولیداتاسیدیاستکهبهماندگاری،طعم،مزهوساختار محصوللبنیتخمیریکمکمیکند (16). لاکتوباسیلها قادرند اسیدیته مواد غذایی را که دارای یک کربوهیدرات قابل تخمیر هستند به 4 برسانند (11). مقدار اسیدیته قابل سنجش ماست نباید از 7/0 درصد بر حسب درصد وزنی/وزنی اسید لاکتیک کمتر باشد (16) (استاندارد ملی ایران شماره 695). باکتریهای میله ای حدود 6/0. تا 8/0 درصد اسید لاکتیک تولید میکنند (11). اما میزان تولید اسید در سویههای جداسازی شده متفاوت بود که بدلیلشرایطوتواناییمتابولیکیسویههایبکار رفته است. بهترین دمای رشد برای تولید اسید در باکتریهای اسید لاکتیک جداشده برابر با 37 درجه سانتیگراد بود. این نتیجه با نتیجه گزارش شده توسط هادادجی و بن سلطان[xiv] برای باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و بیفیدیوباکتریوم لانگوم جداسازی شده از نمونههای ماست فرانسه، بین 37 تا 45 درجه سانتیگراد، همخوانی دارد (20).
در نهایت، مشخص شد که بیشترین تولید اسید در دمای 37 درجه سانتیگراد پس از گذشت 72 ساعت برابر با 83/1 درصد اسیدلاکتیک و اسیدیته نهایی 61/3 است. درگزارش یالیانا و همکاران[xv] بیشترین مقدار تولید اسید لاکتیک پس از 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد برابر با 62/0 درصد و اسیدیته 79/3 آمده است (21). نتایج بدست آمده نشان داد تعدادباکتریهای اسیدلاکتیکدرطیدورهتخمیربالا میرودولیباتوجهفعالیتباکتریها،سرعتافزایشآنها متفاوتاست و در نتیجه میزان تولید اسیدلاکتیک توسط این سویهها متفاوت است. بررسی اخیر مشخص کرد که تولید اسیدلاکتیک با زمان انکوباسیون افزایش مییابد و این نتیجه در راستای گزارش هوگو و همکاران[xvi] و محمود و همکاران[xvii] است (8 و 22).
کمترین مقدار تولید اسید 252/0 و اسیدیته 32/5 برای باسیل جداسازی شده از منطقه دیگری است، پس میتوان این طور نتیجه گرفت که این تفاوت بین تولید اسید لاکتیک توسط باکتریهای اسید لاکتیک جدا شده از مناطق مختلف وجود دارد. این یافته با گزارشهای هادادین[xviii] تطبیق دارد. وی توضیح داد که سویه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس جدا شده از شمال امریکا ممکن است به طور ژنتیکی با یک گونه مشابه در اروپا یا خاورمیانه متفاوت باشد (23). این نتیجه با نتایج هوگو و همکاران مطابقت ندارد به این دلیل که در میزان تولید اسید لاکتیک لاکتوباسیلهای مناطق مختلف بنگلادش تفاوت معنی داری وجود ندارد (8).
در اسیدیته 5، نزدیک به اسیدیته ایزوالکتریک کازئین (6/4)، بافت مناسب ماست به دنبال افزایش پیوندهای هیدروفوب و تولید اسید لاکتیک ایجاد میشود. سویههایی که اسیدیته 6/4 را ایجاد کردند شامل 60/82 درصد بودند. این نتیجه با نتیجه واسیلن و همکاران[xix] همخوانی دارد که سویههای صنعتی استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس بولگاریکوس توانستند اسیدیته 57/4 و میزان اسید لاکتیک 78/0 درصد را تیتر کردند (24).
تولید اسیدلاکتیک توسط لاکتوباسیلوسها به سه عامل وابسته است، محیط کشت، اسیدیته محیط مورد نظر برای تولید اسید و دمای گرمخانهگذاری. شرایط متفاوت خارج از سلول باکتری میتواند تأثیر مستقیم بر فعالیت کاتالیکی آنزیمها (D یا -Lلاکتات دهیدروژناز) یا تمایل آنزیم به سوبسترا (پیروات) داشته باشد (25).
مقدار بالای تولید اسید لاکتیک به دست آمده در این تحقیق پس از 72 ساعت گرمخانهگذاری و کشت یک ارگانیسم به دست آمد. درحالی که در صنعت به دلیل ترکیب 2 ارگانیسم کشت آغازگر به شکل همزمان در محیط شیر در مدت زمان کوتاهتری اتفاق میافتد و این به دلیل تأثیر سینرژیسمی دو ارگانیسم نسبت به یکدیگر است که رشد و تولید اسید را تحریک میکند. این مطابق با گزارشی است که لنگ کی و آدریانی[xx] منتشر کردند مبنی بر اینکه میزان تولید اسید هنگامیکه 2 ارگانیسم کشت آغازگر با یکدیگر کشت داده شوند نسبت به زمانی که به شکل مجزا کشت داده شوند، بیشتر است (26).
یکی از خصوصیتهای لاکتوباسیلوسها توانایی تولید هر دو فرم انانتیومری L و D-لاکتات است، برای این منظور مقدار فرم L-لاکتات برای سویه ای که بیشترین تولید اسید را داشت پس از 72 ساعت با استفاده از کیت آنزیمی اندازهگیری شد که این میزان برابر با 8/6 گرم/ لیتر بود. پانسار با استفاده از لاکتوباسیلوس کازئی میزان L-لاکتات برابر 73/33 گرم بر لیتر پس از 36 ساعت را به دست آورد (13).
پیشنهادات
باکتریهایشناساییشدهدراین پژوهشمیتواننددرآیندهبهعنواناستارترویاکمکاستارتردرمحصولاتلبنیتخمیریباتوجهبهویژگیموردنیازفرآوردهبه کارروند. امااثرترکیبگونههادرتولیدترکیباتمعطروافزایشکیفیتمحصولنیازبهآزمایشهایدقیقتردرواحد آزمایشگاهیدارد. بنابراین پیشنهاد میشود در مطالعات آینده بتواندرنخستین گام به وسیله روشهای نوین تشخیصیبانکهایمیکروبیقابلقبولیاز این سویههای بومی مناطقبکرایجادکرده و نیز تحقیقاتی بر پایه نحوه بکارگیری این باکتریها، بهینهسازی در تولید بیشترین مقدار اسیدلاکتیک و همچنین شرایط دمایی متفاوت انجام شود و درمراحلبعدبابررسی ویژگیهاییافتهها،بهسویاستفادهصنعتیازآنها حرکت کرد.
تشکر و قدردانی
از کلیه افرادی که ما را در انجام این تحقیق یاری نمودند به ویژه جناب آقای مهندس نظری مدیر محترم اداره کل استاندارد استان چهارمحال و بختیاری تشکر و قدردانی می شود.
[1] . Lactic Acid Bacteria
[2]. Lactobacillus
[3]. Pediococcus
[4]. Leuconostoc
[5].Lactococcus
[6]. Orla-jensen
[7]. De Man, Rogosa, Sharpe
[viii]. Ibourahema et al.
[ix]. Pansar et al.
[x]. Rallu et al.
[xi]. Elizete and R.S.
[xii]. Adiguzel and Atasever
[xiii]. Sanders
[xiv]. Hadadji and Binsoltan.
[xv]. Yuliana et al.
[xvi]. Hoque et al.
[xvii]. Mehmood et al.
[xviii]. Haddadin.
[xix]. Vasilean et al
[xx]. Langkey et al.