نویسندگان
1 کارشناس ارشد باکتری شناسی، دانشگاه شهرکرد، ایران
2 استادیار بیماریهای تولیدمثل، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، ایران
3 دکتری دامپزشکی، دانشگاه شهرکرد، ایران
4 دانشجوی دکتری دامپزشکی، دانشگاه شهرکرد، ایران
5 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، ایران
6 دانشجوی دکتری تخصصی بیماریهای داخلی دام بزرگ دانشگاه شهرکرد، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Infertility and abortion can lead to major economic losses. Staphylococcus aureuscan cause infertility and abortion. Considering the importance of what was mentioned, present study was conducted to detect S. aureusin bovine infertility and abortion from Shahrekord, Iran.
Materials and methods: Vaginal discharge from 90 cows with endometritis and 26 aborted cows were investigated to detec S. aureus. Samples were streaked on to Mannitol salt agar plates and incubated at 37°C for 48 hours. Suspected colonies were evaluated to detect S. aureusby biochemical and polymerase chain reaction (PCR) methods.
Results: S. aureus was isolated from %5.5 (5 out of 90) of bovine endometritis and %7.7 (2 out of 26) of aborted cows.
Discussion and conclusion: The study showed that S. aureusmight play a role in bovine infertility and abortion in Shahrekord, but S. aureuscould not be considered as the major cause of bovine infertility and abortion in the region.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
آندومتریت، عفونت رحم بدون علائم سیستمیک است که با حضور ترشحات موکوسی چرکی یا چرکی در رحم تظاهر مییابد. رخداد این بیماری بالاست و پس از زایمان به وسیله عفونت واحد و یا به همراه عفونت با سایر باکتریها، ویروسها، قارچها، مایکوپلاسما و... ایجاد میشود (1- 3).
این بیماری به عنوان یک عامل خطر در ایجاد کیست تخمدانی، آنستروس و سایر مشکلات تناسلی مطرح است و با اثر گذاری بر تولید شیر، به زیانهای جدی اقتصادی منجر میشود (4 و 5). این بیماری باعث افزایش تعداد تلقیح به آبستنی منجر و در نتیجه باعث طولانی شدن فاصله بین زایمان و کاهش میزان گوساله زایی میشوند و در نهایت این اختلالات رحمی به کاهش عملکرد تناسلی منجر میشوند. به طور معمول 15 تا 20 درصد گاوها در 4 تا 6 هفته پس از زایمان دچار آندومتریت بالینی و 30 تا 35 درصد گاوها در 4 هفته پس از زایمان دچار آندومتریت تحت بالینی میشوند.
روشهای متعددی برای درمان آندومتریت پس از زایمان وجود دارد که شامل تزریق داخل رحمی آنتیبیوتیکها یا مواد سپتیک، تجویز سیستمیک آنتیبیوتیکها و هورمون درمانی (استروژن و پروستاگلندین) است.
بیشتر مطالعات نشان میدهند که باکتریهای بیماریزا نقش مهمی در فرایند رخداد و تشدید آندومتریت بازی میکنند (6 و 7) که از میان آنها استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی و باسیلوس سرئوس معمولترین باکتریهای بیماریزا هستند (8).
سقط جنین نیز میتواند باعث خسارات جدی اقتصادی و بهداشتی شود. عوامل زیادی در ایجاد سقط جنین میتوانند نقش داشته باشند. یکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده و تاثیرگذار در سقط جنین، عوامل میکروبی هستند. عوامل بیماریزای باکتریایی از قبیل استافیلوکوکوس اورئوس میتوانند جنین را آلوده کنند و به سقطهای تکگیر در گاو منجر شوند (9 و 10)
گزارشات متعددی از نقاط مختلف دنیا در زمینه جداسازی استافیلوکوکوس اورئوس از موارد آندومتریت، متریت و سقط جنین در گاو وجود دارد (9- 19).
برای شناسایی و جداسازی استافیلوکوکوس اورئوس، معمولا نمونهها را روی محیط مانیتول سالت آگار کشت میدهند. کلونیهای زرد رنگ (از نظر تخمیر مانیتول مثبت)، با آزمایشهای رنگ آمیزی گرم، کاتالاز، کوآگولاز و آزمایش DNAse آزمایش میشوند و اگر نتایج آنها نیز مثبت بود، جدایه مورد نظر، استافیلوکوکوس اورئوس تشخیص داده میشود (20). اما به تازگی گزارشاتی در مورد وجود استافیلوکوکوس اورئوسهای مانیتول منفی منتشر شده است (21). هر چند احتمال رخداد و شیوع استافیلوکوکوس اورئوسهای مانیتول منفی، بسیار پایین است و وضعیت شیوع آنها نامعلوم و مجهول است (21) اما احتمال حضور آنها در نمونههای کلینیکی و غیر کلینیکی وجود دارد. همچنین رائو[1] و همکاران استافیلوکوکوس اورئوسهایی را یافتند که DNAse منفی بودند و علتی را نیز برای این نتیجه نیافتند (22).
آزمایشهای مولکولی برای تشخیص دقیق بسیاری از میکروارگانیسمها استفاده شده اند. همچنین آزمایشهای مولکولی در مقایسه با آزمایشهای بیوشیمیایی، خطای کمتری دارند. ژن Femb یک ژن کروموزمی است و برای شناسایی اختصاصی استافیلوکوکوس اورئوس با روش PCR به عنوان یک روش اختصاصی، دقیق و حساس بکار گرفته شده است (23).
آزمایش PCR، ژنوم باکتریهای زنده (فعال) و مرده (غیر فعال) را تکثیر میکند و تفاوتی بین باکتریهای زنده و مرده قایل نمیشود. زمانیکه میخواهیم عوامل بیماریزای فعال در یک نمونهی کلینیکی را بررسی کنیم، بهتر است در ابتدا روی محیط کشت تکثیر کنیم و سپس از PCR استفاده کنیم و روی نمونهها PCR مستقیم انجام ندهیم.
با توجه به اینکه بیماریهای تناسلی و سقط جنین میتوانند به زیانهای جدی اقتصادی منجر شوند و اینکه اطلاعات چندانی در مورد وضعیت آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در بیماریهای تناسلی و سقط جنین گاو در کشور در دست نیست و نقش احتمالی استافیلوکوکوس اورئوس در ایجاد بیماریهای تناسلی و سقط جنین در گاو در این منطقه در هاله ای از ابهام باقی مانده است، در این مطالعه به ردیابی مولکولی و بیوشیمیایی استافیلوکوکوس اورئوس در موارد ناباروری و سقط جنین در گاوهای شهرکرد، پرداخته شد.
مواد و روشها
نمونه گیری
در این مطالعه که از زمستان سال 1389 تا زمستان سال 1390 انجام شد، به وسیله سواب استریل از ترشحات واژنی 90 گاو مبتلا به آندومتریت و 26 گاو سقط کرده در منطقه شهرکرد، نمونه گیری انجام شد. سوابها به طور مستقیم درون محیط آبگوشت غنیکننده استریل انداخته شدند و به آزمایشگاه منتقل و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند.
کشت و آزمایشهای بیوشیمیایی
در آزمایشگاه نمونهها روی محیط مانیتول سالت آگار (مرک، ساخت آلمان) کشت داده و به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شدند. کلونیهای مشکوک که از نظر تخمیر مانیتول مثبت بودند، تحت آزمایشهای رنگ آمیزی گرم، کاتالاز، کوآگولاز و آزمایش DNAse (کلونیهای مشکوک را روی محیط DNase Agar کشت داده و برای مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد قرار داده و سپس روی پلیتها اسیدکلریدریک یک نرمال ریخته و کلونیهای دارای هاله شفاف مثبت تلقی شدند) آزمایش شدند (20). نمونههای مشکوک برای تشخیص دقیقتر به وسیله PCR نیز آزمایش شدند.
PCR
برای تایید استافیلوکوکوس اورئوس به وسیله PCR از پرایمرهای درج شده در جدول 1 استفاده شد (23). واکنش PCR با استفاده از مواد تهیه شده از شرکت سیناژن در حجم 25 میکرولیتر (5/2 میکرولیتر بافر10XPCR، 5/1 میکرولیتر MgCl2 50 میلیمولار، 7/0 میکرولیترdNTP 10 میلیمولار، 5/1 واحد آنزیم Taq پلی مراز، 5/0 میکرولیتر با غلظت 10 میکرومولار از هر پرایمر، 1 میکرولیتر DNA الگو) انجام شد. برنامه دمایی مورد استفاده به ترتیب واسرشت ابتدایی در 94 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه و 40 سیکل از قرار 94 درجه به مدت 30 ثانیه، 64 درجه به مدت 30 ثانیه، 72 درجه به مدت 45 ثانیه و گسترش نهایی به مدت 5 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر (بایورد، ساخت آمریکا) انجام شد. در پایان محصولات PCR روی ژل آگاروز 5/1 درصد الکتروفورز شد.
جدول 1- جدول مشخصات پرایمرهای مورد استفاده
اندازه محصول |
منبع |
توالی پرایمرها |
نام ژن هدف |
651 bp |
(23) |
F: TTACAGAGTTAACTGTTACC R: ATACAAATCCAGCACGCTCT |
Femb |
نتایج
در نتایج آزمایشهای بیوشیمیایی برای کلونیهایی که از نظر ظاهری مشکوک به استافیلوکوکوس اورئوس بودند، از موارد آندومتریت 5/5 درصد (5 نمونه از 90 نمونه) آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس و از موارد سقط 7/7 درصد (2 نمونه از 26 نمونه) آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس بود. همچنین برای ارزیابی دقیقتر که از آزمون PCR برای جستجوی استافیلوکوکوس اورئوس استفاده شد، نتایج با آزمایشهای بیوشیمیایی مطابقت داشت (شکل 1).
شکل 1- تصویر الکتروفورز ژل آگاروز استافیلوکوکوس اورئوس. M: نشانگر100 جفت بازی پلاس، NC: کنترل منفی، PC: کنترل مثبت استافیلوکوکوس اورئوس ATCC25923،PTCC1431(651 جفت باز)، 1 تا 7: نمونههای مثبت شده استافیلوکوکوس اورئوس
بحث و نتیجه گیری
با در نظر گرفتن اینکه بیماریهای تناسلی و سقط جنین میتوانند زیانهای چشمگیر اقتصادی ایجاد نمایند، اجرای مطالعات تعیین کننده میزان آلودگی به باکتریهای بیماری زا در پروسه رخداد و تشدید آندومتریت و سقط، میتوانند نقش مهمی در شناسایی وضعیت آلودگی به عوامل بیماری زای مختلف و تعیین استراتژی مناسب برای درمان و مقابله با آندومتریت و سقط بازی کنند.
در مورد سقط جنین در گاو مطالعاتی در زمینه بررسی عوامل بیماری زای مختلف از قبیل بروسلا، لپتوسپیرا، کمپیلوباکتر و کلامیدیا در کشور انجام شده است (24- 27). اما متاسفانه اطلاعات چندانی در مورد وضعیت آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در بیماریهای تناسلی و سقط گاو در کشور در دست نیست و نقش احتمالی استافیلوکوکوس اورئوس در ایجاد بیماریهای تناسلی و سقط در گاو در این منطقه در هاله ای از ابهام باقی مانده است.
مطالعاتی که روی وضعیت آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در موارد بیماریهای تناسلی انجام شده شیوع متفاوتی از مقادیر پایین تا مقادیر بالا را در گاوهای مبتلا به عفونت دستگاه تناسلی در مکانهای مختلف نشان میدهد. در مطالعه باتابیال[ii] و همکاران 152 گاو مبتلا به عفونت دستگاه تناسلی بررسی شدند. 8 نمونه از 152 نمونه (33/5 درصد) به عنوان استافیلوکوکوس کوآگولاز مثبت تشخیص داده شدند (11). در مطالعه ای که در چین انجام شد (11- 20) استافیلوکوکوس اورئوس از 35/11 درصد از گاوهای مبتلا به آندومتریت جداسازی شد (12). در یک بررسی که در عراق انجام شد استافیلوکوکوس اورئوس از 13 درصد از بوفالوهای مبتلا به متریت جداسازی شد (13). در مطالعه دیگری که توسط عزاوی[iii] و همکاران انجام شده است شیوع استافیلوکوکوس اورئوس بین بوفالوهای عراق که مبتلا به آندومتریت بودند به میزان 15/15 درصد گزارش شده است (14). در مطالعه زهید[iv] درپاکستانرویگاوهاییمبتلا به آندومتریت، آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس 6/23 درصد اعلامشد (15). در مطالعه میشرا[v] و همکاران، از واژن تعدادی گاو و بوفالو، نمونه گیری انجام شد که میزان آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس 3/33 درصد اعلام شد (16).
پژوهشهای به عمل آمده روی وضعیت آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس در موارد سقط گاو نیز شیوع متفاوتی را در جاهای مختلف نشان میدهد. در پژوهشی که در کالیفرنیای ایلات متحده انجام شد، از میان 76 مورد سقطی که عوامل باکتریایی در ایجاد آن نقش داشتند از 2 مورد استافیلوکوکوس جداسازی شد (9). در مطالعه جامالودین[vi] و همکاران روی سقط در گاوهای شیری از میان 107 مورد سقط با علت باکتریایی، استافیلوکوکوس در 2 مورد شناسایی شد (17). در مطالعه ای روی گله گاوهای شیری دانمارکی از میان 17 مورد سقط با علت باکتریایی، استافیلوکوکوس اورئوس در 2 مورد یافت شد (18). در مطالعه کوربیلینی[vii] و همکاران نیز استافیلوکوکوس اورئوس از سقط در گاو جداسازی شد (19).
این مطالعه نشان میدهد که گاوهای مبتلا به آندومتریت و سقط در این منطقه میتوانند به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده شوند. در بسیاری از مطالعات انجام شده در سایر نقاط دنیا، استافیلوکوکوس اورئوس با شیوع متفاوت در موارد آندومتریت و سقط یافت شده است. با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه به نظر میرسد که نمیتوان استافیلوکوکوس اورئوس را از عوامل اصلی ایجاد آندومتریت و سقط گاو در این منطقه تلقی نمود و ممکن است عوامل بیماری زای دیگری نیز در ابتلای به آندومتریت و سقط گاو در این منطقه تاثیرگذار باشند که در این مطالعه بررسی نشده است. بنابراین، بررسیهای بیشتر در این زمینه توصیه میشود.