نویسندگان
1 دانشجوی دکتری میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران
3 دانشیار میکروبیولوژی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران
4 مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی، تهرااستادیار ژنتیک مولکولی، مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی، تهران، ایرانن، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
 Introduction: Urmia Lake, located in the northwest of Iran, is the largest permanent lake in Iran and one of the three permanent hypersaline lakes in the world. Microbial sampling from four western different regions of the lake was done and then, biodiversity of the samples were studied by culture dependent and culture independent methods.  Materials and Methods: In culture dependent methods, halophilic and halotolerant bacteria were isolated under aerobic condition on four growth media, MH, SWN, MHLN and SWNLN. Differentiation of bacterial isolates was performed based on colony features, Gram staining and primary biochemical tests. In culture independent method, environmental DNA from water and soil samples were extracted. After 16S rRNA PCR amplification 16S rRNA library was constructed and 20% of clones were sequenced.  Results: Within 217 purified isolates in culture dependent methods, 52 strains were selected for 16S rRNA gene sequencing and representatives of Halobacillus, Halomonas, Planococcus, Gracilibacillus, Bacillus, Pontibacillus, Paracoccus, Marinobacter, Providencia, Staphylococcus, Alkalibacterium, Sanguibacter, Lysobacter, Kocuria, Pontibacter, Salicola, Micrococcus, Oceanobacillus, Brevundimonas, Thalassobacillus, Microbacterium and Piscibacillus genera were identified. In culture independent method, selected clones belonged to Salinibacter Ø Adhaeribacter and Cesiribacter genera.  Discussion and Conclusion : In culture dependent selected strains 18 strains showed less than 98.7% sequence similarity to the closest known strains and were representatives as new taxa of Urmia lake. In culture independent method selected clones belonged to Bacteroidetes category. Data obtained from this study were similar to other scientific reports from hypersaline lakes .
کلیدواژهها [English]
مقدمه:
تنوع زیستی مفهوم بسیار مهمی است که پایه و اساس حیات روی کرهی زمین را تشکیل میدهد. روابط بین انسان و سایر موجودات کرهی زمین بهگونهای به هم پیوند خورده که نابودی یک گونه میتواند یکی از امکانات زندگی انسان را کاهش دهد. بنابراین حفاظت از محیط زیست و اطمینان از پایداری و همهجانبه بودن توسعهی آن از چالشهای مهمی است که جامعهی جهانی با آن روبرو است. امروزه برای مطالعهی تنوع زیستی، سطوح سلسله مراتبی مختلفی شامل تنوع ژنتیکی، تنوع ارگانیسمی یا تاکسونومیک و تنوع بومشناختی در نظر گرفته میشوند (1). آگاهی از الگوی تنوع زیستی میکروارگانیسمها از اهمیت ویژهای برخوردار است؛ چرا که میکروارگانیسمها دارای بیشترین تعداد افراد در روی زمین هستند (2). علاوه بر این، باکتریها واسطه بسیاری از فرآیندهای محیطی هستند که باعث حفظ حیات در روی کره زمین میشوند. همچنین، تنوع آنها از اهمیت عملی زیادی در حذف زیستی[1] و اکتشاف زیستی[2] برخوردار است.
با وجود تعداد زیاد میکروارگانیسمها، دانش بشری تنها نسبت به بخش بسیار کمی ازآنها آگاهی دارد. تا کنون بین 1 تا1/0 درصد از گونههای باکتریایی موجود توصیف شدهاند (3). اکثر باقیمانده گونههای باکتریایی (حدود 105×4 تا 106× 3 گونه) ناشناخته باقی ماندهاند که بیشتر این میکروارگانیسمها با روشهای موجود، در آزمایشگاه قابل کشت نیستند (4).
روشهای مستقل از کشت، از قبیل انواع مبتنی بر ماده ژنتیکی استخراج شده از محیط، شناسایی گونههای غیر قابل کشت را امکانپذیر و شرایط را برای پیشرفت تصویر کاملتر و جزییتری از اجتماعات باکتریایی فراهم کرده است (5). توصیف فیلوژنتیک مورد قبول از گونه پروکاریوتی عبارت از سویههای با وابستگی DNA-DNA برابر 70 درصد یا بیشتر است (6). بهعلاوه تمامی سویههای متعلق به یک گونه باید سطح قابل قبولی از ثبات صفات فنوتیپی را داشته باشند و توصیف یک گونه باید با بیش از یک سویه شاخص انجام شود. تنها زمانی میتوان نام گونه را به گروهی از میکروارگانیسمها اطلاق کرد که حداقل در یک صفت فنوتیپی تشخیصی از سایر گونهها متمایز شده باشند (7). سویههای با میزان شباهت RNA ریبوزومی 7/98 درصد یا کمتر همیشه اعضای گونههای متفاوت خواهند بود؛ زیرا تفاوت زیاد در توالی S rRNA16 با احتمال زیادی نشان دهنده وابستگی DNA-DNA کمتر از 70 درصد است (8).
ایران دارای تنوعی از محیطهای پر شور است. این محیطها شامل معادن نمکی، بیابانهای پر شور، رودخانههای نمکی و به ویژه دریاچههای نمک است. دریاچه ارومیه دریاچه نمک مهارلو، تالاب بختگان، دریاچه نمک اینچهبرون و دریاچه نمک آران و بیدگل از جمله دریاچههای نمکی ایران هستند. دریاچه ارومیه بزرگترین و شورترین دریاچه دائمی ایران و یکی از دریاچههای فوق اشباع از نمک دنیا است که از این نظر با دریاچه نمک بزرگ آمریکا شباهت دارد. درازای این دریاچه 140 و پهنای آن بین 15 تا 50 کیلومتر و مساحت آن بین 5000 تا 6000 کیلومتر مربع بر حسب میزان بارش و تبخیر است. سطح حوضه آبریز دریاچه ارومیه حدود 50000 کیلومتر مربع است. میزان شوری این دریاچه در زمستان 220 گرم در لیتر است که در تابستان تا 280 گرم در لیتر افزایش مییابد. با توجه به اهمیت و پراکندگی بالای مناطق شور در ایران و همینطور نقش مطالعات تنوع زیستی در توسعه زیربنایی دانش کشور، باکتری های نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک هتروتروف هوازی سواحل غربی دریاچه پرشور ارومیه به روشهای مبتنی بر کشت و مستقل از کشت بررسی شدند. هدف ما بررسی تنوع زیستی این دریاچه با استفاده از الگوی پلیفازیک مبتنی بر کشت و مستقل از کشت و شناسایی تاکسونهای احتمالی ارائه شده در این روند پس از این پژوهش است. با توجه به اهمیت اکولوژیک بسیار بالای دریاچه ارومیه به عنوان ذخیرهگاه بیوسفر و در معرض خطر بودن آن انجام این گونه مطالعات به منظور ارائه نقشه ژنتیکی کامل پروکاریوتی این دریاچه با ارزش در آینده نزدیک و حفظ محتوای ژنتیکی این زیست بوم بسیار ضروری به نظر میرسد.
مواد و روشها
نمونه برداری
با توجه به وسعت دریاچه ارومیه و شرایط بوم شناختی متنوع آن برای تمرکز بر روی تنوع زیستی دریاچه، نوار ساحلی غربی این دریاچه بهعنوان محل نمونهبرداری انتخاب شد. برای نمونهگیری، نوار ساحلی غربی دریاچه از نظر دسترسی به چهار ناحیهی مختلف تقسیم شده و در هر کدام از این نواحی حداقل از پنج منطقه نمونهبرداری انجام شد. نمونههای جمع آوری شده از محیط شامل آب، خاک، بلورهای نمک و بقایای گیاهی بودند که در مهرماه 1389 از نوار ساحلی غربی دریاچهی ارومیه جمعآوری شده و در شرایط سترون به آزمایشگاه منتقل شدند. موقعیت جغرافیایی هر یک از نقاط نمونهبرداری توسط GPS مشخص و ثبت شده است. میزان اسیدیته و دمای نمونهها بهترتیب توسط pHمتر و دماسنج در محل نمونهگیری با استفاده از دماسنج قابل حمل، اندازهگیری شد. میزان شوری نمونهها نیز با استفاده از دستگاه مالتیمتر شرکت MettlerToledo مدل Multiseven و پس از انتقال نمونهها به آزمایشگاه اندازهگیری شد. تحلیل شیمیایی ترکیبات نمونهها برای سنجش عناصر موجود در نمونهها در دانشکده زمین شناسی دانشگاه تهران با استفاده از روش نور سنجی شعلهای[3] انجام شد. نمونهها در آزمایشگاه در دمای چهار درجه سلسیوس نگهداری شدند.
کشت و جدا سازی باکتریها
برای رسیدن به تنوع کاملتری از باکتریهای نمکدوست نسبی و تحمل کنندهی نمک هتروتروف هوازی، لازم است از محیط کشتهای متنوعی استفاده شود. شرایط محیط کشتهای مورد استفاده بر اساس شرایط اقلیمی دریاچه و همچنین، نیازمندیهای انواع مختلف این باکتریها انتخاب شدهاند. محیط کشتهای MH و SWN با اسیدیته مختلف و SWN و MH با میزان کم ماده غذایی (SWNLN و MHLN) بهمنظور جداسازی بیشترین جدایههای ممکن استفاده شدند. مشخصات محیطهای کشت مورد استفاده برای جداسازی در جدول 1 آورده شده است. تلقیح نمونههای خاک، رسوب و نمک با استفاده از روش رقتهای متوالی تا رقت 5-10 بر روی محیط های مورد استفاده برای جداسازی انجام شد.
جدول 1- مشخصات محیطهای کشت مورد استفاده برای جداسازی
* سترون سازی کلیه محیطها در دمای 121 درجه سلسیوس، فشار 15 psi و زمان 15 دقیقه انجام شده است.
* محیطهای MH و SWN با اسیدیتههای 5/7 و 5/9 و محیطهای LNMHو LNSWN با اسیدیته 5/7 استفاده شدند.
|
نام محیط کشت |
ترکیبات |
||||||||||||
|
NaCl |
MgCl2.6H2O |
MgSO4.7H2O |
CaCl2.2H2O |
KCl |
NaHCO3 |
NaBr |
Yeast Extract |
Meat Extract |
Peptone |
Glucose |
Sucrose |
Agar |
|
|
Moderate Halophilic Medium (MH) |
101 |
7 |
6/9 |
36/0 |
2 |
06/0 |
026/0 |
10 |
- |
5 |
1 |
- |
15 |
|
Modified halophilic medium (1125) low nutrient (LNMH) |
101 |
7 |
6/9 |
36/0 |
2 |
06/0 |
026/0 |
1/0 |
- |
- |
- |
5/0 |
15 |
|
Sea water Nutrient Agar (SWN) |
20 |
3 |
5 |
05/0 |
5/0 |
- |
- |
1 |
2 |
5 |
- |
- |
15 |
|
Modified halophilic medium (1125) low nutrient (LNSWN) |
20 |
3 |
5 |
05/0 |
5/0 |
- |
- |
1/0 |
- |
- |
- |
5/0 |
15 |
برای تلقیح نمونههای آب، از رسوب حاصل از سانتریفوژ آب برای تلقیح مستقیم به محیط کشت استفاده شد. محیطهای تلقیح شده در دمای 34 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند. کلونیهای رشد کرده روی محیطهای جامد در دورههای زمانی 24، 48 و 72 ساعت جداسازی و خالصسازی شدند. بهمنظور دسترسی به بیشترین میزان تنوع و جداسازی انواع کند رشد، پلیتها با استفاده از تامین رطوبت در محیط نگهداری و استفاده از پارافیلم دور پلیتها به مدت 6 ماه نگهداری شده و در بازههای زمانی دو هفتهای بررسی و کلونیهای جدید جداسازی شدند. در هر مرحله کلونیهای دارای مشخصات ریختشناسی (شکل، اندازه، رنگ، قوام، حاشیه و برآمدگی سطحی) متفاوت جداسازی شدند. این کلونیها در شرایط مشابه محیط جداسازی نگهداری شدند (9).
خالصسازی، نگهداری و نامگذاری سویهها
به منظور خالصسازی جدایهها کشت متوالی از تک کلونی انجام شد. کلونیهایی که پس از پنج بار کشت متوالی بر روی محیطهای با مشخصات ثابت از نظر واکنش گرم و ریختشناسی رفتار ثابتی از خود نشان دادند بهعنوان کلونی خالص در نظر گرفته شدند (9).
توصیف اولیه سویه ها
توصیف اولیه سویه ها بر اساس تعیین صفات اولیه ماکروسکوپی، میکروسکوپی و فیزیولوژیک انجام شد. برای مشاهدهی ویژگیهای ماکروسکوپی کلونی، از محیط جامد با ترکیب مورد استفاده برای جداسازی استفاده شده، شکل، ارتفاع، حاشیه، سطح و رنگ کلونی جدایهها مورد توجه قرار گرفت. شکل میکروسکوپی جدایهها توسط میکروسکوپ نوری و بزرگنمایی 1000 مشاهده شد. برای تایید نتایج حاصل از رنگآمیزی گرم از روش KOH سه درصد توصیه شده توسط بارون[iv] استفاده شد (10). حرکت سلول با استفاده از روش لام مرطوب بررسی شد. برای مشاهده حرکت از بزرگنمایی 400 میکروسکوپ نوری استفاده شد. برای بررسی فعالیت کاتالازی از کشت 24 ساعته جدایهها و پراکسید هیدروژن سه درصد بهعنوان معرف استفاده شده و تولید حباب به عنوان واکنش مثبت درنظر گرفته شد. برای بررسی فعالیت اکسیدازی از دیسکهای آماده اکسیداز (شرکت پادتن طب) استفاده شد(11). حدود 25 درصد سویهها به شکل تصادفی برای شناسایی تکمیلی استفاده شدند.
تفکیک سویه های نمک دوست نسبی و تحمل کننده نمک
سویه های منتخب از نظر تعلق به گروه نمک دوستهای نسبی و یا تحمل کننده نمک تفکیک شدند. برای ایجاد تفکیک بین میکروارگانیسمها بر اساس نیاز و پاسخ به غلظتهای مختلف نمک، غلظت کلی نمکهای موجود در محیط مطرح است. بنابراین، برای تفکیک جدایهها از نظر تعلق به گروههای نمکدوست نسبی یا تحمل کننده نمک از محیط با کمترین میزان ماده آلی - که تامین کننده رشد برای سویههای مورد بررسی باشد- استفاده شد. لازم است از افزوده شدن نمک و اسمولیتهای ناخواسته به محیط کشت نیز اجتناب شود. محیط کشت فوق با مقادیر مختلف صفر، 5/0، 3، 5، 5/7، 10، 15، 20 و 25 درصد نمک از نمک کلی دریا 30 درصد با ترکیب زیر (گرم در لیتر) تهیه، هر یک از جدایههای منتخب بر روی کلیه این محیطها کشت داده شده و در دمای 34 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند.
Yeast extract, 5; Sea Water 30%: NaCl, 234; MgCl2.6H2O, 39; CaCl2, 1; MgSO4.7H2O; KCl, 6; NaHCO3, 0.2; KBr, 0.7
درصدی از نمک که نخستین رشد ادامهدار باکتری در آن مشاهده شد، بهعنوان درصد نمک بهینه برای رشد در نظر گرفته شد. گرماگذاری تا 10 روز ادامه یافت و محدوده نمک قابل تحمل برای رشد جدایهها مشخص شد. جدایههای با رشد بهینه در محدوده 3 تا 15 درصد نمک بهعنوان نمکدوست نسبی و جدایههای با توانایی رشد در محیط فاقد نمک و رشد بهینه در محیط با نمک کمتر از سه درصد بهعنوان تحملکنندهی نمک در نظر گرفته شدند(12، 13 و 14).
شناسایی مولکولی و تحلیل فیلوژنتیک جدایههای منتخب
شناسایی تکمیلی جدایههای منتخب با تکثیر و تعیین توالی ژن S rRNA16 انجام شد. برای این منظور، ابتدا از جدایههای منتخب، توده زیستی تهیه شده و پس از استخراج DNA ژنومی جدایهها (15)، تکثیر ژن مربوط به زیر واحد کوچک ریبوزومی انجام شد. این تکثیر با استفاده از پرایمرهای عمومی S rRNA16، 27F با توالی (5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)، 1492R با توالی
(5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’) و پرایمر 1488R با توالی
(5’-CGGTTACCTTGTTACGACTTCACC-3’) و از طریق واکنش زنجیرهای پلیمراز بود (16). استخراج DNA ژنومی و تکثیر ژن S rRNA16 با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز تایید شد. به منظور تکثیر ژن
S rRNA16 با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز بافر با غلظت X1 در ترکیب نهایی، MgCl2با غلظت 5/2 تا 5/0 میلیمول، dNTP با غلظت 4/0 میلیمول از هر کدام، آنزیم Taq DNA پلیمراز به میزان50/U2 میکرولیتر و پرایمرهای رفت و برگشت از هر کدام به میزان 5/0 تا 4/0 میلیمول و DNA الگو به میزان مناسب استفاده شد. در انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز از نمونه با شرایط مشابه با سایرنمونهها که در آن بهجای DNA الگو از آب مقطر تزریقی استفاده شده بود، بهعنوان شاهد منفی استفاده شد. برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز از واسرشت اولیه با دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت پنج دقیقه و 30 چرخه تکرار شونده شامل واسرشت با دمای 95 درجه سانتیگراد و اتصال با دمای بین 56 تا 59 درجه سانتیگراد هر کدام به مدت 60 ثانیه و سنتز با دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 50 تا 60 ثانیه و پس از اتمام 30 چرخه برای سنتز نهایی دمای 72 درجه سانتیگراد برای مدت 7 دقیقه در نظر گرفته شد. محصول نهایی حاصل از واکنش زنجیرهای پلیمراز توسط روش ختم سنتز DNA [v] به شکل رفت و برگشت تعیین ترادف شد (شرکت ماکروژن کره جنوبی). نتایج حاصل از آن با استفاده از نرم افزار ChromasPro ویرایش شده و با استفاده از نرم افزار BLAST با توالیهای معتبر ثبت شده در پایگاه داده EzTaxon (17) مقایسه، نزدیکترین سویه از نظر توالی ژن
S rRNA16 مشخص شد. تحلیل فیلوژنتیک سویهها پس از یافتن توالیهای مشابه و همراستاسازی توالیها، ویرایش و رسم درخت فیلوژنتیک با استفاده از نرمافزارهای ClustalX (ویرایش دوم) (18)، Bioedit (19) و MEGA (ویرایش پنجم) (20) و با الگوریتم Neibour-Joining (21) رسم شد. بررسی اعتبار شاخههای درخت با استفاده از الگوریتم Bootstrapanalysis و با 100 بار نمونهگیری انجام شد (22). توالیهای حاصل از این پژوهش در بانک ژنی NCBI ثبت شدند.
استخراج محتوای ژنومی نمونههای محیطی
بهمنظور استخراج DNA از نمونههای آب و خاک از روش ارائه شده توسط بنلوچ[vi] و همکاران استفاده شد (23).
بررسی تنوع زیستی با استفاده از روش کلونینگ- تعیین توالی
در این روش واکنش زنجیرهای پلیمراز با استفاده ازDNAاستخراج شده از محیط برای استحصال ژن
S rRNA16 با استفاده از پرایمرهای عمومی باکتریایی مورد استفاده در روش قابل کشت انجام شد. برای تکثیر ژن S rRNA16 از برنامه Touchdown استفاده شد و دمای اتصال از 60 درجه سانتیگراد در دوره اول شروع شد و در هر دوره دو درجه سانتیگراد کاهش داشت تا به 50 درجه سانتیگراد رسید.20 دوره باقیمانده با دمای اتصال 50 درجه سانتیگراد انجام شد. ژ
ژنهای
S rRNA16 تکثیر شده از نمونههای محیطی برای استفاده در مراحل بعد با استفاده از الکتروفورز ژل آگاروز و با استفاده از کیت استخراج DNA از ژل شرکت Roche آلمان خالص شد. با استفاده از روش کلونینگ هر یک از ژنهای تکثیر شده که ژن
S rRNA16 مربوط به یک سویه منفرد است با استفاده از کیتT/A وکتور Fermentase به درون وکتور pTz57R/T انتقال یافته و در درون باکتری E. coliسویه DH5α بهعنوان میزبان کلونینگ تکثیر یافت. واکنش اتصال در حجم نهایی 30 میکرولیتر (Buffer, 1; rATP, 1; vector, 1; T4 ligase, 1وDNA ورودی بسته به غلظت) انجام شد. پس از افزودن همه ترکیبات، ویال در دمای 22 درجه سانتیگراد برای مدت 16 ساعت قرار داده شد. بر اساس توصیه کیت و فرمولهای ارائه شده میزان ژن ورودی 25 نانوگرم محاسبه شد. سلولهای میزبان برای انتقال وکتور ابتدا مستعد شده و سپس فرآیند ورود وکتور به درون سلول انجام شد. از روش شوک حرارتی به مدت دو دقیقه در دمای 42 درجه سانتیگراد برای انتقال پلاسمید به درون باکتری مستعد استفاده شد. جداسازی سلولهای واجد پلاسمید نوترکیب با استفاده از غربالگری سفید و آبی انجام،کلونیهای سفید انتخاب و کتابخانهای از آنها تهیه شد. هر کدام از کلونی های سفید دارای یک ژن
S rRNA16متفاوت است. با تعیین توالی هر یک از این ژنها امکان بررسی تنوع زیستی میکروارگانیسمهای موجود در محیط مورد بررسی بهشکل مستقل از کشت فراهم میشود. بهطور تصادفی 20 کلونی برای مطالعات بعدی استفاده شد. استخراج پلاسمید با استفاده از کیت استخراج پلاسمید Bioneer انجام شد(Miniprep plasmid extraction kit, Bioneer, South Korea). از تغییر موقعیت پلاسمید واجد ژن در مقایسه با حالت اولیه در ژل آگاروز ورود ژن به پلاسمید تایید اولیه و پلاسمید های با غلظت (شدت باند) مناسب برای تعیین توالی استفاده شدند. پلاسمیدها توسط شرکت Macrogen با استفاده از پرایمرهای رفت و برگشت M13 مربوط به وکتور تعیین توالی شدند. توالیهای بهدست آمده با استفاده از نرمافزارهای Chromas و Bioedit ویرایش شدند. از نرمافزار Bellerphon برای ارزیابی وجود کایمر در بین قطعات تکثیر شده استفاده شد (24). توالیهای حاصل از روش مستقل از کشت مشابه با روش ارائه شده برای توالیهای حاصل از روش قابل کشت تحلیل فیلوژنتیک شدند.
نتایج
تصویر دریاچه و موقعیت جغرافیایی مناطق نمونهبرداری بر روی نقشه در شکل 1 نمایش داده شده است.
شکل 1- نقشه مناطق جغرافیایی نمونه برداری
نمونه برداری و بررسی ویژگیهای نمونهها
مشخصات جغرافیایی محل نمونه برداری و میزان شوری نمونههای شاخص در جدول2 آورده شده است. بیشترین میزان شوری در منطقه باری و کمترین میزان شوری در منطقه چیچست مشاهده شد.
جدول3 ترکیب و نوع یونهای موجود در دریاچه را نشان میدهد. یونهای سدیم و کلر به ترتیب بیشترین میزان کاتیون و آنیون را در ترکیب این دریاچه به خود اختصاص دادند که نشاندهنده ماهیت تالازوهالین این دریاچه است.
جدول 2- مشخصات نمونههای شاخص مناطق نمونهبرداری
|
منطقه نمونهبرداری |
مختصات جغرافیایی |
نوع نمونه |
دما(درجهی سلسیوس) |
شوری mg/L |
اسیدیته |
||
|
آب |
نمک |
خاک |
|||||
|
باری |
N: 37.59.7.87 E: 45.4.5.87 |
P |
|
P |
20 |
2830 |
5/7 |
|
دیزج |
N: 37.17.52.99 E: 45.18.14.90 |
|
|
P |
20 |
1000 |
8 |
|
چیچست |
N: 37.35.33.45 E: 45.16.35.11 |
P |
P |
|
18 |
710 |
7 |
|
اسکله |
N: 37.45.43.04 E: 45.18.5.88 |
P |
P |
|
18 |
1020 |
8 |
جدول 3- ترکیب و نوع یونهای موجود در دریاچه ارومیه
|
نوع یون |
باری (mg/L) |
اسکله (mg/L) |
چیچست (mg/L) |
|
Na |
10728 |
83812 |
63296 |
|
K |
9750 |
3470 |
9600 |
|
Mg |
16300 |
33700 |
22000 |
|
Ca |
73 |
71 |
149 |
|
Fe |
626/0 |
43/0 |
23/0 |
|
Ba |
18 |
5/6 |
2/10 |
|
Cl |
134900 |
236075 |
181700 |
|
HCO3 |
190 |
324 |
506 |
بر اساس تفاوت در ویژگیهای اولیه از قبیل تفاوت در کلونی و رشد، تعداد 217 جدایه از نمونهها و محیطهای مختلف جداسازی بهدست آمد. تعداد جدایههای اولیه منطقه باری 106، منطقه چیجست 54، منطقه دیزج 39 و منطقه اسکله 18 جدایه بود. بر این اساس، منطقه باری بیشترین میزان جدایههای اولیه و اسکله کمترین میزان جدایه اولیه را در بین مناطق مختلف نمونهبرداری به خود اختصاص دادند. در شکل 3 میزان اولیه جدایهها به تفکیک محیط مورد استفاده برای جداسازی، شکل میکروسکوپی و رنگ آمیزی گرم آورده شده است. محیط SWN بیشترین و محیط SWNLN و MHLN کمترین میزان جدایههای اولیه را به خود اختصاص داده است. در بین 52 جدایه منتخب، تعداد 27 جدایه نمکدوست نسبی و تعداد 25 جدایه دارای بهینه رشد کمتر از 3 درصد و تحمل کننده نمک بودند.
شکل 4- نمودار میزان جدایههای اولیه به تفکیک محیط کشت، شکل میکروسکوپی و رنگآمیزی گرم
نتایج حاصل از مقایسه سویههای منتخب از نظر میزان شباهت در توالی ژن S rRNA16 با سویههای استاندارد ثبت شده در پایگاه داده Eztaxon در جدول 4 آورده شده است. بیشترین شباهت، 100 درصد و کمترین شباهت، 9/96 در میان سویه ها مشاهده شد.
جدول 4- مقایسه میزان شباهت ژن S rRNA16 سویههای منتخب با سویههای استاندارد
|
ردیف |
نام سویه منتخب |
سویه استاندارد با بیشترین میزان شباهت |
درصد شباهت |
|
1 |
Bacillus novalis LMG 21837(T) |
9/96 |
|
|
2 |
Piscibacillus salipiscarius RBU1-1(T) |
8/98 |
|
|
3 |
Microbacterium testaceum DSM 20166(T) |
7/97 |
|
|
4 |
Halomonas ventosae Al12(T) |
4/99 |
|
|
5 |
Providencia vermicola OP1(T) |
5/99 |
|
|
6 |
Paracoccus aminovorans JCM 7685(T) |
9/97 |
|
|
7 |
Thalassobacillus hwangdonensis AD-1(T) |
7/99 |
|
|
8 |
Bacillus daliensis DLS13(T) |
5/99 |
|
|
9 |
Brevundimonas basaltis J22(T) |
2/99 |
|
|
10 |
Bacillus niabensis 4T19(T) |
4/97 |
|
|
11 |
Oceanobacillus picturae LMG 19492(T) |
7/99 |
|
|
12 |
Micrococcus lylae DSM 20315(T) |
2/99 |
|
|
13 |
Planococcus donghaensis JH 1(T) |
1/98 |
|
|
14 |
Gracilibacillus saliphilus YIM 91119(T) |
98 |
|
|
15 |
Salicola salis B2(T) |
3/99 |
|
|
16 |
Marinobacter adhaerens HP15(T) |
1/99 |
|
|
17 |
Alkalibacterium putridalgicola T129-2-1(T) |
1/99 |
|
|
18 |
Planococcus rifietoensis M8(T) |
5/98 |
|
|
19 |
Pontibacter korlensis X14-1(T) |
2/97 |
|
|
20 |
Bacillus pseudofirmus DSM 8715(T) |
6/99 |
|
|
21 |
Staphylococcus saprophyticussubsp. bovis GTC 843(T) |
5/99 |
|
|
22 |
Planococcus donghaensis JH 1(T) |
8/97 |
|
|
23 |
Bacillus halmapalus DSM 8723(T) |
6/97 |
|
|
24 |
Paracoccus homiensis DD-R11(T) |
9/97 |
|
|
25 |
Bacillus vallismortis DSM 11031(T) |
100 |
|
|
26 |
N2 |
Kocuria gwangalliensis SJ2(T) |
3/99 |
|
27 |
Bacillus hwajinpoensis SW-72(T) |
1/99 |
|
|
28 |
Planococcus rifietoensis M8(T) |
1/98 |
|
|
29 |
Bacillus horikoshii DSM 8719(T) |
98 |
|
|
30 |
Lysobacter spongiicola KMM 329(T) |
100 |
|
|
31 |
Bacillus safensis FO-036b(T) |
100 |
|
|
32 |
Sanguibacter marinus 1-19(T) |
4/99 |
|
|
33 |
Alkalibacterium putridalgicola T129-2-1(T) |
8/99 |
|
|
34 |
Staphylococcus warneri ATCC 27836(T) |
8/99 |
|
|
35 |
Bacillus subterraneus DSM 13966(T) |
5/99 |
|
|
36 |
Providencia vermicola OP1(T) |
8/99 |
ادامه جدول 4
|
ردیف |
نام سویه منتخب |
سویه استاندارد با بیشترین میزان شباهت |
درصد شباهت |
|
37 |
Bacillus oceanisediminis H2(T) |
3/99 |
|
|
38 |
Marinobacter daqiaonensis YCSA40(T) |
5/99 |
|
|
39 |
Planococcus antarcticus CMS 26or(T) |
4/97 |
|
|
40 |
Paracoccus aestuarii B7(T) |
2/99 |
|
|
41 |
Pontibacillus marinus BH030004(T) |
6/99 |
|
|
42 |
Bacillus vietnamensis 15-1(T) |
4/98 |
|
|
43 |
Halobacillus profundi IS-Hb4(T) |
99 |
|
|
44 |
Planococcus rifietoensis M8(T) |
1/99 |
|
|
45 |
Bacillus clausii KSM-K16 |
5/98 |
|
|
46 |
Gracilibacillus dipsosauri DD1(T) |
8/99 |
|
|
47 |
Halomonas desiderata FB2(T) |
9/98 |
|
|
48 |
Halobacillus profundi IS-Hb4(T) |
6/98 |
|
|
49 |
Planococcus donghaensis JH 1(T) |
4/98 |
|
|
50 |
Halomonas ventosae Al12(T) |
3/99 |
|
|
51 |
Halomonas fontilapidosi 5CR(T) |
8/99 |
|
|
52 |
Halobacillus trueperi DSM 10404(T) |
5/99 |
درخت فیلوژنتیک کلی برای مقایسه وضعیت سویههای مورد بررسی و درخت فیلوژنتیک رسم شده برای سویههای متعلق به هر شاخه، به تفکیک شاخههای مختلف به ترتیب در شکلهای 4، 5، 6 و 7 آورده شده است. در شکل 4 که درخت کلی سویههای مورد بررسی به تفکیک شاخه رسم شده است، فراوانی شاخههای مختلف در بین سویههای مورد بررسی و رابطه فیلوژنتیک این شاخهها را نمایش میدهد. همانطور که مشاهده میشود، شاخه Firmicutes بیشترین میزان جدایهها را به خود اختصاص داده است.
شکل 4- درخت فیلوژنتیک جدایهها برای نمایش روابط فیلوژنتیک با استفاده از روشNeighbor- joining
وضریبBoot Strapصد
وضریبBoot Strapصد
.
شکل 5- درخت فیلوژنتیک جدایههای شاخههای Bacteroidetes، Alphaproteobacteria و Actinobacteria برای نمایش روابط فیلوژنتیک سویههای جداسازی شده در هر شاخه با یکدیگر و با سایر شاخهها با استفاده از روش Neighbor- joining و ضریب Boot Strap صد
شکل 6- درخت فیلوژنتیک جدایههای شاخه Gamaproteobacteria برای نمایش روابط فیلوژنتیک سویههای جداسازی شده در هر شاخه با یکدیگر و با سایر شاخهها با استفاده از روش Neighbor- joining و ضریب Boot Strap صد
شکل 7- درخت فیلوژنتیک جدایههای شاخه Firmicutesبرای نمایش روابط فیلوژنتیک سویههای جداسازی شده در هر شاخه با یکدیگر و با سایر شاخهها با استفاده از روش Neighbor- joining و ضریب Boot Strap صد
در روش مستقل از کشت، نتایج حاصل از مقایسه میزان شباهت کلونهای منتخب در توالی ژن
S rRNA16 در جدول 5 آورده شده است. بیشترین میزان شباهت مشاهده شده به میزان 9/98 و کمترین میزان شباهت مشاهده شده به میزان 3/82 است. درخت فیلوژنتیک رسم شده برای توالیهای حاصل از روش مستقل از کشت در شکل 8 آورده شده است.
جدول 5- مقایسهی کلونهای منتخب با توالیهای ثبت شده استاندارد
ردیف |
نام کلون |
سویه استاندارد با بیشترین میزان شباهت |
درصد شباهت |
|
1 |
C10 |
Salinibacter ruber DSM 13855(T) |
3/99 |
|
2 |
G8 |
Adhaeribacter aquaticus MBRG1.5(T) |
8/82 |
|
3 |
G15 |
Salinibacter ruber DSM 13855(T) |
2/98 |
|
4 |
G17 |
Adhaeribacter aquaticus MBRG1.5(T) |
8/82 |
|
5 |
C3 |
Salinibacter ruber DSM 13855(T) |
9/98 |
|
6 |
C22 |
Salinibacter ruber DSM 13855(T) |
9/98 |
|
7 |
C24 |
Salinibacter ruber DSM 13855(T) |
3/98 |
|
8 |
G3 |
Salinibacter ruber DSM 13855(T) |
2/97 |
|
9 |
G5 |
Adhaeribacter aquaticus MBRG1.5(T) |
4/82 |
|
10 |
G20 |
Salinibacter ruber DSM 13855(T) |
94 |
|
11 |
N6 |
Salinibacter ruber DSM 13855(T) |
6/97 |
|
12 |
N11 |
Cesiribacter roseus 311(T) |
3/82 |
شکل 8- درخت فیلوژنتیک جدایههای حاصل از روش کلونینگ و تعیین توالی به روشNeighbor- joiningو بااستفاده از معیارBoot strapصد
بحث
محیطهای پر شور به دو بخش آبهای پر شور و خاکهای پرشور تقسیم میشوند. محیطهای پر شور به علت سختی شرایط زندگی از تنوع زیستی کمتری نسبت به محیطهای معتدل برخوردارند؛ اما از نظر حضور میکروارگانیسمهای نمکدوست و تحملکننده نمک، تنوع بالایی دارند و انواعی از نمکدوستهای نسبی و تحملکنندههای نمک در این محیطها وجود دارند.
در روشهای مبتنی بر کشت در زمینه جداسازی، از محیطهای کشت متنوع و رقتهای متوالی و گرماگذاری طولانی، برای جداسازی بیشترین تنوع گونهها استفاده شد. محیط کشتهای رقیق شده SWNLN و MHLN نیز برای افزایش جداسازی استفاده شد. کارآیی استفاده از محیط کشتهای رقیق شده در پژوهشهای قبلی تایید شده است (25 و 26). در زمینه استفاده از این محیطها یکی از دشواریها، خالصسازی میکروارگانیسمهای جدا شده از طریق این محیط است که این مورد در بیشتر موارد به علت عدم توانایی رشد در محیطهای خالصسازی است. محیطهای MH و SWN بازده مناسبی در جداسازی داشتند. تفاوت در میزان جدایههای حاصل از هر محیط کشت نشاندهنده بازده هر کدام از محیطها در جداسازی و همچنین ایجاد امکان کشت مجدد و خالصسازی است. بیشترین میزان جدایهها از نمونههای محیط بازی بهدست آمد که شاید بهعلت وجود نمونههای خاک در بین نمونههای مربوط به این منطقه است. از جدایههای حاصل از محیطهای جداسازی دارای اسیدیته قلیایی، جدایههای BH8 و DC2 برای تکثیر ژن S rRNA16 و توالییابی انتخاب شدند و بیشترین میزان شباهت را به گونه استاندارد (Alkalibacterium putridalgicola T129-2-1T) نشان دادند. این جدایهها پلیاکستریموفیل (نمکدوست و قلیادوست) بوده و به علت این ویژگی دارای قابلیت بررسی در زمینه توانمندیهای آنزیمی هستند. بیشترین میزان سویهها دارای شکل میکروسکوپی میلهای و گرم مثبت هستند که با توجه به شرایط شوری و سخت اکوسیستم و توانایی برخی از اشکال میلهای در ایجاد هاگ و قرارگیری در حالت خفتگی مورد انتظار است. نتیجه مشابه در بررسیهای قبلی بر روی دریاچه آران و بیدگل نیز بهدست آمده است (27 و 28). جدایههای گرم منفی و جدایههای دارای شکل میکروسکوپی کوکوس از فراوانی کمتری در بین جدایهها برخوردار بودند. در بررسی مشابه که توسط گارابیتو[i] و همکاران در سال 1998 انجام شد. ایشان این گروه 99 شکل میلهای به شدت تحمل کننده نمک گرم مثبت و مولد هاگ را از خاک و رسوبات زیستگاههای پر شور واقع در نقاط مختلف اسپانیا جدا کردند که قادر به رشد در غلظتهای نمک 20 تا 25 درصد بودند و بر اساس ویژگیهای ریختشناسی و محتوی G+C، در گونههای مختلف جنس Bacillus قرار گرفتند (29).
بر خلاف نتایج حاصل از پژوهش حاضر، که اشکال میلهای گرم مثبت در بین جدایهها دارای بیشترین میزان فراوانی هستند و 9/59 درصد جدایهها را به خود اختصاص میدهند، در مطالعهی مشابه انجام شده توسط مارکوز[ii] و همکاران که در سال 1987 انجام شد، تعداد 154 باکتری غیر نمکدوست از یک حوضچه نمک واقع در Huelvea کشور اسپانیا جداسازی و مطالعه شد که بیشتر آنها کوکوسهای گرم مثبت به جنسهای MicrococcusوStaphylococcusمتعلق بوده و اشکال میلهای گرم مثبت از جنس Bacillus نیز با سهم کمتری در این زیستگاه حضور داشتند (30). این اختلاف تعجب برانگیز نبوده و در مطالعات انجام شده مشخص شده که تنوع میکربی خاکهای پرشور بیشتر به خاکهای غیر شور شباهت دارد تا آبهای شور و باکتریهای خاکهای پرشور به طور معمول وابستگان تحملکنندة نمک باکتریهای معمول موجود در خاک هستند (9). با توجه به جدا سازی بخش اعظم سویهها از خاک و رسوبات این تفاوت قابل تفسیر است.
بیشترین میزان جداسازی سویهها بر روی محیط SWN با میزان نمک سه درصد بهدست آمد که بهعلت تعداد زیاد نمونههای خاک با شوری متوسط قابل انتظار است. همچنین، ناهمگونی مکانی[iii] که از ویژگیهای ذاتی خاک است موجب بهوجود آمدن ریز زیستگاههای مختلفی میشود که دارای شرایط فیزیکی شیمیایی و زیستی متفاوت هستند (31). از آنجایی که در خاک ماده غذایی بیشتری در دسترس باکتریها است، وجود چنین ریز زیستگاههایی در خاک نسبت به شورابه و بلورهای نمک، که شوری بسیار بالا (40 درصد) و یکنواخت دارند، برای رشد و تکثیرگونههای تحملکننده نمک مکان مناسبتری است. در مورد نمونههای با درصد نمک بالا و کریستالهای نمک از قبیل نمونههای بلور نمک مربوط به منطقه اسکله و چیچست، تعداد جدایهها بسیار پائین بود که شاید به علت شوری بالا، برای زندگی انواع نمکدوست اجباری مناسبتر بهنظر میرسند. در بررسیهای فیلوژنتیک بر اساس توالییابی ژن S rRNA16 در مورد سویههای منتخب، این سویهها به پنج رده
Firmicutes، Actinobacteria، Proteobacteria-γ، α-Proteobacteriaو Bacteroidet و22 جنس مختلف تعلق داشتند. در بین سویههای تعیین توالی شده تعداد 34 سویه به رده Firmicutes و 10سویه به رده Proteobacteria-γ تعلق داشتند. همچنین، تعداد چهار سویه به شاخه α-Proteobacteria، سهسویه به شاخهActinobacteriaو یک سویه به شاخهBacteroidetes تعلق داشتند. در مطالعهی مشابه دیگری با هدف جداسازی و شناسایی باکتریهای نمکدوست نسبی بومی دریاچه نمک آران و بیدگل و توانایی این میکروارگانیسمها در تولید آنزیمهای هیدرولازی خارج سلولی، 83 سویه نمکدوست نسبی جدا شد که با جنسهای نمکدوست نسبی Bacillus، Thalassobacillus، Salinococcus، Halobacillus، Halomonas، Staphylococcus، Marinococcus، Idiomarina و Salicola نزدیکی داشته و بیشترین فراوانی مربوط به جنسهای Salicola و Halobacillus گزارش شد (32).
در مطالعه تنوع زیستی باکتریهای تحمل کننده نمک دریاچه آران و بیدگل، جدایههای حاصل به چهار رده Firmicutes، Actinobacteria، -Proteobacteriaγ و α-Proteobacteriaو 20 جنس مختلف متعلق بودند. 41 سویه متعلق به رده Firmicutes، چهار سویه در رده Actinobacteria، در رده-Proteobacteriaγسهسویه و در رده α-Proteobacteriaدو سویه گزارش شد.جنسهای Aneurinibacillus، Bacillus،Brevibacillus، Marinilactibacillus،Oceanobacillus، Ornithinibacillus، Paenibacillus، Virgibacillus، Staphylococcus، Aerococcus، Jeotgalicoccus، Salinicoccus، Arthrobacter، Kocuria، Microbacterium، Pseudomonas، Halomonas، Acinetobacter، Paracoccus، Bervundimonas در این مطالعه گزارش شدند (27).
از بین جدایههای نمکدوست نسبی حاصل از بررسی تنوع زیستی در دریاچه آران و بیدگل جنسهای Aquisalibacillus، Bacillus، Gracilibacillus، Halobacillus، Oceanobacillus، Ornithinibacillus، Paraliobacillus، Piscibacillus، Salinicoccus، Salirhabdus، Thalassobacillus، Virgibacillus، Salicola، Marinobacter، Chromohalobacter، Halomonas و Idiomarina گزارش شدند (28).
در مطالعهای که در سال 2011 بر روی جداسازی میکروارگانیسمها از دریاچه ارومیه انجام شده است نیز میکروارگانیسمهایی در دو شاخه γ- Proteobactreiaو Firmicutes گزارش شدند که بیشترین میزان شباهت را به جنسهای Halomonas، Salicola، Pseudomonas، Idiomarina، Marinobacter، BacillusوHalobacillusنشان دادند (33). در پژوهش حاضر، تنوع بسیار بالاتری در سطح شاخه و جنس مشاهده شد که میتوان آنرا به تنوع محیطهای جداسازی و حجم بالاتر کار نسبت داد.
در این پژوهش، سویههای گرم مثبت در جنسهای Halobacillus، Planococcus، Gracilibacillus، Bacillus، Staphylococcus، Ornithinibacillus، Alkalibacterium، Kocuria، Pontibacter، Sanguibacter، Micrococcus، Oceanobacillus، Microbacterium، Thalassobacillus و Piscibacillus و سویههای گرم منفی نیز در جنسهای Halomonas، Paracoccus، Marinobacter، Providencia، Lysobacter، Pontibacter، Salicola و Brevundimonas قرار گرفتند.
در مطالعات محدودی که روی تنوع زیستی خاکهای پرشور انجام شده، مشخص شد که جنسهای بیشتر در این محیطها را به طور معمول جنسهای Bacillus، Pseudomonas، Micrococcus، Alcaligenes، Flavobacterium و Acinetobacter تشکیل میدهند (9).
علاوه بر این گروهها، جنسهایSalinivibrio، Pseudoalteromonas، Vibrio، Marinicoccus، Geotgalibacillus، Nestrenconia، Actinopolyspora، Aquisalibacillus، Ornithinibacillus، Paraliobacillus، Salirhabdus، Salinicoccus، Virgibacillus، ChromohalobacterوIdiomarinaکه در بررسی تنوع زیستی دریاچه ارومیه مشاهده نشدند؛ در مطالعه بر روی محیطهای پر شور دیگر گزارش شدهاند (34، 35، 36، 37 و 38).
تعداد و تنوع نمونههای بهکار گرفته شده، فصلهای مختلف نمونهبرداری، توزیع طبیعی میکروارگانیسمها در محیط زیست و مشخصات بومشناختی هر منطقه همگی از جملهی مواردی هستند که در نوع باکتریهای جداسازی شده اثر خواهند داشت (39). احتمال افزایش تنوع موجود با افزایش هربار نمونهبرداری نیز در تفاوت نوع و تعداد میکروارگانیسمهای جداشده در هر پژوهش تأثیرگذار خواهد بود (40).
بخش اصلی توالیها در کتابخانه ژنی باکتریها، توالیهای به گروه Bacteroidetes متعلق بود. در این گروه، توالیهای مرتبط با گونه Salinibacter ruber بیشترین فراوانی را داشت بهطوریکه 66 درصد از توالیهای بهدست آمده در روش مستقل از کشت، اعضای این جنس بودند. این مشاهده در دیگر دریاچههای نمک نیز گزارش شده است (41 و42). مطالعه بر روی تنوع زیستی باکتریهای دریاچه آران و بیدگل با استفاده از روش کلونینگ و توالییابی نیز نتایج مشابهی را ارائه داد که حدود 40 درصد از جدایههای تعیین توالی شده به گونه Salinibacter ruberمتعلق بودند (43). در میان اعضای کتابخانههای ژنومی تهیه شده از دریاچه ارومیه در 42 درصد از جدایههای تعیین توالی شده شباهت کمتر از 97 درصد با گونههای استاندارد ثبت شده مشاهده شد. سه جنس متفاوت Salinibacter، Adhaeribacter و Cesiribacter در بین جدایههای تعیین توالی شده مشاهده شدند که هر سه به رده Bacteroidetes متعلق هستند.
روشهای کشت و کلونینگ- توالییابی، برای بررسی تنوع زیستی باکتریهای دریاچه ارومیه بهکار برده شدند. نتایج بهدست آمده از هرکدام از روشها با توجه به ویژگیهای ذاتی روش و شیوههای اجرایی دارای محدودیت و جهتگیریهای[iv] خاص است. در روش کشت علاوه بر محدودیت اصلی (دسترسی به تنها حدود یک درصد از میکروارگانیسمهای موجود)، محیطها و روشهای کشت استفاده شده، تنها امکان رشد گروه خاصی از میکروارگانیسمها را فراهم میکند و نتایج بهدست آمده از این روش بیانگر واقعیت کامل جامعه نیست. در روش مولکولی سد کشت برداشته شده و دسترسی به میکروارگانیسمهای محیط بدون نیاز به رشد آنها در شرایط مصنوعی آزمایشگاه میسر است. با این وجود، دسترسی به ماده ژنتیکی و توانایی تکثیر ژن مورد نظر در این روش محدودیتهایی ایجاد میکند. تمامی میکروارگانیسمهای منطقه در برابر روش استخراج DNA بکاربرده شده پاسخ یکسانی ندارند. در این پژوهش، هیچگونه همپوشانی در بین نتایج حاصل از روشهای وابسته به کشت و غیر وابسته به کشت مشاهده نشد که این امر را میتوان به تعداد بسیار کم جدایههای تعیین توالی شده با استفاده از روش کلونینگ و تعیین توالی نسبت داد. در بررسی جوامع میکروبی افزایش تعداد نمونه بهاندازه افزایش تعداد نمونه در جوامع گیاهی و جانوری مؤثر و قابل تعمیم به واقعیت نیست. اما با افزایش تعداد نمونهها نتایج قابلقبولتری بهدست میآید. بر اساس نتایج بهدست آمده، بهکارگیری روشهای پلی فازیک شامل استفاده همزمان از روشهای سنتی وابسته به کشت و روشهای مولکولی بهترین نتیجه در معرفی تنوع زیستی منطقه را ارائه میدهد. علاوه بر آن، استفاده از ابزارهای مختلف دید درستتری در مورد تنوع زیستی میکروارگانیسمهای منطقه بهدست میدهد.
تشکر و قدردانی
پژوهش حاضر با حمایت مالی مرکز ملی ذخایر ژنتیک و زیستی ایران انجام گرفته است.
)