تحلیل ساختار جامعه میکروبی موجود در هاضم بی‌هوازی لجن فاضلاب شهری با استفاده از تکنیک توالی‌یابی نسل بعدی

مقدمه

به‌عنوان یک فرایند تصفیه زیستی، هم کارایی و هم پایداری فناوری هضم بی‌هوازی (AD)[1] به‌طور بنیادی به جوامع میکروبی پیچیده و فعالیت‌های آنها در هاضم‌ها بستگی دارد. به همین دلیل، در طول سال‌ها، دانشمندان و مهندسان فعال در این حوزه توجه خود را به پاسخ به سؤالات اساسی معطوف کرده‌اند؛ نظیر (1) کدام میکروارگانیسم‌ها حضور دارند، (2) چند نوع مختلف میکروارگانیسم وجود دارد، (3) کدام میکروارگانیسم‌ها فعال و درحال رشد هستند، (4) میکروارگانیسم‌ها تحت شرایط محیطی خاص چگونه رفتار می‌کنند و (5) ساختار جامعه میکروبی چگونه با عملکرد هاضم مرتبط است.

با وجود گزارش‌های متعدد که تأثیر پارامترهای محیطی بر ساختار جامعه میکروبی را توصیف می‌کنند، رویکرد معکوس که تأثیر ساختار جامعه میکروبی بر عملکرد و پایداری هاضم را توصیف می‌کند، کمتر مطالعه شده است. محققان به‌تازگی شروع به استفاده از اطلاعات مربوط به ساختار جامعه میکروبی کرده‌اند تا تأثیرات آن بر عملکرد هاضم را درک یا پیش‌بینی کنند ]1[.

تنوع میکروبی که به‌طور خاص به‌عنوان غنای گونه‌ای[2] (تعداد گونه‌ها) و یکنواختی[3] (فراوانی نسبی گونه‌ها) اندازه‌گیری می‌شود، نشان داده است نقش مهمی در عملکرد اکوسیستم‌های طبیعی و مهندسی‌شده دارد. اکوسیستم‌هایی که در آنها چندین ارگانیسم با فراوانی نسبتاً برابر قادر به انجام یک عملکرد زیستی مشابه هستند، به‌دلیل برخورداری از غنای عملکردی و یکنواختی بالا، از افزونگی عملکردی بیشتری بهره‌مند هستند و در نتیجه ثبات عملکردی بالاتری دارند. این یک نوع بیمه عملکردی برای یک اکوسیستم است که دارای غنای بالا و یکنواختی براساس رشد جبرانی است. اگر جمعیت یک گونه درون یک گروه عملکردی به‌دلیل اختلال در سیستم کاهش یابد یا از بین برود، آنگاه گونه دیگری از همان گروه عملکردی، اما با مقاومت بیشتر به اختلال، ممکن است به سرعت جای آن را بگیرد؛ البته اگر در ابتدا به تعداد کافی وجود داشته باشد ]1[.

سیستم‌های بیولوژیکی مهندسی‌شده، مانند هاضم‌های بی‌هوازی، اغلب به ناپایداری عملکردی دچار می‌شوند و به همین دلیل مورد انتقاد قرار می‌گیرند؛ بنابراین، مطالعاتی که به بررسی مقاومت و تاب‌آوری عملکردی سیستم‌های تصفیه بیولوژیکی پس از اختلال می‌پردازند، بر ارتباط تنوع گونه‌ای و یکنواختی با پایداری کلی عملکردی تمرکز کرده‌اند. Wittebolle et al. (2009) در مطالعه‌ای روی باکتری‌های دنیتریفایر، گزارش دادند که جوامع با یکنواختی بالاتر، نرخ‌های بالاتری از دنیتریفیکاسیون را در مقایسه با جوامع با یکنواختی پایین‌تر در معرض سمیت نمک نشان دادند ]1[. در مقالات دیگری، Fernanadez et al. (2000) و Hashsham et al. (2000) در مطالعه اختلال هاضم‌های متان‌زا با استفاده از بارگذاری گلوکز نتیجه‌گیری کردند پایداری عملکردی بیشتری در جوامعی مشاهده شد که چندین میکروارگانیسم درون یک گروه عملکردی مشابه داشتند [1].

در دهه گذشته پیشرفت‌های چشمگیری در شناسایی گروه‌های کلیدی میکروارگانیسم‌ها که بر مراحل تغذیه‌ای هضم بی‌هوازی تأثیر می‌گذارند و همچنین چگونگی تأثیر شرایط محیطی مختلف بر ساختار جامعه میکروبی و عملکرد هاضم صورت گرفته است. کارهای تجربی آینده می‌تواند به‌گونه‌ای تصور شود که در آن تعداد زیادی از جوامع میکروبی مختلف از هاضم‌های بی‌هوازی کنترل‌شده تجزیه و تحلیل شوند و از فناوری توالی‌یابی نسل بعدی (NGS)[4] استفاده شود. فناوری‌ توالی‌یابی نسل بعدی که به‌تازگی توسعه یافته‌ است، ممکن است یک پیشرفت بزرگ را فراهم کند. در عین حال، به‌جای تجزیه و تحلیل یک گروه خاص عملکردی یا تاکسونومیکی، توالی‌یابی نسل بعدی می‌تواند برای توصیف کامل جامعه میکروبی هاضم استفاده شود؛ با استفاده از رویکرد متاژنومیک یا با به‌کارگیری پرایمرهای جهانی ژن 16S rRNA یا با سایر رویکردها ]2[. داده‌های جامعه میکروبی و عملکرد سپس می‌توانند برای تعیین روابط پیش‌بینی‌کننده، تجربی یا مکانیکی بین ساختار جامعه و توصیف‌کننده‌های عملکرد هاضم، ازجمله نرخ تولید متان استفاده شوند. این یک تلاش ارزشمند و یک گام مهم روبه‌جلو در این حوزه خواهد بود.

هدف از انجام این پژوهش، تحلیل ساختار جامعه میکروبی هاضم بی‌هوازی است که برای دستیابی به یک رابطه کمی و پیش‌بینی‌کننده میان ساختار میکروبی و توصیف‌کننده‌های عملکرد هاضم (تولید متان) ضروری است.

مواد و روش‌ها

نمونه‌گیری در بازه‌های زمانی مختلف

در این پژوهش، هاضم فاضلاب شهری در تصفیه‌خانه فاضلاب جنوب تهران به‌عنوان هاضم نمونه انتخاب شد. دلیل این امر در مدار قرار گرفتن هاضم مدنظر پس از لایروبی در هنگام شروع نمونه‌گیری‌ها بود که امکان نمونه‌گیری از این هاضم را به مدت شش ماه با احتمال از مدار خارج شدن کمتری نسبت به هاضم‌های دیگر فراهم می‌کرد. در این مرحله، از جریان‌ لجن خروجی از هاضم، در بازه‌‌های زمانی مختلف (هر ماه یک نمونه) برای انجام تست‌های شناسایی مولکولی با استفاده از فناوری توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) و تعیین نوع (باکتریایی و آرکی‌ها) و همچنین فراوانی گونه‌ها نمونه گرفته شد. نمونه‌ها به‌طور مستقیم از جریان خروجی از هاضم بررسی‌شده، در بطری‌های پلاستیکی اتوکلاوشده با حجم 1 لیتر جمع‌آوری شدند. بطری‌های نمونه در یک جعبه یخ قرار داده و به آزمایشگاه منتقل شدند. در آزمایشگاه، نمونه‌ها پس از هموژن‌سازی، به حجم‌های کمتر، تقسیم و در دمای 18- درجه سانتیگراد فریز شدند و برای انجام آزمایش‌های مربوط به آنالیز میکروبی نگهداری شدند. در شکل 1، مراحل و چگونگی نمونه‌گیری به‌صورت شماتیک نشان داده شده است (پروتکل استاندارد نمونه‌گیری از لجن هاضم بی‌هوازی). جدول 1، بیان‌کننده شرایط فرایندی هاضم بررسی‌شده در طول دوره نمونه‌برداری است.

 آنالیز میکروبی نمونه‌ها با استفاده از فناوری توالی‌یابی نسل بعدی (NGS)

در این مرحله، نمونه‌های گرفته‌شده از جریان‌ لجن خروجی هاضم، تحت تجزیه و تحلیل توالی‌یابی کل ژنوم (WGS)^[5] قرار گرفتند تا یافته‌هایی درباره ترکیب ژنتیکی و تنوع جامعه میکروبی به دست آیند. استخراج DNA میکروبی طبق روش‌شناسی ارائه‌شده توسط Ramezani et al. (2022) انجام شد ]3[. توالی‌یابی DNA ژنومی روی پلتفرم Illumina Hiseq High Output با طول خوانش bp 2 * 150 انجام شد که توسط شرکت Novogene مستقر در بریتانیا تسهیل شد.

پس از کنترل کیفیت داده‌های حاصل از توالی‌یابی کل ژنوم، تحلیل تاکسونومیکی نمونه‌ها با استفاده از پلتفرم‌های MG-RAST و OneCodex انجام شد. در هر دو پلتفرم، فراوانی نسبی تاکسون‌ها براساس نسبت تعداد خوانش‌های تخصیص‌یافته به هر تاکسون به کل خوانش‌های طبقه‌بندی‌شده، محاسبه و به‌صورت درصد گزارش شد. نمودارهای تاکسونومیک استفاده‌شده در این مطالعه براساس خروجی همین پلتفرم‌ها و در سطوح مختلف رده‌بندی (شاخه و جنس) تهیه شدند.

شکل 1- شماتیک پروتکل استاندارد نمونه‌گیری از لجن هاضم بی‌هوازی.

Figure 1- Schematic of the standard sampling protocol for anaerobic digester sludge.

 MG-RASTیکی از پرکاربردترین سامانه‌های متن‌باز برای تحلیل داده‌های متاژنومیک است که امکان کنترل کیفیت داده‌ها، حذف توالی‌های مصنوعی و آلاینده، پیش‌بینی ژن‌ها، طبقه‌بندی تاکسونومیکی و حاشیه‌نویسی عملکردی را فراهم می‌کند. در این سامانه، طبقه‌بندی تاکسونومیکی براساس هم‌ترازی توالی‌ها با پایگاه‌های داده مرجع انجام می‌شود و امکان تعیین فراوانی نسبی میکروارگانیسم‌ها در سطوح مختلف رده‌بندی فراهم می‌شود. علاوه بر این، MG-RAST قابلیت تحلیل عملکردی ژن‌ها و مسیرهای متابولیکی را نیز در اختیار پژوهشگر قرار می‌دهد ]4، 5[.

به‌منظور افزایش دقت در شناسایی گونه‌ها، داده‌های WGS همچنین در پلتفرم One Codex تحلیل شدند. One Codex با مقایسه قطعات کوتاه توالی با پایگاه داده‌ای گسترده از ژنوم‌های مرجع میکروبی، شناسایی تاکسونومیکی را با قدرت تفکیک بالا، به‌ویژه در سطح گونه انجام می‌دهد. این سامانه علاوه بر تعیین فراوانی نسبی تاکسون‌ها، شاخص‌های متداول تنوع زیستی ازجمله شاخص‌های شانون^[6]، جینی-سیمپسون^[7]، کائو1^[8] و مقدار پوشش[9] را نیز محاسبه می‌کند که به‌ترتیب برای ارزیابی تنوع گونه‌ای، یکنواختی جامعه، برآورد غنای گونه‌ای و کفایت عمق توالی‌یابی استفاده می‌شوند ]6[.

به‌منظور افزایش قابلیت اطمینان نتایج، طبقه‌بندی تاکسونومیکی حاصل از دو پلتفرم با یکدیگر مقایسه شد و نتایج نهایی براساس خروجی‌های همسو و قابل تأیید تفسیر شدند.

جدول 1- شرایط عملیاتی و ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی هاضم مورد بررسی

Table 1- Operating conditions and physicochemical characteristics of the studied digester

 نتایج

تحلیل ساختار جامعه میکروبی هاضم

همان‌طور که پیشتر نیز اشاره شد، تنوع میکروبی که به‌طور خاص به‌عنوان غنای گونه‌ای (تعداد گونه‌ها) و یکنواختی (فراوانی نسبی گونه‌ها) اندازه‌گیری می‌شود، نقش مهمی در عملکرد اکوسیستم‌های طبیعی و مهندسی‌شده دارد. اکوسیستم‌هایی که شامل بیش از یک ارگانیسم دارای یک عملکرد خاص (غنای بالا) با فراوانی نسبتاً برابر (یکنواختی بالا) هستند، احتمال بیشتری برای داشتن افزونگی عملکردی یا ثبات عملکردی دارند. بر این اساس در این بخش، ابتدا تنوع میکروبی در لجن خروجی از هاضم بررسی شده است. سپس، ساختار جامعه میکروبی در هاضم به تفصیل تحلیل شده است.

 بررسی تنوع میکروبی (تعداد و فراوانی نسبی گونه‌ها) در هاضم بررسی‌شده

توالی‌یابی کل ژنوم روی نمونه‌های لجن خروجی از هاضم، به‌منظور تجزیه و تحلیل جامعه میکروبی انجام شد. این آزمون با هدف بررسی تأثیر محیط چالش‌برانگیز درون هاضم بر ترکیب جامعه میکروبی انجام شد. شاخص‌های تنوع میکروبی به‌دست‌آمده از نمونه‌های لجن هاضم بی‌هوازی، اطلاعات مهمی درباره ساختار جامعه میکروبی، غنای گونه‌ای، یکنواختی توزیع جمعیت‌ها و میزان کفایت نمونه‌برداری توالی‌یابی ارائه می‌کنند. نتایج به‌دست‌آمده، در جدول 2 ارائه شده است.

جدول 2- شاخص‌های تنوع آلفا جامعه میکروبی در لجن خروجی هاضم بی‌هوازی

Table 2- Alpha diversity indices of microbial community in anaerobic digester sludge

در فرایند هضم بی‌هوازی، عملکرد سیستم وابسته به یک کنسرسیوم پیچیده از باکتری‌ها و آرکی‌ها است که به‌صورت هماهنگ در مراحل هیدرولیز، اسیدزایی، استات‌زایی و متان‌زایی فعالیت می‌کنند ]1، 7[. شاخص مقدار پوشش میزان کفایت عمق توالی‌یابی را نشان می‌دهد و بیان‌کننده سهم جمعیت میکروبی است که توسط داده‌های توالی‌یابی پوشش داده شده‌اند. مقدار پوشش[10] برابر 99 درصد نشان می‌دهد عمق توالی‌یابی کافی بوده است و تقریباً تمام تنوع میکروبی موجود در نمونه شناسایی شده‌اند. مقادیر بالای پوشش توالی‌یابی بیان‌کننده قابلیت اعتماد بیشتر شاخص‌های تنوع و کاهش احتمال عدم شناسایی تاکسون‌های مهم است ]8[.

شاخص کائو1 یک برآوردگر غیرپارامتری برای غنای گونه‌ای است که تعداد گونه‌های مشاهده‌نشده را نیز براساس گونه‌های نادر تخمین می‌زند ]9[. شاخص کائو1 برابر 1177 نشان‌دهنده غنای گونه‌ای بالا در هاضم بی‌هوازی است. این شاخص تخمینی از تعداد کل تاکسون‌های موجود در جامعه میکروبی ارائه می‌دهد و مقدار بالای آن بیان‌کننده حضور تعداد زیادی گروه میکروبی در لجن هاضم است. غنای گونه‌ای بالا معمولاً با وجود مسیرهای متابولیکی متنوع و توانایی بیشتر سیستم در پاسخ به تغییرات محیطی مرتبط است ]8[.

شاخص شانون علاوه بر تعداد گونه‌ها، یکنواختی توزیع فراوانی آنها را نیز در نظر می‌گیرد و یکی از متداول‌ترین شاخص‌های ارزیابی تنوع زیستی محسوب می‌شود ]9[. شاخص شانون برابر 77/4 نشان‌دهنده تنوع میکروبی نسبتاً زیاد است. شاخص شانون هم غنای گونه‌ای و هم یکنواختی توزیع گونه‌ها را در نظر می‌گیرد؛ بنابراین، مقدار 77/4 بیان‌کننده وجود یک جامعه میکروبی پیچیده با پراکنش نسبتاً متعادل جمعیت‌ها است. در سامانه‌های هضم بی‌هوازی، تنوع بیشتر معمولاً با پایداری عملکردی بالاتر، مقاومت بیشتر در برابر شوک‌های عملیاتی و حفظ کارایی تولید بیوگاز ارتباط دارد ]1[.

شاخص سیمپسون میزان غالب‌بودن گونه‌های خاص در جامعه را ارزیابی می‌کند و به یکنواختی توزیع جمعیت حساس است [9[ مقدار سیمپسون برابر 85/0 نیز نشان می‌دهد جامعه میکروبی تحت سلطه تعداد محدودی میکروارگانیسم قرار ندارد و توزیع جمعیت میکروبی نسبتاً متعادل است. شاخص سیمپسون برای ارزیابی غالب‌بودن گونه‌ها و یکنواختی جامعه کاربرد دارد و مقادیر بالاتر آن معمولاً نشان‌دهنده تنوع مطلوب‌تر و کاهش احتمال غلبه یک گروه محدود از میکروارگانیسم‌ها است] 8[.

تعداد بالای OTUs نیز بیان‌کننده پیچیدگی بالای جامعه میکروبی است. مطالعات مختلف روی هاضم‌های بی‌هوازی نشان داده‌اند این سامانه‌ها معمولاً دارای جوامع میکروبی بسیار متنوع شامل گروه‌های مختلف باکتریایی و آرکیایی هستند که در آن شاخه‌های باکتریایی مانند فرمیکیوتس[11]، پروتئوباکتریا[12]، باکترویدیتس[13] و کلروفلکسی[14] غالب‌اند و آرکی‌های متان‌ساز نقش کلیدی در تولید متان دارند ]10[.

نتایج حاصل از این پژوهش با گزارش Tahmasebi & Aliasghari Veshareh (2026) در مطالعه هاضم بی‌هوازی پسماند شهری همخوانی دارد که از همین شاخص‌ها برای ارزیابی تنوع آلفای جامعه میکروبی استفاده کرده‌اند ]11[. براساس مجموع شاخص‌های به‌دست‌آمده، می‌توان نتیجه گرفت هاضم بی‌هوازی مطالعه‌شده دارای یک جامعه میکروبی غنی، متنوع و نسبتاً متعادل است که احتمالاً از نظر عملکردی دارای پایداری مناسب و ظرفیت مطلوب برای انجام فرایندهای هیدرولیز، اسیدزایی، استات‌زایی و متان‌زایی است. همچنین چنین ساختاری معمولاً بیان‌کننده وجود افزونگی عملکردی در جامعه میکروبی است که می‌تواند مقاومت سامانه را در برابر تنش‌ها و تغییرات عملیاتی افزایش دهد ]1[.

شایان ذکر است که شاخص‌های شانون، سیمپسون، کائو1 و OTU تنها تنوع آلفا را توصیف می‌کنند و برای شناسایی دقیق ساختار جامعه میکروبی (مانند تعیین جنس‌ها یا گونه‌های غالب) به داده‌های ترکیب تاکسونومیک نیاز است ]10[.

 بررسی ترکیب و ساختار جامعه میکروبی در هاضم بررسی‌شده

جامعه باکتری‌ها

نتایج بررسی جامعه میکروبی در جریان لجن خروجی از هاضم در سطح شاخه (phylum)، در شکل 2 نشان داده شده است. نتایج نشان می‌دهند نماینده فیلاها در جریان لجن خروجی شامل پروتئوباکتریا (03/22 درصد)، فرمیکیوتس (93/64 درصد)، سینرگیستتز[15] (24/3 درصد)، باکترویدیتس (08/0 درصد)، کوپروترموباکتروتا[16] (01/0 درصد)، و کلروفلکسی (76/0 درصد) است.

همان‌طور که در شکل 2 نشان داده شده است، دو فیلای غالب در جریان‌ لجن خروجی، پروتئوباکتریا و فرمیکیوتس هستند. پروتئوباکتریا، یک شاخه متنوع از باکتری‌های گرم منفی، نقش مهمی در فرایندهای هضم بی‌هوازی دارد. این شاخه به‌دلیل تنوع متابولیکی‌اش شناخته می‌شود و شامل چندین کلاس است که گاماپروتئوباکتریا^[17] و دلتاپروتئوباکتریا^[18] به‌ویژه در محیط‌های بی‌هوازی تأثیرگذار هستند. پروتئوباکتری‌ها در تجزیه مواد آلی پیچیده، ازجمله سلولز و پروتئین‌ها نقش دارند. آنها به مرحله هیدرولیز در هضم بی‌هوازی کمک می‌کنند و این زیرمجموعه‌ها را به ترکیبات ساده‌تر تبدیل می‌کنند که سپس توسط متان‌سازها برای تولید متان استفاده می‌شوند ]12، 13[. بسیاری از پروتئوباکتری‌ها در شراکت‌های سینتروفیک با آرکی‌های متان‌زا شرکت می‌کنند.

شکل 2- فراوانی نسبی شاخه‌های باکتریایی شناسایی‌شده براساس داده‌های توالی‌یابی کل ژنوم. فراوانی هر شاخه براساس درصد خوانش‌های طبقه‌بندی‌شده محاسبه شده است. شاخه‌هایی که در هر نمونه کمتر از 1 درصد از کل فراوانی نسبی را تشکیل داده‌اند، در گروه «سایرین» ادغام شده‌اند.

Figure 2- Relative abundance of bacterial phyla identified by whole-genome shotgun sequencing (WGS). Relative abundance was calculated based on the percentage of classified reads assigned to each phylum. Taxa representing less than 1% relative abundance in each sample were grouped as "Others".

آنها انتقال الکترون بین گونه‌ها را تسهیل می‌کنند؛ عمدتاً از طریق تولید هیدروژن که متان‌سازها از آن برای تولید متان استفاده می‌کنند. این تعامل متابولیکی برای حفظ غلظت‌های پایین هیدروژن حیاتی است و به این ترتیب تولید کارآمد متان را ترویج می‌کند ]13[. ترکیب جوامع میکروبی در هاضم‌های بی‌هوازی می‌تواند در طول زمان به‌طور چشمگیری تغییر کند؛ برای مثال، در یک مطالعه که مراحل مختلف هضم را بررسی می‌کرد، پروتئوباکتریا نسبت‌های متفاوتی از میکروبیوم را نمایندگی می‌کردند (تا 9/23 درصد در هفته ششم)؛ اما با افزایش تسلط گروه‌های باکتریایی دیگر، کاهش نشان دادند. این موضوع نقش آنها را در مراحل اولیه هضم نشان می‌دهد و ماهیت پویای جمعیت‌های میکروبی در سیستم‌های هضم بی‌هوازی را برجسته می‌کند ]12[.

به‌عنوان بی‌هوازی‌های اختیاری، بسیاری از پروتئوباکتری‌ها می‌توانند در شرایط هوازی و بی‌هوازی رشد کنند. این سازگاری به آنها اجازه می‌دهد در نواحی مختلف درون هاضم که سطح اکسیژن نوسان دارد، زندگی کنند و به پایداری و استحکام جامعه میکروبی کمک کنند ]14.[ حضور و فعالیت پروتئوباکتری‌ها می‌تواند به‌طور چشمگیری بر کارایی سیستم‌های هضم بی‌هوازی تأثیر بگذارد. آنها در چرخه مواد مغذی درون هاضم شرکت دارند و به حفظ یک محیط بهینه برای سایر میکروارگانیسم‌ها کمک می‌کنند. برخی از اعضای این گروه، با ایجاد رقابت و جلوگیری از رشد باکتری‌های پاتوژن، به بهبود سلامت کلی جامعه میکروبی کمک می‌کنند ]15[. با تسهیل تجزیه زیرلایه‌های آلی و حمایت از فرایندهای متانوژنی، پروتئوباکتری‌ها به‌طور مستقیم به تولید بیوگاز کمک می‌کنند که یک عامل حیاتی برای قابلیت اقتصادی سیستم‌های هضم بی‌هوازی است ]16[.

شاخه فرمیکیوتس نقش مهمی در هضم بی‌هوازی لجن فاضلاب دارد و به تجزیه مواد آلی و تولید متان کمک می‌کند. باکتری‌های فرمیکیوتس، به‌ویژه اعضای کلاس کلاستریدیا[19]، باکتری‌های هیدرولیتیکی حیاتی هستند که ترکیبات آلی پیچیده را به مولکول‌های ساده‌تر تجزیه می‌کنند. این هیدرولیز یک مرحله اولیه حیاتی در هضم بی‌هوازی است؛ جایی که زیرلایه‌های پیچیده به اسیدهای چرب فرار (VFAs)[20] و سایر واسطه‌ها تبدیل می‌شوند که می‌توانند توسط آرکی‌های متان‌ساز بیشتر پردازش شوند ]17[. فرمیکیوت‌ها اغلب در روابط سینتروفیک با آرکی‌های متان‌ساز درگیر هستند. آنها هیدروژن و اسیدهای چرب فرار تولید می‌کنند که سپس توسط متان‌سازها برای تولید متان استفاده می‌شود. این انتقال هیدروژن بین گونه‌ها برای حفظ اکوسیستم بی‌هوازی و اطمینان از تولید مؤثر بیوگاز حیاتی است ]18[. جنس‌هایی مانند کاندیداتوس کلواکاموناس[21] که در شاخه فرمیکیوتس شناسایی شده‌اند، به‌عنوان باکتری‌های سینتروفیک تولیدکننده هیدروژن شناخته شده‌اند که با تسهیل این تبادلات متابولیکی، کارایی هضم بی‌هوازی را افزایش می‌دهند ]17[. در مطالعاتی که ساختارهای جامعه میکروبی در سیستم‌های هضم بی‌هوازی را تحلیل کرده‌اند، مشخص شده است فرمیکیوت‌ها یکی از شاخه‌های غالب هستند و معمولاً بخش قابل توجهی از جامعه باکتریایی را در کنار باکترویدیتس و پروتئوباکتریا تشکیل می‌دهند ]12، 16[. حضور آنها به ثبات و تاب‌آوری جامعه میکروبی کمک می‌کند که برای عملکرد پایدار هاضم ضروری است. تنوع در ترکیب جامعه می‌تواند براساس شرایط عملیاتی مانند تغذیه با سوبستراهای مشترک رخ دهد؛ با این حال، فرمیکیوتس به‌طور کلی حضور ثابتی را حفظ می‌کنند که نشان‌دهنده سازگاری و اهمیت آنها در محیط‌های مختلف هضم بی‌هوازی است ]16، 18.[ در مطالعه حاضر نیز این پدیده مشاهده می‌شود. حضور باکتری‌های فرمیکیوتس به پایداری هاضم‌های بی‌هوازی کمک می‌کند. توانایی آنها در سازگاری با شرایط محیطی متغیر به حفظ عملکرد هاضم در طول زمان کمک می‌کند؛ حتی زمانی که تحت نوسانات در ترکیب زیرلایه یا پارامترهای عملیاتی قرار می‌گیرند ]16[. تنوع در شاخه فرمیکیوتس ظرفیت عملکردی هاضم‌های بی‌هوازی را افزایش می‌دهد. گونه‌های مختلف ممکن است به هدف قرار دادن زیرلایه‌های مختلف بپردازند و در نتیجه کارایی کلی تجزیه و تولید بیوگاز را بهبود بخشند ]17[. غالب‌بودن این شاخه در هاضم بررسی‌شده، می‌تواند یکی از دلایل پتانسیل بالای تولید بیوگاز در این هاضم باشد (مطابق جدول 1).

جامعه آرکی‌ها

متانوژن‌های غالب در هاضم بررسی‌شده، در شکل 3 نشان داده شده‌اند. همان‌طور که در شکل نشان داده شده است، متانوژن‌های غالب در هاضم شامل 41/18 درصد متانوکورپوسکیولوم[22]، 26/5 درصد متانوکولیوس[23]، 18/6 درصد متانواسپیریلیوم[24]، 19/20 درصد متانوتریکس[25]، 23/11 درصد متانورگولا[26]، 13/11 درصد متیلوورساتیلیس[27]، 69/16 درصد متیل اسیدیفیلوم[28]، 61/12 درصد متیلوباکتریوم[29]، و 59/6 درصد متیل اوشنی‌باکتر[30] هستند.

شکل 3- متانوژن‌های غالب در هاضم بررسی‌شده در سطح جنس

Figure 3- Dominant methanogens at the genus level in the studied digester.

با توجه به شکل 3، مشخص می‌شود جامعه آرکئایی هاضم بررسی‌شده که در مرحله تولید متان نقش مؤثری دارد، از انواع متانوژن‌های استوکلاستیک، هیدروژنوتروفیک و متیلوتروفیک تشکیل شده است. متانوژن‌ها متان را از طریق چندین مسیر متمایز تولید می‌کنند:

متان‌زایی هیدروژنوتروفیک: شامل کاهش CO₂ با استفاده از H₂ به‌عنوان اهداکننده الکترون است؛

متان‌زایی استوکلاستیک: شامل تجزیه استات است؛

متان‌زایی متیلوتروفیک: از ترکیبات متیله‌شده مانند متانول یا متیل‌آمین‌ها استفاده می‌کند ]19[.

این مسیرها به متانوژن‌ها اجازه می‌دهند در محیط‌های مختلف بی‌هوازی، از واحدهای بیوگاز کشاورزی تا روده انسان، به خوبی رشد کنند و نقش حیاتی در چرخه کربن جهانی و تولید بیوانرژی داشته باشند.

درباره متان‌زایی استوکلاستیک، انتظار می‌رود استات به‌طور مستقیم توسط متانوژن‌های استوکلاستیک به متان تبدیل شود؛ با این حال، بخشی از استات (با توجه به شرایط هاضم)، می‌تواند توسط باکتری‌های سینتروفیک اکسیدکننده استات، به گاز هیدروژن و CO₂ اکسید شود؛ به‌جای اینکه به‌طور مستقیم توسط متانوژن‌های استوکلاستیک به متان تبدیل شود. اکسیداسیون سینتروفیک استات به H₂ و CO₂ از نظر ترمودینامیکی بسیار نامطلوب است و تنها می‌تواند در مقادیر بسیار پایین فشار جزئی H₂، یعنی بین Pa 6/2 و 74 انجام شود. تنها در این بازه باریک از غلظت‌های گاز هیدروژن، اکسیداسیون سینتروفیک استات و متان‌زایی هیدروژنوتروفیک بعدی (SAO-HM)[31] از نظر ترمودینامیکی ممکن است؛ بنابراین، باکتری‌های اکسیدکننده استات به ارگانیسم‌های شریک نیاز دارند که آنها را در متانوژن‌های هیدروژنوتروفیک پیدا می‌کنند ]20[.

اختلالات مختلفی باعث تغییر در مسیر تجزیه استات از شکست مستقیم استات به سمت اکسیداسیون سینتروفیک استات همراه با متان‌زایی هیدروژنوتروفیک می‌شود. غلظت‌های بالای آمونیاک در محدوده 3000 میلی‌گرم بر لیتر، افزایش نرخ بارگذاری آلی که منجر به انباشت اسیدهای چرب، به‌ویژه اسید استیک می‌شود و افزایش غلظت استات انباشته‌شده تا مقدار 3000 میلی‌گرم بر لیتر، دمای هاضم (دماهای ترموفیلیک) و افزایش زمان ماند هیدرولیکی، از عوامل این تغییر مسیر به شمار می‌آیند ]2[.

بحث و نتیجه‌گیری

به‌عنوان یک فرایند تصفیه زیستی، هم کارایی و هم پایداری فناوری هضم بی‌هوازی به‌طور بنیادی به جوامع میکروبی پیچیده و فعالیت‌های آنها در هاضم‌ها بستگی دارد. در این پژوهش، ساختار جامعه میکروبی هاضم فاضلاب شهری در تصفیه‌خانه فاضلاب جنوب تهران بررسی شده است. برای این منظور مراحل مختلفی شامل نمونه‌گیری از لجن داخل هاضم در بازه‌های زمانی مختلف (هر ماه)، آنالیز میکروبی نمونه‌ها برای تعیین نوع‌ و فراوانی گونه‌‌های اصلی و در نهایت تحلیل ساختار جامعه میکروبی هاضم بی‌هوازی انجام شد.

تحلیل جامعه باکتریایی هاضم نشان داد باکتری‌های حاضر در مراحل هیدرولیز، اسیدسازی و استات‌سازی از تنوع و فراوانی مناسبی برخوردار هستند. مقادیر شاخص‌های تنوع زیستی نیز این موضوع را تأیید می‌کنند و بیان‌کننده وجود یک جامعه میکروبی متنوع و نسبتاً یکنواخت هستند. چنین ساختاری موجب افزایش افزونگی عملکردی می‌شود و توانایی هاضم را برای حفظ عملکرد در برابر نوسانات محیطی افزایش می‌دهد؛ در نتیجه، ظرفیت تولید متان و پایداری فرایند هضم بی‌هوازی در طول زمان حفظ می‌شود. این یافته با نتایج مطالعات پیشین همخوانی دارد که نشان دادند تنوع بالاتر جامعه میکروبی با افزایش پایداری عملکرد هاضم و مقاومت بیشتر در برابر تنش‌های عملیاتی همراه است ]21، 22[.

در این پژوهش، پروتئوباکتریا و فرمیکیوتس به‌عنوان شاخه‌های غالب باکتریایی شناسایی شدند. غالب‌بودن این دو شاخه در بسیاری از هاضم‌های بی‌هوازی شهری و صنعتی نیز گزارش شده است. باکتری‌های متعلق به شاخه فرمیکیوتس نقش مهمی در هیدرولیز پلیمرهای آلی و تولید اسیدهای چرب فرار دارند؛ درحالی‌که بسیاری از اعضای پروتئوباکتریا در تجزیه ترکیبات آلی محلول و تولید پیش‌سازهای مورد نیاز متانوژن‌ها مشارکت می‌کنند. این نتایج با گزارش‌های پیشین مطابقت دارند ]23، 24[.

شکل 4- مسیرهای احتمالی تولید متان در هاضم مورد بررسی

Figure 4- Possible methane production pathways in the studied digester.

نتایج حاصل از تحلیل جامعه آرکئایی نشان دادند انواع متانوژن‌های استوکلاستیک، هیدروژنوتروفیک و متیلوتروفیک در هاضم حضور دارند؛ اما مِتانوتریکس (متانوسائتا) بیشترین فراوانی را به خود اختصاص داده است. غالب‌بودن این جنس معمولاً نشان‌دهنده غالب‌بودن مسیر متان‌زایی استوکلاستیک در شرایط بهره‌برداری پایدار و غلظت‌های نسبتاً پایین استات و آمونیاک است. مطالعات متعددی گزارش کرده‌اند در هاضم‌هایی با عملکرد پایدار، زمان ماند مناسب و غلظت پایین آمونیاک آزاد، فراوانی مِتانوتریکس نسبت به سایر متانوژن‌ها بیشتر است ]25، 26[. در پژوهش حاضر نیز شرایط عملیاتی و ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی هاضم، ازجمله pH، دما و سایر پارامترهای بهره‌برداری، با این یافته همخوانی دارند و از غالب‌بودن مسیر استوکلاستیک حمایت می‌کنند.

در مقابل، حضور متانوژن‌های هیدروژنوتروفیک و متیلوتروفیک نشان می‌دهد علاوه بر مسیر استوکلاستیک، سایر مسیرهای متان‌زایی نیز در هاضم فعال هستند. فعال‌بودن هم‌زمان چند مسیر متان‌زایی، انعطاف‌پذیری متابولیکی جامعه آرکئایی را افزایش می‌دهد و پایداری فرایند را در برابر تغییرات شرایط بهره‌برداری تقویت می‌کند. چنین ساختاری در بسیاری از هاضم‌های بی‌هوازی با عملکرد پایدار نیز گزارش شده است ]22[.

به‌طور کلی، نتایج حاصل از تحلیل جامعه میکروبی، در کنار شرایط عملیاتی، ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی هاضم و عملکرد مناسب آن در تولید متان نشان می‌دهد هاضم مطالعه‌شده از یک جامعه میکروبی پایدار و متنوع برخوردار است. این یافته‌ها با نتایج مطالعات پیشین در زمینه هاضم‌های بی‌هوازی شهری همخوانی دارد؛ هرچند ترکیب نسبی برخی تاکسون‌ها می‌تواند تحت تأثیر عواملی نظیر نوع خوراک، زمان ماند هیدرولیکی، دمای بهره‌برداری و شرایط محیطی هر هاضم متفاوت باشد.

قدردانی

این پژوهش با حمایت مالی شرکت فاضلاب تهران انجام شده است؛ از همین رو، نویسندگان بر خود لازم می‌دانند که مراتب تشکر و قدردانی خود را نسبت به این سازمان ابراز نمایند. نویسندگان همچنین از مساعدت‌های ارزشمند‌ ارائه‌شده توسط تصفیه‌خانه فاضلاب جنوب تهران در راستای تحقق اهداف تحقیق سپاسگزاری می‌کنند.

[1] Anaerobic Digestion

[2] species richness

[3] species evenness

[4] Next Generation Sequencing

[5] whole genome sequencing

[6] Shannon

[7] Gini-Simpson

[8] Chao1

[9] Good’s Coverage

[10] coverage

[11] Firmicutes                                         

[12] Proteobacteria

[13] Bacteroidetes

[14] Chloroflexi

[15] Synergistetes

[16] Coprothermobacterota

[17] Gammaproteobacteria

[18] Deltaproteobacteria

[19] Clostridia

[20] Volatile Fatty Acids

[21] Candidatus Cloacamonas

[22] Methanocorpusculum

[23] Methanoculleus

[24] Methanospirillum

[25] Methanothrix

[26] Methanoregula

[27] Methyloversatilis

[28] Methylacidiphilum

[29] Methylobacterium

[30] Methyloceanibacter

[31] syntrophic acetate oxidation and hydrogenotrophic methanogenesis

[32] Methanosaeta