نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسنده
گروه زیستفناوری میکروبی، دانشکده زیستفناوری، دانشگاه تخصصی فناوریهای نوین آمل، آمل، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسنده [English]
Mycoplasma agalactiae is the primary etiological agent of contagious agalactia in small ruminants, a disease that has been reported in several countries, including Iran. The microorganism's ability to persist in chronic infections within herds results in substantial economic losses in the dairy industry. Recent advances in bioinformatics tools for macromolecular analysis, combined with the availability of the complete genome sequence of M. agalactiae, have enabled the systematic evaluation of diagnostically relevant epitopes and the rational design of novel constructs for diagnostic applications. The objective of the present study was to identify and evaluate epitopes with diagnostic potential and to design a multi-epitope protein suitable for use in diagnostic assays. The open reading frames (ORFs) of M. agalactiae were extracted using bioinformatics approaches. These ORFs were subsequently screened based on cellular localization, species specificity, toxicity, allergenicity, immunogenicity, and membrane-associated features to select appropriate candidate proteins for B-cell epitope prediction. The most promising epitopes were then employed in the design of a diagnostic multi-epitope protein. In silico analyses were performed to evaluate its structural and physicochemical properties, solubility, and interaction with the host MHC class II receptor. The results demonstrated that the bioinformatics screening process led to the selection of 5 ORFs and, ultimately, 7 B-cell epitopes exhibiting high immunogenicity, non-toxic and non-allergenic, and suitable specificity for M. agalactiae. Furthermore, the designed multi-epitope protein exhibited favorable structural stability, adequate solubility, and strong predicted interactions with the MHC class II receptor of goat immune cells. Overall, these findings suggest that the epitopes have significant potential for use in diagnostic assays and represent promising candidates for subsequent experimental validation of M. agalactiae infection.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
باکتری Mycoplasma agalactiae یک پاتوژن فاقد دیواره سلولی است که بهعنوان عامل کلاسیک اتیولوژیک بیماری آگالاکسی مسری در گوسفند و بز شناخته میشود. این بیماری از اکثر کشورهای جهان بهویژه کشور ایران گزارش شده و سازمان جهانی سلامت حیوانات World Organization for Animal Health (OIE)))، آگالاکسی مسری را مسئول خسارات سنگین اقتصادی به صنعت لبنیات اعلام کرده است. مطالعات متعددی حضور عامل بیماری را در حیوانات ناقلی که هم بهصورت طبیعی و هم تجربی آلوده شده بودند، ماهها پس از فاز حاد آلودگی نشان دادند. ماندگاری باکتری منجر به ایجاد حالت مزمن بیماری میشود که بهعنوان تهدیدی جدی در صنعت لبنیات و اقتصاد کشورهای وابسته به این صنعت به شمار میرود؛ زیرا حیواناتی که دچار آلودگی مزمن شدهاند میتوانند بهراحتی از دید برنامهریزی کنترل و حذف بیماری پنهان مانده و موجب شعلهورشدن مجدد آتش شیوع بیماری شوند [1- 4].
بیوانفورماتیک علمی بین رشتهای است که از ترکیب علوم زیستشناسی، کامپیوتر و آمار برای تحلیل و تفسیر دادههای زیستی استفاده میکند. برخی از رویکردهای بیوانفورماتیکی شامل دستهبندی دادههای زیستی، ارزیابی کمی و کیفی این دادهها و همچنین بهبود طراحی داروها و واکسنها براساس اطلاعات زیستی حاصل از تجزیه و تحلیل مولکولهای DNA، RNA و پروتئین است. در سالهای اخیر، بیوانفورماتیک بهعنوان پیشرفتهترین حوزه با دستاوردهای چشمگیر در پیشگیری، کنترل، تشخیص و درمان بیماریها در علوم پزشکی و دامپزشکی شناخته شده است [5]. ایمونوانفورماتیک یا ایمونولوژی محاسباتی یکی از جدیدترین زیرشاخههای علم بیوانفورماتیک است که میتواند بهعنوان یک رویکرد قدرتمند برای تحلیل، مدلسازی و پیشبینی عملکرد سیستم ایمنی در شرایط سلامت و بیماری به کار رود و فرایند توسعه و تسریع تولید واکسنها و تستهای تشخیصی جدید براساس دادههای ژنومی و پروتئومی را تسهیل کند. چنین واکسنها و روشهای تشخیصی، بهویژه آنهایی که برای کنترل و مقابله با عوامل عفونتی کشنده و فراگیر در سطح جهان طراحی شدهاند، میتوانند از اهمیت استراتژیکی ویژهای برای بهبود سلامت جهانی برخوردار باشند. ایمنوانفورماتیک از طیف گستردهای از ابزارها برای پیشبینی اپیتوپ در آنتیژنها استفاده میکند. این پیشبینی، اخیراً با اهداف مختلفی ازجمله تولید تستهای تشخیصی، شناسایی علل بیماریها و ساخت واکسنهای مبتنی بر اپیتوپ شایان توجه محققان قرار گرفته است. واکسنهای مبتنی بر اپیتوپ نشان دادهاند بهعلت ایجاد پاسخ ایمنی قویتر با ماندگاری بیشتر، تحریک هر دو سیستم ایمنی همورال و سلولی و امنیت بالاتر، جایگزین مناسبی برای واکسنهای کشته و واکسنهای زنده تخفیف حدت یافته هستند. همچنین کیتهای تشخیصی مبتنی بر پروتئینهای نوترکیب چند اپیتوپی نیز مزایای چشمگیری از قبیل ساخت آسان و هزینه تولید کمتر، حساسیت و اختصاصیت بیشتر و میزان پایین نتایج مثبت کاذب نسبت به کیتهای مبتنی بر کل باکتری یا آنتیژن دارند [6].
همچنین، با توجه به زمانبربودن و هزینه بالای آزمایشات مربوط به بررسی ایمنزایی هر پروتئین شامل بیان پروتئین نوترکیب، خالصسازی و بررسی ایمنزابودن پروتئین خالصسازیشده، استفاده از ابزار بیوانفورماتیکی و پیشگویی ویژگیهای فیزیکوشیمیایی و آنتیژنی یک پروتئین و اپیتوپهای آن و طراحی یک پروتئین مولتیاپیتوپ مورد اطمینان پیش از انجام مراحل تجربی، امری کلیدی به نظر میرسد [7].
در مطالعه حاضر، با بهکارگیری ابزارهای بیوانفورماتیکی، نواحی اپیتوپی پروتئینهای سطح سلولی باکتری M. agalactiae تخمین زده شدند و سپس از کنار هم قرار دادن بهترین اپیتوپها با استفاده از لینکر مناسب، یک پروتئین نوترکیب چند اپیتوپی با پتانسیل آنتیژنی بالا ساخته شد که قابلیت شناسایی آنتیبادیها علیه این باکتری را دارد.
مواد و روشها
استخراج توالی ژنوم باکتری و ارزیابی پروتئینهای منتخب تشخیص
ابتدا توالی ژنوم باکتری M. agalactiae از پایگاه داده NCBI با فرمت FASTA استخراج شد. سپس با استفاده از سرور ORFfinder تمامی چارچوبهای خوانش باز (Open Reading Frames, ORFs) موجود در توالی ژنوم استخراجشده تعیین شدند. از میان ORFهای حاصل، تنها ORFهای مربوط به پروتئینهای غشای خارجی و خارج سلولی در معرض سیستم ایمنی میزبان هستند؛ بنابراین، با استفاده از سرور Psort موقعیت سلولی هریک از پروتئینهای حاصل از ORFهای تعیینشده پیشگویی شد و صرفاً ORFهای مربوط به پروتئینهای غشای خارجی و خارج سلولی انتخاب شدند [8]. در مرحله بعد با استفاده از سرور SignalP، وجود توالی سیگنال پپتید در ORFs حاصل، بررسی و از توالی اصلی پروتئینها حذف شد [9]. بهمنظور بررسی اختصاصیت پروتئینهای حاصل برای باکتری M. agalactiae روی توالی همه ORFها همترازی انجام گرفت و ORFهای دارای همولوژی بالا با سایر گونهها حذف شدند. سپس با کمک سرور VaxiJen، همه پروتئینها از نظر خاصیت ایمنزایی با در نظر گرفتن حد آستانه 4/0، آنالیز و پروتئینهایی با امتیاز بالاتر برای انجام مراحل بعدی انتخاب شدند [10]. همچنین، مارپیچهای داخل غشایی که در معرض سیستم ایمنی نبودند و کاندید مناسبی برای تشخیص نیستند، با استفاده از سرور TMHMM حذف شدند [11].
پیشبینی و ارزیابی B-cell اپیتوپهای منتخب تشخیص
در مرحله بعد، B-cell اپیتوپهای فضایی و خطی مربوط به هریک از پروتئینهای حاصل با استفاده از نرمافزار SVMTriP (http://sysbio.unl.edu/SVMTriP/ prediction.php) براساس توالی آمینواسیدی پروتئین و نرمافزار ElliPro (http://tools.immuneepitope.org/ tools/ElliPro) براساس ساختار سهبعدی پروتئین با فرمت PDB پیشبینی شد [12، 13]. اپیتوپهای پیشبینیشده مجدداً از نظر سمیت، آلرژنبودن و خاصیت ایمنی بررسی شدند و از میان اپیتوپهای حاصل، بهترین اپیتوپها از نظر فاکتورهای مهم، مانند خاصیت ایمنزایی و سمیت، برای ساخت یک پروتئین چند اپیتوپی انتخاب شد.
ساخت و ارزیابی یک پروتئین چند اپیتوپی کاندید تشخیص با استفاده از اپیتوپهای منتخب
با استفاده از لینکر KK، اپیتوپهای منتخب به هم متصل شدند و پروتئین چند اپیتوپی ساخته شد. ساختار دوم و سوم پروتئین حاصل بهترتیب با نرمافزارهای SOPMA و Robetta پیشبینی شدند. همچنین خصوصیات فیزیکوشیمیایی از قبیل وزن مولکولی، پایداری و نیمهعمر پروتئین از طریق سرور آنلاین ProtParam Tool بررسی شد. نرمافزار آنلاین Protein-sol میزان حلالیت پروتئین چند اپیتوپی حاصل را در مقایسه با میزان میانگین حلالیت مناسب پروتئینهای محلول باکتری E. coli محاسبه کرد که شاخص 45/0 دارد. هرچه عدد حاصل به این شاخص نزدیکتر باشد، به معنی مطلوببودن وضعیت حلالیت پروتئین مدنظر است.
بررسی برهمکنش پروتئین چند اپیتوپی کاندید تشخیص با سیستم ایمنی میزبان
بهمنظور ارزیابی پروتئین چند اپیتوپی طراحیشده در برهمکنش مطلوب با سیستم ایمنی میزبان، با استفاده از سرور HDOCK داکینگ مولکولی بین این پروتئین بهعنوان لیگاند و پروتئین DRB1-4 بز (NCBI Reference Sequence: NP_001301146.2) بهعنوان رسپتور MHC class II سلولهای ایمنی میزبان انجام گرفت [14].
نتایج
ارزیابی و انتخاب پروتئینهای منتخب تشخیص
براساس نتایج سرور ORFfinder درمجموع 4372 ORF از توالی ژنوم باکتری M. agalactiae شناسایی شدند که از میان آنها 69 ORF توسط سرور Psort بهعنوان پروتئینهای غشای خارجی و خارج سلولی معرفی شدند. بهعلت موقعیت سلولی این پروتئینها و در دسترس بودن آنها برای سیستم ایمنی میزبان، مراحل بعدی روی این 69 ORF ادامه یافت. پس از انجام همترازی روی توالی ORFs موجود، 21 ORF بهعلت عدم وجود همولوژی بالا با سایر گونهها بهعنوان پروتئینهای اختصاصی برای باکتری M. agalactiae، انتخاب و توسط سرور VaxiJen از نظر خاصیت ایمنیزایی بررسی شدند. نتایج این سرور نشان دادند درمجموع 5 ORF دارای بالاترین امتیاز آنتیژنی بودند و برای تخمین نواحی اپیتوپی وارد مرحله بعد شدند.
پیشبینی و انتخاب B-cell اپیتوپهای منتخب تشخیص
پس از پیشبینی B-cell اپیتوپها با نرمافزارهای آنلاین SVMTriP و ElliPro، اپیتوپهای غیرتوکسیک، غیرآلرژن و دارای خاصیت آنتیژنی بالاتر با نرمافزارهای آنلاین ToxinPred، AllerTOP و VaxiJen بهعنوان اپیتوپهای منتخب برای ساخت پروتئین چند اپیتوپی انتخاب شدند. این اپیتوپهای منتخب در جدول 1 و شکل 1 ذکر شدهاند.
جدول 1. لیست B-cell اپیتوپهای منتخب
Table 1. Selected B-cell Epitopes
|
Toxicity |
Allergenicity |
VaxiJen Score |
Score |
Epitope Sequence |
|
|
Non Toxic |
Non Allergen |
0.74 |
1.00 |
HSEALEAIYSHVPGLKVIMP |
Linear Epitopes Predicted via SVMTriP
|
|
Non Toxic |
Non Allergen |
0.80 |
0.95 |
AASCGDKYFKETEVDGVKTI |
|
|
Non Toxic |
Non Allergen |
0.99 |
0.91 |
YNSLAAKLASKKITDKYKRE |
|
|
Non Toxic |
Non Allergen |
0.68 |
0.77 |
TFADIAQKSFKNSAAQNSRLH
|
Discontinuous Epitopes Predicted via Ellipro
|
|
Non Toxic |
Non Allergen |
0.73 |
0.73 |
TADVTIPLPVLEKQ
|
|
|
Non Toxic |
Non Allergen |
0.69 |
0.72 |
KNSQTDAPSRITNESNTVSFSSFNPEFKKYLT |
|
|
Non Toxic |
Non Allergen |
0.70 |
0.66 |
EDAGFEGGVFRATEGLQKKYGDQRVWDSPISEGG |
شکل 1- ساختار سهبعدی B-cell اپیتوپهای پیشبینیشده توسط نرمافزار ElliPro. نواحی زرد رنگ اپیتوپهای پیشبینیشده را در ساختار سهبعدی پروتئین نمایش میدهد.
Figure1. 3D structure of B-cell Epitopes estimated by ElliPro.
ساخت پروتئین چند اپیتوپی با اپیتوپهای منتخب
با اتصال B-cell اپیتوپهای انتخابشده با کمک لینکر KK پروتئین چند اپیتوپی مدنظر ساخته شد.
HSEALEAIYSHVPGLKVIMPKKAASCGDKYFKETEVDGVKTIKKYNSLAAKLASKKITDKYKREKKTFADIAQKSFKNSAAQNSRLHKKKIIDQIIQSVTLNPNGKDSLQEQKKTADVTIPLPVLEKQKKKNSQTDAPSRITNESNTVSFSSFNPEFKKYLTKKEDAGFEGGVFRATEGLQKKYGDQRVWDSPISEGG
پیشبینی ساختار دوم و سوم پروتئین چند اپیتوپی
با استفاده از سرور آنلاین SOPMA پروتئین چند اپیتوپی حاصل از نظر ساختار دوبعدی ارزیابی شد. براساس این، درصد حضور random coil، extended strand (β fold) و α helices بهترتیب 91/40، 6/9 و 49/49 درصد است که در شکل 2-الف نمایش داده شده است. ساختار سوم پروتئین چند اپیتوپی توسط نرمافزار Robetta، پیشبینی و فایل PDB حاصل استخراج شد (شکل 2-ب).
شکل 2- پیشبینی ساختار پروتئین چند اپیتوپی طراحی شده. الف) پیشبینی ساختار دوم با استفاده از نرمافزار SOPMA ب) پیشبینی ساختار سوم با استفاده از نرمافزار Robetta
Figure 2. Prediction of Multi-Epitope Protein Structure.
ارزیابی خواص فیزیکوشیمیایی و حلالیت پروتئین کاندید تشخیص
یافتههای حاصل از ارزیابی خواص فیزیکوشیمیایی پروتئین چند اپیتوپی توسط سرور آنلاین ProtParam Tool نشان دادند این پروتئین شامل 198 آمینواسید با وزن مولکولی تقریبی 22 کیلودالتون و دارای نیمهعمر مطلوب (10 ساعت در میزبان باکتریایی E. coli) است. همچنین، شاخص ناپایداری این پروتئین 25/35 (<40) تخمین زده شد که حاکی از پایداری مطلوب پروتئین چند اپیتوپی پیشنهادی است. نتایج حاصل از نرمافزار Protein-sol نیز نشان دادند شاخص حلالیت پروتئین کاندید تشخیص، تقریباً 8/0 تخمین زده شد که در مقایسه با شاخص حلالیت مناسب پروتئینهای باکتری E. coli (45/0)، حلالیت بالای پروتئین پیشنهادی را نشان میدهد.
شکل 3- پیشبینی میزان حلالیت پروتئین چند اپیتوپی (QuerySol) در مقایسه با میانگین حلالیت پروتئینهای باکتری E. coli (PopAvrSol).
Figure 3. Predicting the Multi-epitopic protein (QuerySol) Solubility Compared to the Average Solubility of E. coli Proteins (PopAvrSol).
بررسی برهمکنش پروتئین چند اپیتوپی کاندید تشخیص با سیستم ایمنی میزبان
نتایج حاصل از داکینگ مولکولی بین پروتئین چند اپیتوپی طراحیشده بهعنوان لیگاند و پروتئین DRB1-4 بهعنوان رسپتور MHC class II سلولهای ایمنی میزبان با استفاده از سرور HDOCK در شکل 4 نمایش داده شدهاند. امتیاز داکینگ (Docking Score) 76/297- و امتیاز اطمینان (Confidence Score) 95/0 بود که حاکی از برهمکنش مناسب بین این دو پروتئین است.
شکل 4- داکینگ مولکولی بین رسپتور DRB1-4 (قهوهای) و پروتئین چند اپیتوپی کاندید تشخیص (زرد)
Figure 4. Molecular Docking between DRB1-4 Receptor (Brown) and Serodiagnostic Candidate Multi-Epitope Protein (Yellow)
بحث
بیماری آگالاکسی بهدلیل احتمال بالای انتشار عامل بیماریزا از حیوانات ناقل بدون علامت حتی تا ماهها پس از آلودگی اولیه، پتانسیل ایجاد حالت مزمن و ماندگاری در گله را دارد که حذف کامل این بیماری از سطح گله را دشوار میکند. از سوی دیگر، درمان آنتیبیوتیکی نیز منجر به کاهش علائم و افزایش حالت ناقل میشود؛ ازاینرو، بهکارگیری روشی دقیق و سریع برای تشخیص زودهنگام و غربالگری سریع حیوانات آلوده و جداسازی آنها از حیوانات سالم، نقش بهسزایی در کنترل و حذف این بیماری از سطح گله خواهد داشت. شناسایی آنتیبادیهای موجود در سرم افراد آلوده با روش سرولوژیکی الایزا مناسبترین و سریعترین روش تشخیص وجود عفونت در سطح گله است. در گذشته از عصاره سلول باکتری برای انجام این تست استفاده میشد که شامل مقادیر زیادی پروتئین و سایر ماکرومولکولها بود که با ایجاد نتایج مثبت کاذب بر کارایی تست اثر منفی داشتند [1، 2، 3، 15]. امروزه، استفاده از پروتئینهای نوترکیب خالصسازیشده حاصل از تکنیکهای مولکولی شامل ترکیبی از اپیتوپهای آنتیژنتیک باکتری برای شناسایی آنتیبادیهای موجود در سرم فرد آلوده، روش مؤثرتری با حساسیت و اختصاصیت دقیقتر است. مطالعات گستردهای برای یافتن آنتیژنهای مؤثر در بهبود روشهای سرولوژیکی انجام گرفته است؛ اما تاکنون یک پروتئین نوترکیب چند اپیتوپی قطعی برای استفاده در ساخت روش تشخیص سرولوژیکی معرفی نشده است. دسترسی به ژنوم کامل باکتری M. agalactiae فرصت مناسبی برای پیشبینی پروتئینهای دارای قدرت آنتیژنی بالا و تخمین اپیتوپهای آنها با کمک ابزارهای بیوانفورماتیکی فراهم کرده است [16]. در مطالعه حاضر، برای اولینبار یک پروتئین جدید متشکل از اپیتوپهای اختصاصی، غیرتوکسیک، غیرآلرژن با قدرت آنتیژنی بالا برای کاربرد در توسعه روش تشخیص سرولوژیکی طراحی و معرفی شد. با توجه به ارتباط بین ساختار دوبعدی پروتئین و توزیع اپیتوپهای آن، با استفاده از نرمافزار آنلاین SOPMA ساختار دوم پروتئین چند اپیتوپی طراحیشده بررسی شد. ساختارهایα helices و extended strand (β fold) با قرارگیری در بخشهای داخلی پروتئین در پایداری و استحکام پروتئین نقش دارند و ساختار random coil با موقعیتیابی در سطح سلول، در معرض سیستم ایمنی قرار داشته و احتمال تشکیل اپیتوپ در آن بالاتر است [17]. با توجه به درصد حضور هریک از ساختارهای فوق میتوان نتیجه گرفت پروتئین چند اپیتوپی حاضر، از نظر استحکام و پتانسیل تشکیل اپیتوپ در وضعیت مطلوبی قرار دارد. این نتایج با یافتههای حاصل از سرور ProtParam مطابقت داشت که با بررسی خواص فیزیکوشیمیایی پروتئین چند اپیتوپی طراحیشده، آن را پایدار ارزیابی کرده بود. همچنین، بر اساس نتایج حاصل از نرمافزار که حاکی از شاخص حلالیت بالای پروتئین پیشنهادی در مقایسه با محدوده مطلوب حلالیت پروتئینهای بیانشده در باکتری E. coli است، میتوان استنباط کرد قطبیت بالای این پروتئین از یکسو آن را برای کاربردهای تشخیصی و برهمکنش با آنتیبادی مناسب میکند و از سوی دیگر، بیان و اجرای مراحل خالصسازی آن در شرایط استاندارد بهسهولت امکانپذیر است و احتمال تجمع پروتئین و تشکیل اینکلوژنبادی در سیستم بیانی E. coli پایین ارزیابی میشود.
بهمنظور بررسی پتانسیل پروتئین چند اپیتوپی طراحیشده در برهمکنش با سیستم ایمنی میزبان، با استفاده از سرور HDOCK، داکینگ مولکولی بین ساختار سهبعدی پروتئین طراحیشده بهعنوان لیگاند و ساختار سهبعدی پروتئین DRB1-4 بهعنوان رسپتور MHC class II میزبان بز انجام گرفت. این سرور با آنالیز برهمکنشهای بیوفیزیکی و بیوشیمیایی، داکینگ بین دو مولکول را ارزیابی میکند. طبق نتایج بهدستآمده، برهمکنش مطلوب بین پروتئین چند اپیتوپی پیشنهادی و رسپتور MHC class II نشان میدهد اپیتوپهای این پروتئین قابل شناسایی برای سیستم ایمنی میزبان هستند و آنتیبادیهای تولیدشده در میزبان، توانایی تشکیل کمپلکس با این پروتئین را دارند. این قابلیت، حاکی از پتانسیل بالای پروتئین چند اپیتوپی طراحیشده برای کاربرد در تولید روشهای تشخیص سرولوژیکی بر پایه اپیتوپ است. در توافق با یافتههای مقاله حاضر، مطالعات متعددی در حیطه طراحی و تولید پروتئینهای چند اپیتوپی در توسعه روش تشخیص مؤثر برای سایر گونههای مایکوپلاسما از قبیل M. bovis، M. gallisepticum، M. pneumonia و M. synoviae با بهکارگیری داکینگ مولکولی نشان دادند برهمکنش مناسب پروتئینهای طراحیشده، با رسپتورهای سلولهای ایمنی میزبان اختصاصی هر باکتری، شاخص مناسبی برای تخمین ایجاد پاسخ ایمنی پایدار و تشکیل صحیح کمپلکس آنتیژن-آنتیبادی است [6، 18، 19، 20].
نتیجهگیری
در تحقیق حاضر، پروتئینها و اپیتوپهای دارای ویژگیهای مناسب برای کاربرد در تشخیص عفونت ناشی از باکتری M. agalactiae ارزیابی و انتخاب شدند و برای اولینبار با استفاده از آنالیزهای بیوانفورماتیکی، یک پروتئین چند اپیتوپی اختصاصی باکتری M. agalactiae غیرتوکسیک، غیرآلرژن، با خاصیت آنتیژنی بالا، طراحی و از نظر ساختار، پایداری، خواص فیزیکوشیمیایی، حلالیت و توانایی ایجاد کمپلکس آنتیژن-آنتیبادی تأیید شد. گام بعدی مطالعه، تولید پروتئین نوترکیب و ارزیابی خاصیت ایمنزایی این پروتئین و توانایی شناسایی آنتیبادیهای موجود در سرم حیوان بیمار است.
سپاسگزاری
از همراهی و همکاری تمامی افرادی که در اجرای این پژوهش نقش داشتند، صمیمانه قدردانی به عمل میآید.
)