جداسازی، غربال‌‌گری و بهینه‌‌سازی تولید آنزیم لاکاز از مخمر و استفاده از آن به‌عنوان گامی نوین در سنتز هیدروژل‌‌های زیست‌فعال

مقدمه

لاکازها یکی از قدیمی‌‌ترین و شناخته‌شده‌‌ترین اعضای خانواده پروتئین چند مسی هستند که به‌عنوان بنزن دیول اکسیژن اکسیدوردوکتاز شناخته می‌‌شوند. آنها آنزیم‌‌های مدل اکسیدازهای چند مسی هستند که در اتصال عرضی مونومرها، تخریب پلیمرها و برش ترکیبات آروماتیک شرکت می‌‌کنند (1). ساده‌‌ترین آنزیمی است که هر سه رزونانس آلی مس (II) را در یک مولکول ترکیب می‌‌کند.

آنزیم لاکاز یک اکسیداز است که به‌عنوان کاتالیست در واکنش‌‌های کاهش اکسیژن به آب به کار برده می‌‌شود (2). لاکازها به‌عنوان بیوکاتالیست‌‌های وسیع‌الطیف برای تجزیه چندین ترکیب مانند آلاینده‌‌های فاضلاب‌‌های صنعتی و بیمارستانی استفاده می‌‌شوند. هنگامی که سوبسترا توسط لاکاز اکسید می‌‌شود، یک الکترون از دست می‌‌دهد و معمولاً یک رادیکال آزاد تشکیل می‌‌دهد که ممکن است تحت اکسیداسیون بیشتر یا واکنش‌‌های غیرآنزیمی ازجمله هیدراتاسیون و پلیمریزاسیون قرار گیرد (3).

لاکاز از اکسیژن به‌عنوان پذیرنده الکترون، استفاده و کوئینون تولید می­کند و به این دلیل جزء خانواده فنل اکسیداز است (4). این آنزیم طیف وسیعی از سوبستراهای آلی شامل مونو، دی و پلی‌فنل­ها، آمین­های آروماتیک، اسیدهای کربوکسیلیک و نیز سوبستراهای غیرفنلی و غیرآلی را اکسید می­کند؛ البته تمایل آن به اکسید کردن پارا دی­فنل بیشتر است. این آنزیم به‌علت قدرت اکسیدکنندگی ترکیبات فنلی و غیرفنلی ترکیبات لیگنین می­تواند ترکیبات مشابه که در طبیعت بسیار سخت تجزیه­پذیر هستند را نیز تجزیه و در حذف آلاینده­ها نقش داشته باشد. لاکاز در طبیعت به‌طور وسیع پراکنده است؛ به‌طوری‌که در بسیاری از گیاهان آلی، قارچ­ها باکتری­ها و حتی در بعضی از حشرات دیده شده است (5).

یکی از کاربردهای آنزیم لاکاز استفاده از این آنزیم در تهیه هیدروژل برای استفاده در پانسمان زخم‌‌های مزمن است. مواد پانسمان کیتوزان و کلاژن یا ژلاتین معمولاً به شکل هیدروژل و مطابق با مفهوم پذیرفته‌‌شده‌‌ ترمیم مرطوب زخم تولید می‌‌شوند. پایداری پانسمان در کاربرد زخم‌‌های مزمن ممکن است به‌دلیل نیاز به تعویض مکرر و کم، به خطر بیفتد؛ بنابراین، این هیدروژل‌‌ها باید دارای پایداری زیستی و استحکام مکانیکی باشند تا با ایجاد پیوند عرضی اضافی قابل دستیابی باشد (6).

برای این منظور، از اتصال‌‌دهنده‌‌های عرضی شیمیایی مختلفی استفاده شده است؛ با این حال، سمیت سلولی، آنها را برای کاربردهای زیست‌‌پزشکی نامناسب می‌‌کند (7). جست‌وجو برای عوامل پیونددهنده طبیعی و ایمن، (8) استفاده از پلی‌‌فنل‌‌های گیاهی مانند پروآنتوسیانیدین‌‌ها (9) و تانن‌‌های قابل هیدرولیز (10) را به‌دلیل سمیت سلولی پایین آن پیشنهاد می‌‌دهد (11). دربارة پلی‌فنل‌‌ها تصور می‌‌شود تثبیت ماتریس‌‌های کربوهیدرات و پروتئین به‌دلیل تعاملات فیزیکی بین این ترکیبات و بیوپلیمرها باشد. چنین رویکردهای مبتنی بر ترکیب طبیعی را می‌‌توان با استفاده از ابزارهای آنزیمی بسیار اختصاصی برای دستیابی به ژل‌‌های پایدار و پیوندیافته کووالانسی ارتقا داد. آنزیم‌‌های اکسیداتیو، مانند لاکاز، قادر به افزایش واکنش‌‌های جفت‌شدن بین و درون مولکولی در بیوپلیمرها و فنولیک‌‌های طبیعی هستند (12) و برای مثال، لاکاز (EC 1.10.3.2) ترکیبات فنلی و باقیمانده‌‌های تیروزین را در پروتئین‌‌ها به کینون‌‌های واکنش‌‌پذیر اکسید می‌‌کند که می‌‌توانند با تشکیل باز شیف با نوکلئوفیل‌‌هایی مانند گروه‌‌های آمینه از کیتوزان و ژلاتین واکنش بیشتری نشان دهند. از سوی دیگر، این ترکیبات به‌دلیل ظرفیت آنتی‌‌اکسیدانی، اثر ضدمیکروبی، ضدالتهابی و خواص بهبود زخم شناخته شده‌‌اند.

پلی‌‌فنل‌‌های دانه جارو[1] که به‌عنوان آنتی‌‌اکسیدان‌‌های قوی شناخته می‌‌شوند و دارای خواص ضدالتهابی و ضدمیکروبی هستند، می‌‌توانند در پیشگیری از آسیب‌‌های سلولی و کاهش خطر ابتلا به بیماری‌‌های مزمن نقش داشته باشند. پلی‌فنل‌‌های دانه جارو شامل اسیدهای فنولیک، فلاونوئیدها، لیگنان‌‌ها و استیلین‌‌ها می‌‌شوند.

این عصاره‌‌ها قادر به محافظت از سلول‌‌ها در برابر رادیکال‌‌های آزاد هستند که مانع از تکثیر سلول‌‌های ملانوما می‌‌شوند (13) و اثر مهاری بر آنزیم‌‌های مضر زخم‌‌های مزمن در شرایط آزمایشگاهی دارند (14) . برتری درمانی عصاره‌‌ها در مقایسه با اجزای منفرد جداشده در دوزهای معادل (15) دلیل استفاده از عصاره طبیعی به‌عنوان اتصال‌‌دهنده‌‌های عرضی به‌جای مواد فنلی منفرد بود.

هدف این مطالعه جداسازی و غربالگری سویه‌‌های مخمر تولیدکننده لاکاز و بهینه‌سازی سویه‌ برتر آنالیز آنزیم تولیدشده و استفاده از آن برای تولید پانسمان‌‌های هیدروژل برای کاربرد زخم‌‌های مزمن حاوی کیتوزان، ژلاتین و فنولیک‌‌های طبیعی است که توسط لاکاز به هم متصل می‌‌شوند تا مواد زیست‌‌فعال و زیست‌‌پایدار با خواص فیزیکومکانیکی و عملکردی قابل تنظیم به دست آید.

 مواد و روش‌‌ها

جداسازی مخمرها

مخمر‌‌های جداشده برای این مطالعه از فضولات باغ وحش اصفهان و چوب‌‌های درحال پوسیدن پارک کوه صفه اصفهان جدا شدند. نمونه‌‌ها در ظروف استریل، جمع‌‌آوری و برای پردازش بیشتر به آزمایشگاه منتقل شدند.

نمونه‌‌های حاصل از منابع جداسازی فوق به‌صورت سریالی 10 برابر با سرم فیزیولوژی رقیق شدند. سپس یک میلی‌‌لیتر از رقت‌‌های بالاتر هر نمونه به محیط کشت استریل عصاره مخمر گلوکز آگار تلقیح شد که به آن آنتی‌‌بیوتیک استرپتومایسین با غلظت 100 میلی‌‌گرم بر لیتر برای جلوگیری از آلودگی باکتریایی اضافه شده بود. پلیت‌‌های محیط کشت عصاره مخمر گلوکز آگار (گلوکز- 10، عصاره مخمر- 3، پپتون- 5 و آگار- 15 گرم بر لیتر)، تلقیح و به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد در شرایط هوازی انکوبه شدند. کلنی‌‌های نماینده رشد مخمر به‌طور تصادفی، انتخاب و 3-2 بار روی پلیت‌‌های استریل عصاره مخمر گلوکز آگار کشت داده شدند تا کلنی‌‌های خالص جدایه‌‌ها به دست آید.

غربالگری کیفی مخمر تولیدکننده لاکاز در محیط جامد

جداهای مخمر به‌‌دست‌‌آمده به‌‌صورت کیفی در محیط کشت عصاره مخمر پپتون دکستروز (YPD) آگار با ترکیبات شاخص گایاکول (w/v) 5/0 درصد، ABTS (2، 2'-آزینو-بیس(3-اتیل بنزتیازولین-6-سولفونیک اسید)، استامینوفن و کاتکول هرسه (w/v) 02/0  درصد غربالگری شدند. همه موارد به‌‌جز اسید تانیک با محیط آگار با استفاده از اتوکلاو استریل شدند. اسید تانیک به‌‌طور جداگانه در دمای 121 درجه سانتی‌‌گراد با استفاده از اتوکلاو به مدت 15 دقیقه استریل شد و قبل از افزودن به محیط آگار، 5 دقیقه اجازه خنک‌شدن یافت؛ درحالی‌که ABTS با فیلتر غشایی استریل شده بود. سویه‌‌های مخمر خالص جداشده با روش کشت نقطه‌‌ای روی محیط غربالگری لاکاز، تلقیح و به مدت 48 ساعت به‌‌صورت هوازی در دمای 30 درجه سانتی‌‌گراد انکوبه شدند. مشاهده تشکیل هاله رنگی در اطراف کلنی‌‌های مخمر، نشان‌‌دهنده تولید لاکاز است.

تولید لاکاز در محیط کشت مایع

از جدایه‌‌هایی استفاده شد که براساس پاسخ به غربالگری کیفی، بهترین پتانسیل را برای تولید لاکاز داشتند. محیط کشت، عصاره مخمر گلوکز شامل گلوکز (10)، عصاره مخمر (5)، پپتون (3) برحسب گرم بر لیتر بود. سپس با 1 میلی‌‌لیتر از کشت مخمر 48 ساعته براساس نیم مک فارلند، تلقیح و به مدت 8 روز در دمای 30 درجه سانتی‌‌گراد درون شیکر 80 دور بر دقیقه انکوبه شد. ۴۸ ساعت بعد، ۲ میلی‌‌لیتر از کشت رشدیافته در شرایط استریل، جمع‌‌آوری و با استفاده از میکروسانتریفیوژ با سرعت ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. محلول‌‌های رویی، جمع‌‌آوری و برای سنجش آنزیم استفاده شدند. این روش در این تحقیق برای تولید آنزیم در مراحل بعدی نیز دنبال شد.

 تعیین کمی فعالیت لاکاز

سنجش لاکاز با استفاده از روش اصلاح‌‌شده‌ Moncultunaroc et al. (2012) انجام شد. این روش شامل اندازه‌‌گیری اسپکتروفتومتری اکسیداسیونABTS ، در دمای 30 درجه سانتی‌گراد بود. مخلوط واکنش شامل 280 میکرولیتر عصاره آنزیمی، 180 میکرولیتر بافر استات سدیم با pH 5.0 (1/0 مولار) و 60 میکرولیتر محلول ABTS (1 میلی‌‌مولار) بود. واکنش با استفاده از 20 میکرولیتر اسید تری‌‌کلرواستیک ۵ درصد پس از 10 دقیقه متوقف شد. در هر سنجش (به‌جز مواردی که ذکر شده باشد)، نمونه شاهد شامل تمام اجزای مخلوط واکنش به‌جز عصاره آنزیمی بود که با حجم مربوطه آب مقطر استریل جایگزین شد. اکسیداسیون از طریق افزایش جذب در طول موج 420 نانومتر در مقایسه با لاکاز استاندارد (IU/mL 50) با استفاده از اسپکتروفتومتر  UV/VISدنبال شد. یک واحد فعالیت آنزیم به‌عنوان مقدار آنزیم اکسیدکننده یک میلی‌مول ABTS در دقیقه تعریف شد.

رسم منحنی رشد و تولید لاکاز توسط سویه برتر

از بهترین جدایه‌ای استفاده شد که براساس پاسخ به غربالگری کمی و کیفی، بهترین پتانسیل را برای تولید لاکاز داشت. محیط کشت عصاره مخمر گلوکز استفاده‌شده قرار گرفت و سپس با 1 میلی‌‌لیتر از کشت مخمر 48 ساعته براساس نیم مک فارلند، تلقیح و به مدت 8 روز در دمای 30 درجه سانتی‌‌گراد درون شیکر 80 دور بر دقیقه انکوبه شد. هر ۴۸ ساعت، ۲ میلی‌‌لیتر از کشت رشدیافته در شرایط استریل، جمع‌‌آوری و میزان رشد و تولید آنزیم لاکاز آن اندازه‌‌گیری شد.

تولید آنزیم لاکاز در شرایط محیطی مختلف

اثر منبع کربن: منابع کربن مختلف (گلوکز و ساکارز) و محصولات کشاورزی مانند تخم جارو، ملاس، برگ زنبق، چای سبز، کاکائو و آب پنیر با غلظت 1 درصد (وزنی / حجمی) به محیط کشت عصاره مخمر پپتون اضافه شدند. محیط کشت، استریل و با 1 میلی‌‌لیتر از کشت مخمر 48 ساعته براساس نیم مک فارلند تلقیح شد. پس از 72 ساعت میزان لاکاز تولیدشده در هر کدام از محیط‌‌ها اندازه‌‌گیری شد.

اثر منبع نیتروژن: محیط کشت پایه حاوی گلوکز و عصاره مخمر استفاده شد. منابع مختلف نیتروژن شامل پپتون، عصاره مخمر، سولفات آمونیوم، نیترات سدیم و نیترات پتاسیم به‌صورت جداگانه با غلظت 1/0 درصد (وزنی / حجمی) به‌عنوان تنها منبع نیتروژن به محیط کشت پایه، اضافه و استریل و با 1 میلی‌‌لیتر از کشت مخمر 48 ساعته تلقیح شدند. پس از 72 ساعت میزان لاکاز تولیدشده در هر کدام از محیط‌‌ها سنجش شد.

تأثیر دما: تأثیر دماهای مختلف انکوباسیون (25، 30، 35 و 37 درجه سانتی‌گراد) بر تولید لاکاز در یک محیط کشت استریل با ترکیب ذکرشده در بالا انجام شد. محیط کشت با 1 میلی‌‌لیتر از کشت مخمر 48 ساعته، تلقیح و در دماهای فوق انکوبه شد. پس از 72 ساعت میزان لاکاز تولیدشده در هر کدام از محیط‌‌ها اندازه‌‌گیری شد.

 خالص‌‌سازی نسبی (تغلیظ) آنزیم لاکاز

خالص‌‌سازی نسبی آنزیم لاکاز طبق روش دینگ و همکاران (2012) انجام شد (16). لاکاز خام با استفاده از روش رسوب با سولفات آمونیوم تغلیظ شد که در آن از نمک سولفات آمونیوم برای حذف پروتئین‌‌های هیبریدی از محیط تخمیر در سطح اشباع 60 درصد استفاده شد. سپس رسوب با سانتریفیوژ با سرعت 5000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه به دست آمد. سپس رسوب پروتئینی دیالیز شد تا سولفات آمونیوم و سایر مواد غیرآنزیمی حذف شوند. رسوب به داخل کیسه دیالیز ریخته شد، دو سر آن به خوبی محکم شد و به مدت 24 ساعت در شرایط یخچال در آب مقطر غوطه‌‌ور شد.

فعالیت آنزیم لاکاز و محتوای کل پروتئین آنزیم قبل و بعد از خالص‌‌سازی نسبی برای تعیین اثر خالص‌‌سازی آنزیم انجام شد. همچنین، محتوای کل پروتئین با استفاده از روش برادفورد و در مقایسه با نمودار استاندارد با غلظت‌‌های متفاوت آلبومین سرم گاوی (BSA) انجام شد.

توصیف مولکولی جدایه‌‌ها

استخراج  DNAاز کشت‌‌های فعال درحال رشد با استفاده از روش فنل کلروفرم انجام شد. به‌عنوان بافر استخراج اضافه شد و چندین بار مخلوط شد تا امولسیون تشکیل شود. تکثیر واکنش زنجیره‌‌ای پلیمراز تکثیر ناحیه فاصله‌‌گذار رونویسی داخلی (ITS1/ITS2)  ژنوم مخمر با استفاده از آغازگر رو به جلو - ITS1 5'-CTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3' و آغازگر معکوس ITS4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3' 35  انجام شد. محصول PCR  به یک لوله جدید، منتقل و تا زمان استفاده برای تعیین توالی منجمد شد.

 تهیه هیدروژل

استخراج پلی‌‌فنل‌‌ها از دانه‌‌های جارو (Kochia scoparia) با استفاده از حلال‌‌ اتانول هم حجم محلول آبی و با استفاده از روتاری انجام شد.

محلول ژلاتین (w/v) 2 درصد در بافر ۲۵ میلی‌‌مولار بافر استات در pH  برابر 5 و دمای ۶۰ درجه سانتی‌گراد تهیه شد و کیتوزان در HCl 1 درصد حل شد تا محلول (w/v) 2 درصد به دست آید و pH با NaOH نرمال برابر 5 تنظیم شد. محلول‌‌های کیتوزان و ژلاتین به نسبت (w/w) ۲:۳ در دمای اتاق به مدت یک شب مخلوط شدند. پس از آن، 20 میلی‌‌لیتر محلول عصاره جاروی استخراج‌شده به ۷۵ میلی‌‌لیتر از مخلوط کیتوزان و ژلاتین اضافه شد که قبلاً با نسبت (w/w) ۲:۳ تهیه شده بود. واکنش اتصال عرضی با افزودن 15 میلی‌‌لیتر محلول لاکاز (10 واحد در میلی‌‌لیتر) آغاز شد و برای مدت زمان مشخصی تا ۲۴ ساعت در دمای ۴۵ درجه سانتی‌گراد تحت هم‌زدن مداوم ادامه یافت. واکنش آنزیمی با حرارت‌دادن در دمای ۱۰۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۲ دقیقه خاتمه یافت و مخلوط‌‌های حاصل تا دمای 20- درجه سانتی‌گراد سرد و خشک منجمد شدند. نمونه‌‌ها براساس زمان واکنش آنزیمی تعیین شدند. مخلوط‌‌های کنترل کیتوزان و ژلاتین و عصاره فنلی و کیتوزان و ژلاتین به تنهایی با پیروی از همان روش، اما با حذف آنزیم یا با حذف همزمان پلی‌فنل و آنزیم تهیه شدند.

 بررسی و آنالیز هیدروژل

میکروگراف‌‌های میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) از هیدروژل‌‌ها با بزرگنمایی 25× تهیه شدند.

فعالیت ضدمیکروبی هیدروژل‌‌های ساخته‌‌شده به روش آنزیمی، در برابر باکتری‌‌های استافیلوکوکوس آرئوس¹، لیستریا مونوسیتوژنز² و اشریشیا کولی³ ارزیابی شد.

نتایج

جداسازی و غربالگری کیفی مخمر تولیدکننده لاکاز

در مجموع 22 سویه مخمر تولیدکننده لاکاز از نمونه‌‌ها جدا

شد که نتیجه غربالگری کیفی تولید لاکاز 22 مخمر جداشده از منابع نمونه مختلف، در محیط‌‌های غربالگری حاوی کاتکول، گایاکول، استامینوفن و ABTS در جدول 1 ارائه شده‌‌اند. جدایه‌‌هایی کنار گذاشته شدند که هیچ پاسخی به سوبستراها نشان ندادند یا تنها با یک سوبسترا پاسخ ضعیفی نشان دادند. تنها جدایه F12 بیشترین پاسخ مثبت را به همه سوبستراها نشان داد.

جدول 1Error! No text of specified style in document.: غربالگری کیفی پلیت تولید آنزیم لاکاز توسط جدایه‌‌های مخمر در محیط کشت عصاره مخمر پپتون دکستروز (YPD) آگار حاوی شاخص‌‌های غربالگری مختلف براساس ایجاد کلنی قهوه‌‌ای

Table 1: Qualitative plate screening of laccase enzyme production by yeast isolates on yeast extract peptone dextrose (YPD) agar containing different screening indices based on brown colony formation[2] [3][4]

غربالگری کمی جدایه‌‌های مخمر تولیدکننده لاکاز

نتیجه غربالگری کمی جدایه‌‌های مخمر در شکل 1 نشان داده شده است. فعالیت کمی لاکاز با استفاده از 1 میلی‌‌مولار ABTS (2، 2'-آزینو-بیس (3-اتیل بنزتیازولین-6-سولفونیک اسید) نشان داد جدایه مخمر F12 و F14 بالاترین فعالیت IU/mL 6/50 واحد در لیتر و پس از آن جدایه مخمر F11 (IU/mL 9/47) را داشت. کمترین فعالیت مربوط به جدایه F1 با مقدار IU/mL 24 بود.

از نتایج غربالگری کیفی و کمی، جدایه F12 که دارای رشد و فعالیت لاکاز بالاتری بود، به‌عنوان جدایه برتر برای مطالعات بیشتر انتخاب شد؛ F12 از فضولات باغ وحش جدا شده بود.

شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی مخمر برتر تولیدکننده لاکاز

جدایه F12 براساس ویژگی‌‌های مورفولوژیکی، میکروسکوپی و فیزیولوژیکی شناسایی شد.

همان‌‌طور که در شکل 2 نشان داده شده است، مورفولوژی کلنی جدایه F12 روی محیط کشت PDA کرمی و برجسته بود. همچنین شکل میکروسکوپی جدایه را می‌‌توان در این شکل مشاهده کرد.

شکل 1: نمودار کمی رشد و فعالیت کمی آنزیم لاکاز مخمرهای جداشده

Figure 1: Quantitative graph of growth and quantitative activity of laccase enzyme of isolated yeasts

الگوی تخمیر قند جدایه F12 نشان داد این مخمر قادر به تخمیر قندهای سوربیتول، مالتوز، مانیتول، ترهالوز، گلوکز، گالاکتوز است و قادر به تخمیر قند گزیلوز نیست.

 براساس جست‌وجوی BLAST در توالی کامل ناحیه ITS سویه مخمر استفاده‌شده برای سویه F12، بیشترین شباهت را با سویه ASAA1404 Rhodotorula mucilaginosa و به میزان 90 درصد داشت. توالی‌‌ جدایه مخمر در پایگاه داده GenBank ذخیره و با شماره‌‌ دسترسی  SUB15519713 تعیین شدند. شکل‌‌ 3 درخت فیلوژنتیکی سویه برتر را نشان می‌‌دهد.

شکل2: الف) کلنی جدایه F12 روی محیط کشت PDA. ب) مرفولوژی جدایه F12 با رنگ‌آمیزی گرم با میکروسکوپ نوری.

Figure 2: A) Colony of isolate F12 on PDA medium. B) Morphology of isolate F12 with Gram staining under light microscope.

شکل‌‌ 3: درخت فیلوژنتیکی سویه رودوتورولا موسیلاژینوزا ASAA1404.

Figure 3: Phylogenetic tree of Rhodotorula mucilaginosa strain ASAA1404.

بهینه‌‌سازی تولید آنزیم لاکاز در شرایط محیطی مختلف

همان‌طور که در شکل 4 نشان داده شده است، رشد و فعالیت آنزیم تولیدکننده لاکاز تا 216 ساعت دنبال شده است. همبستگی بین منحنی رشد و تولید آنزیم لاکاز نشان داد حداکثر میزان تولید آنزیم لاکاز در زمان مرحله‌ لگاریتمی و مرحله سکون بوده است.

تأثیر منابع کربن مختلف بر فعالیت لاکاز توسط جدایه‌‌های مخمر (شکل 5) نشان داد بالاترین فعالیت توسط جدایه مخمر رودوترولا موسیلاژینوزا ASAA1404 در زمان انکوباسیون 192 ساعت برای گلوکز ثبت شد. بالاترین فعالیت لاکاز (34/50 واحد در میلی‌‌لیتر) را در گلوکز داشت و کمترین فعالیت در ساکارز (20 واحد در میلی‌‌لیتر) بود.

شکل 4: ارتباط بین منحنی رشد و میزان فعالیت آنزیم لاکاز تولیدشده در مایع رویی محیط کشت توسط سویه رودوتورولا موسیلاژینوزا ASAA1404.

Figure 4: Relationship between the growth curve and the amount of laccase enzyme activity produced in the supernatant of the culture medium by the Rhodotorula mucilaginosa strain ASAA1404.

شکل 5: تأثیر منابع کربن مختلف بر فعالیت آنزیم لاکاز توسط سویه رودوتورولا موسیلاژینوزا ASAA1404.

Figure 5: Effect of different carbon sources on laccase enzyme activity by Rhodotorula mucilaginosa ASAA1404.

تأثیر منابع مختلف نیتروژن (اعم از آلی و معدنی) بر فعالیت لاکاز توسط رودوتورولا موسیلاژینوزا ASAA1404 (شکل 6) نشان داد حداکثر فعالیت را در عصاره مخمر (18/50 واحد در میلی‌‌لیتر) و کمترین فعالیت را در آمونیوم کلراید (19 واحد در میلی‌‌لیتر) داشت.

تأثیر دمای مختلف انکوباسیون بر فعالیت لاکاز جدایه‌‌ها نشان داد رودوتورولا موسیلاژینوزا ASAA1404 بالاترین فعالیت لاکاز را در دمای 30 درجه سانتی‌گراد (02/60 واحد در میلی‌‌لیتر) و کمترین فعالیت را در دمای 50 درجه سانتی‌گراد (98/9 واحد در میلی‌‌لیتر) داشت.  

شکل 6: تأثیر منابع مختلف نیتروژن بر فعالیت لاکاز. توسط سویه رودوتورولا موسیلاژینوزا ASAA1404.

Figure 5: Effect of different carbon sources on laccase enzyme activity by Rhodotorula mucilaginosa ASAA1404.

شکل 7: تأثیر دماهای مختلف انکوباسیون بر فعالیت لاکاز توسط سویه رودوتورولا موسیلاژینوزا ASAA1404.

Figure 7: Effect of different incubation temperatures on laccase activity by Rhodotorula mucilaginosa ASAA1404.

تمامی آزمایشات به‌صورت مستقل سه بار تکرار شد. داده­ها به‌صورت میانگیـن ± انحـراف معیار بیان شده‌اند. در مقایسـه آزمـایش­هـا از t-student با اسـتفاده از نرم‌افزار IBM SPSS Statistics 25 مطالعه شد.

نتایج خالص‌سازی نسبی (تغلیظ) آنزیم لاکاز تولیدشده

محتوای پروتئین کل در هر مرحله خالص‌‌سازی از 452/0 میلی‌‌گرم بر میلی‌‌لیتر به 160/0 میلی‌‌گرم بر میلی‌‌لیتر کاهش یافت که متعاقباً فعالیت ویژه آنزیم را از 52 واحد بر میلی‌‌لیتر به 400 واحد بر میلی‌‌لیتر افزایش داد.

بررسی خصوصیات هیدروژل

تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) از هیدروژل‌‌های کیتوزان و ژلاتین با تخم جارو لئوفیلیزه‌شده، ساختارهای متخلخلی را با اندازه و شکل منافذ متفاوت، با توجه به چگالی پیوندهای عرضی (زمان واکنش آنزیمی) نشان دادند (شکل 8).

شکل 8: الف) تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) از هیدروژل‌‌های کیتوزان و ژلاتین با تخم جارو. ب) مورفولوژی هیدروژل تولید شده.

Figure 8: a) Scanning electron microscope (SEM) images of chitosan and gelatin hydrogels with broomrape. b) Morphology of the produced hydrogel.

 بررسی فعالیت آنزیم قبل از تثبیت (400 واحد بر میلی‌‌لیتر) و بعد از تثبیت در هیدروژل کیتوزان و ژلاتین (280واحد بر میلی‌‌لیتر) نشان داد فعالیت آنزیم در حین تثبیت کاهش می‌‌یابد.

خاصیت ضدمیکروبی هیدروژل

فعالیت ضدمیکروبی هیدروژل‌‌های ساخته‌‌شده به روش آنزیمی در برابر باکتری‌‌های گرم مثبت S. aureus و L. monocytogenes و گرم منفی E. coli در جدول 2 آورده شده است. هیدروژل‌‌ها پس از 24 ساعت انکوباسیون، رشد هر سه سویه را مهار کردند. همان‌گونه که در شکل 9 مشاهده می‌‌شود عصاره جارو اثر ضدمیکروبی بر سویه‌های گرم مثبت و گرم منفی دارد؛ اما وقتی درون هیدروژل بدون آنزیم لاکاز قرار می‌‌گیرد به‌دلیل عدم اتصال‌‌های مناسب خاصیت ضدمیکروبی بسیار کاهش می‌‌یابد. آنزیم لاکاز به‌دلیل خاصیت اکسیدکنندگی که دارد باعث اتصالات جانبی و محکم بین کیتوزان و ژلاتین و پلی‌‌فنل استفاده‌شده می‌‌شود؛ بنابراین، از حذف پلی‌‌فنل در جریان تولید هیدروژل جلوگیری می‌‌کند و خاصیت ضدمیکروبی افزایش می‌‌یابد.

شکل 9: اثر ضدمیکروبی عصاره تخم جارو به تنهایی بر باکتری‌‌های گرم مثبت و گرم منفی، الف) استافیلوکوکوس آرئوس و ب) اشریشیا کولی

Figure 9: Antimicrobial effect of broomrape seed extract alone on Gram-positive and Gram-negative bacteria: a) Staphylococcus aureus and b) Escherichia coli.

جدول 2: فعالیت ضدمیکروبی هیدروژل‌‌های ساخته‌‌شده بدون آنزیم لاکاز و پس از افزودن آنزیم لاکاز (افزودن آنزیم مانع از حذف پلی‌‌فنل در مراحل تولید هیدروژل می‌‌شود)

Table 2: Antimicrobial activity of hydrogels made without laccase enzyme and after adding laccase enzyme. (Adding the enzyme prevents the removal of polyphenols during hydrogel production)

بحث و نتیجه‌‌گیری

جدایه‌‌های مخمر با بهترین پتانسیل لاکاز در این کار از فضولات باغ وحش جدا شدند. مخمرها در پاسخ خود به چندین ترکیب شاخص، تنوع نشان دادند که مطابق با گزارش بالداریان 2004 بود (16) که این را می‌‌توان به تمایل آنزیم به گروه‌‌های مختلف سوبستراها (ارتو و پارا-دی‌‌فنول‌‌ها) نسبت داد. تشکیل رنگ قهوه‌‌ای تیره میکروب‌‌های مثبت به‌دلیل محصول واکنش‌‌پذیر کینون تولیدشده در طول واکنش بوده است که اغلب به‌طور خودبه‌خود پلیمریزه می‌شوند و رنگدانه‌‌های ملانوئیدی قهوه‌‌ای تیره یا سیاه را تشکیل می‌‌دهند (17).

در این پژوهش، امکان تولید آنزیم لاکاز از مخمر به‌‌عنوان یک منبع زیستی مقرون‌‌به‌‌صرفه و کارآمد بررسی و بهینه‌‌سازی شد. نتایج غربالگری اولیه نشان دادند سویه‌‌های مخمری منتخب قادر به تولید لاکاز با سطح قابل توجهی از فعالیت آنزیمی هستند. این یافته با مطالعات پیشین هم‌راستا است که مخمرهایی نظیر یاروویا لیپولیتیکا[5] و پیچیا پاستوریس[6] را به‌‌عنوان تولیدکنندگان بالقوه لاکاز معرفی کرده‌‌اند (18).

عصاره چای سبز و عصاره تخم جارو بعد از گلوکز به‌عنوان بهترین سوبسترا برای تولید لاکاز شناخته شدند. در گزارشی از Wakil et al. (2016) سبوس برنج و باگاس نیشکر بهترین سوبسترا برای مخمر کلویورومایسس .Dw1[7] شناخته شده‌اند (18). به‌طور کلی گزارش‌‌ها نشان داده‌‌اند بیشتر این ضایعات به‌دلیل ترکیبات آروماتیک یا فنلی محلول در آب فعالیت لاکاز را افزایش می‌‌دهند (19).

عصاره مخمر و سولفات آمونیوم بهترین منبع نیتروژن برای تولید لاکاز شناخته شد. در گزارشی نیتروژن معدنی نیترات سدیم بهترین منبع نیتروژن برای تولید لاکاز شناخته شده است (20). این با گزارشی مبنی بر اینکه یک منبع نیتروژن معدنی، نیترات آمونیوم، تولید بالای لاکاز را در قارچ‌‌های پوسیدگی سفید افزایش می‌‌دهد، مطابقت دارد (21). علاوه بر این، بهترین فعالیت لاکاز را توسط پلئوروتوس اوستراتوس[8] با سولفات آمونیوم به‌عنوان منبع نیتروژن نشان دادند (22).

تأثیر دماهای مختلف انکوباسیون در این مطالعه نشان داد دمای 25 تا 30 درجه سانتی‌گراد بهترین دما برای تولید لاکاز است. همچنین در گزارشی آمده است با افزایش دمای انکوباسیون بالاتر از 30 درجه سانتی‌گراد برای مخمر کلویورومایسس .Dw1 و 25 درجه سانتی‌گراد برای پیچیا .Dw2، کاهش تدریجی در تولید لاکاز مشاهده شد (18). گزارش‌‌های مشابهی ارائه شده است که دمای بهینه برای تولید لاکاز در ماراسمیوس[9]، دمای 31 درجه سانتی‌گراد (21) و 25 درجه سانتی‌گراد دمای بهینه برای تولید لاکاز در قارچ خوراکی شیزوفیلوم کامیون[10] (23) و پلئوروتوس اوستراتوس بود (24) که با گزارش ما مطابقت دارد. کاهش در دمای بالا می‌‌تواند به‌دلیل تغییر ترکیب غشای سلولی و تحریک کاتابولیسم پروتئین باشد.

بهینه‌‌سازی شرایط کشت منجر به افزایش معنی‌‌دار در بازده تولید لاکاز (فعالیت از 25 به 60 واحد در میلی‌‌لیتر) شد. عوامل کلیدی ازجمله نوع و غلظت منابع کربن و نیتروژن و دمای انکوباسیون به‌‌عنوان پارامترهای مؤثر شناسایی شدند. شرایط بهینه موجب افزایش حدود 2 تا 3 برابری فعالیت آنزیم نسبت به شرایط کنترل شدند که نشان‌‌دهنده تأثیر مستقیم این عوامل بر بیان آنزیم و پایداری آن در محیط است.

در بخش دوم مطالعه، لاکاز تولیدشده به‌‌عنوان عامل زیست‌‌کاتالیستی در سنتز هیدروژل به‌ کار گرفته شد. استفاده از لاکاز در واکنش اتصال متقاطع[11] پلیمرهایی مانند پلی‌‌وینیل الکل یا پلی‌‌ساکاریدهای مشتق‌‌شده، منجر به تشکیل شبکه‌‌های سه‌‌بعدی پایدار و یکنواخت می‌‌شود. بررسی ویژگی‌‌های فیزیکوشیمیایی هیدروژل‌‌ها ازجمله درجه تورم، پایداری مکانیکی، زیست‌‌سازگاری سلولی و قابلیت رهایش کنترل‌‌شده، نشان داد محصول نهایی از کیفیت مطلوبی برخوردار است و توانایی استفاده در سامانه‌‌های دارورسانی یا مهندسی بافت را دارد.

انواع مختلف زخم‌‌های مزمن منشأ یا علت مشترکی ندارند؛ با این حال، آنها دارای عفونت باکتریایی و غلظت‌‌های بالای متالوپروتئازهای ماتریکس (MMPs)، میلوپراکسیداز (MPO) و گونه‌‌های اکسیداتیو واکنشی هستند که باعث تخریب بیش‌ازحد ماتریکس خارج سلولی (ECM) و فاکتورهای رشد می‌‌شوند. در زخم‌‌های درحال بهبود، متالوپروتئازهای ماتریکس‌‌ها توسط مهارکننده‌‌های طبیعی خود خنثی می‌‌شوند (25)؛ درحالی‌که در زخم‌‌های مزمن، نسبت پروتئازها / مهارکننده‌‌ها مختل می‌‌شود و بیشتر این آنزیم‌‌ها مهار نمی‌‌شوند. عدم تعادل پروتئاز-آنتی‌‌پروتئاز توسط اسید هیپوکلرو (HOCl) تولیدشده توسط میلوپراکسیداز بیشتر تشدید می‌‌شود که از یک طرف مهارکننده‌‌های پروتئاز را غیرفعال می‌‌کند و از طرف دیگر فعالیت متالوپروتئازهای ماتریکس نهفته را تحریک می‌‌کند. علاوه بر این، بیشتر زخم‌‌های مزمن با چندین گونه باکتریایی، مانند استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا کلونیزه می‌‌شوند (26).

بنابراین، برای تحریک ترمیم زخم، یک ماده پانسمان باید همزمان هم آنزیم‌‌های پروتئولیتیک و اکسیداتیو را در محل زخم کنترل کند و هم محیطی عاری از میکروارگانیسم فراهم کند و همچنین رطوبت بافت را در حین جذب ترشحات اضافی حفظ کند. بیوپلیمرهایی با خواص ذاتی ضدمیکروبی یا بهبوددهنده التیام، مانند کیتوزان و کلاژن / ژلاتین، برای درمان زخم پیشنهاد شده‌‌اند و اگرچه بسیاری از آنها در بازار موجود هستند (8)، تنها تعداد کمی از آنها به‌عنوان پانسمان زخم‌‌های مزمن تجاری شده‌‌اند. کیتوزان‌‌های با منشأ حیوانی و قارچی، خطی و تا حدی استیله (۱→۴)-۲-دئوکسی-دی-گلوکان با خواص ذاتی ضدمیکروبی هستند (27). از سوی دیگر، ژلاتین (کلاژن دناتوره‌شده) علاوه بر تضمین چسبندگی و رشد سلول (28)، می‌‌تواند به‌عنوان یک سوبسترای رقیب برای چندین پروتئاز موجود در محل زخم عمل کند و در نتیجه آنها را از هضم ماتریکس خارج سلولی منحرف کند.

عصاره پلی‌‌فنلی تخم جارو[12] در یک فرایند یک مرحله‌‌ای در شرایط واکنش ملایم توسط لاکاز اکسید می‌‌شود تا کیتوزان و ژلاتین به‌صورت کووالانسی به هم متصل شوند. در نظر گرفته شده است که پلی‌‌فنل‌‌ها نقش دوگانه‌‌ای در هیدروژل ایفا می‌‌کنند؛ هم به‌صورت «غیرفعال» - به‌عنوان یک عنصر ساختاری و هم به‌صورت «فعال» - با کاهش فعالیت‌‌های مضر متالوپروتئازهای ماتریکس، میلوپراکسیداز و گونه‌‌های اکسیداتیو عفونت باکتریایی، محیط زخم مزمن را اصلاح می‌‌کنند و هم خاصیت ضدباکتریایی دارند.

پیوند هیدروژنی و برهمکنش‌‌های یونی - آبگریز بین عصاره فنلی و بیوپلیمرها منجر به ساختار ورقه‌‌ای شکل بدون پیوندهای عرضی می‌‌شود (9, 29)؛ اما همان‌طور که در نتایج مشاهده شد، هیدروژل‌‌های پیوند عرضی‌‌شده آنزیمی، ساختاری متخلخل با افزایش اندازه منافذ به‌عنوان تابعی از میزان پیوندهای عرضی نشان دادند که در سیستم‌‌های بیوپلیمری پیوند عرضی مشابه نیز مشاهده می‌‌شود (6).

تحمل باکتری‌‌ها برای پلی‌‌فنول‌‌ها به گونه باکتری و ساختار مولکولی پلی‌‌فنل‌‌ها بستگی دارد. عصاره تخم جارو غنی از اپی‌‌کاتچین‌‌ها (EC) است که دارای فعالیت ضدمیکروبی علیه استافیلوکوکوس آرئوس است (29) و از طریق اختلال در غشای سلولی، فعالیت ضدمیکروبی علیه سودوموناس آئروژینوزا اعمال می‌‌کنند (30). از سوی دیگر، پیوند هیدروژنی و برهمکنش‌‌های یونی - آبگریز بین عصاره فنلی و بیوپلیمرها توسط آنزیم لاکاز خواص ضدباکتریایی ذاتی کیتوزان توسط فعل و انفعالات بین گروه‌‌های آمین کاتیونی آن و غشاهای سلولی میکروبی با بار منفی را افزایش می‌‌دهد که منجر به تغییر نفوذپذیری دیواره غشا می‌‌شود. گزارش شده است این مکانیسم برای همه سویه‌‌ها رایج است؛ اگرچه در غشای سلولی استافیلوکوکوس آرئوس کارآمدتر است (31).

مقایسه نتایج این پژوهش با مطالعات مشابه حاکی از آن است که استفاده از لاکاز مخمری به‌‌جای لاکاز قارچ‌‌های کپکی می‌‌تواند از نظر هزینه تولید، زمان رشد و ایمنی بیولوژیکی مزیت‌‌هایی به همراه داشته باشد (32). علاوه بر این، فرایندهای زیست‌‌کاتالیتیکی مبتنی بر لاکاز نیاز به شرایط سخت واکنشی را کاهش می‌دهد و رویکردی سبز و پایدار در سنتز مواد زیستی ارائه می‌‌دهند؛ با این حال، هنوز چالش‌‌هایی نظیر خالص‌‌سازی کامل آنزیم، پایداری بلندمدت هیدروژل در محیط فیزیولوژیک و بررسی سمیت در مدل‌‌های درون‌‌تنی وجود دارد که نیازمند تحقیقات گسترده‌‌تر و توسعه در مقیاس نیمه‌‌صنعتی و صنعتی هستند. همچنین، مهندسی سویه‌‌های مخمری از طریق روش‌‌های مولکولی می‌‌تواند به بهبود بیان ژن لاکاز و افزایش فعالیت آنزیمی منجر شود (33).

نتایج حاصل از این مطالعه نشان دادند مخمر استفاده‌شده قابلیت بالایی در تولید آنزیم لاکاز دارد؛ به‌‌ویژه پس از بهینه‌‌سازی شرایط کشت، پارامترهایی مانند دما، منبع کربن و نیتروژن تأثیر معناداری بر تولید آنزیم داشتند که با مطالعات پیشین روی قارچ‌‌ها و باکتری‌‌ها هم‌‌خوانی دارد؛ اما استفاده از مخمر به‌‌عنوان منبع تولید لاکاز، مزایایی همچون سرعت رشد بالا، ایمنی زیستی و هزینه پایین‌‌تر تولید را به همراه دارد. استفاده از این آنزیم در ساخت هیدروژل‌‌های زیست‌‌سازگار، گامی نوآورانه در جهت توسعه سامانه‌‌های نوین دارورسانی، ترمیم بافت و تصفیه زیستی محسوب می‌‌شود. ترکیب لاکاز با ساختارهای پلیمری در فرایند سنتز هیدروژل، موجب ایجاد شبکه‌‌های سه‌‌بعدی با خواص مکانیکی و زیستی قابل کنترل شد. این هیدروژل‌‌ها از نظر زیست‌‌سازگاری، تورم و پایداری ساختاری، عملکرد مطلوبی از خود نشان می‌‌دهند و می‌‌توانند به‌‌عنوان حامل‌‌های مؤثر در کاربردهای پزشکی و محیط زیستی به کار روند. نتایج این پژوهش نه‌تنها کاربرد صنعتی لاکازهای تولیدشده از مخمر را برجسته می‌‌کند، بلکه افق‌‌های تازه‌‌ای برای بهره‌‌برداری از منابع میکروبی ارزان‌‌قیمت در زیست‌‌فناوری باز می‌‌گشاید؛ با این حال، انجام مطالعات بیشتر در زمینه خالص‌‌سازی، مهندسی آنزیمی و بررسی عملکرد در مقیاس نیمه‌‌صنعتی می‌‌تواند مسیر تجاری‌‌سازی این دستاورد را هموارتر کند.

تشکر و قدردانی

این مقاله حاصل طرح تحقیقاتی با عنوان تأثیر لاکاز قارچی بر خنثی‌کردن آنتی­بیوتیک رهاشده در محیط و بررسی اثر این فرایند بر سلول های انسانی مصوب صندوق حمایت از پژوهشگران و فناوران کشور با کد 4003367 است که با حمایت دانشگاه اصفهان اجرا شده است.

 ملاحظات اخلاقی

 نویسندگان این مقاله پژوهشی تمام نکات اخلاقی اعم از سرقت ادبی، عدم انتشار دوگانه و تحریف داده‌‌ها را رعایت کرده‌‌اند.

[1] Broom seeds) Kochia scoparia(

[2] S. aureus

[3] L.monocytogenes

[4] E. coli

[5] Yarrowia lipolytica

[6] Pichia pastoris

[7] Kluyveromyces sp.Dw1

[8]Pleurotus . ostreatus HAI 493

[9] Marasmius sp.

[10] Schizophyllum commune

[11] crosslinking

[12] Kochia scoparia