شناسایی سودوموناس‌های عامل لکه‌برگی و بلایت باکتریایی برخی گونه‌های گیاهان زینتی خانواده آراسه

مقدمه

خانواده آراسه[1] با بیش از 3700 گونه و 144 جنس، یکی از گروه­های مهم گیاهی جهان محسوب می­شود. این خانواده علاوه بر نقش اکولوژیکی در اکوسیستم‌های طبیعی، ارزش اقتصادی و زینتی بالایی دارد. بسیاری از گونه‌های این خانواده به‌عنوان گیاهان شاخص در فضای سبز و محیط­های آپارتمانی نگهداری می‌شوند. از گونه­های شناخته‌شده آن می­توان به اسپاتی­فیلوم (Spathiphyllum wallisii)، برگ انجیری (Monstera deliciosa)، زاموفیلیوم (Zamioculcas zamiifolia)، آگلونما ((Aglaonema treubii، پتوس (Epipremnum aureum)، فیلودندرون (Philodendron sp.)، سینگونیوم (Syngonium podophyllum) و آنتوریوم (Anthurium scherzerianum) اشاره کرد (1-3).

اهمیت اقتصادی خانوادة آراسه در کشورهای تولیدکنندة عمده گل و گیاهان زینتی، ازجمله ایران، بیش از پیش آشکار شده است. براساس آمارنامه رسمی وزارت جهاد کشاورزی (۱۴۰۱)، سطح زیرکشت گل و گیاهان زینتی در کشور بالغ بر ۷۸۰۰ هکتار (ترکیبی از گلخانه و فضای باز) است (4). آمارهای تولید نشان می‌دهند ظرفیت سالانه کشور بیش از ۴ میلیارد شاخه گل بریده و ۱۲۰ میلیون گلدان گل زینتی است که ایران را در جایگاه پنجم تولیدکنندگان آسیایی این محصولات قرار داده است. استان‌های تهران، مرکزی، مازندران و اصفهان به‌دلیل شرایط اقلیمی مساعد، قطب‌های اصلی تولید این محصولات به شمار می‌آیند. این جایگاه اقتصادی برجسته، ضرورت مدیریت مؤثر عوامل خسارت‌زا در گیاهان زینتی را بیش‌ازپیش نمایان می‌کند.

در میان عوامل بیماری­زا، باکتری­های جنس Pseudomonas به­عنوان یکی از تهدیدهای اصلی شناخته می­شوند. این جنس بیش از ۱۴0 گونه شناسایی‌شده دارد که قادر به ایجاد بیماری­هایی همچون لکه­برگی، سوختگی و پوسیدگی در گیاهان مختلف هستند (5). در خانواده آراسه، گونه­هایی نظیر Pseudomonas cichorii ، P. marginalis و P. aeruginosa به‌عنوان عوامل ایجادکننده لکه­برگی و بلایت در جنس­های دیفن­باخیا (Dieffenbachia sp.) و گل شیپوری (Zantedeschia sp.) گزارش شده­اند (6-10). این بیماری­ها معمولاً به‌صورت لکه­های نکروتیک روی برگ­ها ظاهر می‌شوند، فتوسنتز را کاهش می­دهند و در صورت فراهم‌بودن شرایط، می­توانند کل گیاه را از بین ببرند (11).

با وجود شناسایی و گزارش برخی عوامل بیماری‌زا، اطلاعات مربوط به تنوع، پراکنش جغرافیایی و ویژگی‌های فنوتیپی و ژنتیکی گونه‌های بیماری‌زای Pseudomonas در گیاهان زینتی خانواده آراسه در ایران محدود است. این کمبود داده‌ها مانع توسعه روش‌های تشخیص سریع، اعمال تدابیر قرنطینه داخلی و بین‌المللی و اصلاح ارقام مقاوم می‌شود؛ بنابراین، شناسایی و بررسی دقیق این عوامل بیماری‌زا گامی ضروری در جهت حفاظت از صنعت گل و گیاهان زینتی کشور محسوب می‌شود.

مواد و روش ­ها

جمع­آوری نمونه­ ها

در بازه زمانی سال­ ۱۳۹۹-۱۴۰۰، نمونه­های دارای علائم لکه­برگی و بلایت از گلخانه­ها و مراکز پرورش و فروش گیاهان زینتی از استان­های همدان (ملایر، همدان)، مرکزی (محلات)، خوزستان (دزفول، اهواز)، تهران (پاکدشت)، گلستان (گرگان)، سمنان (شاهرود) و یزد (بهاباد) جمع­آوری شدند. گیاهان بررسی‌شده شامل گونه­های اسپاتی­فیلوم (Spathiphyllum wallisii)، باباآدم (Alocasia sanderiana)، آنتوریوم (Anthurium scherzerianum)، پتوس Epipremnum aureum))، آگلونما (Aglaonema treubii)، برگ انجیری (Monstera deliciosa)، سینگونیوم (Syngonium podophyllum)، دیفن باخیا (Diffenbachia amoena)، فیلودندرون (Philodendron sp.) و زاموفیلیا zamiifolia) Zamioculcas ) بودند؛ در نهایت، 20 نمونه از مناطق مختلف جمع­آوری شد.

برای هر نمونه، برگه‌ای حاوی اطلاعات کامل شامل کد نمونه، تاریخ و مختصات جغرافیایی محل جمع‌آوری، گونه گیاه میزبان و بخش آلوده گیاه تهیه شد. برگ‌های آلوده به‌صورت مجزا در کیسه‌های کاغذی قرار داده و تا زمان انتقال به آزمایشگاه، در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند.

 جداسازی و خالص­ سازی

به‌منظور جداسازی باکتری­های بیماری­زا، برگ­های گیاهان آلوده خانواده آراسه با آب جاری، شسته و سپس در شرایط استریل خشک شدند. قطعات 5 سانتی­متری از مرز بافت سالم و آلوده، جدا و ضدعفونی سطحی با غوطه­وری در هیپوکلریت سدیم 1 درصد (به مدت ۳۰ ثانیه) انجام شد. سپس سه مرتبه با آب مقطر استریل شسته شدند. سوسپانسیون باکتریایی با قراردادن قطعات در آب مقطر استریل به مدت ۲۰ دقیقه و ورتکس‌کردن آنها تهیه شد. سپس ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون روی محیط کشت آگار غذایی (NA)، پخش و در دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد به مدت ۴۸ ساعت انکوبه شد.

پرگنه­های با مورفولوژی متفاوت، خالص­سازی و روی محیط کینگ بی (King’s B agar) کشت شدند. جدایه­های دارای فلورسانس زیر نور فرابنفش به‌عنوان کاندیدای سودوموناس، انتخاب و برای تأیید نهایی در مطالعات بعدی استفاده شدند.

 آزمون واکنش فوق حساسیت (Hypersensitive response)

آزمون HR روی برگ­های گیاهان مدل، شمعدانی (Pelargonium zonale) و توتون (Nicotiana tabacum) مطابق روش Klement et al (1964) انجام شد (12). سوسپانسیون باکتریایی با غلظت CFU/mL ۱۰^۸ از کشت ۲۴ ساعته در محیط NA، تهیه و به فضای بین سلولی برگ­های کاملاً توسعه‌یافته با سرنگ انسولین تزریق شد. ظهور نکروز موضعی در محل تزریق پس از 24-48 ساعت به‌عنوان پاسخ مثبت در نظر گرفته شد.

 آزمون بیماری­زایی

برای ارزیابی بیماری­زایی جدایه­های باکتریایی، گیاهان سالم از گونه­های میزبان در شرایط یکنواخت رشد (بستر پیت: پرلیت 1:1) انتخاب شدند. سوسپانسیون باکتریایی (کشت 24 ساعته در محیط کشت LB، غلظت ≈۱۰⁸CFU/mL ) آماده شد. تزریق داخل مزوفیل برگ­های کاملاً توسعه‌یافته با سرنگ انسولین و حجم ۱۰۰ میکرولیتر در هر نقطه انجام شد (13). برای هر گیاه سه برگ و برای هر برگ دو ناحیه تلقیح شد (درمجموع ۶ نقطه). آب مقطر استریل به‌عنوان شاهد به روش مشابه تزریق شد. گلدان­ها به مدت 20 روز در اتاقک رشد با رطوبت نسبی ۸۵ درصد، دمای ۲۵±۱ سانتی‌گراد و طول روشنایی ۱۲ ساعت نگهداری شدند. برای القای رطویت اولیه، هر گیاه پس از تلقیح به مدت 48-24 ساعت با کیسه پلی‌اتیلن پوشانده شد. ظهور و پیشرفت علائم روزانه ثبت و تصویربرداری شد. برای تکمیل اصول کخ، نمونه­هایی از مرز بافت آلوده-سالم برداشته و پس از ضدعفونی سطحی با اتانول ۷۰ درصد (یک دقیقه) و شست‌وشو با آب مقطر استریل، روی محیط NA کشت داده شدند. جدایه­های بازجداسازی‌شده از نظر مورفولوژی کلنی و آزمون­های بیوشیمیایی با جدایه­های اولیه، مقایسه و همسانی آنها تأیید شد.

 بررسی ویژگی­ های فنوتیپی

گونه‌هایPseudomonas  براساس روش­های استاندارد باکتری­شناسی (14- 18) بررسی شدند. ویژگی­های ارزیابی‌شده شامل شکل کلنی، تولید رنگدانه فلورسنت روی محیط کشت کینگ بی (King’s B agar) و رنگدانه زرد روی محیط YDC[2]، آزمون حساسیت به هیدروکسید پتاسیم 3 درصد، رشد در شرایط هوازی و بی‌هوازی O/F))، رشد در غلظت‌های مختلف NaCl، تولید گاز H₂S، آزمون­های اکسیداز و کاتالاز، استفاده از سیترات، تولید اسید از سوربیتول، آرابینوز، دی‌زایلوز و مانیتول، آزمون متیل رد، هیدرولیز ژلاتین، نشاسته، آسکولین و تویین ۸۰ و ۲۰ و تولید لوان از ساکارز بودند. همچنین فعالیت پکتولیتیکی استرین­های باکتریایی روی ورقه­های سیب‌زمینی سنجش شد (12). برای هر آزمون، شاهدهایی برای مقایسه در نظر گرفته شدند.

 استخراج DNA و تکثیر قطعات ژنی

جدایه­های باکتریایی پس از ۲۴ ساعت رشد روی محیط کشت NA، در یک میلی­لیتر آب مقطر استریل سوسپانسیون شدند. استخراج DNA با روش لیز قلیایی اصلاح‌شده (19) انجام شد. به هر نمونه ۲۰ میکرولیتر پتاس ۱۰ درصد، اضافه و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای 100 درجه ­سانتی‌گراد حرارت داده شد. نمونه­ها پس از سردشدن سریع روی یخ، با سانتریفیوژ در ۱۳۰۰۰ دور بر دقیقه به مدت ۱۰ دقیقه رسوب­دهی شدند. مایع رویی حاوی DNA به لوله­های جدید، منتقل و در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. کیفیت و کمیت DNA با اندازه­گیری جذب نوری در طول موج­های ۲۶۰ و ۲۸۰ نانومتر (دستگاه نانودراپ) تعیین شد و نمونه­های با نسبتOD260/OD280  8/1 تا ۲ برای مراحل بعدی انتخاب شدند.

 تکثیر قطعات ژنومی 16S rDNA، rpoD و recA با واکنش زنجیره­ای پلیمراز

ژن­های 16S rDNA،  rpoDو recA با استفاده از آغازگرهای اختصاصی (جدول ۱) و مخلوط واکنش در حجم نهایی ۲۵ میکرولیتر تکثیر شدند. ترکیب واکنش شامل 5/12 میکرولیتر مسترمیکس x2 (شرکت آمپلیکون[3]، دانمارک)، یک میکرولیتر از هر آغازگر (۱۰ پیکومول)، یک میکرولیتر DNA الگو و 5/9 میکرولیتر آب بدون نوکلئاز بود. برنامه حرارتی در ترموسایکلر (انگلیس، مدل (Techne TC_512 به شرح زیر تنظیم شد: واسرشت­سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه، سپس 35 چرخه شامل واسرشت­سازی در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگرها برای ژن­های 16S rDNA، recA و rpoD به‌ترتیب در دمای 60، 58 و 56 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 ثانیه و گسترش در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت یک دقیقه؛ درنهایت، یک مرحله گسترش نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه انجام شد.

جدول 1- توالی آغازگرهای استفاده‌شده در این پژوهش

Table 1- PCR primer sequences used in this study

 الکتروفورز محصولات PCR و توالی­یابی

از هر محصول PCR، سه میکرولیتر در چاهک‌های ژل آگارز یک درصد (تهیه‌شده با بافر TAE) بارگذاری شد و الکتروفورز در ۸۰ ولت به مدت 60 دقیقه انجام گرفت. ژل با محلول اتیدیوم بروماید (5/0 میکروگرم بر میلی‌لیتر) به مدت 15 دقیقه، رنگ­آمیزی و با دستگاه ژل داکیومنت تصویربرداری شد (23). محصولات PCR با اندازه و شدت باند مناسب برای تعیین توالی به روش سنگر[4] به شرکت بایونیر (کره جنوبی) ارسال شد.

 رسم درخت فیلوژنتیک

توالی‌های خام دریافتی با استفاده از نرم‌افزار BioEdit 7.0  (24) ویرایش و اصلاح شدند. مقایسه میزان شباهت توالی‌ها با سویه‌های مرجع موجود در پایگاه داده از طریق ابزار BLASTn انجام گرفت. هم­ردیفی توالی­ها با بهره­گیری از الگوریتم ClustalW صورت پذیرفت. تحلیل­های فیلوژنتیکی به‌صورت جداگانه برای ژن 16s rDNA و به‌صورت ترکیبی برای ژن­های rpoD و recA در نرم‌افزار MEGA نسخه 7 انجام شد. برای رسم درخت­های فیلوژنتیک از توالی­های معتبر متعلق به ژنوم کامل باکتری‌ها استفاده شد. بهترین مدل براساس معیار اطلاعات بِیزین (BIC) انتخاب شد و درخت­ها به روش Neighber-joining با اجرای آزمون بوت استرپ با 1000 تکرار برای برآورد پایداری شاخه­ها ساخته شدند. به‌عنوان گروه خارجی[5] Pectobacterium brasiliense_Strain_TS20SJ1 از خانواده Pectobacteriaceae برای ریشه‌دارکردن درختان فیلوژنتیک استفاده شد. پس از تأیید گونه­ها با استفاده از رسم درخت فیلوژنتیک، توالی­های نهایی در پایگاه داده NCBI ثبت شدند.

  نتایج

جداسازی و شناسایی باکتری­های عامل بیماری

در این مطالعه، 20 سویه باکتریایی از گیاهان خانواده آراسه با علائم لکه­برگی و بلایت، از مناطق مختلف ایران جمع­آوری و جداسازی شدند (شکل 1). براساس آزمون­های بیوشیمیایی اولیه، تولید رنگدانه فلورسنت در محیط کینگ بی (King’s B)، فعالیت اکسیداز و کاتالاز و ویژگی­های مورفولوژیک، تمامی سویه­ها به جنسPseudomonas  تعلق داشتند. این سویه­ها شامل 9 سویه از گیاه آگلونما (Agloanema treubii)، 4 سویه از دیفن باخیا (Diffenbachia amoena)، 5 سویه از پتوس Epipremnum aureum))، یک سویه از سینگونیوم (Syngonium podophyllum) و یک سویه از برگ انجیری (M. deliciosa) بودند.

شکل 1: نمونه­های جمع­آوری‌شده با علائم لکه­برگی برای جداسازی و شناسایی باکتری­های عامل بیماری

Figure 1. Collected leaf spot samples to isolate and identify the causal bacterial pathogen

نتایج آزمون بیماری­زایی

آزمون بیماری‌زایی مطابق با اصول کخ روی گیاهان میزبان سالم از گونه­های Epipremnum aureum (پتوس)، Aglaonema treubii  (آگلونما) و Syngonium podophyllum  (سینگونیوم) انجام شد. سوسپانسیون باکتریایی هر سویه با غلظت ۱۰⁸CFU/mL به روش تزریق درون بافتی به برگ­های جوان تلقیح شد. گیاهان شاهد با آب استریل تلقیح شدند و تحت شرایط کنترل­شده (دمای 1±25 درجه سانتی‌گراد و دوره نوری 12 ساعته) نگهداری شدند. ۷۲ ساعت پس از تلقیح، لکه­های آبسوخته کوچک (قطر 2–1 میلی‌متر) با حاشیه زاویه­دار در سطح زیرین برگ­ها مشاهده شد. در مرحله پیشرفت (۱۰ روز پس از تلقیح)، لکه­ها به­طور چشمگیری گسترش یافتند (قطر 10–5 میلی‌متر) و به رنگ قهوه­ای تیره با هاله زردرنگ تغییر یافتند. در مرحله نهایی (۱۵ روز بعد) در آلودگی­های شدید، لکه­ها به هم پیوستند (شکل ۲) و موجب نکروز کامل برگ‌ها، خشک‌شدگی و ریزش آنها شدند؛ با این حال، هیچ نشانه­ای از آلودگی سیستمیک مانند پژمردگی آوندی یا تغییر رنگ ساقه در گیاهان آلوده مشاهده نشد.

 ویژگی­ های فنوتیپی استرین­های باکتریایی آزمایش‌شده

در مجموع 20 سویه بررسی‌شده روی محیط کشت King’s B تولید رنگ فلورسنت کردند و دارای ظاهر موکوئیدی بودند. این سویه­ها گرم منفی و بی­هوازی اختیاری (دارای تنفس نیتراتی) بودند. فعالیت اکسیداز، کاتالاز، لوان دی‌هیدرولاز و آژنین دی‌هیدرولاز در آنها مثبت بود. توانایی تولید رنگدانه زرد روی محیط کشت آگار گچ­دار (YDC) در آنها منفی بود. همچنین، این سویه­ها فعالیت پکتولیتیکی نداشتند و روی نمک خوراکی 3 و 5 درصد رشد کردند. آنها از سیترات استفاده کردند؛ اما آزمون متیل رد و تولید سولفید هیدروژن از پپتون در آنها منفی بود. این سویه­ها قادر به متابولیزه‌کردن دی‌سوربیتول، مانیتول، آرابینوز و دی‌زایلوز بودند. علاوه بر این، توانایی هیدرولیز ژلاتین، تویین 20 و تویین 80 را داشتند؛ اما نشاسته و اسکولین را هیدرولیز نکردند.

 بررسی­ های مولکولی

مقایسه توالی­های ژنی در این پژوهش (ژن­های 16s rDNA، recA و rpoD) با جدایه­های معتبر در بانک ژن، با استفاده از نرم‌افزار آنلاین BLASTn نشان داد تمامی جدایه­ها بیش از 97 درصد شباهت نوکلئوتیدی با گونه­های ثبت‌شده P. aeruginosa دارند (جدول 2). سویه­هایPE1 ، PE2 و PE3 در بانک ژن ثبت شدند (جدول 3) و برای رسم درخت فیلوژنتیکی با توالی­های مرجع از مقالات معتبر مقایسه شدند.

تحلیل فیلوژنتیکی با استفاده از روش Neighbor-Joining و با درجه اعتبارسنجی 1000 تکرار، برای ژن 16S rDNA (شکل 3) و همچنین ترکیبی از ژن­های rpoD و recA انجام شد (شکل 4). نتایج نشان دادند هر سه سویه با 99 درصد شباهت درون خوشه با P. aeruginosa قرار گرفتند. این نتایج تأیید می­کنند جدایه­ های مطالعه متعلق به گونه P. aeruginosaهستند.

جدول 2- درصد تشابه ژن­های مطالعه‌شده با توالی­های معتبر در پایگاه داده NCBI

Table 2 -Percentage of similarity of the studied genes with reference sequences in the NCBI database

جدول 3- شماره ­های دسترسی ژن­های ثبت‌شده در NCBI و میزبان استرین­ها

Table 3- Gene Accession Numbers in the NCBI and Host Strain Information

شکل 3- درخت فیلوژنتیکی استرین­های PE1،  PE2 و PE3 با استفاده از روش همسایگی (neighbor-joining) برای ژن 16S rDNA، مقیاس نشان­دهنده 01/0 تغییر در توالی بین استرین­های مختلف است. اعداد بالای هر شاخه درجه اعتبارسنجی از 1000 تکرار را نشان می‌دهد. این نمودار درختی نشان می‌دهد سویه‌های PE1، PE2 و PE3 ارتباط نزدیکی با هم دارند.

Figure 3- The phylogenetic tree was constructed using the neighbor-joining method based on 16S rDNA gene sequences. The scale bar represents 0.01 nucleotide substitutions per site. Bootstrap values, calculated from 1000 replicates, are shown above each branch. The tree indicates that strains PE1, PE2, and PE3 are closely related.

برای تحلیل روابط تکاملی، از مدل Kimura 2-parameter همراه با توزیع گامای گسسته (K2+G+I) استفاده شد. انتخاب نشانگرهای ژنتیکی مناسب در مطالعات فیلوژنی سودوموناس­ها از اهمیت کلیدی برخوردار است. براساس مطالعات فیلوژنتیکی، ژن­های خانه­دار (rpoD کدکننده زیرواحد سیگمای RNA پلیمراز وrecA  درگیر در ترمیم نوترکیبی DNA) به‌دلیل نرخ تکاملی نسبتاً ثابت، سطح پایین انتقال ژن افقی و حفاظت‌شدگی بالای توالی، به­عنوان نشانگرهای مولکولی کلیدی برای تمایز گونه­های این جنس شناخته می­شوند (25). این ژن­ها قابلیت تفکیک دقیق تا سطح گونه را فراهم کرده­اند (26).

شکل 4- درخت فیلوژنتیکی استرین­های PE2 PE1 و PE3 با استفاده از روش neighbor-joining برای دو ژن rpoD و recA، مقیاس نشان­دهنده 01/0 تغییر در توالی بین استرین­های مختلف است. اعداد بالای هر شاخه درجه اعتبار سنجی از 1000 تکرار را نشان می­دهد.

Figure 4- A neighbor-joining phylogenetic tree based on the rpoD and recA genes, showing the relationships among strains PE1, PE2, and PE3. The scale bar represents 0.5% sequence divergence. Bootstrap values (1000 replicates) are shown above each branch.

بحث و نتیجه­ گیری

بیماری­های لکه­برگی ناشی از باکتری­های جنس Pseudomonas به­عنوان یک چالش جدی در کشت گیاهان زینتی شناخته می­شوند. این مطالعه برای نخستین‌بار نقش P. aeruginosa را به­عنوان عامل بیماری­زای گیاهان خانواده آراسه در ایران گزارش می­کند. پیش از این، گونه­های P. aeruginosa، P. cichorii و P. marginalis به‌عنوان عوامل اصلی لکه­برگی در این خانواده در دنیا معرفی شده بودند (8؛ 27؛ 28). با این حال، شناسایی  P. aeruginosaدر این پژوهش، گستره میزبانی این باکتری را به گیاهان زینتی آراسه گسترش می­دهد و نیاز به بازنگری در برنامه­های مدیریتی را آشکار می­کند.

ویژگی­های فنوتیپی و بیوشیمیایی جدایه­های مطالعه‌شده، با مشخصات P. aeruginosa سویه مرجع (MTCC 647) همسویی درخور توجهی نشان می­دهد. با این حال، برخی تست­های بیوشیمیایی نظیر تولید اسید از D-سوربیتول، مانیتول، آرابینوز و دی‌زایلوز که در سویه­های معمول P. aeruginosa گزارش نشده‌اند، لزوم انجام بررسی­های تکمیلی ژنومی نظیر توالی­یابی و آنالیز MLST[vi] را برای تعیین دقیق جایگاه تاکسونومیکی این جدایه­ها نشان می­دهد.

در این مطالعه، استفاده از روش MLSA مبتنی بر ژن­های 16S rDNA، rpoD وrecA ، امکان تفکیک دقیق گونه­های نزدیک به هم در جنس Pseudomonas را فراهم کرد. این یافته با پژوهش­های پیشین همسو است که تأکید دارند تکیه صرف بر ژن 16S rDNA به­دلیل شباهت بالای توالی­ها (تفاوت نوکلئوتیدی کمتر از ۱ درصد) در برخی گونه­های این جنس، می­تواند به خطا در شناسایی منجر شود (29)؛ در مقابل، ژن­های rpoD و recA به­دلیل نرخ جهش بالاتر، ابزارهای مولکولی کارآمدی برای تمایز درون گونه­ای هستند (30- 32). این نتایج، اهمیت تلفیق داده­های فنوتیپی با تحلیل­های چندژنی را در شناسایی دقیق بیمارگر­های باکتریایی برجسته می­کند.

برخی سویه­های جنس Pseudomonas، ازجمله P. aeruginosa دارای دوگانگی عملکردی درخور توجهی هستند؛ به‌طوری‌که در شرایط مختلف هم به‌عنوان بیمارگر گیاهی و هم به‌عنوان عامل کنترل زیستی گزارش شده­اند؛ برای مثال، سویه P. aeruginosa PNA1 به‌طور همزمان توانایی مهار پوسیدگی ریشه ناشی از Pythium myriotylum و ایجاد بیماری در گیاهان حساس را نشان داده است (33). این تناقض ممکن است ناشی از تفاوت در بیان ژن­های پرآزاری یا تولید متابولیت­های ثانویه (مانند فنازین­ها و بیوسورفکتانت­ها) تحت شرایط محیطی متفاوت باشد. مطالعات اخیر نیز تأیید می­کنند سویه­های P. aeruginosa (مانند جدایه EU081518) قادرند از طریق مکانیسم­های مختلفی نظیر انحلال فسفات، تولید سیدروفور، سنتز اکسین (IAA[vii]) و انتشار سیانید هیدروژن (HCN[viii])، همزمان هم رشد گیاه را بهبود بخشند و هم علیه بیمارگر­های قارچی فعالیت آنتاگونیستی داشته باشند (34)؛ با این حال، همین سویه­ها در میزبان­های حساس یا تحت شرایط استرس، به­عنوان عامل بیماری­زای مهاجم عمل می­کنند (35). این دوگانگی نقش، چالش­های جدی در مدیریت اکولوژیک این باکتری ایجاد کرده است؛ برای نمونه، P. aeruginosa علاوه بر گزارش­های پیشین به­عنوان عامل پوسیدگی در محصولاتی مانند پیاز (36) و جینسنگ (37)، پوسیدگی میوه تیندا (Praecitrullus fistulosus) (38)، لکه‌برگی توتون (39) و پوسیدگی طوقه در گل شیپوری (Zantedeschia elliottiana) از خانواده آراسه (7) گزارش شده است. همچنین این مطالعه اولین شواهد از حضور این بیمارگر در گیاهان خانواده آراسه در ایران به شمار می­رود. در مقابل، گونه­های نزدیک مانند P. cichorii نیز به­عنوان عامل بیماری­زای لکه­برگی آراسه شناخته می­شوند (10). این اختلاف ممکن است نشان­دهنده خطاهای تاکسونومیک ناشی از تشابه ژنتیکی بالا در ژن­های سنتی (مانند 16S rDNA) یا تنوع در مجموعه ژن­های پرآزاری باشد. این ناهمگونی­ها ممکن است نشان­دهنده وجود تنوع زیرگونه­ای یا ژنووارهای نوظهور در جمعیت­های P. aeruginosa باشد که پیش از این در مطالعات پیشین کمتر به آن توجه شده است. برای حل این ابهام، استفاده از روش­های مولکولی پیشرفته نظیر توالی­یابی ژنوم کامل[ix] و تحلیل ژن­های مرتبط با پرآزاری ضروری است (40). چنین رویکردی نه­تنها مرز بین گونه­ها را مشخص می­کند، بلکه امکان شناسایی سویه­هایی که هم بیمارگر و هم آنتاگونیست هستند در شرایط خاص را فراهم می­آورد.

شرایط محیطی نامساعد نظیر آبیاری بارانی مکرر و رطوبت نسبی بالا، همراه با مصرف بیش‌ازحد کودهای نیتروژنی، علاوه بر اینکه موجب ایجاد استرس فیزیولوژیک در گیاهان می­شود، با تضعیف سدهای دفاعی گیاهی (مانند کاهش تولید فیتوالکسین­ها)، زمینه را برای نفوذ و تکثیر بیمارگرهای باکتریایی فراهم می­کند (41). مطالعات نشان می­دهند نیتروژن اضافی با اختلال در توازن هورمونی گیاه (به‌ویژه افزایش اتیلن و کاهش جاسمونات)، مقاومت سیستمیک اکتسابی(SAR) را سرکوب و گیاهان را به‌ویژه در برابر بیمارگر­های گرم منفی مانند Pseudomonas آسیب­پذیر می­کند. در خانواده آراسه، این پدیده به­وضوح در بروز لکه­های نکروتیک با حاشیه زردرنگ مشاهده می­شود (42).

با توجه به تأثیر مخرب بیماری­های باکتریایی مانند لکه­برگی ناشی ازPseudomonas spp.  بر کیفیت ظاهری و بازارپسندی گیاهان زینتی خانواده آراسه (نظیر پوسیدگی برگ­ها و کاهش عمر گیاهان)، ادغام روش­های مدیریت تلفیقی بیماری (IDM) در برنامه­های کشاورزی ضروری است. در این میان، به­کارگیری تحلیل توالی چندجایگاه(MLSA)  به‌عنوان یک ابزار مولکولی پیشرفته، نقش کلیدی در بهبود دقت تشخیص بیمارگر­ها دارد. مطالعات پیشین نشان می­دهند MLSA با استفاده همزمان از ژن­های تکاملی مانند rpoD، recA و gyrB، خطای طبقه­بندی ناشی از تشابه بالای توالی 16S rDNA در جنس Pseudomonas را تا ۸۵ درصد کاهش می­دهد (31). این دقت بالا علاوه بر اینکه تفکیک سویه­های نزدیک به هم (مانند P. aeruginosa و P. putida) را ممکن می­کند، امکان ردیابی منشأ آلودگی و طراحی استراتژی­های کنترل هدفمند (مانند استفاده از آنتی­بیوتیک­های اختصاصی یا سویه­های آنتاگونیست) را فراهم می­کند (28). با توجه به ارزش اقتصادی بالای گیاهان زینتی آراسه در بازارهای صادراتی، اتخاذ چنین روش­هایی هم از خسارات مالی جلوگیری می‌کند و هم پایه علمی مستحکمی برای توسعه دستوالعمل‌های قرنطینه‌ای و استانداردهای بهداشتی فراهم می­آورد (43).

[1] Araceae

[2] Yeast extract-Dextrose-CaCO₃

[3] Ampliqon Taq DNA Polymerase Master Mix RED1/25(mL, Ampliqon, Denmark)

[4] Sanger

[5] Outgroup

[vi] Multi-Locus Sequence Analysis

[vii] Indole-3-acetic acid

[viii] Hydrogen cyanide

[ix] Whole Genome Sequencing