نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 پژوهشکده بیوتکنولوژی سازمان پژوهشهایعلمی و صنعتی ایران، تهران، ایران
2 دانشکده زیستشناسی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Beta-carotene, a natural plant pigment belonging to the carotenoid family, is one of the most important carotenoids. It is widely used as a precursor of vitamin A in pharmaceuticals, food, feed, and other applications. Due to its high capacity for carotenoid production, the heterothallic fungus Blakeslea trispora is considered one of the main biological sources of these compounds. Trisporic acids act as sexual hormones between the two mating types and are key regulators of carotenoid biosynthesis. This study used an adaptive laboratory evolution (ALE) approach involving selective pressure with imidazole to develop new strains of this mold. The results showed that one of the adapted strains exhibited a significant increase in the expression of genes involved in carotenoid biosynthesis. These genes included carRA, which encodes lycopene cyclase and phytoene synthase; carG, which is involved in geranylgeranyl pyrophosphate synthase, and Sr5AL, which is a key gene related to the trisporic acid response. Regardless of the presence of exogenously added trisporic acids, a 2.5-fold increase in Sr5AL transcription positively influenced β-carotene production in one of the imidazole-adapted strains. These results suggest that β-carotene producing strains could be optimized using evolutionary approaches combined with controlled stress conditions.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
رنگدانههای کاروتنوئیدی بهعنوان عامل ایجاد رنگ طبیعی با طیف رنگی زرد تا قرمز در صنایع غذایی، دارویی، لوازم آرایشی و بهداشتی استفاده میشوند. رنگ نقش بسیار مهمی در مقبولیت و پذیرش فرآوردههای غذایی دارد. این ترکیبات بهعنوان مکمل غذای دام و طیور نیز بهطور گسترده به کار گرفته میشوند. بتاکاروتن بهعنوان یکی از فعالترین کاروتنوئیدها برای پیشگیری از ابتلا به انواع بیماریها ازجمله بیماریهای قلبی و سرطانها و همچنین تقویت سیستم ایمنی بدن مؤثر است. از آنجایی که بدن قادر به ساختن این ماده نیست، ضرورت تأمین این ماده از منابع خارجی، بهویژه منابع طبیعی، اهمیت درخور توجهی پیدا میکند (1-3). در سالهای اخیر با وجود دسترسی به انواعی از کاروتنوئیدهای سنتتیک و طبیعی، تولید زیستی و میکروبی رنگدانههای کاروتنوئیدی بهویژه بتاکاروتن بهدلیل افزایش حساسیت عمومی به مسئله افزودنیهای سنتتیک غذا درخور توجه قرار گرفته است (4, 5).
قارچ بلاکسلا تریسپورا[1]یکی از مهمترین میکروارگانیسمهای تولیدکنندة کاروتنوئیدها، بهویژه بتاکاروتن به شمار میرود. این قارچ دو جنسی، از طریق همآمیختگی سویههای مثبت و منفی، قادر است ترکیبات سیگنالی خاصی به نام اسیدهای تریسپوریک تولید کند که تنظیمکنندة اصلی مسیر بیوسنتز کاروتنوئیدها هستند. سنتز اسیدهای تریسپوریک از استرولها، بهویژه β-استرولها مشتق میشود و مهار آنها میتواند بهطور مستقیم بر بیان ژنهای مسیر کاروتنوئید اثر بگذارد. از سوی دیگر، مشخص شده است برخی ترکیبات مانند ایمیدازول، با مهار آنزیمهای دخیل در بیوسنتز تریسپوریک اسید، میتوانند بهعنوان ابزار مهندسی تنش در فرایند بهبود سویههای تولیدی استفاده شوند (6). تولید بتاکاروتن در بلاکسلا تریسپورا از طریق مسیر موالونات صورت میگیرد. ازجمله ژنهای کلیدی در مسیر بیوسنتز کاروتنوئید در این کپک، carRA (کدکنندة آنزیمهای لیکوپن سیکلاز و فیتوئن سنتاز)، carB (کدکنندة فیتوئن دهیدروژناز) و SR5AL (کدکنندة آنزیم استروئیدی 5-آلفا-ردوکتاز مرتبط با متابولیسم هورمونهای جنسی) هستند که بیان آنها به شدت تحتتأثیر شرایط محیطی و سیگنالهای درونسلولی قرار دارد (7- 9).
اغلب میکروارگانیسمهای کاروتنزا بهعنوان بخشی از واکنش دفاعی خود به تنشهای محیطی مختلف، کاروتنوئیدها را درون یاختههای خود ذخیره میکنند (7, 10-12). درحال حاضر رویکرد تکامل سازشیآزمایشگاهی (ALE) بهعنوان یک رویکرد علمی شناخته میشود که در آن با استفاده از اعمال فشار انتخابی، میکروارگانیسمی با فنوتیپ مدنظر به دست میآید. با توسعه دانش بیوانفورماتیک، توالییابی میکروارگانیسمها و شناسایی جهشها و تغییرات ژنتیکی حاصل از روش تکامل سازشیآزمایشگاهی سرعت یافته است (13, 14). هنگامی که میکروارگانیسمها بهطور مکرر در آزمایشگاهها به زیر کشت میروند، مرحله تأخیر کوتاه میشود و سرعت رشد در مقایسه با کشت اولیه افزایش مییابد. طی فرایند رقابت در محیطی با منابع محدود، جهشهایی سازگار به نسلهای بعدی منتقل میشوند که تغییراتی را در کل جمعیت به وجود میآورند (15-18). بهرهگیری از روش تکامل آزمایشگاهی سازشی با اعمال غلظتها و شوکهای پراکسید هیدروژن در مخمر ساکارومایسس سرویزیه[2] مهندسیشده دارای ژنهای مسیر بیوسنتز بتاکاروتن سبب افزایش سه برابری تولید بتاکاروتن در آن شد (19) .از این راهبرد تکاملی میتوان بهعنوان روش کارآمد برای افزایش و مقرونبهصرفه کردن تولید بتاکاروتن در بلاکسلا تریسپورا نیز استفاده کرد؛ زیرا پژوهشها نشان دادهاند استفاده از عوامل استرس اکسیداتیو ازجمله افزایش رادیکالهای آزاد اکسیژن تأثیر چشمگیری بر تولید بهینه بتاکاروتن توسط این کپک دارد (20) و از طرفی ژنهای مسئول مسیر بیوسنتز بتاکاروتن بهطور طبیعی در این کپک وجود دارند و این امر شانس افزایش تولید در این کپک را نسبت به مخمر مهندسیشده بالاتر میبرد.
عامل استرسزای ایمیدازول بر آنزیمهای مسیر بیوسنتز بتاکاروتن تأثیر میگذارد و بهطور اختصاصی آنزیم لیکوپن سیکلاز از مسیر بیوسنتز بتاکاروتن را مهار میکند (21). لیکوپن سیکلاز یک آنزیم دو عملکردی است که با کاتالیزکردن تبدیل لیکوپن به بتاکاروتن، نقش کلیدی در این مسیر دارد. همچنین فعالیت درخور توجه فیتوئن سنتاز را نشان میدهد و اهمیت آن را در هدایت فرایندهای پیچیده درگیر برجسته میکند. با استفاده از تکنیک PCR کمّی، میتوان تغییرات پیچیده در بیان ژنهای مرتبط با این مسیر را در سطح رونویسی بررسی کرد (22Liu). در این مطالعه، با استفاده از رویکرد ALE و اعمال تدریجی غلظتهای افزاینده ایمیدازول بر سویه منفی بلاکسلا تریسپورا تلاش شده است سویههایی با تحمل بالاتر و ظرفیت بیشتر در تولید بتاکاروتن جداسازی شوند. در ادامه، تغییرات حاصل در بیان ژنهای کلیدی مسیر بیوسنتز کاروتنوئید بررسی شده و عملکرد تولیدی سویههای سازشیافته با سویه وحشی مقایسه شده است. این پژوهش میتواند زمینهساز توسعه سویههای صنعتی جدید برای تولید پایدار و ایمن کاروتنوئیدها باشد.
مواد و روشها
سویهها: کپک دو جنسی بلاکسلا تریسپورا سویه جنس منفی PTCC 5278 و جنس مثبت PTCC 5277، از کلکسیون میکروبی سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران تهیه شد. سویهها ابتدا روی محیط کشت شیبدار مالت اکسترکت آگار (عصاره مالت از شرکت به مالت 5 درصد و آگار 2 درصد) کشت شدهاند و به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتیگراد، گرماگذاری و سپس در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
محیط پیشکشت: بهمنظور تهیه مایه تلقیح از کپک، محیط کشت مایع با ترکیب گلوکز 2 درصد و عصاره مخمر 3/0 درصد و روغن سویا 5/0 درصد در ارلنهای بافلدار، تهیه و سپس در دمای 121 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه در اتوکلاو استریل شد. برای انجام تلقیح ابتدا اسپورهای سطحی سویهها، با استفاده از پیپت پاستور و سرم فیزیولوژی حاوی توئین شستوشو شد و پس از شمارش با لام نئوبار به میزان 107 اسپور از سویههای منفی و مثبت بهصورت جداگانه به ارلنها، تلقیح و به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتیگراد و دور rpm 120 در انکوباتور شیکردار گرماگذاری شد (23).
محیط کشت تخمیر: در آزمایشات تست نهایی تولید بتاکاروتن از محیط کشت پایه با فرمول ترکیبی گلوکز 50 گرم بر لیتر، پودر سویا 6 گرم بر لیتر، روغن سویا 10 میلیلیتر بر لیتر، KH2PO42/1 گرم بر لیتر، MgSO4.7H2O 4/0 گرم بر لیتر، BHT 4 گرم بر لیتر و Span20 2 میلیلیتر بر لیتر استفاده شد (23).
محیط کشت آزمایشات تکامل سازشی: آزمایشهای کشت و سازگاری با استفاده از محیط جامد (CM17) متشکل از گلوکز 3 گرم بر لیتر، عصاره مخمر 1/0 گرم بر لیتر، ال-آسپاراژین 2/0 گرم بر لیتر، MgSO4 05/0 گرم بر لیتر، KH2PO4 15/0 گرم بر لیتر و آگار20 گرم بر لیتر pH برابر با 7 و با افزودن ایمیدازول در گرادیانی از غلظتهای مختلف انجام شد (22).
بررسی تحمل سویه بلاکسلا تریسپورا 5278 در برابر ایمیدازول
باتوجه به مطالعات قبلی، از آنجا که سویه منفی نسبت به سویه مثبت در تولید بتاکاروتن مؤثرتر عمل میکند، سویه PTCC 5278 بهعنوان سویه منفی برای ادامه مراحل آزمایشات تکمیلی انتخاب شد (21). برای بررسی میزان تحمل سویه والد طبیعی نوع منفی به ماده بازدارندة ایمیدازول و ویژگیهای رشد آن قبل از شروع آزمایشهای تکامل سازشی، این سویه در معرض غلظتهای مختلف ایمیدازول از 0 تا 2 گرم بر لیتر در محیط کشت مایع (CM17) قرار گرفت. غلظتی از ماده تنشزا که در آن کمترین رشد از سویه مشاهده شد، بهعنوان غلظت اولیه برای آغاز آزمایشهای تکامل سازشی استفاده شد (شکل 1).
شکل 1: تعیین آستانه تحمل کپک بلاکسلاتریسپورا در برابر ایمیدازول
Figure 1: Determination of the imidazole tolerance threshold in Blakeslea trispora
آزمایشهای تکامل سازشی
بهطور خلاصه رویکرد تکامل آزمایشگاهی از گسترش جمعیت میکربی تحت فشار انتخابی استفاده میکند. سویههای تطابقیافتهای که سرعت رشد آنها بهدلیل افزایش تحملپذیری و مصرف سریعتر سوبسترا افزایش یافته است، بهتدریج در جمعیت گسترش مییابند و درنهایت از طریق جداسازیهای مکرر انتخاب میشوند. اگر جمعیت اولیه سویهها متنوعتر و با قابلیت تولید بالاتری از محصول باشد، در ادامه با انجام آزمایشات تکامل سازشی میتوان انتظار داشت به سویههای بهتری دسترسی پیدا کرد. به همین منظور، از جهشزایی کلاسیک با بهکارگیری روش فیزیکی اشعه ماوراءبنفش استفاده شد و ابتدا منحنی بقای سویه اولیه با بقای 10 درصد در برابر UV تهیه شد. برای یک جهشزایی مؤثر، مقدار 200 میکرولیتر از سوسپانسیون اسپور با غلظت اولیه 106 اسپور بر میلیلیتر روی محیط کشت انتخابی CM17 حاوی ماده غربالگر استواستانیلید پخش شد (استواستانیلید برای غربالگری سویههای جهشیافتة بلاکسلا تریسپورا به کار میرود) (22). سپس پلیتها در فاصله 50 سانتیمتری به مدت 180 ثانیه در معرض اشعه فرابنفش (دز تابشی 1/0 J/cm2) قرار گرفتند و بلافاصله در تاریکی کامل انکوبه شدند. بعد از 48 ساعت و رشد اسپورها در همان محیط کشت، کلنیهایی ظاهر شدند که در برابر اشعه ماوراءبنفش قابلیت زندهمانی داشتند و هر کلنی که رنگ زرد پررنگتری نسبت به بقیه کلنیها داشت، بهعنوان تولیدکنندة بهتر بتاکاروتن انتخاب شد. در مرحله بعد، کلنیهای پررنگ به محیط کشت مالت اکسترکت آگار (MEA) منتقل شدند و بعد از چند مرحله واکشت، کلنیهایی که خصوصیات مطلوب از نظر میزان رشد و رنگ حفظ کرده بودند برای آزمایشات تکامل سازشی انتخاب شدند. سویه منتخب حاصل از جهشزایی و همچنین سویه والد طبیعی برای آزمایشات تحت تنش به محیط کشت جامد حاوی عامل تنشزای ایمیدازول منتقل شدند. انتقال آنها در هر واکشت از یک غلظت معین ماده تنشزا، بهصورت انتقال سوسپانسیون اسپور با غلظت ثابت (شمارش توسط لام نئوبار) در محیط کشت جامد در نظر گرفته شد. اسپورهای حاصل از جمعیت سازشیافته اول با کمک قیف و فیلتر پشم شیشهای استریل، جمعآوری و به دوره بعدی از کشت جامد با غلظت بالاتر از ماده تنشزا منتقل شد. زمان ماند هر دوره در برابر هر غلظت از عامل تنشزا بین 8 تا 18 واکشت بهینه بود. در مجموع طی دو دوره، 26 واکشت در مدت 130 روز از غلظت 1250 تا 1500 میلیگرم بر لیتر انجام شد (جدول 1).
شایان ذکر است پس از اتمام هر دوره از تأثیردهی غلظتهای مشخص عامل تنشزا، از جمعیت حاصل در گلیسرول 20 درصد استوک تهیه شد. بعد از استریلکردن، محیط کشتها با نسبت 4 به 1 از مایه تلقیح سویه منفی و مثبت تلقیح شد. سپس در انکوباتور شیکردار در دور 180 و دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 5 روز گرماگذاری شد.
جدول 1: غلظت ماده تنشزا استفادهشده در طول آزمایشات تکاملی و تعداد واکشتها
Table 1: Concentrations of the stress-inducing agent used during the ALE experiments and the number of subcultures at each level
|
Number of Subcultures |
Stress agent concentration (Final) |
Stress agent concentration (Initial) |
Strain Name |
|
8 |
1500mg/l |
1250mg/l |
W 78 |
|
18 |
1500mg/l |
1250mg/l |
M1 |
در ادامه سویههای سازشیافته منتخب با سویه مثبت در محیط کشت تولید مایع جفتشده و ارزیابی براساس وزن خشک (خشککردن در آون 60 درجه)، مورفولوژی سویهها و سنجش بتاکاروتن و مقایسه مقدار تولید بتاکاروتن در محیط تولید استاندارد انجام شد.
سنجش بتاکاروتن
ازآنجا که بتاکاروتن تولیدشده توسط کپک بلاکسلا تریسپورا درونسلولی است، بعد از پایان مرحله تخمیر با استفاده از صافی توده سلولی حاصل، جمعآوری و به مدت 24 ساعت در فریزر نگهداری شد تا شکست سلولی برای استخراج بتاکاروتن تجمعیافته در میسلیومهای کپک آسانتر شود. سپس مقدار مشخصی معادل 2/0 گرم از توده سلولی منجمدشده، جدا و به همراه 2/0 گرم پودر شیشه در هاون دستی بهطور کامل ساییده شد. سپس به پودر حاصل 10 میلیلیتر اتانول 96 درصد، افزوده و مخلوط به داخل فالکون منتقل شد. برای شستوشوی کامل باقیماندة پودر از هاون، 10 میلیلیتر هگزان به هاون، افزوده و پس از مخلوطسازی، به فالکون منتقل شد. مخلوط داخل فالکون به مدت 10 دقیقه با دستگاه ورتکس کاملاً مخلوط شد. در ادامه، 10 میلیلیتر آب مقطر به مخلوط، افزوده و مجدداً عملیات ورتکس انجام شد تا فازهای آلی و آبی از یکدیگر جدا شوند. در پایان، مخلوط دوفازی حاصل با استفاده از سانتریفیوژ با سرعت 5000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. فاز رویی که حاوی رنگدانه بتاکاروتن بود، جدا و میزان جذب نوری آن در طول موج 450 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. مقدار نهایی بتاکاروتن استخراجشده با استفاده از منحنی استاندارد محاسبه شد (23).
بررسی میزان رونویسی ژنها با ریل تایم پیسیآر[3]
برای آشکارشدن تأثیر ایمیدازول در مسیر بیوسنتز کاروتنوئید سویههای سازشیافته، سطوح رونویسی ژنهای مرتبط با مسیر MVA، ژنهای hmgr و ipi، سنتز کاروتنوئید (carG، carA و carB) و ژن شبهاستروئیدی 5-آلفا-ردوکتاز مربوط به سنتز اسیدتریسپوریک (Sr5AL) بررسی شد. به این منظور، ابتدا اسپورهای حاصل از رشد سویههای مدنظر (والد، جهشیافتههای حاصل از جهشزایی تصادفی و جهشیافتههای حاصل از تکامل سازشی) از روی کشت جامد (MEA) با سرم فیزیولوژی توئیندار، شستوشو و به محیط کشت تولید مایع منتقل شد و در انکوباتور شیکردار با 180 دور در دقیقه و در شرایط دمایی 28 درجه سانتیگراد گرماگذاری شدند. سپس با توجه به منحنی رشد و در زمان 56 ساعت میزان بیان ژنهای مربوطه بررسی شد. به این منظور، ابتدا توده زیستی حاصل از طریق فیلتر، جمعآوری و با آب مقطر دوبار تقطیر شستوشو شد. سپس طبق پروتکل موجود در کیت مخصوص استخراج RNA قارچی، کل RNA مربوط به سویهها استخراج شد و مقدار و درصد خلوص RNA استخراجشده توسط دستگاه نانودراپ با نسبت جذب A260/A280 بررسی شد (24).
در ادامه با استفاده از کیت، از RNA استخراجشده cDNA تهیه شد تا با استفاده از پرایمرهای اختصاصی این ژنها (جدول 2) سطح رونویسی شش ژن مسیر بیوسنتز کاروتنوئید در سویه سازشیافته بررسی شود. نتایج بهدستآمده با ژن خانهزاد[4] tef1 و مقایسه با کنترل مربوطه نرمالسازی شد.
جدول 2: پرایمرهای استفادهشده در این مطالعه (12)
Table 2: Primers used in this study (12)
|
Genes name
|
Gene Abbreviating |
Forward and reverse primers (5 → 3) |
Amplicon length (bp)
|
||
|
Translation elongation factor -1 |
tef1 |
tef1-F tef1-R |
AACTCGGTAAGGGTTCCTTCAAG CGGGAGCATCAATAACGGTAAC |
138 |
|
|
Isopentenyl pyrophosphate isomerisse |
ipi |
ipi-F ipi-R |
TCTCACCCCTTAAATACAGCAGATG CTCGGTGCCAAATAATGAATACG |
161 |
|
|
Gernyl gernyl pyrophosphate |
carG |
carG-F carG-R |
AATTGTTTTGGCGTGACACCTT CAGTTCCCGATTGACTAGCTTCTT |
129 |
|
|
3 hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A redoctase |
hmg |
hmgR-F hmgR-R |
AAACGATGGATTGAACAAGAGGG TAGACTAGACGACCGGCAAGAGC |
113 |
|
|
lycopene cyclase phytoene synthase |
carRA |
carRA-F carRA-R |
CTAAAGCCGTTTCACTCACAGCA ACAAGTAGGACAGTACCACCAAGCG |
129 |
|
|
Phytoene dehydrogenases |
carB |
carB-F carB-R |
AGACCTAGTACCAAGGATTCCACAA AGAACGATAGGAACACCAGTACCTG |
92 |
|
|
Steroid 5α-reductase-like gene |
SR5AL |
SR5AL-F SR5AL-R |
TCCCTTTTTTTTACATTTCGTTTTGG ATACCTTGGTTGTTTTGAGAGCCCT |
180 |
|
F: Forward, R: reverse
نتایج
میزان تولید بتاکاروتن
نتایج حاصل از سنجش بتاکاروتن تولیدشده در سویههای سازشیافته در نمودار 1 نشان میدهد میزان تولید بتاکاروتن در سویه سازشیافته موتانت (IM1) به مقدار 35 میلیگرم بر لیتر رسیده است که نسبت به سویه والد طبیعی (W78) در حدود دو برابر است و همچنین نسبت به سویه سازشیافته والد (WI78)، حدود پنج برابر بیشتر است (شکل 2).
همچنین در مقایسه با سویه والد، زیستتوده در سویه سازشیافتة وحشی (WI78) حدود یکسوم کاهش یافت؛ درحالیکه سویه سازشیافتة موتانت (IM1) حدود دو برابر افزایش نشان داد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان دادند فرایند سازش در سویههای مختلف اثرات متفاوتی نشان میدهد. اثرگذاری فرایند سازش وابسته به زمینه ژنتیکی سویه است؛ بهطوریکه در سویه وحشی اثر منفی داشته است؛ اما در سویه موتانت موجب تقویت تولید و افزایش بازده شده است.
خصوصیات ظاهری
همچنین بررسی و مشاهده تصویر میکروسکوپی لام حاصل از کشت مایع، سویههای سازشیافته در مقایسه با سویه والد (W78) و سویه سازشیافتة آن (WI78) نشان داد میسلیومهای سویه موتانت سازشیافته (IM1)، از نظر شکلی دارای ظاهر پررنگتری هستند که ناشی از افزایش حضور بتاکاروتن است (شکل 3).
شکل 2: مقایسه تولید بتاکاروتن توسط سویههای سازشیافته به ایمیدازول
Figure 2: Comparison of beta-carotene production by strains adapted to imidazole
بررسی میزان بیان ژنها
نتایج بررسی میزان رونویسی ژنها نشان دادند در سویه سازشیافتة 78 یعنی سویه WI78، سطح رونویسی ژنهای hmgr و carA درحدود دو برابر نسبت به سویه والد افزایش داشته است (بخش a شکل 4).
ژن hmgr مسئول کدگذاری اولین آنزیم محدودکنندة سرعت در مسیر MVA یعنی هیدروکسی متیلگلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز است که تنظیم مثبت این ژن منجر به تقویت شار مسیر MVA و درنتیجه افزایش دسترسی به پیشسازهای موردنیاز سنتز کاروتنوئید میشود. ژن carA مسئول کدگذاری آنزیمهای لیکوپنسیکلاز و فیوتئنسنتاز است. سطوح رونویسی ژنهای carB و Sr5AL در سویه سازشیافته WI78 نسبت به سویه والد کاهش داشت.
در سویه سازشیافته موتانت (IM1)، سطح رونویسی ژنهای carG و carAحدود دو برابر و ژن Sr5AL در حدود دو و نیم برابر نسبت به سویه والد افزایش داشتهاند و سطوح رونویسی دیگر ژنها حالت پایداری نسبت به سویه والد داشت (بخش b شکل4).
شکل 3: مقایسه ظاهری سویه های سازشیافته والد WI78)) و موتانت (IM1) به ایمیدازول در ساب کالچر 14
Figure 3: Morphological comparison of the adapted wild-type strain (WI78) and the mutant strain (IM1) under imidazole stress at subculture 14
|
b |
|
a |
شکل4: a) میزان بیان ژنهای سویه والدW78 و WI78 و b) میزان بیان ژنهای سویه موتانت M1 و IM1
Figure 4: (a) Gene expression levels in the parental strain W78 and adapted strain I78. (b) Gene expression levels in the mutant strains M1 and IM1
بحث
بیوسنتز کاروتنوئیدها شامل شبکه پیچیدهای از فرایندها است که در آن تنظیم بازخورد متابولیک نقش مهمی در هدایت کارایی و خروجی مسیر دارد. نتایج این پژوهش نشان دادند بهرهگیری از روش تکامل آزمایشگاهی سازشی همراه با اعمال تنش ایمیدازول، منجر به بهبود معنادار در توان تولید بتاکاروتن در کپک بلاکسلا تریسپورا شده است. سویه موتانت سازشیافته (IM1) نسبت به سویه والد (W78) و حتی سویه والد سازگارشده (WI78) عملکرد بهتری از خود نشان داد. همچنین افزایش سطح رونویسی ژنهای کلیدی مانند carG، carRA و Sr5AL در سویه IM1، حتی در غیاب افزودن اسیدهای تریسپوریک، بر نقش مهم تنظیمی ژن Sr5AL در القای سنتز کاروتنوئیدها دلالت دارد. اسیدهای تریسپوریک یکی از عوامل کلیدی تنظیمکنندة مسیر سنتز کاروتنوئید هستند و از طرفی کاروتنوئیدها پیشساز اسیدهای تریسپوریک هستند (6، 25). همچنین افزایش بیان ژن hmgr در سویههای بهبودیافته میتواند نشانهای از افزایش شار مسیر MVA و درنتیجه افزایش پیشسازهای سنتز کاروتنوئید باشد (21).
کاهش بیان ژنهای carB و Sr5AL در برخی سویهها مانند WI78 نشان میدهد سازشپذیری به تنهایی کافی نبوده و اعمال جهشهای هدفمند یا انتخاب بهتر، در بهبود همزمان تنظیم مسیر متابولیک و افزایش تولید محصول مؤثرتر بوده است. این نتایج نشان میدهند فرایندهای سازشی در سطح بیان ژنها نیز بازتاب پیدا کردهاند و تنها به تحمل فیزیکی محدود نمیشوند.
بهطور کلی، استفاده از عامل استرسزای ایمیدازول بهعنوان ابزار انتخابی در فرایند تکامل سازشی موجب تحریک پاسخهای تنظیمی مؤثری در بلاکسلا تریسپورا شده است. این یافتهها مسیرهای تازهای را برای افزایش بازده تولید ترکیبات ارزشمند بیولوژیکی از طریق بهکارگیری روشهای مبتنی بر فشار انتخابی و تحلیل مولکولی هموار میکند.
مشاهدات میکروسکوپی و ماکروسکوپی نشان دادند تنش ایمیدازول، بهویژه پس از اعمال فرایند تکامل سازشی آزمایشگاهی (ALE)، موجب تغییرات چشمگیری در ساختار و رنگ میسلیوم بلاکسلا تریسپورا شده است. سویه تکاملیافتة IM1 دارای شبکة هیفی متراکمتر و منشعبتر نسبت به سویههای W78 و WI78 بود که میتواند نشانهای از سازگاری فیزیولوژیکی سلولها بهمنظور افزایش سطح تماس با محیط و ارتقای جذب مواد مغذی باشد. از نظر رنگدانهای، سویههای تکاملیافته، بهویژه IM1، رنگ نارنجی شدیدتری از خود نشان دادند. این ویژگی ظاهری با افزایش محسوس بتاکاروتن درونسلولی مطابقت داشت که از طریق آنالیز اسپکتروفتومتری تأیید شد. اگرچه افزایش وزن خشک زیستتوده اندک بود، تمرکز اصلی تغییرات متابولیکی بر مسیرهای تولید کاروتنوئیدها بود. تشکیل پلتهای فشرده و هیفهای کوتاهتر نیز میتواند فرایند استخراج رنگدانه و عملکرد صنعتی را بهبود بخشد. این ویژگیهای ساختاری در شرایط صنعتی از اهمیت زیادی برخوردارند؛ زیرا رشد رشتهای در قارچها اغلب مشکلاتی در ویسکوزیته محیط کشت و عملکرد بیورآکتورها ایجاد میکند (9). این نتایج اهمیت بررسی همزمان ویژگیهای مورفولوژیک و رنگدانهای را در بهینهسازی سویههای صنعتی قارچی نشان میدهد.
نتیجهگیری
در این مطالعه با مقایسة نتایج مقدار بتاکاروتن تولیدشده و بررسیهای صورتگرفته در زمینة سطوح رونویسی ژنها، تأثیر ژن Sr5AL در همافزایی پاسخ آنزیمهای مسیر بیوسنتز کاروتنوئید مشخص شد. نتایج نشان دادند سویه سازشیافته موتانت (IM1) شرایط سازشپذیری را نسبت به سویه سازشیافته والد (WI78) بهتر طی کرده است. این یافته بر مزایای بالقوه سازشپذیری سویهها برای ویژگیهای بهبود یافته تأکید میکند.
[1] Blakeslea trispora
[2] Saccharomyces cerevisiae
[3] Real-time PCR
[4] Housekeeping
Wang Q, Chen Y, Yang Q, Zhao J, Feng L, Wang M. SR5AL serves as a key regulatory gene in lycopene biosynthesis by Blakeslea trispora. Microbial Cell Factories. 2022;21(1):126. https://doi.org/10.1186/s12934-022-01853-x
)