نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه ازاد اسلامی، قم، ایران.
2 گروه میکروبیولوژی،دانشکده علوم پایه،دانشگاه ازاد اسلامی ، قم ، ایران.
3 گروه شیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه ازاد اسلامی، قم، ایران.
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Exopolysaccharides (EPSs) play a crucial role in the resistance of microorganisms to various stresses, including salinity. The aim of this study was to screen the native halophilic strains of actinomycetes, which produce antimicrobial EPSs, isolated from the rhizosphere soils of Qom Salt Lake. Actinomycete isolates were obtained using ISP2 medium with different salt concentrations. A BHI liquid medium containing 2% sucrose was used for the preparation of EPS. The antimicrobial activity of the EPSs was evaluated using the agar well diffusion method, and the MIC and MBC values were determined using a 96-well microplate assay. The structure of the isolated EPS was analyzed by FTIR, HPLC and UV-Vis spectroscopy. In addition, their thermal properties and stability were evaluated by TGA. The selected isolates were identified on the basis of morphological, physiological and biochemical characteristics of EPS, as well as the 16S rRNA molecular method. A total of 30 native strains of halophilic actinomycetes were isolated in this study. Two of these isolates showed the ability to produce EPS with antimicrobial properties. The highest antimicrobial activity of EPS was observed against pathogenic strains at a concentration of 2% and a volume of 200 µl. FTIR results confirmed the presence of hydroxyl groups, while HPLC analysis showed that the heteropolysaccharide structure consisted of six monomers. UV-Vis analysis confirmed the presence of carboxyl, carbonyl, amine and ester functional groups. TGA showed acceptable thermal stability. Phylogenetic analysis of the isolates confirmed that the strain belonged to the genus Streptomyces with 100% similarity. The results of this study suggest that the native halophilic strain of Streptomyces isolated from the rhizosphere soils of Qom Salt Lake could serve as an important source for the production of EPS with various biotechnological applications, particularly in the food and pharmaceutical industries.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
در سال‌های اخیر توجه پژوهشگران به استفاده از متابولیت‌های باکتریایی به‌علت تنوع بالا، دوستدار محیط زیست بودن و قابلیت استفاده در صنایع مختلف بیشتر شده است (1, 2). اگزوپلی‌ساکاریدها از واحدهای قندی عمدتاً گلوکز، گالاکتوز و رامنوز در نسبت‌های مختلف تشکیل شده‌اند و در دو گروه هموپلی‌ساکاریدها و هتروپلی‌ساکاریدها قرار می‌گیرند (3). در دهه‌های اخیر پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی ریزموجودات جایگزین پلی‌ساکاریدهای گیاهی شده‌اند که به مقدار فراوان و با درجه خلوص بالاتری به دست می‌آیند. توانایی تولید اگزوپلیساکارید در میان باکتری‌ها بیشتر از قارچ‌ها و مخمرها است (4). توجه ویژه به EPS (Exopolysaccharide) اغلب به‌دلیل تنوع آنها است. این تنوع، با تفاوت در تعداد و انواع عملکرد گروه‌های متصل به EPS است که پلیمرهایی با خواص مختلف ایجاد می‌کنند؛ درنتیجه، به آنها اجازه می‌دهد دارای یک طیف گسترده‌ای از عملکردهای فیزیولوژیکی درون‌ریز موجودات مانند حفظ مواد مغذی برای جلوگیری از گرسنگی، تشکیل بیوفیلم برای ایجاد روابط همزیستی یا برای محافظت در برابر خشک‌شدن و سموم یا آنتی‌بیوتیک‌ها در محیط اطراف آنها باشد (5). پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی ریزموجودات هالوفیل دارای ثبات در دما، شوری و حتی pH بالا هستند. این ویژگی‌های منحصربه‌فرد EPS تولیدشده توسط هالوفیل‌ها، برنامه‌های کاربردی متنوعی را در زمینه‌های مختلف صنعت ارائه می‌دهد (6). در سال‌های اخیر ترکیبات متعدد جدید با خواص ضدمیکروبی کشف شدند که بخش عمده‌ای از آنها توسط اکتینوباکتری‌ها تولید می‌شوند. روش‌های جدید و فناوری‌های کشف محصولات طبیعی جدید نظیر پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی از منابع میکروبی موجود در نواحی شور از اهمیت ویژه‌ای برخوردار هستند. در شرایط آزمایشگاهی پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی تولیدشده توسط L.rhamnosus جداشده از شیر مادر فعالیت ضدباکتریایی چشمگیری را در برابر عوامل بیماری‌زا مانند سالمونلا انتریکا سرووار تیفی موریوم و E.coli از خود نشان داده‌اند (7). همچنین اگزوپلیساکارید تولیدشده توسط Bifidobacterium longum تقسیم سلول عوامل بیماری‌زای باکتریایی یعنیVibrio parahaemolyticus ،Typhimurium Salmonella، Staphylococcus aureus و Bacillus cereus را مختل می‌کند. از طرف دیگر، اگزوپلیساکارید Lactobacillus gasseri hetero فعالیت ضدباکتریایی را در برابر چندین مورد از عوامل بیماری‌زا نشان داده است؛ ازجمله لیستریا مونوسایتوژنز 65 MTCC، که به‌طور چشمگیری بدین وسیله مهار می‌شود. اگزوپلیساکارید تولیدشده توسط L. plantarum C70 جدا شده از شیر شتر باعث کاهش رشد 2 تا 3 برابری باکتری‌های بیماری‌زای coli. E و .aureus S در شرایط آزمایشگاهی شدند. اگزوپلیساکارید تولیدشده توسط Lactobacillus kefiranofaciens DN1 فعالیت ضدباکتری و فعالیت‌های باکتریواستاتیک علیه Monocytogenes Listeria و serovar Enteritidis S. enterica ازخود نشان می‌دهند که تأثیر آن متناسب با غلظت پلی‌ساکارید خارج سلولی است. همچنین، EPS تولیدشده از spp Lactobacillus، اثر آنتی‌باکتریال چشمگیری را در برابر Salmonella enterica و luteus Ca6 Micrococcus از خود نشان می‌دهد. پلی‌ساکارید خارج سلولی لاکتوباسیلوس حاوی چندین نوع گروه‌های عملکردی است؛ برای مثال، کربونیل، فسفات و گروه‌های هیدروکسیل که به نظر نقش اساسی در اعمال اثرات ضدمیکروبی و آنتی‌اکسیدانی EPS دارند. مطالعات اخیر، اهمیت نقش آنتاگونیستی EPSها برای عوامل ضدمیکروبی مانند ویروس‌ها، باکتری‌ها و قارچ‌ها را آشکار کرده است. همچنین، از پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی برای درمان آلودگی‌های ناشی از باکتری و ویروس، افزایش پاسخ‌های واکسیناسیون و کاهش آلرژی گزارش شده است. طول زنجیره EPS و وزن مولکولی آنها بر فعالیت‌های بیولوژیکی آنها مانند فعالیت‌های ضدمیکروبی تأثیر می‌گذارند. حضور گروه‌های فسفات و آهنی می‌تواند فعالیت بیولوژیکی ضدمیکروبی و ضدسرطانی EPS را بهبود ببخشد (8).
با توجه به مطالب اشاره‌شده و اهمیت تنوع و خواص زیستی و دارویی پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی ریزموجودات، هدف تحقیق حاضر، غربالگری و جداسازی اکتینومایست‌های شورپسند خاکزی دریاچه نمک قم با توانایی تولید EPS و ارزیابی اثرات ضدباکتری این متابولیت‌های ارزشمند است. شایان ذکر است این تحقیق برای اولین‌بار در کشور در رابطه با دریاچه نمک قم انجام شد. از مهم‌ترین جنبه‌های نوآوری و کاربردی این طرح تحقیقاتی دستیابی به پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی با خواص ضدباکتریایی خواهد بود.
مواد و روش‌ها
جمع‌آوری نمونه
برای جمع‌آوری نمونه‌های خاک، ابتدا بخش‌های سطحی (حدود 5 سانتی‌متر) خاک‌های اطراف ریشه گیاهان و درختچه‌های (گز، سودا، پرند، سالسولا، درمنه بیابانی، اشنان و تاغ زرد) مسیر دریاچه نمک قم (میسله) کنار زده شدند و با بیلچه کاملاً تمیز و استریل از عمق 15 تا30 سانتی‌متر و به‌طور تصادفی حدود 100 نمونه خاک برداشت شد و در بسته‌های پلی‌تن استریل قرار داده شدند. سپس تمامی نمونه‌ها در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند و سپس به آزمایشگاه انتقال یافتند و تاریخ و محل نمونه‌گیری روی نمونه‌ها درج شد (9).
غربالگری و شناسایی اولیه جدایه‌ها
برای جداسازی اکتینوباکترها، نمونه‌های خاک با روش رقت‌سازی متوالی رقیق شدند. 100 میکرولیتر از رقـت‌هـای 2- تا 10- در محیط کشت اختصاصی ISP2 (pH 2/7 با درصد نمک‌های 5، 10، 15، 20 و 25 درصد) کشت داده شدند. پلیت‌ها به مدت 14-7 روز در دمای 30-28 درجه سانتی‌گراد در گرمخانه نگهداری شدند. سویه‌هایی با کلنی‌ها و ظاهری پودری و خشک جداسـازی شـدند. شناسایی اولیه بـراسـاس مشخصـات ظاهری کلنـی، اندازه کلنی، تولید اسپور و نیز مشخصـات میکروسـکوپی میسـلیوم هـوایی، وضـعیت اسـپور و شـکل انشـعابات اسـپور انجـام شد (10).
ارزیابی تولید پلی‌ساکارید خارج سلولی در جدایه‌های اکتینومیست نمک‌دوست
جدایه‌ها در ارلن مایر حاوی ١٠0 میلی‌لیتر محیط BHI مایع با 2 درصد ساکارز تلقیح شدند. ارلن‌ها به مدت 9 روز در دمای 30-28 درجه سانتی‌گراد و با سرعت ٢٠٠ دور در دقیقه گرماگذاری شدند (11).
استخراج اگزوپلیساکارید در جدایه‌های منتخب
در این مرحله محیط کشت با سرعت 12000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس به سوپرناتانت تری‌کلرو استیک اسید (5 درصد) اضافه شد و یک شب در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار داده و دوباره با سرعت 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 3 برابر حجم مایع رویی اتانول مطلق، اضافه و یک شب در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. پلی‌ساکاریدهای رسوب داده شده با سرعت 12000 هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. دو بار با استون شسته شد و سپس در زیر هود برای خشک‌شدن قرار داده شد (12).
هیدرولیز پلی‌ساکارید خارج سلولی جدایه‌های منتخب
01/0 گرم پلی‌ساکارید خارج سلولی با 25/1 میلی‌لیتر اسید سولفوریک 72 درصد حل شد و سپس در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 60 دقیقه قرار داده شد. سپس 13 میلی‌لیتر آب دیونیزه به محلول مدنظر اضافه شد. محلول به مدت 4 ساعت داخل حمام آب گرم دمای 60 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. سپس محلول در دمای محیط قرار داده شد تا خنک شود. سپس 1/3 میلی‌لیتر هیدروکسید سدیم 32 درصد و 65/7 میلی‌لیتر متانول به نمونه اضافه شد. حجم نهایی باید 25 میلی‌لیتر باشد. مابقی محلول با اتانول به حجم رسانده شد (13).
بررسی فعالیت ضدمیکروبی پلی‌ساکارید خارج سلولی جدایه‌های منتخب
برای ارزیابی خاصیت ضدمیکروبی از سازمان پژوهش‌های علمی صنعتی ایران باکتری‌های بیماری‌زای استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 10690، اشریشیا کلای ATCC 10708، سالمونلا تیفی موریوم ATCC 10707 و باسیلوس سوبتیلیس ATCC 1080 استفاده شد. فعالیت ضدمیکروبی پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی جدایه‌های منتخب (کشت 24 ساعته و با غلظت نیم مک فارلند) به روش چاهک‌گذاری روی محیط مولر هینتون آگار (با اندکی تغییر) انجام شد. از آب دیونیزه به‌عنوان حلال اگزوپلیساکارید استفاده شد و با غلظت‌های 50، 100، 150 و 200 درصد به مقدار 50، 100، 150 و 200 میکرولیتر به چاهک‌ها اضافه شدند. یک چاهک حاوی آب دیونیزه به‌عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد. پلیت‌ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت، گرماگذاری و ازنظر وجود هاله عدم رشد بررسی شدند (14).
تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی به روش رقیق‌کردن در محیط مایع میکرو
در این مرحله از میکروپلیت‌های 96 چاهک از جنس پلی‌استیرن استفاده شد. به هر چاهک 100 میکرولیتر محیط مایع مولر هینتون براث اضافه شد. سپس 100 میکرولیتر از محلول اگزوپلیساکارید که با غلظت 1/0 گرم اگزوپلیساکارید در 1 میلی‌لیتر آب دیونیزه استریل تهیه شده است، درون چاهک اول هر ردیف ریخته و با چاهک‌های بعد سریال رقت شد. این کار به‌طور متوالی تا چاهک شماره 10 تکرار شد و درنهایت 100 میکرولیتر اضافی دور ریخته شد. سپس 15-10 میکرولیتر از سوسپانسیون نیم مک فارلند باکتری بیماری‌زا (کشت 24 ساعت) مدنظر به چاهک‌ها اضافه شد. چاهک برای کنترل مثبت (بدون EPS) و منفی (بدون باکتری) در نظر گرفته شد. میکروپلیت به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، گرماگذاری و میزان رشد در دستگاه میکروپلیت ریدر (Epoch2c-آمریکا) با طول موج 600 نانومتر اندازه‌گیری شد. کمترین غلظت از محلول اگزوپلیساکارید که مانع رشد باکتری‌های مورد آزمایش شد، به‌عنوان حداقل غلظت مهارکنندگی گزارش شد (15).
شناسایی بیوشیمیایی جدایه منتخب
برای شناسایی اولیه جدایه‌های منتخب از ویژگی‌های مورفولوژی کلنی، رنگ‌آمیزی گرم و سایر آزمون‌های فیزیولوژیک و بیوشیمیایی براساس کتاب مرجع برجی استفاده شد (16).
تعیین ساختار اگزوپلیساکارید با آزمون FTIR
ساختار اگزوپلیساکارید تولیدشده ازطریق دستگاه طیف‌سنجی تبدیل فوریه- مادون قرمز (FT-IR) Rayleigh مدل WQF-510 ساخت کشور چین تجزیه و تحلیل شد.
در این آزمون باندهای جذبی مادون قرمز، اجزا و ساختارهای مولکولی خاص مشخص می‌شوند. برای انجام این تکنیک 1 تا 2 میلی‌گرم پودر اگزوپلیساکارید خشک‌شده با 100 میلی‌گرم پتاسیم برماید سائیده شد و تحت فشار 7500 کیلوگرم به مدت 30 ثانیه در دستگاه FTIR قرار داده شد (12).
بررسی اگزوپلیساکارید جدایه منتخب با آزمون HPLC
برای این منظور 5 میلی‌گرم اگزوپلیساکارید هیدرولیزشده در آب، حل و با فیلتر سرسرنگی 45/0 میکرون صاف شد. سپس 20 میکرولیتر از آن را به دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) شرکت Knauer مدل Pump k-100آشکارساز K-2301 ستون C18 با ابعاد 6/4×250 تزریق شد. کروماتوگرام به‌دست‌آمده با استانداردها برای شناسایی تحلیل شد. فاز متحرک استونیتریل / آب با نسبت 80/20 حجمی سرعت جریان 1 میلی‌لیتر بر دقیقه انجام شد (17).
بررسی اگزوپلیساکارید جدایه منتخب با آزمون حرارتی (TGA)
برای آزمون حرارتی و پایداری اگزوپلیساکارید جدایه منتخب، نمونه در ظرف Al2O3 قرار داده شد و با سرعت گرمایش 10 درجه سانتی‌گراد بر دقیقه در محدوده 1000-30 درجه، گرم و نمودار آن بررسی شد (18).
بررسی اگزوپلیساکارید جدایه منتخب با آزمون طیف نورسنجی (UV-Vis)
برای بررسی انتقالات الکترونی و بررسی میزان متابولیت، از طیف‌سنجی جذبی مرئی - فرابنفش استفاده شد (11).
شناسایی مولکولی جدایه منتخب
به‌منظور تکثیر ژن s rRNA16 از پرایمرهای یونیورسال (5'-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG- 3') 8F و 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')) 1541R استفاده شد. پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی استفاده‌شده در این واکنش، سکانس نوکلئوتیدی ژن s rRNA16 است که محصول 1520 جفت‌باز را ردیابی می‌کند. برنامه PCR با استفاده از آنزیم تک‌پلیمراز و به روش زیر انجام گرفت:
دناتوراسیون اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 دقیقه انجام شد. به‌منظور جداشدن دو رشته DNA الگو از یکدیگر 30 سیکل که شامل 30 ثانیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد برای دناتوراسیون، 30 ثانیه در دمای 52 درجه سانتی‌گراد به‌منظور اتصال پرایمرها به توالی DNA و 40 ثانیه طویل‌سازی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد انجام شد. سپس طویل‌سازی نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. نمونه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. ران‌کردن روی ژل، برای اثبات وجود باندهای مدنظر انجام شد. باند تشکیل‌شده برای تشخیص این ژن روی ژل آگارز 1520 جفت‌باز است.
تعیین توالی ژن
بعد از خالص‌سازی برای تمامی نمونه‌های مثبت OD هریک از نمونه‌ها خوانده شد. سپس ارسال محصول PCR به کمپانی میکروسینس سوئیس برای تعیین توالی به روش سنگر ازطریق شرکت توپازژن با حجم حدود 10 میکرولیتر و غلظت (30 نانوگرم بر میکرولیتر) از هر نمونه انجام شد؛ درنهایت بررسی سکانس‌ها با برنامه CLC Sequence Viewer با سکانس‌های اورجینال موجود در بانک اطلاعاتی NCBI ثبت شد (19).
نتایج
غربالگری و جداسازی اولیه اکتینومیست‌ها از نمونه‌های خاک
در این تحقیق 30 سویه اکتینوباکتر از نمونه‌های خاک جدا شدند. از این تعداد 4 جدایه توانستند نمک 10 درصد را تحمل کنند و 3 جدایه قادر به تولید اگزوپلیساکارید بودند. در مراحل بعدی جدایه‌ای انتخاب و ارزیابی شد که اگزوپلیساکارید آن خاصیت ضدمیکروبی نشان داد.
شناسایی ماکروسکوپی و میکروسکوپی
جدایه‌های اکتینوباکتر دارای کلنی‌های سفت و گچی بودند (شکل-1). مشخصـات میکروسـکوپی اکتینوباکترها در شکل-2 که حاوی میسـلیوم هـوایی بودند و همچنین وضـعیت اسـپور و شـکل انشـعابات اسـپور نشان داده شده‌اند.
ویژگی‌های بیوشیمیایی جدایه منتخب اکتینومیست
جدایه منتخب کاتالاز مثبت و محدوده رشد آن در سدیم کلراید (10%-V/W) است. محدوده دمایی جدایه در دمای 30 -28 درجه سانتی‌گراد و بهینه pH آنها 2/7 بود. هیدرولیز ژلاتین و نشاسته، منفی و اوره و لستیناز مثبت بود. سایر اطلاعات در جدول-1 آمده است. با توجه به نتایج آنالیز بیوشیمیایی نام جنس باکتری استرپتومایسس تعیین شد.
تولید اگزوپلیساکارید جدایه منتخب
سویه منتخب قادر به تولید 3-8/2 گرم بر لیتر بیشترین تولید اگزوپلیساکارید در محیط BHI براث با 2 درصد ساکارز به مدت 9 روز در انکوبه شیکردار در دمای 30-28 درجه سانتی‌گراد با rpm 200 مشاهده شد (شکل-3).
بررسی خاصیت بازدارندگی اگزوپلیساکارید جدایه منتخب
نتایج خواص ضدمیکروبی اگزوپلیساکارید تولیدشده توسط جدایه با کد شماره 1، در غلظت 200 درصد (200 میکرولیتر)، هاله عدم رشد در باکتری‌های بیماری‌زای Staphylococcus aureus 15 میلی‌متر، Escherichia coli 18 میلی‌متر، Salmonella Typhimurium 15 میلی‌متر و Bacillus subtilis در غلظت‌های 200 درصد و 150 درصد (200 و 150 میکرولیتر) به‌ترتیب 25 و 15 میلی‌متر هاله عدم رشد مشاهده شد. بیشترین هاله عدم رشد در باسیلوس سوبتیلیس مشاهده شد (شکل-4).
جدول 1- نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی جدایه منتخب
Table 1- Results of biochemical tests of selected isolates
|
نوع آزمون |
نتایج |
نوع آزمون |
نتایج |
نوع آزمون |
نتایج |
|
کاتالاز |
+ |
هیدرولیز نشاسته |
- |
فروکتوز |
- |
|
اکسیداز |
- |
لستیناز |
+ |
گزیلوز |
+ |
|
هیدرولیز اوره |
+ |
احیای نیترات |
+ |
رافینوز |
+ |
|
احیا نیترات |
- |
ژلاتیناز |
- |
آرابینوز |
+ |
|
حرکت |
- |
تولید ملانین |
- |
ساکارز |
+ |
|
اندول |
- |
DNase |
- |
محدوده pH |
2/7 |
|
تجزیة توئین |
- |
گلوکز |
- |
|
|
شکل 3- اگزوپلیساکارید خشک‌شده جدایه منتخب
Figure 3- Dried EPS of the selected isolate
|
|
|
|
باکتری باسیلوس سوبتیلیس |
باکتری سالمونلا تیفی موریوم |
|
|
|
|
باکتری استافیلوکوکوس اورئوس |
باکتری اشریشیا کلای |
شکل 4- هاله عدم رشد در سویه‌های مورد آزمون
Figure 4- Inhibition zone in the test strains
Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli
جدول 2- نتایج آزمون MIC اگزوپلیساکارید جدایه منتخب
Table 2- The results of the MIC test of the selected isolate EPS
|
نوع ماده |
10 |
9 |
8 |
7 |
6 |
5 |
4 |
3 |
2 |
1 |
چاهک |
|
اگزوپلیساکارید |
05/0 گرم بر میلی‌لیتر |
0 گرم بر میلی‌لیتر |
0003/0 گرم بر میلی‌لیتر |
0007/0 گرم بر میلی‌لیتر |
001/0 گرم بر میلی‌لیتر |
003/0 گرم بر میلی‌لیتر |
006/0 گرم بر میلی‌لیتر |
012/0 گرم بر میلی‌لیتر |
025/0 گرم بر میلی‌لیتر |
05/0 گرم بر میلی‌لیتر |
غلظت اگزوپلیساکارید |
|
اگزوپلیساکارید |
کنترل - |
کنترل + |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
اشریشیا کلای |
|
اگزوپلیساکارید |
کنترل - |
کنترل + |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
باسیلوس سوبتیلیس |
|
اگزوپلیساکارید |
کنترل - |
کنترل + |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
سالمونلا تیفی موریوم |
|
اگزوپلیساکارید |
کنترل - |
کنترل + |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
استافیلوکوکوس اورئوس |
نتایج MIC-MBC
کمترین غلظت از محلول اگزوپلیساکارید مدنظر که مانع رشد باکتری‌های بیماری‌زا شد، به‌عنوان MIC گزارش شد. نتایج MIC در جدول-2 آورده شده‌اند.
باکتری Escherichia coli در چاهک اول و دوم رشد نکرد و چاهک دوم (025/0 گرم بر میلی‌لیتر) که چاهک ماقبل چاهک رشد است، به‌عنوان MIC گزارش شد. Salmonella Typhimurium نیز مشابه Escherichia coli جواب داد. باکتری Staphylococcus aureus در چاهک اول (05/0 گرم بر میلی‌لیتر) رشد نداشت. باکتری Bacillus subtilis در 3 چاهک اول رشد نداشت و چاهک سوم (012/0 گرم بر میلی‌لیتر) که چاهک ماقبل چاهک رشد است، به‌عنوان MIC گزارش شد.
آنالیز کمی اگزوپلیساکارید طیف‌سنجی FTIR
بررسی ساختار متابولیت تولیدشده با آزمون FTIR انجام شد که تحلیل گراف تولیدشده تأییدکنندة تولید ساختار مدنظر است. گراف به‌دست‌آمده در شکل 5 آورده شده است (شکل-5).
نوار جذبی cm-1 3431 نشان‌دهندة تعداد زیادی گروه‌های هیدروکسیل (-OH) است؛ بنابراین، پلیمر خالص پلی‌ساکارید است. در cm-1 2921 ، cm-1 1632 و cm-1 1243 به‌ترتیب مربوط به پیوند (C-H)، پیوند (C=O) و پیوند (C-O-C) است.
آنالیز کیفی اگزوپلیساکارید با آزمون UV-Vis
اگزوپلیساکارید جدایه منتخب با آزمون طیف‌سنجی UV-Vis بررسی شد (شکل -6).
همان‌طور که در طیف مشاهده می‌شود، طول موج ماکزیمم 267 نانومتر است و آنالیز کمی میزان تولید اگزوپلیساکارید است. در این محدوده احتمال انتقالات در گروه‌های کربوکسیل، کربونیل، آمین و استری وجود دارند که نشان‌دهندة کونژوگه‌شدن با پروتئین‌ها است. در طیف رزونانس مغناطیسی هسته مربوط به اگزوپلیساکارید در ناحیه 3-2 پروتون‌های پلی‌ساکارید مشاهده می‌شوند و در ناحیه 3-4 رزونانس پروتون وضعیت آنومریک را تأیید می‌کند.
شکل 5- گراف آنالیز FTIR اگزوپلیساکارید تولیدشده توسط جدایه منتخب
Figure 5- FTIR analysis graph of theEPS produced by selected isolated
شکل 6- طیف UV-Vis اگزوپلیساکارید جدایه منتخب
Figure 6- UV-Vis spectrum of selected isolated EPS
آنالیز کیفی اگزوپلیساکارید با آزمون HPLC
اگزوپلیساکارید جدایه منتخب با آزمون کروماتوگرافی HPLC بررسی شد. کروماتوگرام به‌دست‌آمده در شکل-7 آورده شده است.
نتایج براساس استانداردها نشان دادند اگزوپلیساکارید 6 مونوساکارید رامینوز، مانوز، گلوکز ، فروکتوز، گالاکتوز و آرابینوز است و درواقع یک هتروپلی‌ساکارید است.
آنالیز ساختار مولکولی اگزوپلیساکارید با آزمون TGA
اگزوپلیساکارید جدایه منتخب با آزمون حرارتی TGA بررسی شد (شکل-8).
کاربرد اگزوپلی‌ساکاریدها تا حد زیادی به رفتار حرارتی آنها بستگی دارد. تجزیه و تحلیل گرماسنجی براساس کاهش وزن مواد به‌عنوان تابعی از دما است؛ بنابراین، ویژگی حرارتی یک مشخصه مهم برای کاربرد تجاری پلی‌ساکارید‌ها است. همان‌طور که در شکل نشان داده شده است، اولین مرحله حدود 24 درصد کاهش وزن در دامنه 120-30 درجه است که مربوط به کاهش وزن حذف آب و تخریب کربوکسیل است. در مرحله بعد، کاهش وزن تا 40 درصد در محدوده 500-120 درجه اتفاق می‌افتد که به تخریب پلی‌ساکارید نسبت داده می‌شود. تفاوت ساختار اگزوپلی‌ساکاریدها تفاوت پایداری حرارتی را نشان می‌دهد و در صنایع غذایی اهمیت پیدا می‌کند.
شکل 7- کروماتوگرامHPLC اگزوپلیساکارید جدایه منتخب
Figure 7- HPLC chromatogram of selected isolated EPS
شکل 8- گراف TGA اگزوپلیساکارید جدایه منتخب
Figure 8 - TGA graph of selected isolated EPS
تکثیر توالی ژن16srRNA توسط واکنش PCR
نتایج الکتروفورز نمونه‌ها براساس پرایمرهای استفاده‌شده برای انجام واکنش PCR باند 1520 جفت‌بازی روی ژل آگارز 1 درصد است که تکثیر ژن مدنظر را نشان داد.
شناسایی مولکولی جدایه منتخب
تصویر درختچه (شکل-9) براساس متد Neighbor joining به روش اختلاف نوکلئوتیدی رسم شد که نشان‌دهندة شباهت 100 درصدی جدایه فوق با طول قطعه 1520 جفت‌باز نوکلئوتیدی با باکتری استرپتومایسس به شماره KJ854396 است و در رسم دندروگرام فیلوژنتیک در یک شاخه قرار می‌گیرند.
شکل 9- نتایج حاصل از ترسیم دندروگرام فیلوژنتیک، تعیین توالی و درختچه فیلوژنتیک که شباهت به استرپتومیست‌ها را نشان می‌دهد. رسم درختچه براساس متد neighbor joining به روش اختلاف نوکلئوتیدی رسم شد که نشان‌دهندة میزان شباهت نوکلئوتیدها براساس نرم‌افزار MEGA X است.
Figure 9- The results of drawing the phylogenetic dendrogram and determining the sequence and the phylogenetic tree show a similarity to Streptomyces. The tree was drawn based on the neighbor-joining method using the nucleotide difference method, which shows the degree of nucleotide similarity based on the MEGA X software.
بحث
با توجه به استفاده بیش‌ازحد و بی‌رویه از آنتی‌بیوتیک‌ها، بسیاری از عوامل بیماری‌زا به درمان آنتی‌بیوتیکی مقاوم شده‌اند. این عوامل بیماری‌زا با داشتن تعداد زیادی از ژن‌های مقاومت به آنتی‌بیوتیک در بین ژنوم اصلی و پلاسمیدها سبب محدودشدن انتخاب‌های درمانی شده‌اند (20). امروزه مطالعات بسیار زیادی برای کشف و توسعه آنتی‌بیوتیک‌های جدید به‌عنوان عامل مؤثر در برابر عوامل بیماری‌زای کشنده مورد نیاز است. اکتینومایست‌ها با ارزش‌ترین میکروارگانیسم‌ها برای تولید و سنتز ترکیبات درمانی و آنتی‌بیوتیک‌های جدید هستند. مطالعات زیادی توسط دانشمندان برای جداسازی اکتینومیست‌ها، به‌عنوان منبع اصلی تولیدکنندة آنتی‌بیوتیک‌ها و متابولیت‌های ثانویه متنوع انجام شده است؛ اما در دو دهه گذشته میزان کشف متابولیت‌های جدید جداشده از اکتینومایست‌های بارز اعضای جنس استرپتومایسس‌ها کاهش یافته است؛ بنابراین، اکتینومیست‌های کمیاب به‌عنوان منابع جدید متابولیت فعال زیستی درخور توجه قرار گرفته‌اند (21). الیباکس و همکاران (2019) از نمونه آب‌های ساحلی جزیره موریس گونه‌های باکتریایی تولیدکنندة اگزوپلیساکارید با خواص ضدباکتریایی در برابر جنس اسنیتوباکتر را جداسازی کردند و درنهایت جدایه‌ها را با آنالیز مولکولی و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک شناسایی کردند (22). فاطمه نهال و همکاران (2019) خصوصیات تولید بالا و فعالیت ضدمیکروبی اگزوپلی‌ساکاریدها از لاکتوکوکوس لاکتیک شیر شتر را بررسی کردند (23). پالانیاپان سیدویا و همکاران (2018) سنتز سبز نانوذرات نقره به همراه اگزوپلیساکارید به‌عنوان ماده واسط را انجام دادند و خواص ضدباکتریایی آن را بررسی کردند (24). کووان کیما و همکاران ( 2013) اگزوپلیساکارید خارج سلولی یک اکتینوباکتر دریایی را بررسی کردند که ممکن است به‌عنوان منبع جدیدی از آنتی‌اکسیدان طبیعی با ارزش بالقوه برای سلامتی، غذا و درمان بررسی شود (25). در این تحقیق هاله عدم رشد پاتوژن‌ها به نسبت دیگر پژوهش‌های انجام‌شده به‌مراتب بیشتر بود و هاله عدم رشد 35 میلی‌متر در باکتری E.coli بود که مزیت مهمی در اکتینوباکترهای نمک‌دوست تولیدکنندة اگزوپلیساکارید در این پژوهش است. همچنین، تاکنون در داخل کشور روی جداسازی و شناسایی انواع باکتری‌های تولیدکنندة اگزوپلیساکارید در دریاچه نمک قم کار تحقیقی انجام نشده است. شناسایی و تعیین ویژگی‌های متابولیت اکتینومایست‌ها به‌خصوص استرپتومیست‌های نمک‌دوست، زمینه پژوهشی جدید و تازه‌ای محسوب می‌شود؛ بنابراین، انجام این تحقیق قدم‌های مؤثری در تهیه اطلاعات لازم و مفید برای به‌کارگیری این ریزموجودات در تولید اگزوپلی‌ساکاریدهای ضدمیکروبی و کاربردی‌کردن این محصولات زیستی در صنایع دارویی و غذایی است. گونه‌های باکتری استرپتومایسس منبع اصلی آنتی‌بیوتیک‌های مهم بالینی هستند. اکثر این ترکیبات بسیار پیچیده و توسط شیمی ترکیبی سنتز می‌شوند. ازلحاظ ساختاری و عملکردی ترکیبات فعال زیستی متنوعی از اکتینومیست‌ها به‌عنوان آنتی‌بیوتیک‌ها با عنوان ضدباکتری، ضدقارچ و ضدانگل جدا شده‌اند (26). مطالعات زیادی توسط دانشمندان برای جداسازی اکتینومیست‌ها انجام شده است؛ اما در دو دهه گذشته میزان کشف متابولیت‌های جدید جداشده از اکتینومیست‌های بارز اعضای جنس استرپتومایسس‌ها کاهش یافته است؛ بنابراین، اکتینومیست‌های کمیاب به‌عنوان منابع جدید متابولیت فعال زیستی درخور توجه قرار گرفته‌اند (27). اکتینوباکترها یکی از اصلی‌ترین منابع ترکیبات زیست‌فعال طبیعی به‌ویژه آنتی‌بیوتیک‌ها هستند و نزدیک به دو سوم آنتی‌بیوتیک‌های موجود در بازار منشأ اکتینوباکتریایی دارند. اکتینوباکترها باوجود شباهت‌های مورفولوژیکی با قارچ‌ها، به‌دلیل داشتن برخی ویژگی‌های اختصاصی باکتری‌ها ازجمله ساختار دیواره سلولی، وجود پپتیدوگلیکان و محتوای ژنومی تک کروموزومی با درصد G+C بالا، جزء سلسله باکتری‌ها محسوب می‌شوند (28). به‌عنوان یکی از بزرگ‌ترین راسته‌های باکتریایی در جدیدترین تقسیم‌بندی‌های فیلوژنتیکی، در 6 کلاس و 20 راسته به همراه 66 خانواده قرار گرفته‌اند. مهم‌ترین و شناخته‌شده‌ترین جنس‌های اکتینوباکترها شامل نوکاردیا، مایکوباکتریوم، کورینه باکتریوم، استرپتومایسس و رودوکوکوس هستند که به‌دلیل کاربردهای دارویی، پزشکی، بیوتکنولوژی و صنعتی و در موارد کمتر به‌دلیل بیماری‌زایی شایان توجه قرار گرفته‌اند (29). با توجه به توانایی اکتینوباکترها در سازگاری و زندگی در محیط‌های مختلف و پیدایش مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی در باکتری‌ها و همچنین کاهش روزافزون منابع جدید برای جداسازی ترکیبات دارویی، توجه محققان را به خود جلب کرده‌اند (30). اکثر متابولیت‌های تولیدشده توسط اکتینوباکترهای هالوفیلیک، مربوط به جنس استرپتومایسس است و حدود 50 درصد از کل آنتی‌بیوتیک‌های تولیدشده را سنتز می‌کنند (31). مشخصات ساختاری پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی مانند وزن مولکولی، تعداد و اتصالات ساکاریدی می‌تواند نقش مهمی در کاربرد وسیع آنها در صنایع مختلف داشته باشند. در دهه‌های اخیر، پلی‌ساکاریدهای خارج سلولی ریزموجودات جایگزین پلی‌ساکاریدهای گیاهی شده‌اند که به مقدار فراوان و با درجه خلوص بالاتری به دست می‌آیند. اگزوپلی‌ساکاریدها در هنگام رشد باکتری‌ها توسط باکتری‌های مختلف تولید می‌شوند. مطالعات مختلف نشان می‌دهد توانایی تولید اگزوپلیساکارید در میان باکتری‌ها بیشتر از قارچ‌ها و مخمرها است (4). اثر باکتری‌های مولد اگزوپلیساکارید بر خصوصیات فیزیکی ریزوسفر خاک نشان می‌دهد کلنیزاسیون متراکم ریزوسفر گیاه همراه باکتری مولد اگزوپلیساکارید با خاکدانه‌سازی و پایداری خاک چسبیده به ریشه همراه بوده است. همچنین، جوانه‌زنی بذر در گیاهان همراه با کاربرد اگزوپلیساکارید باکتریایی بهبود یافته است. این باکتری‌ها در خاک‌های شور اگزوپلیساکارید بیشتری تولید می‌کنند و باعث افزایش دانه‌بندی اطراف ریشه گیاهان در خاک شور می‌شوند. در تحقیق حاضر می‌توان رشد گیاه تحت تنش شوری را توسط سویه منتخب جداسازی‌شده افزایش داد. همچنین، اگزوپلی‌ساکاریدها طیف گسترده‌ای از کاربردهای بالقوه را در فناوری زیستی نوین به‌ویژه در پزشکی و داروسازی به‌عنوان عوامل ضدحساسیت دارند (32). اگزوپلیساکارید باکتری‌های شورپسند دارای ثبات در درجه حرارت و همچنین اگزوپلی‌ساکریدهای با وزن مولکولی کم و بار منفی بیشتر می‌توانند پاسخ ایمنی را در میزبان انسان نسبت به باکتری‌های بیماری‌زا بهبود بخشند. حضور گروه‌های فسفات و آهنی می‌تواند فعالیت بیولوژیکی ضدمیکروبی و ضدسرطانی اگزوپلیساکارید را بهبود ببخشد. این مکانیزم که توسط اگزوپلی‌ساکاریدها روی عوامل بیماری‌زای میکروبی کار می‌کند و بر سیستم ایمنی ذاتی تأثیر می‌گذارد، خیلی پیچیده است و هنوز به‌خوبی شناخته نشده است؛ بنابراین، تحقیقات بیشتری لازم است؛ به‌ویژه روی مکانیسم‌هایی که در آن اگزوپلی‌ساکاریدها اثرات خود را می‌گذارند (33).
نتیجه‌گیری
نتایج حاصل نشان می‌دهند خاک اطراف ریشه گیاهان دریاچه نمک قم دارای اکتینومیست‌های نمک‌دوست مولد اگزوپلیساکارید با خواص ضدمیکروبی است. بررسی و مقایسه پژوهش حاضر و پژوهش‌های مشابه ازجمله جداسازی سویه‌های اکتینومیست تولیدکنندة اگزوپلیساکارید، آنالیز ساختاری اگزوپلیساکارید و بررسی خصوصیات ضدباکتریایی جدایه حاضر تأییدکنندة صحت نتایج پژوهش حاضر و همچنین انتخاب درست نوع پژوهش و مکان نمونه‌برداری است.
)