بررسی فعالیت بتالاکتامازی طیف گسترده (ESBL) و AmpC بتالاکتامازی در سویه سودموناس آئروژینوزا جداشده از نمونه‌های بالینی

نوع مقاله : پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد ورامین-پیشوا، دانشگاه آزاد اسلامی، ورامین، ایران

2 دانشگاه آزاد اسلامی واحد ورامین-پیشوا، ورامین، ایران

چکیده

 سودوموناس آئروژینوزا یکی از میکروارگانیسم‌های فرصت‌طلب است که باعث عفونت در بیماران مختلف می‌شود. مقاومت ذاتی گسترده و افزایش مقاومت اکتسابی این باکتری به آنتی‌بیوتیک‌ها، درمان عفونت‌های ناشی از این میکروارگانیسم را به یک چالش تبدیل می‌کند. هدف از این مطالعه بررسی فعالیت بتالاکتامازی ESBLs و AmpC و همچنین بررسی وجود ژن‌های دخیل در تولید این آنزیم‌ها در سودوموناس آئروژینوزا است. تعداد 55 سویه سودوموناس آئروژینوزا جداشده از بیماران بالینی به روش‌های بیوشیمیایی تعیین هویت شده‌اند. سپس الگوی مقاومت آنتی‌بیوتیکی آنها به روش انتشار از دیسک مشخص شد. سویه‌های مولد ESBLs به روش دیسک ترکیبی و AmpC به روش فنوتیپی سینرژیسم دو دیسک ارزیابی شدند. همچنین برای تشخیص سویه‌های حامل ژن‌های ACC، FOX، MOX، DHA، MIR، CMY، TEM، SHV و CTX از روش‌های مولکولی استفاده شد. در مطالعه حاضر با بررسی سینرژیسم دو دیسک، 8/61 درصد از سویه‌ها مولد AmpC مشاهده شدند. در این مطالعه هیچ‌یک از سویه‌های ESBLs نبودند. فراوانی هریک از ژن‌های DHA، MOX، FOX، ACC، SHV و CTX به‌ترتیب 9/30، 7/12، 8/81، 3/27، 5/5 و 5/5 درصد و ژن‌های MIR، CMY و TEM در این مطالعه در هیچ‌یک از سویه‌ها مشاهده نشدند. نتایج بیان‌کنندة فراوانی ژن FOX در بین سویه‌ها و مقاومت بیشتر این سویه‌ها نسبت به آنتی‌بیوتیک مروپنم بود؛ فعالیت AmpC بتالاکتامازی عاملی مهم در ایجاد مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌ها ارزیابی شد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Evaluation of Extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) and AmpC beta-lactamase activity in Pseudomonas anrogenase isolated from clinical specimens

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Noorbakhsh 1
  • Erphaneh Ghobakhloo 1
  • Fahimeh Baghbani Arani 2
1 Department of Microbiology, Biological Sciences College, Varamin-Pishva Branch, Islamic Azad University, Varamin-Pishva, Iran
2 Department of Genetic, Biological Sciences College, Varamin-Pishva Branch, Islamic Azad University, Varamin-Pishva, Iran
چکیده [English]

Pseudomonas aeruginosa is one of the most common opportunistic microorganisms causing infections in a wide variety of patients. Increasing intrinsic and acquired resistance to antibiotics is a global challenge for the treatment of infections. The aim of this study is to evaluate the extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) and AmpC beta-lactamase activity of Pseudomonas anrogenase isolated from clinical specimens. In this research 55 strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from clinical patients were identified by biochemical methods and then their antibiotic resistance pattern was determined by diffusion method. The strains producing ESBLs were evaluated by combined test and AmpC by the double synergism phenotypic method. Molecular methods were also used to detect strains carrying ACC, FOX, MOX, DHA, MIR, CMY, TEM, SHV and CTX genes. In this study, the highest resistance was to the antibiotic meropenem (52.7%) and the lowest resistance was to the antibiotic colistin (1.8%). When the synergism of the double discs was examined, 61.8% of the strains were found to produce AmpC. None of the strains in this study were ESBLs. The frequencies of DHA, MOX, FOX, ACC, SHV and CTX genes were 30.9%, 12.7%, 81.8%, 27.3%, 5.5% and 5.5%, respectively. MIR, CMY and TEM genes were not observed in any of the strains in this study. The results showed the frequency of the FOX gene among the strains and the greater resistance of these strains to the antibiotic meropenem, and AmpC β-lactamase activity was evaluated as an important factor in the occurrence of antibiotic resistance.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Pseudomonas aeruginosa
  • combined disc test
  • double disc synergism test
  • AmpC
  • ESBL

اصل مقاله

مقدمه

سودوموناس‌‌ها جزء مهم‌ترین باکتری‌های گرم منفی و متعلق به شاخه پروتئوباکتریا، رده گاماپروتئوباکترها هستند. اعضای جنس سودوموناس، در همه جا وجود دارند‍‍؛ در خاک، مواد آلی درحال فساد، پوشش گیاهی، آب، محیط بیمارستان، مخازن مرطوب مانند وان دستشویی، توالت‌ها، زمین‌شورها، وسایل درمان تنفسی و دیالیز و حتی در محلول‌های ضدعفونی‌کننده یافت می‌شوند (1, 2). عفونت‌های ناشی از این باکتری به صورت‌های گوناگونی مانند عفونت‌های تنفسی در محیط‌های بیمارستانی و به‌خصوص به‌صورت ذات‌الریه انتقالی از سیستم تهویه، عفونت‌های سیستمیک، عفونت‌های دستگاه گوارش، عفونت در استخوان‌ها و مفاصل و درماتیت ظهور می‌کنند. این باکتری غالباً به‌صورت مزمن کلونیزه می‌شود و این خود منجر به تخریب بافت‌های ریه و کاهش فعالیت‌های ریوی می‌شود (3, 4).

سودوموناس آئروژینوزا یکی از مهم‌ترین ارگانیسم‌های مقاوم در برابر عوامل آنتی‌بیوتیکی است. این باکتری از مهم‌ترین عوامل ایجاد عفونت در بیماران بستری‌شده در بیمارستان‌ها است که معمولاً به‌صورت باکتریمی و ذات‌الریه خود را نشان می‌دهد. سودوموناس آئروژینوزا علاوه بر اینکه ذاتاً در مقابل آنتی‌بیوتیک‌ها مقاوم است، این قابلیت را دارد تا در برابر آنتی‌بیوتیک‌های جدید، خاصیت مقاومتی خود را حفظ و به‌روزرسانی کند (5).

بهترین گزینه برای درمان بسیاری از عفونت‌های باکتریایی استفاده از آنتی‌بیوتیک‌های خانواده بتالاکتام است؛ با این حال، باکتری‌های گرم منفی قادرند با تولید آنزیم بتا-لاکتاماز نسبت به این آنتی‌بیوتیک‌ها مقاومت کسب کنند. آنزیم‌های بتالاکتاماز قادرند حلقه بتالاکتام را هیدرولیز کنند و به این ترتیب آن را غیرفعال کنند (6). دو سیستم طبقه‌بندی اصلی برای آنزیم‌های بتالاکتاماز شامل سیستم‌ Ambler و سیستم Bush-Jacoby وجود دارند. در سیستم Ambler، آنزیم‌های بتالاکتاماز براساس همولوژی توالی اسید آمینه از A تا D طبقه‌بندی می‌شوند. در سیستم Bush-Jacoby براساس پروفایل هیدرولیز سوبسترا (پنی‌سیلین، سفالوسپورین، سفالوسپورین با طیف گسترده، کارباپنم) و همچنین مهارکننده (مهارکننده‌های بتالاکتاماز کلاولانات و تازوباکتام) به گروه‌های 1 تا 4 طبقه‌بندی می‌شوند (7).

بتالاکتامازهای کلاس A، C و D ازطریق مکانیسم سرین عمل می‌کنند و شباهت ساختاری بالایی دارند. بتالاکتامازهای کلاس B ازطریق یون Zn2+ عمل می‌کنند و به‌عنوان متالو بتالاکتامازها (MBLs) شناخته می‌شوند (8).

در باکتری‌های گرم منفی، آنزیم‌های وسیع‌الطیفی مانند TEM-1 و SHV-1 به‌دنبال معرفی سفالوسپورین‌های نسل اول و دوم به وجود آمدند (9). متعاقباً، آنتی‌بیوتیک‌های بتا-لاکتام وسیع‌الطیف مانند سفتازیدیم و سفوتاکسیم معرفی شدند که در برابر هیدرولیز توسط این آنزیم‌ها مقاوم بودند. استفاده گسترده از این آنتی‌بیوتیک‌ها منجر به تکامل بتالاکتامازهای جدیدی شد که این داروها را هیدرولیز می‌کند که ESBL نامیده شدند (10). این گروه ازنظر اپیدمیولوژیک در سراسر جهان پراکنده‌اند و از کلاس A بتالاکتامازها محسوب می‌شوند (11). آنزیم‌های ESBL عموماً شامل موتانت‌های ایجادشده از TEM و SHV هستند و قدرت هیدرولیتیک محدودتری دارند (12). بتالاکتامازهای نوع AmpC شامل ACC، DHA، FOX، MOX، ACT، BIL، LAT و CMY هستند که در گروه C قرار می‌گیرند (13). تمامی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا دارای ژن AmpC هستند که توسط بتالاکتام‌ها القاء می‌شوند. از معروف‌ترین بتالاکتامازهای سودوموناس آئروژینوزا می‌توان PSE-1 و PSE-4 را نام برد. گروه دیگری از بتالاکتامازها شامل SHV، ESBLs و OXA بازه گسترده‌ای از مقاومت را در سودوموناس آئروژینوزا ایجاد می‌کنند. از میان این گروه‌ها، ESBLها بیشتر فعال‌اند و بعضی گونه‌های آنها مانند OXA، تقریباً در تمامی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا یافت می‌شوند (14).

بیان ژن‌های AmpC در جنس‌های گرم منفی مختلف متفاوت بوده و ممکن است به‌صورت القایی یا غیرالقایی روی دهد. آنزیم‌های DHA-1،DHA-2،ACD-1،CMY-3، CFE-1از آمپی‌سیلینازهای القایی هستند. گونه‌های انتروباکتر، سیتروباکتر فرئوندی ای، سراشیا مارسیسنس، مورگانلا مورگانی‌ای و سودوموناس آئروژینوزا ازجمله ارگانیسم‌هایی هستند که تولید آنزیم در آنها به‌صورت القایی روی می‌دهد. ایزوله‌های واجد آمپی‌سیلینازهای القایی مقاومت خاصی در برابر سفوکسیتین دارند (15).

افزایش ظهور گونه‌های سودوموناس آئروژینوزا دارای مقاومت آنتی‌بیوتیکی، به‌خصوص مقاومت چنددارویی، مشکلات بسیاری درزمینة درمان عفونت‌های ناشی از آنها ایجاد کرده است. علاوه بر این، بررسی‌ها نشان داده‌اند ارتباط مستقیمی بین مقاومت سودوموناس آئروژینوزا به آنتی‌بیوتیک‌ها و مصرف آنتی‌بیوتیک‌ها وجود دارد (12، 13). ژن‌های ESBL در بروز مقاومت‌های چندگانه به دیگر آنتی‌بیوتیک‌ها نقش دارند و از همین رو بروز و انتشار ژن‌های مختلف ESBL مشکلات بسیاری در درمان عفونت‌های ناشی از آنها ایجاد می‌کند (12). با توجه به شیوع مقاومت در سویه‌های سودوموناس ائروژینوزا، به‌عنوان یکی از عوامل اصلی عفونت‌های بیمارستانی، در تحقیق حاضر میزان مقاومت آنتی‌بیوتیکی، فعالیت بتالاکتامازی طیف گسترده (ESBL)، فعالیت AmpC بتالاکتامازی و همچنین فراوانی ژن‌های دخیل در القای مقاومت در سویه سودموناس آنروژینوزا جداشده از نمونه‌های بالینی ارزیابی شد.

 مواد و روش‌ها

نمونه‌گیری

این مطالعه روی سودوموناس ائروژینوزاهای جداشده از 120 نمونه بالینی بیماران مراجعه‌کننده به بیمارستان میلاد تهران به‌صورت سرپایی و بستری از تاریخ اردیبهشت ماه 1401 تا مرداد ماه 1401 انجام شد. نمونه‌ها روی محیط‌های کشت بلاد آگار، EMB آگار و مک کانکی آگار کشت داده و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 48-24 ساعت انکوبه شدند. در آزمایشگاه برای شناسایی و جداسازی باکتری سودوموناس آئروژینوزا رنگ‌آمیزی گرم، تست‌های بیوشیمیایی افتراقی شامل SIM، TSI، MR-VP، سیمون سیترات، اکسیداز و کاتالاز انجام شدند.

تعیین مقاومت آنتی‌بیوتیکی

این تست به روش دیسک دیفیوژن (کربی-بائر) براساس استانداردهای CLSI انجام شد. بر این اساس سوسپانسیون میکروبی استاندارد با غلظت نیم مک فارلند از هر جدایه سودوموناس آئروژینوزا تهیه شد و به‌صورت چمنی بر سطح محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده شدند. سپس دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی شامل آمیکاسین (30 میکرولیتر)، سفتازیدیم (30 میکرولیتر)، مروپنم (10 میکرولیتر)، سیپروفلوکساسین (5 میکرولیتر)، لووفلوکساسین (10 میکرولیتر)، پیپراسیلین (100 میکرولیتر)، کولیستین (10 میکرولیتر) و جنتامیسین (10 میکرولیتر) (شرکت پادتن طب) به فاصله حداقل 2 سانتی‌متر از یکدیگر روی محیط کشت قرار داده شدند. سپس پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. با استفاده از خط‌کش، قطر هاله عدم رشد برحسب میلی‌متر اندازه گرفته و میزان حساسیت باکتری نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها به‌صورت حساس، نیمه‌حساس و مقاوم گزارش شد.

از سویه سودوموناس آئروژینوزا ATCC  27853 به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد (16).

 تشخیص فنوتیپ ESBL با روش دیسک ترکیبی

 پس از انجام تست تعیین حساسیت آنتی‌بیوتیکی، سویه‌های مقاوم به یکی از سفالوسپورین‌های نسل سوم مطالعه‌شده برای تشخیص فنوتیپ ESBL با روش دیسک ترکیبی انتخاب شدند. برای انجام این مرحله دیسک‌های سفتازیدیم (30 میکرولیتر) و سفوتاکسیم (30 میکرولیتر) و دیسک کلاونیک اسید (10 میکرولیتر) (شرکت پادتن طب) به فاصله 20 میلی‌متری روی کشت چمنی جدایه‌های مدنظر روی محیط آگار قرار داده شدند. پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، اگر افزایش قطر هاله مربوط به کلاونیک نسبت به هریک از آنتی‌بیوتیک‌ها در مقایسه با قطر هاله آنها به تنهایی به میزان 5 میلی‌متر بود، تأییدکنندة وجود ESBLs است (17).

جدول 1. پرایمرهای استفاده‌شده در PCR

Table 1. primers used in PCR

منبع

bp

توالی پرایمر

ژن

(19)

870

F: TGG CCG TTG CCG TTA TCT AC

R: CCC GTT TTA TGC ACC CAT GA

CMY

(19)

405

F: AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG T

R: CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC

DHA

(19)

520

F: GCT GCT CAA GGA GCA CAG GAT

R: CAC ATT GAC ATA GGT GTG GTG C

MOX

(19)

190

F: AAC ATG GGG TAT CAG GGA GAT G

R: CAA AGC GCG TAA CCG GAT TGG

FOX

(19)

302

F: TCG GTA AAG CCG ATG TTG CGG

R: CTT CCA CTG CGG CTG CCA GTT

MIR

(19)

346

F: AAC AGC TCT AGC AGC CGG TTA

R: TTC GCC GCA ATC ATC CCT AGC

ACC

(20)

454

F: TCG CCG CAT ACA CTA TTC TCA GAA TG

R: ACG CTC ACC GGC TCC AGA TTT AT

TEM

(20)

747

F: ATG CGT TAT ATT CGC CTG TG

R: TGC TTT GTT CGG GCC AA

SHV

(20)

593

F: ATG TGC AGY ACC AGT AA? GTK ATG GC

R: TGG GT AA TA GT ACC AGA AC AGC G

CTX

 

 تست سینرژیسم دو دیسک (DDS) برای بررسی سویه‌های AmpC

در تست [1]DDS، یک دیسک سفتازیدیم و یک دیسک سفوکسیتین به فاصله 20 میلی‌متری روی کشت چمنی جدایه‌های مدنظر روی محیط آگار قرار داده شدند. پس از 24 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتی‌گراد پلیت‌ها ازنظر قطر هاله تشکیل‌شده بررسی شدند. اگر در اطراف دیسک سفتازیدیم یک هاله بزرگ و اطراف دیسک سفوکسیتین هاله کوچک تشکیل شود و هاله

سفتازیدیم در سمت هاله سفوکسیتین دارای انتهای صاف باشد، تست DDS مثبت گزارش می‌شود (18).

 استخراج DNA و روش ژنوتیپی تعیین سویه‌های AmpC و ESBL

استخراج DNA به روش ستونی برحسب دستورالعمل سازنده کیت (شرکت سیناژن) انجام شد. توالی پرایمرهای مورد نیاز از مقالات استخراج‌شده و توالی آنها با نرم‌افزار BLAST در سایت NCBI بررسی شد. سپس با نرم‌افزار Oligo7 عدم تشکیل ساقه و لوپ، بررسی و برای سنتز توالی به شرکت ماکروژن کشور کره سفارش داده شد (جدول 1). به‌منظور تکثیر ژن‌های مطالعه‌شده، هر واکنش PCR با حجم نهایی 25 میکرولیتر متشکل از master mix(2X) به میزان 5/12 میکرولیتر، آب مقطر استریل به میزان 9 میکرولیتر، هرکدام از پرایمر‌ها به میزان 10 پیکومول و DNAی الگو به میزان 20 نانوگرم افزوده و با دمای دناتوره‌کنندة 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، دمای اتصال پرایمر 58 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و دمای طویل‌سازی 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و طی 30 سیکل در دستگاه ترموسایکلر قرار داده شد. با هر سری اجرایPCR ، یک کنترل مثبت و یک کنترل منفی استفاده شد.

 آنالیز آماری نتایج

برای آنالیز آماری اطلاعات جمع‌آوری‌شده از نرم‌افزار SPSS ver-22 و آزمون خی استفاده شد. مقدار P-value کمتر از 05/0 معنا‌دار در نظر گرفته شد.

نمودار 1. درصد فراوانی مقاومت آنتی‌بیوتیکی در سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا

Figure-1. frequency of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa strains

 یافته‌ها

از نمونه‌های بالینی مراجعه‌کنندگان سرپایی و بستری‌شده در بیمارستان میلاد تهران، تعداد 55 سویه سودوموناس آئروژینوزا براساس تست‌های بیوشیمیایی شناسایی شدند. براساس نتایج به‌دست‌آمده از تست مقاومت آنتی‌بیوتیکی، کمترین مقاومت سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا مطالعه‌شده نسبت به آنتی‌بیوتیک کولیستین (8/1 درصد) و بیشترین مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک مروپنم (7/52 درصد) تعیین شد (نمودار 1).

براساس نتایج به‌دست‌آمده از آزمون شناسایی فنوتیپ ESBL، در این تحقیق هیچ‌کدام از جدایه‌های سودوموناس آئروژینوزا به‌عنوان ESBL تشخیص داده نشدند. براساس نتایج به‌دست‌آمده از تست DDS نیز، 8/61 درصد (34 سویه) از جدایه‌ها به‌عنوان مولدAmpC  شناسایی شدند. علاوه بر این، ارتباط معناداری بین سویه‌های دارای مقاومت آنتی‌بیوتیکی و سویه‌های مولد AmpC مشاهده شد (p<0.001).

جدایه‌های سودوموناس آئروژینوزا به‌دست‌آمده در این تحقیق ازنظر وجود یا عدم وجود ژن‌های ACC، MIR، FOX، DHA، CMY، TEM، SHV و CTX بررسی شدند. فراوانی نسبی ژن‌های مدنظر در نمودار 2 نشان داده شده است. با توجه به نتایج به‌دست‌آمده 3/27 درصد (15 سویه) از سویه‌ها حامل ژن ACC، 8/81 درصد (45 سویه) حامل ژن FOX، 7/12 درصد (7 سویه) حامل ژن MOX، 9/30 درصد (17 سویه) حامل ژن DHA، 5/5 درصد (3 سویه) حامل ژن SHV، 5/5 درصد (3 سویه) حامل ژن CTX بودند و هیچ‌یک از سویه‌های بررسی‌شده حامل ژن‌های MIR، CMY و TEM تشخیص داده نشدند.

بررسی حضور همزمان ژن‌های مطالعه‌شده نشان داد (نمودار 3) بیشترین حضور همزمان مربوط به ژن‌های DHA و FOX (9/30 درصد) و کمترین نیز مربوط به ژن‌های ACC و MOX (8/1درصد) است. همچنین در این مطالعه ژن‌های CTX-ACC، CTX-MOX، SHV-ACC و SHV-MOX به‌صورت همزمان مشاهده نشدند.

نمودار 2. فراوانی نسبی ژن‌ها در بین سویه‌های بررسی‌شده

Figure 2. relative frequency of genes among the strains.

نمودار 3. فراوانی نسبی همزمانی ژن‌ها

Figure 3. relative frequency of gene coexistence

بررسی فراوانی ژن‌های بررسی‌شده در سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌های مدنظر در نمودار 4 نشان داده شده است. با توجه به نتایج به‌دست‌آمده مشخص شد در تمامی سویه‌های مقاوم مورد بررسی بیشترین فراوانی مربوط به ژن  FOXو کمترین فراوانی مربوط به ژن MOX بود. در این میان سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌های مروپنم بیشترین فراوانی ژن‌های مطالعه‌شده را داشتند. همچنین کمترین فراوانی ژن‌ها در سویه مقاوم به آنتی‌بیوتیک کولیستین مشاهده شد. فراوانی ژن‌های SHV و CTX در بین تمامی سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک به یک میزان (5/5 درصد) مشاهده شد. همچنین با بررسی‌های آنالیز آماری بین مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های سیپروفلوکساسین، سفتازیدیم، لوفلوکساسین، پیپراسیلین، آمیکاسین و جنتامیسین و ژن‌های SHV و CTX، بین مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های آمیکاسین و جنتامایسین و ژن ACC و بین مقاومت به آنتی‌بیوتیک جنتامایسین و ژن FOX ارتباط معناداری مشاهده شد (P value < 0.05).

 

فراوانی نسبی ژن‌ها در سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک

نمودار 4. فراوانی نسبی ژن‌ها در سویه‌های سودوموناس آئروژینوزای مقاوم به آنتی‌بیوتیک

Figure 4. relative frequency of genes in antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa strains

نمودار 5. فراوانی نسبی ژن‌ها در سویه‌های سودوموناس آئروژینوزای AmpC مثبت.

Figure 5. relative frequency of genes in AmpC positive Pseudomonas aeruginosa strains

نتایج بررسی فراوانی ژن‌های بررسی‌شده در سویه‌های سودوموناس آئروژینوزای AmpC مثبت نشان داد بیشترین فراوانی ژنی در سویه‌های AmpC مثبت مربوط به ژن FOX (8/61 درصد) و کمترین فراوانی مربوط به ژن MOX (1/9 درصد) است (نمودار 5). علاوه بر این، بین ژن‌های ACC و FOX و سویه‌های AmpC مثبت ارتباط معناداری مشاهده شد (P value < 0.05).

نتایج به‌دست‌آمده از بررسی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزای AmpC مثبت و مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌ها نشان داد بیشترین مقاومت آنتی‌بیوتیکی در بین سویه‌های AmpC مثبت نسبت به آنتی‌بیوتیک مروپنم (50 درصد) بوده و همچنین هیچ‌کدام از سویه‌های AmpC مثبت نسبت به آنتی‌بیوتیک کولیستین مقاوم نبودند (نمودار 6). بین سویه‌های AmpC مثبت و مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های سیپروفلوکساسین، مروپنم، سفتازیدیم، لوفلوکساسین، پیپراسیلین، آمیکاسین و جنتامایسین ارتباط معناداری مشاهده شد (P value < 0.05).

نمودار 6. فراوانی نسبی مقاومت آنتی‌بیوتیکی در بین سویه‌های سودوموناس آئروژینوزای AmpC مثبت.

Figure 6. relative frequency of antibiotic resistance among AmpC positive Pseudomonas aeruginosa strains.

بحث

سازمان بهداشت جهانی سودوموناس آئروژینوزا را به‌عنوان یک پاتوژن «اولویت بحرانی[2]» مقاوم به چند دارو شناسایی کرده است که در برابر آن استراتژی‌های درمانی و کنترل عفونت جدید به فوریت مورد نیاز است. امروزه، تولید آنزیم‌های بتالاکتامازها توسط سویه‌های پاتوژن‌های باکتری‌های گرم منفـی، یکـی از مهم‌ترین عوامل مقاومت به آنتی‌بیوتیک‌های بتالاکتام است. بتالاکتامازها آنزیم‌های باکتریـایی هسـتند کـه قادرنـد آنتی‌بیوتیک‌های بتالاکتام را هیدرولیز کنند و سبب بـی‌اثـرشـدن این ترکیبات شوند (21).

در مطالعه حاضر، میزان مقاومت سویه‌ها نسبت به آنتی‌بیوتیک‌های بررسی‌شده، سیپروفلوکساسین، مروپنم، سفتازیدیم، لوفلوکساسین، پیپراسیلین، کولیستین، آمیکاسین و جنتامایسین به‌ترتیب 9/30، 7/52، 8/21، 7/32، 5/25، 8/1، 3/27 و 1/29 درصد مشاهده شد. در این میان، بیشترین مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک مروپنم و کمترین مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک کولیستین مشاهده شد. طی مطالعه حیدری و همکارانش در سال 2022، مقاومت آنتی‌بیوتیکی سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا به این ترتیب گزارش شد؛ کولیستین 9/3، مروپنم 1/52، آمیکاسین 6/70، سیپروفلوکساسین 7/65، پیپراسیلین 8/59، سفتازیدیم 8/59، آزترونام 9/54، توبرامایسین 52، جنتامایسین 51، سفپیم 9/37 و پیپراسیلین تازوباکتام 2/42 درصد. همچنین در این مطالعه 60 (2/52 درصد) سویه سودوموناس آئروژینوزا از مجموع 115 سویه بررسی‌شده کارباپنماز مشاهده شدند (22). میزان مقاومت‌ها در این مطالعه نسبت به مطالعه حاضر بالاتر است. همچنین در مطالعه حیدری همانند مطالعه حاضر بیشترین حساسیت نسبت به آنتی‌بیوتیک کولیستین گزارش شده است. دلیل مقاومت بالا در این مطالعه می‌تواند به‌دلیل تفاوت در موقعیت جغرافیایی این دو مطالعه باشد؛ زیرا نمونه‌های جمع‌آوری‌شده در مطالعه حیدری و همکاران از منطقه جنوب‌غربی کشور ایران بوده است.

اثربخشی آنتی‌بیوتیک کولیستین برای سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا در سایر مطالعات نیز مشاهده شده است. این اثربخشی را می‌توان با عواملی مانند هزینه قابل توجه کولیستین، سمیت کلیوی و استفاده محدود آن در خارج از بیمارستان توضیح داد (23). گزارش‌هایی مبنی بر توصیه آمیکاسین و سیپروفلوکساسین به‌عنوان آنتی‌بیوتیک‌های مؤثر در برابر عفونت‌های بیمارستانی سودوموناس آئروژینوزا وجود دارد (24, 25). در این مطالعه نیز این گروه‌های آنتی‌بیوتیکی اثر مناسبی بر سویه‌های مطالعه‌شده داشتند.

یکی دیگر از یافته‌های مهم تحقیق حاضر، میزان مقاومت بالای 7/52 درصد در برابر آنتی‌بیوتیکی مروپنم بود. در مطالعات قبلی، میزان مقاومت به کارباپنم از 5/17 تا 100 درصد بسیار متفاوت بوده است (26-31).

طی مطالعه Hosu و همکارانش در سال 2021، مقاومت‌های آنتی‌بیوتیکی به این ترتیب گزارش شد؛ از 204 سویه بررسی‌شده با آنتی‌بیوتیک‌های مختلف، مقاومت به پیپراسیلین (2/64 درصد)، پس از آن آزترونام (8/57 درصد)، سفپیم (5/51 درصد)، سفتازیدیم (51 درصد)، پیپراسیلین/تازوباکتام (5/50 درصد)، ایمی‌پنم (6/46 درصد) جنتامایسین (3/35 درصد)، مروپنم (24 درصد) و آمیکاسین (1/20 درصد) مشاهده شد. توبرامایسین با حساسیت 7/91 درصد قوی‌ترین آنتی‌بیوتیک بود و پس از آن دوریپنم و سیپروفلوکساسین (7/88 درصد) و لووفلوکساسین (1/80 درصد) قرار گرفتند (32).

طی مطالعه Ejikeugwu و همکارانش در سال 2021، با بررسی نمونه‌های سودوموناس آئروژینوزا جداشده از منابع مختلف نتایج آنتی‌بیوگرام سویه‌ها به این صورت گزارش شد؛ سفتریاکسون 6/64 درصد، سفوکسیتین 3/80 درصد، ایمی‌پنم 7/66 درصد، سفتازیدیم 4/54 درصد، ارتاپنم 2/61 درصد، افلوکساسین 3/63 درصد، جنتامایسین 8/55 درصد، آمیکاسین 9/63 درصد، سیپروفلوکساسین 81 درصد، سفوتاکسیم 6/79 درصد، مروپنم 5/60 درصد، آمپی‌سیلین 81 درصد و آزترونام 5/58 درصد مقاومت داشتند (33).

با توجه به نتایج تست Double Disk Synergy Test برای بررسی سویه‌های AmpC مثبت در این مطالعه 8/61 درصد (34 سویه) از سویه‌ها مولد AmpC شناسایی شدند. در این مطالعه هیچ‌یک از سویه‌های بررسی‌شده ازنظر فنوتیپی ESBLs مثبت مشاهده نشدند.

طی مطالعه طهماسبی و همکارانش در سال 2018، 1/83 درصد سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا ازنظر فنوتیپی تولیدکنندة AmpC و 7/95 درصد از سویه‌ها از نوع ESBLs بودند (34). طی مطالعه Ejikeugwu و همکارانش در سال 2021، با بررسی نمونه‌های سودوموناس آئروژینوزا جداشده از منابع مختلف تولید آنزیم AmpC به روش فنوتیپی Double Disk Synergy Test بررسی شد. نتایج این تحقیق به این صورت گزارش شد، از 56 سویه جداشده از کشتارگاه 9 نمونه (1/16 درصد)، از 48 نمونه جداشده از طیور 7 نمونه (6/14 درصد) و از 43 نمونه جداشده از مقعد گاو 8 نمونه (6/18 درصد) AmpC مثبت بودند (33).

در بسیاری از مطالعات صورت‌گرفته دربارة حضور و مکانیسم فعالیت ژن‌های AmpC و خانواده‌های مختلفAmpC ، گزارش شده است حضور آنتی‌بیوتیک‌های مختلف که اثر عملکردی متفاوتی دارند، می‌تواند ژن‌های تنظیمی خانواده AmpC را به نوعی تغییر دهد که تظاهرات مقاومتی جدیدی را در پی داشته باشد. حضور ژن‌های تنظیمی مانند AmpR در سویه‌های مختلف، تأییدکنندة این مطلب است که بالابودن مقادیر حداقل غلظت مهاری سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا طی سال‌های اخیر، به‌دلیل فعالیت‌های این گروه‌های تنظیمی به‌شدت افزایش یافته است (34).

همچنین با بررسی‌های مولکولی انجام‌شده دربارة ژن‌های مربوط به تولید آنزیم‌های AmpC، 3/27 درصد سویه‌ها حامل ژن ACC، 8/81 درصد حامل ژن FOX، 7/12 درصد حامل ژن MOX و 9/30 درصد حامل ژن DHA مشاهده شدند. در بررسی‌های مولکولی انجام‌شده دربارة ژن‌های مربوط به تولید آنزیم‌های ESBLs، 5/5 درصد از سویه‌ها حامل ژن SHV و 5/5 درصد سویه‌ها حامل ژن CTX بودند. همچنین هیچ‌کدام از سویه‌ها حامل ژن TEM مشاهده نشدند. همچنین در مطالعه جمشیدی و همکاران از میان 80 سویه سودوموناس آئروژینوزا مطالعه‌شده، 5 درصد حامل ژن AmpC بودند (35). در تحقیقی که توسط طهماسبی و همکاران (2018) انجام شد، 1/22 درصد سویه‌ها حامل ژن FOX، 57/11 درصد حامل ژن ACC، 1/2 درصد حامل ژن DHA و 36/7 درصد حامل ژن MOX گزارش شدند (34). در این مطالعه نیز مانند مطالعه حاضر، بیشترین فراوانی را ژن FOX داشت. نتایج تحقیق Ejikeugwu و همکاران (2021) 2/29 درصد از سویه‌های سودوموناس آئروژینوزا حامل ژن CMY و 5/12 درصد حامل ژن FOX گزارش شدند و هیچ‌یک از سویه‌ها حامل ژن ACC و DHA نبودند (33). در مطالعه حاضر، فراوانی ژن FOX بیشتر از مطالعهEjikeugwu  و همچنین ژن‌های ACC و DHA به‌ترتیب 3/27 درصد و 9/30 درصد مشاهده شد. دلیل اختلاف در مطالعات احتمالاً به‌دلیل منبع نمونه‌برداری است. به نظر می‌رسد سویه‌های عامل بیماری در حیوانات و سویه‌های عامل بیماری در انسان متفاوت بوده‌اند و از این نظر ممکن است حامل ژن‌های متفاوتی باشند.

طی مطالعه Hong و همکارانش در سال 2019، روی باکتری‌های اشریشیاکلی و کلبسیلا پنومونیه جداشده از انسان و طیور، 4/26 درصد از سویه‌های بررسی‌شده حامل ژن CMY بوده‌اند و هیچ‌یک از سویه‌ها حامل ژن FOX، ACC و DHA مشاهده نشدند (36). ممکن است دلیل تفاوت در نوع ژن‌های عامل مقاومت، تفاوت در باکتری مطالعه‌شده در این تحقیقات باشد.

 نتیجه‌گیری

در مطالعه حاضر، سویه‌های حامل ژن‌های بررسی‌شده از مقاومت بالایی نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها برخوردار بودند. همچنین در این مطالعه بین سویه‌های AmpC مثبت و مقاومت نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها ارتباط معنی‌داری مشاهده شد. در این مطالعه مشخص شد مقاومت بتالاکتاماز طیف گسترده (ESBL) در سویه‌های مطالعه‌شده وجود ندارد و تعداد کمی از سویه‌ها حامل ژن‌های این نوع مقاومت بودند. از آنجا که اکثر مقاومت‌ها القایی هستند، به نظر می‌رسد در سال‌های اخیر آنتی‌بیوتیک‌هایی که موجب القای این نوع مقاومت می‌شوند، به مقدار کمتری در درمان استفاده شده‌اند که این مقاومت کاهش یافته است؛ اما به‌دلیل استفاده بیشتر از سفالوسپورین‌های نسل سوم این مقاومت همچنان به میزان بالایی در سویه‌های پاتوژن وجود دارد.

[1] Double Disk Synergy

[2] critical priority

مراجع

  1. Diggle SP, Whiteley M. Microbe Profile: Pseudomonas aeruginosa: opportunistic pathogen and lab rat. Microbiology, 2020; 166(1): 30-33. https://doi.org/10.1099/mic.0.000860
  2. Taghinejad J, Hosseinzadeh M, Molayi Kohneshahri S, Javan Jasor V. Pseudomonas aeruginosa: A biological review. Laboratory & Diagnosis, 2017; 8(34): 67-82. http://labdiagnosis.ir/article-1-202-en.html [In Persian].
  3. Ruedas-López A, Alonso-García I, Lasarte-Monterrubio C, Guijarro-Sánchez P, Gato E, Vázquez-Ucha JC, et al. Selection of AmpC β-lactamase variants and metallo-β-lactamases leading to ceftolozane/tazobactam and ceftazidime/avibactam resistance during treatment of MDR/XDR Pseudomonas aeruginosa infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2022; 66 (2): e02067-21. https://doi.org/10.1128/aac.02067-2
  4. Jangra V, Sharma N, Chhillar AK. Therapeutic approaches for combating Pseudomonas aeruginosa Infections. Microbes and Infection, 2022; 24 (4): 104950. https://doi.org/10.1016/j.micinf.2022.104950
  5. Siegel RE. Emerging gram-negative antibiotic resistance: daunting challenges, declining sensitivities, and dire consequences. Respiratory Care, 2008; 53 (4): 471-9. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18364060/
  6. Farrokhnazar E, Khaki P, Moradi Bidhendi S. Investigation of ampC &amp; esbl genes in Escherichia coli isolated from human and poultry. Journal of Microbial World, 2014; 7 (2): 138-47. [In Persian].
  7. Bush K, Jacoby GA. Updated functional classification of beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother, 2010; 54 (3): 969-76. https://doi.org/10.1128/aac.01009-09
  8. Bonomo RA. β-Lactamases: A Focus on Current Challenges. Cold Spring Harb Perspect Med, 2017; 7 (1). 10.1101/cshperspect.a025239
  9. Bradford PA. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev, 2001; 14 (4): 933-51. https://doi.org/10.1128/cmr.14.4.933-951.200
  10. Bush K, Fisher JF. Epidemiological expansion, structural studies, and clinical challenges of new β-lactamases from gram-negative bacteria. Annu Rev Microbiol, 2011; 65: 455-78. https://doi.org/10.1146/annurev-micro-090110-102911
  11. Castanheira M, Simner PJ, Bradford PA. Extended-spectrum β-lactamases: an update on their characteristics, epidemiology and detection. JAC-Antimicrobial Resistance, 2021; 3 (3). https://doi.org/10.1093/jacamr/dlab092
  12. Shah AA, Hasan F, Ahmed S, Hameed A. Characteristics, epidemiology and clinical importance of emerging strains of Gram-negative bacilli producing extended-spectrum β-lactamases. Research in Microbiology, 2004; 155 (6): 409-21. https://doi.org/10.1016/j.resmic.2004.02.009
  13. George A. Jacoby. AmpC beta-Lactamases. Clin Microbiol Rev 2009; 22 (1): 161-82. https://doi.org/10.1128/cmr.00036-08
  14. Philippon A, Arlet G, Jacoby GA. Plasmid-determined AmpC-type β-lactamases. Antimicrobial agents and chemotherapy, 2002; 46 (1): 1-11. https://doi.org/10.1128/aac.46.1.1-11.2002
  15. Upadhyay S, Sen MR, Bhattacharjee A. Presence of different beta-lactamase classes among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa expressing AmpC beta-lactamase enzyme. The Journal of Infection in Developing Countries, 2010; 4 (04): 239-42. https://doi.org/10.3855/jidc.497
  16. PA W. Clinical and Laboratory Standards Institute: Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: 20th informational supplement. CLSI document M100-S20. 2010. http://www.clsi.org
  17. Rafiee R, Eftekhar F, Tabatabaei SA, Minaee Tehrani D. Prevalence of Extended-Spectrum and Metallo β-Lactamase Production in AmpC β-Lactamase Producing Pseudomonas aeruginosa Isolates From Burns. Jundishapur J Microbiol. 2014 Sep; 7(9): e16436. https://doi.org/10.5812/jjm.16436
  18. Kaur J, Chopra S, Sheevani, Mahajan G. Modified Double Disc Synergy Test to Detect ESBL Production in Urinary Isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. J Clin Diagn Res, 2013; 7 (2): 229-33. https://doi.org/10.7860/JCDR/2013/.2734
  19. Mohamed MSE, Hassan AT, Ahmed SMK. Prevalence of carbapenemases among Klebsiella pneumoniae strains isolated from respiratory tract specimens. The Egyptian Journal of Medical Microbiology, 2016; 38 (105): 1-8. https://platform.almanhal.com/Reader/Article/101831
  20. Schill F, Abdulmawjood A, Klein G, Reich F. Prevalence and characterization of extended-spectrum β-lactamase (ESBL) and AmpC β-lactamase producing Enterobacteriaceae in fresh pork meat at processing level in Germany. International journal of food microbiology, 2017; 257: 58-66. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2017.06.010
  21. Sader HS, Carvalhaes CG, Shortridge D, Castanheira M. Comparative activity of newer β-lactam/β-lactamase inhibitor combinations against Pseudomonas aeruginosa from patients hospitalized with pneumonia in European medical centers in 2020. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 2022; 41 (2): 319-24. https://doi.org/10.1007/s10096-021-04363-7
  22. Heidari R, Farajzadeh Sheikh A, Hashemzadeh M, Farshadzadeh Z, Salmanzadeh S, Saki M. Antibiotic resistance, biofilm production ability and genetic diversity of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains isolated from nosocomial infections in southwestern Iran. Molecular Biology Reports, 2022; 49 (5): 3811-22. https://doi.org/10.1007/s11033-022-07225-3
  23. Azimi A,  PeymaniA,  Kianoush PourP. Phenotypic and molecular detection of metallo-β-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with burns in Tehran, Iran. Rev Soc Bras Med Trop, 2018 ;51(5):610-5. https://doi.org/10.1590/0037-8682-0174-2017
  24. Motbainor H, Bereded F, Mulu W. Multi-drug resistance of blood stream, urinary tract and surgical site nosocomial infections of Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa among patients hospitalized at Felegehiwot referral hospital, Northwest Ethiopia: a cross-sectional study. BMC infectious diseases, 2020; 30; 20 (1): 92. https://doi.org/10.1186/s12879-020-4811-8
  25. Mekonnen H, Seid A, Molla Fenta G, Gebrecherkos T. Antimicrobial resistance profiles and associated factors of Acinetobacter and Pseudomonas aeruginosa nosocomial infection among patients admitted at Dessie comprehensive specialized Hospital, North-East Ethiopia. A cross-sectional study. Plos One, 2021; 16 (11): e0257272. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0257272
  26. El-Mahdy R, El-Kannishy G. Virulence factors of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in hospital-acquired infections in Mansoura, Egypt. Infection and drug resistance, 2019; 12: 3455. https://doi.org/10.2147/IDR.S222329
  27. Rodulfo H, Arcia A, Hernández A, Michelli E, Martinez DdV, Guzman M, et al. Virulence factors and integrons are associated with MDR and XDR phenotypes in nosocomial strains of Pseudomonas aeruginosa in a Venezuelan university hospital. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 2019;61. https://doi.org/10.1590/S1678-9946201961020
  28. Lila G, Mulliqi G, Raka L, Kurti A, Bajrami R, Azizi E. Molecular epidemiology of Pseudomonas aeruginosa in University clinical center of Kosovo. Infection and drug resistance, 2018; 11: 2039. https://doi.org/10.2147/IDR.S174940
  29. Rouhi S, Ramazanzadeh R. Prevalence of blaOxacillinase-23and blaOxacillinase-24/40-type Carbapenemases in Pseudomonas aeruginosa Species Isolated From Patients With Nosocomial and Non-nosocomial Infections in the West of Iran. Iranian Journal of Pathology, 2018; 13 (3): 348. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30636958/
  30. Kresken M, Körber-Irrgang B, Korte-Berwanger M, Pfennigwerth N, Gatermann SG, Seifert H, et al. Dissemination of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates and their susceptibilities to ceftolozane-tazobactam in Germany. International journal of antimicrobial agents 2020; 55 (6): 105959. https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2020.105959
  31. Hemmati H, Hasannejad-Bibalan M, Khoshdoz S, Khoshdoz P, Yaghubi Kalurazi T, Sedigh Ebrahim-Saraie H, et al. Two years study of prevalence and antibiotic resistance pattern of Gram-negative bacteria isolated from surgical site infections in the North of Iran. BMC research notes, 2020; 13 (1): 1-6. https://doi.org/10.1186/s13104-020-05223-x
  32. Hosu MC VS, Okuthe GE, Apalata T. Detection of extended spectrum beta-lactamase genes in Pseudomonas aeruginosa isolated from patients in rural Eastern Cape Province, South Africa. Scientific reports 2021; 11 (1): 1-8. https://doi.org/10.1038/s41598-021-86570-y
  33. Ejikeugwu C, Nworie O, Saki M, Al-Dahmoshi HOM, Al-Khafaji NSK, Ezeador C, et al. Metallo-β-lactamase and AmpC genes in Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Pseudomonas aeruginosa isolates from abattoir and poultry origin in Nigeria. BMC Microbiology, 2021; 21 (1): 124. https://doi.org/10.1186/s12866-021-02179-1
  34. Tahmasebi H, Alikhani MY, Dehbashi S, Arabestani MR. Determination of Minimum Inhibitory Concentration of Different Antibiotic Groups in Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa Containing p-AmpC and Their Relationship with Antibiotic Resistance Pattern. Avicenna Journal of Clinical Medicine, 2018; 24 (4): 277-84. http://dx.doi.org/10.21859/ajcm.24.4.277 [In Persian].
  35. Jamshidi Gohar M, Rahimi Fard N, Hosseini Doust SR. The pattern of antibiotic resistance within clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa and detection of AmpC. Medical Sciences Journal, 2018; 28 (3): 212-9. http://tmuj.iautmu.ac.ir/article-1-1443-en.html [In Persian].
  36. Hong JS, Song W, Park H-M, Oh J-Y, Chae J-C, Shin S, et al. Clonal spread of extended-spectrum cephalosporin-resistant Enterobacteriaceae between companion animals and humans in South Korea. Frontiers in microbiology, 2019; 10: 1371. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.01371

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار