خالص سازی فوزوباکتریوم نوکلئاتوم از پاکت های پریودنتال دندانی

مقدمه

حفره دهان محیطی گرم، مرطوب و غنی از مواد غذایی است که گونه‌های مختلف و فراوانی از میکروارگانیسم‌ها را در خود نگهداری می‌کند. بیش از 1000 گونه مختلف باکتری ممکن است در دهان افراد بالغ وجود داشته باشد. با پیشرفت فناوری‌های تشخیص میکروبی، تعداد فزاینده‌ای از میکروارگانیسم‌هایی کشف شدند که قبلاً نادیده گرفته شده بودند و مشخص شد نقش مهمی در بیماری‌های انسانی دارند. Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum) یک باسیل بی‌هوازی گرم منفی با انتهای باریک‌تر از خانواده Bacteroidaceae است. F. nucleatum یکی از گونه‌های غالب در حفره دهان است و اصولاً فلور قسمت فوقانی دستگاه تنفس است؛ اما در دستگاه گوارش و ادراری تناسلی نیز حضور دارد. این باکتری در شرایط عادی در سایر نقاط بدن وجود ندارد یا به‌ندرت شناسایی می‌شود (1, 2). با این حال، در شرایط بیماری، به‌عنوان یک پاتوژن فرصت‌طلب، یکی از شایع‌ترین گونه‌های موجود در محل‌های خارج دهانی است (3)؛ به‌طوری‌که F. nucleatum را علاوه بر دهان، از عفونت‌هایی مانند زخم‌های پوستی، آبسه‌های اطراف لوزه، آرتریت سپتیک و اندوکاردیت می‌توان جدا کرد. F. nucleatum یک گونه ناهمگن با پنج زیرگونه پیشنهادی (ss)، شامل ss animalis، ss fusiforme، ss nucleatum، ss polymorphis و ss vincentii است که شیوع آنها در بیماری‌های مختلف متفاوت است (3-6).

1. nucleatum با طیف گسترده‌ای از بیماری‌های انسانی مرتبط است. از مهم‌ترین این بیماری‌ها می‌توان به بیماری‌های پریودنتال[1] اشاره کرد (7). بیماری‌های پریودنتال منجر به آسیب بافت‌های پریودنتال محافظ دندان‌ها (استخوان و بافت پیوندی) می‌شوند و کیفیت زندگی افراد درگیر را تحت‌تأثیر قرار می‌دهند. در حالت کلی ازنظر علت‌شناسی[2]، این بیماری‌ها ناشی از عوامل متعدد هستند؛ اما داده‌ها نشان می‌دهند برخی میکروارگانیسم‌های موجود در بیوفیلم پلاک زیرلثه‌ای مانند فوزوباکتریوم‌ها نقش عمده‌ای در شروع و پیشرفت پریودنتیت دارند و از بین پنج گونه فوزوباکتریوم که اغلب از عفونت‌های دهانی جدا می‌شوند، درصد حضور F. nucleatum بیشتر است؛ به‌طوری‌که می‌توان این باکتری را مهم‌ترین عامل بیماری‌زای این گروه در نظر گرفت. در مراحل اولیه بیماری پریودنتال، باکتری‌های ساکارولیتیک، استرپتوکوکوس‌های هوازی و برخی دیگر از باکتری‌ها به مینای دندان و سطح ریشه می‌چسبند و کلون می‌شوند. این امر زمینه را برای F. nucleatum فراهم می‌کند تا به این مهاجمان اولیه متصل شود و به دیگر باکتری‌ها ازجمله Porphyromonas gingivalis، Bacteroides forsythus، Actinobacillus actinomycetemcomitans، و Treponema denticola اجازه دهد تجمع و رشد کنند، بیوفیلم تشکیل دهند و درنهایت منجر به بیماری‌های دهان و پوسیدگی دندان شوند. با توجه به نقش واسطه‌ای، طول غیرمعمول، ماهیت چسبندگی و داشتن سایر فاکتورهای سطحی، این باکتری به‌عنوان «باکتری پل[3]» نامیده می‌شود (8, 9). F. nucleatum همچنین ازطریق اتصال پروتئین‌های چسبندگی سطحی به قند لاکتوز، به انواع سلول‌های یوکاریوتی ازجمله سلول‌های HeLa، سلول‌های اپیتلیال، ماکروفاژها، لکوسیت‌های پلی‌مورفونوکلئر و سلول‌های بافت لثه و پاکت پریودنتال متصل می‌شود و منجر به بیماری‌های متعدد می‌شود (10-12). بیماری دیگری که F. nucleatum در ایجاد و پیشرفت آن نقش دارد، اختلالات دستگاه گوارش (سرطان کولورکتال[4]، بیماری التهابی روده و آپاندیسیت) است که توسط دو فاکتور حدت قابل توجه شامل FadA[5] و Fap2[6] وساطت می‌شود. نشان داده شده است که FadA با اتصال به قند لاکتوز در سطح سلول‌های اپیتلیال روده، مسیر سیگنالینگ بتا-کاتنین[7] را در جهت پیشرفت تکثیر سلول‌های تومور فعال می‌کند. همچنین به لایه‌های اپیتلیال و سلول‌های اندوتلیال حمله می‌کند تا سیتوکین‌های پیش‌التهابی تولید کند. علاوه بر این، Fap2 یک ریزمحیط مناسب برای توسعه سرطان کولورکتال ازطریق تعامل با فعالیت‌های سلول‌های ایمنی ایجاد می‌کند (13). درحالی‌که تحقیقات قبلی F. nucleatum را به‌عنوان یک کاتالیزور برای پیشرفت و تشدید سرطان کولورکتال ثابت کرده است، تحقیقات اخیر حضور آن را در طیفی از تومورهای گوارشی و خارج از دستگاه گوارش ازجمله سرطان دهان، سرطان پانکراس، سرطان سینه، سرطان سلول سنگفرشی مری و سرطان معده نشان داده‌اند و حضور F. nucleatum را اغلب با پیش‌آگهی ضعیف همراه می‌دانند (14). از دیگر بیماری‌های ایجادشده توسط F. nucleatum می‌توان به پیامدهای نامطلوب بارداری (کوریوآمنیونیت، تولد زودرس، مرده‌زایی، سپسیس نوزادان و پره‌اکلامپسی)، بیماری‌های قلبی عروقی، آرتریت روماتوئید، عفونت‌های دستگاه تنفسی، سندرم لمیر و بیماری آلزایمر اشاره کرد (7).

به‌دنبال بیان نقش F. nucleatum در توسعه و پیشرفت بیماری‌های پریودنتال و سایر بیماری‌های انسانی، ترویج تومورزایی و تأثیرگذاری بر درمان، این باکتری هدف بسیاری از مطالعات قرار گرفته است (15)؛ بنابراین، جداسازی و بررسی خصوصیات دقیق F. nucleatum مهم‌ترین گام در بررسی ویژگی‌های آن و کنترل بیماری‌ها است؛ اما به‌دلیل ویژگی بی‌هوازی اجباری بودن آن و مشکلات فراوان برای رشد و نگهداری این باکتری در آزمایشگاه، انجام چنین مطالعاتی دشوار است. هدف از مطالعه حاضر بررسی روش‌های مختلف برای دستیابی به روشی بهینه در جهت خالص‌سازی F. nucleatum از ریشه دندان‌های دارای پاکت‌های پریودنتال عمیق و سپس کشت و نگهداری باکتری‌ها در دمای ۷۰- درجه سانتی‌گراد است تا بتواند چالش‌های موجود در زمینة جداسازی F. nucleatum را رفع کند و امکان دستیابی به این باکتری و استفاده از آن در مطالعات بعدی فراهم شود.

مواد و روش‌ها

1. نمونه‌گیری و کشت میکروبی:

ابتدا بیماران مبتلا به پریودنتیت توسط دندان‌پزشک شناسایی شدند. وسایل مخصوص نمونه‌گیری مانند پنس و سطح آبسه‌های دندانی برای حذف فلور نرمال‌های دهان با گاز استریل و الکل اتیلیک 70 درصد ضدعفونی شدند. سپس از کن کاغذی[8] با سایز 40 استفاده شد؛ به‌طوری‌که کن کاغذی در عمق پاکت‌های پریودنتال بیمار فرو برده و به مدت 30 ثانیه نگه داشته شد. به‌منظور انتخاب روش مناسب برای جداسازی باکتری هدف از دو روش زیر استفاده شد:

• در روش اول نمونه‌ها بلافاصله به محیط انتقالی تریپتیک سوی براث[9]، تلقیح و به آزمایشگاه منتقل شدند؛ به‌طوری‌که مدت زمان تهیه نمونه و تلقیح آن به محیط کشت انتقالی و رساندن آن به آزمایشگاه کمتر از 40 دقیقه به طول انجامید (16). سپس نمونه روی محیط کلمبیا آگار حاوی 5 درصد خون دفیبرینه گوسفندی کشت داده شد. پلیت در جار بی‌هوازی قرار گرفت و برای تخلیه کامل اکسیژن محیط، جار به دستگاه مارت وصل شد (10 درصد H₂، 10 درصد CO₂ و 80 درصد N₂). نمونه‌ها به مدت 48 تا 72 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند و تا رسیدن به کلنی‌های خالصی که ازنظر مورفولوژی و رنگ‌آمیزی گرم مشابه با nucleatum بودند، این مراحل تکرار شدند (16, 17) (جدول1).

جدول 1. مشخصات مربوط به روش اول نمونه‌گیری

Table 1. Characteristics related to the first sampling method

• در روش دوم نمونه‌گیری، نمونه‌ها مستقیماً در محل نمونه‌گیری روی محیط کشت کلمبیا آگار حاوی 5 درصد خون دفیبرینه گوسفند کشت داده‌شده در همان محل در جار بی‌هوازی حاوی گاز پک نوع A قرار گرفتند. پس از انتقال به آزمایشگاه، جار در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. پس از انکوباسیون، از کلنی‌های ایجادشده روی محیط کشت کلمبیا آگار جدید حاوی خون دفیبرینه گوسفندی پاساژ داده شد و مجدداً در جار بی‌هوازی قرار گرفت. جار به دستگاه مارت، متصل و سپس به مدت 48 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد؛ تا رسیدن به کلنی‌های خالصی که ازنظر مورفولوژی و رنگ‌آمیزی گرم مشابه با nucleatum بودند، این مراحل تکرار شدند (18) (جدول2).

جدول 2. مشخصات مربوط به روش دوم نمونه‌گیری (انتقال مستقیم به محیط بی‌هوازی)

Table 2. Characteristics related to the second sampling method (direct transfer to the anaerobic environment)

2. شناسایی و تأیید باکتری خالص‌شده

از کشت‌هایی که باکتری زنده و خالص حاصل شدند، مراحل زیر به‌ترتیب برای شناسایی و تأیید آن انجام شدند.

الف. مشاهده میکروسکوپی

چندین لام مستقیم از هرکدام از نمونه‌ها در پاساژهای مختلف، تهیه و با استفاده از رنگ‌آمیزی گرم، حضور و خلوص F. nucleatum  بررسی شد (18, 19).

• تست‌های بیوشیمیایی

برای تمامی نمونه‌ها تست‌های بیوشیمیایی تأییدکنندة F. nucleatum انجام شدند. این تست‌ها شامل تست مقاومت آنتی‌بیوتیکی، تست اندول و تست لیپاز بودند (19-21).

تست مقاومت آنتی‌بیوتیکی: در کنار شعله و در کوتاه‌ترین زمان از پاساژ سوم و چهارم نمونه‌ها روی محیط کشت کلمبیا آگار حاوی خون گوسفندی (فاقد هِمین، ویتامین k1 و آنتی‌بیوتیک) کشت داده شد و آنتی‌بیوتیک‌های ونکومایسین، کانامایسین، پنی‌سیلین و کلیستین در چاهک‌های ایجادشده در محیط کشت قرار گرفتند.

• تست اندول: برای انجام تست اندول، در کنار شعله در مدت زمان اندک با آنس سوزنی از کلنی موجود در پاساژ سه یا چهار نمونه‌ها برداشته و در محیط اس‌آی‌ام[10] کشت داده شد.
• تست لیپاز: به‌منظور انجام این تست در کنار شعله و در مدت زمان کم، از کلنی موجود در پاساژ سه یا چهار نمونه‌ها برداشته و روی محیط اگ یولک آگار[11] کشت داده شد.

محیط‌های کلمبیا آگار، اگ یولک آگار و اس‌آی‌ام حاوی نمونه در جار بی‌هوازی قرار گرفتند، به دستگاه مارت متصل شدند و سپس به مدت 48 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند.

 ج. تست مولکولی برای تأیید باکتری جداسازی‌شده

استخراج DNA از باکتری: به‌منظور اسـتخراج DNA، از روش جوشاندن[12] استفاده شد. نمونه‌های باکتریایی ذخیره‌شده در محیط مایع عصاره قلب و مغز[13] در دمای 70- درجه سانتی‌گراد مجدداً روی محیط کلمبیا آگار حاوی خون گوسفندی کشت داده و پس از گذشت 48 ساعت، پلیت‌ها باز شدند و با سرسمپلر، چند کلون از باکتری برداشته و در میکروتیوپ‌های حاوی 20 میکرولیتر آب مقطر حل شدند. میکروتیوپ‌های حاوی نمونه به‌منظور استخراج ژنوم به مدت 15 دقیقه در دستگاه ترموبلاک با دمای 95 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. سپس میکروتیوپ‌ها به مدت 5 دقیقه در rpm 13000 سانتریفیوژ شدند. با استفاده از سمپلر، مایع رویی حاوی ژنوم، خارج و در میکروتیوپ دیگری ریخته شد؛ درنهایت، غلظت نمونه‌های DNA با دستگاه نانودراپ مشخص شد.

پس از تأیید کیفیت DNA استخراج‌شده، تست PCR برای تکثیر قطعه ژن S16 انجام شد.

1. پرایمرهای اختصاصی برای ژنrRNA S16 باکتری nucleatum (جدول3) تهیه شدند که برحسب مقالات انتخاب شده بودند (22) و در پایگاه داده NCBI بلاست شدند. پس از تأیید توالی ازنظر اختصاصیت و افزودن حلال به مخزن اصلی پرایمرها، مواد استفاده‌شده در PCR برای انجام واکنش به‌آرامی تکان داده شدند.
2. حجم نهایی واکنش PCR به میـزان 10 میکرولیتـر، شامل 3 میکرولیتر آب مقطر، 1 میکرولیتر نمونه با غلظت 4/192 نانوگرم بر میکرولیتر، 5 میکرولیتر Master Mixو 5/0 میکرولیتر از هرکدام از پرایمرها با غلظت 10 پیکومول بود. واسرشتگی[14] در دمای 95 درجه سـانتی‌گـراد و مدت زمان 30 ثانیه، مرحله اتصـال[15] پرایمرها در دمای 61 درجه سـانتی‌گـراد بـه مـدت 30 ثانیـه و مرحله گستردگی[16] در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه انجام شد. تعداد سیکل‌های انجام‌شده در دستگاه 30 بود (23) و از یکی از نمونه‌های فوزوباکتریوم نوکلئاتوم جداشده از دندان به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شد.

جدول 3. مشخصات پرایمرهای استفاده‌شده در تکثیر قطعة DNA (16S rRNA)

Table 3. Primers used for amplification of the DNA fragment (16S rRNA)

3. درنهایت، محصولات حاصل از دستگاه PCR، روی ژل آگارز 1 درصد و با استفاده از بافر 5/0 درصد TBE[17] الکتروفورز شدند و اندازه باندها در حضور لدر bp50 تأیید شد.
4. به‌منظور انجام توالی‌یابی ژنوم، محصولات PCR همراه با حجم مشخص از پرایمرها برای انجام توالی‌یابی به شرکت ژنومین تهران فرستاده شدند.

نتایج

پس از ارزیابی‌های کلینیکی بیش از 60 بیمار، 16 بیمار دارای پاکت‌های پریودنتال دندانی وارد مطالعه شدند که از بهمن ماه 1399 تا مرداد ماه 1400 به دانشکده دندان‌پزشکی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان مراجعه کرده بودند. اغلب بیماران مرد بودند. هیچ‌کدام از بیماران طی هفت روز قبل از مراجعه آنتی‌بیوتیک مصرف نکرده بودند و مبتلا به بیماری‌های سیستمیک نبودند و عمق پاکت بزرگ‌تر یا مساوی 5 میلی‌متر داشتند. همچنین زنان واردشده به مطالعه باردار نبودند. سپس از بین 16 نمونة گرفته‌شده از بیماران، 11 نمونه به‌علت عدم تطابق شکل کلنی، ظاهر میکروسکوپی، تست‌های بیوشیمیایی و تست‌های مولکولی با F. nucleatum از مطالعه خارج شدند.

1. کشت باکتری، بررسی میکروسکوپی و رنگ‌آمیزی گرم برای باکتری‌های خالص‌شده

نمونه‌هایی که ازنظر شکل ظاهری کلنی مشابه F. nucleatum بودند و در رنگ‌آمیزی گرم به شکل باسیل‌های کشیده گرم منفی خالص با انتهای باریک دیده شدند که ویژة F. nucleatum است (نمونه 1، 2، 5، 6، 7 در روش دوم نمونه‌گیری) برای انجام تست‌های بیوشیمیایی انتخاب شدند و سایر نمونه‌ها از مطالعه خارج شدند (نمونه‌ای از پلیت کشت و رنگ‌آمیزی گرم F. nucleatum در (شکل A, B-1) آورده شده است).

2. تست‌های بیوشیمیایی

برای تمامی نمونه‌های 1، 2، 5، 6، 7 تست‌های بیوشیمیایی تأییدکننده انجام شدند. این تست‌ها شامل تست مقاومت آنتی‌بیوتیکی (ونکومایسین، پنی‌سیلین، کانامایسین و کلیستین)، تست اندول و تست لیپاز بودند (جدول 4).

الف. تست لیپاژ

پس از کشت باکتری در محیط اگ یولک آگار، رشد باکتری همزمان با عدم وجود هاله روی محیط نشان‌دهندة حضور یک باکتری لیپاز منفی در محیط است که این مورد از ویژگی‌های تأییدکنندة حضور F. nucleatum است (شکل C-1).

ب. تست اندول

پس از اضافه‌کردن معرف کواکس به محیط اس‌آی‌ام حاوی باکتری، یک حلقه قرمز در قسمت بالایی محیط تشکیل شد. این رنگ نشان‌دهندة حضور آنزیم تریپتوفاناز در باکتری و تجزیه تریپتوفان محیط به اندول و آلانین است که به‌دنبال اضافه‌شدن معرف کواکس و واکنش این معرف با اندول تولیدشده، رنگ قرمزی ایجاد می‌شود که تأییدکنندة مثبت‌بودن تست اندول و حضور F. nucleatum است (شکل1-D).

ج. تست‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی

پس از بررسی پلیت کشت 48 ساعته نمونه‌ها روی محیط کشت کلمبیا آگار حاوی چاهک‌های آنتی‌بیوتیک‌های ونکومایسین، کانامایسین، کلیستین و پنی‌سیلین، هاله عدم رشد با قطر بالای 2 سانتی‌متر در اطراف چاهک حاوی آنتی‌بیوتیک کانامایسین[18]، کلیستین[19] و پنی‌سیلین[20] مشاهده شد؛ اما این هاله در اطراف چاهک حاوی آنتی‌بیوتیک ونکومایسین[21] وجود نداشت (شکل E-1). این نتایج نشان‌دهندة حضور باکتری F. nucleatum در محیط کشت است که به‌علت مقاوم‌بودن به ونکومایسین در اطراف چاهک آن رشد کرده و به‌علت حساس‌بودن به کانامایسین، کلیستین و پنی‌سیلین قادر به رشد در اطراف چاهک این آنتی‌بیوتیک‌ها نبوده است و هاله عدم رشد ایجاد می‌شود.

شکل 1. مورفولوژی سلولی و رنگ‌آمیزی گرم Fusobacterium nucleatum. کلنی‌های دایره‌ای خشک و نامنظمF. nucleatum روی پلیت کلمبیا آگار (A). F. nucleatum یک باکتری گرم منفی با ظاهری بلند، نازک و دوکی شکل در رنگ‌آمیزی گرم است ( ,B×100). عدم وجود هاله شفاف در اطراف کلنی‌های باکتری نشان‌دهندة منفی‌بودن تست لیپاز است (C)، تتشکیل حلقه قرمز روی محیط SIM نشان‌دهندة مثبت‌بودن تست ایندول است (D) و وجود هاله اطراف آنتی‌بیوتیک کانامایسین، پنی‌سیلین و کولیستین نشان‌دهندة حساسیت F. nucleatum و درنتیجه عدم رشد در اطراف این آنتی‌بیوتیک‌ها است؛ درحالی‌که عدم وجود هاله در اطراف آنتی‌بیوتیک ونکومایسین نشان‌دهندة مقاومت F. nucleatum به آن است .(E) KM: کانامایسین، PCN: پنی‌سیلین، VAN: وانکومایسین، COL: کلیستین.

Figure 1. Cell morphology and Gram staining of Fusobacterium nucleatum. Dry and irregular circular colonies of F. nucleatum on a Columbia agar plate (A). F. nucleatum is a Gram-negative bacterium with a long, thin and spindle-shaped appearance on Gram staining (B×100). The absence of a clear halo around the bacterial colonies indicates a negative lipase test (C), the formation of a red ring on the SIM medium indicates a positive indole test (D), and the presence of a halo around the antibiotics kanamycin, penicillin and colistin indicates the sensitivity of F. nucleatum and consequently the lack of growth around these antibiotics, while the absence of a halo around the antibiotic vancomycin indicates resistance of F. nucleatum to this antibiotic. (E) KM: Kanamycin, PCN: Penicillin, VAN: Vancomycin, COL: Colistin.

جدول 4. ویژگی‌های بیوشیمیایی باکتری‌های جداشده از بیماران

Table 4. Biochemical characteristics of bacteria isolated from patients

3. تست‌های مولکولی

در ابتدا برای انجام تست PCR، ژنوم 5 نمونه باکتریایی تأییدشده به روش بیوشیمیایی با روش جوشاندن، استخراج و با نانودراپ تعیین غلظت شد. پس از تأیید کیفیت DNA استخراج‌شده، قطعه s16 آن تکثیر و پس از تأیید روی ژل آگارز (شکل 2) تعیین توالی انجام شد. نتایج حاصل از تعیین توالی DNA برای نمونه شماره 5 با استفاده از Nucleotide BLAST، بیش از 85 درصد همسانی را با  F. nucleatum نشان داد (شکل3).

شکل 2. نتایج الکتروفورز محصولات PCR ژن s16 نمونه‌های 1، 2 و 5 روی ژل آگارز

Figure 2. Electrophoresis results of 16S rRNA gene PCR products from samples 1, 2 and 5 on agarose gel.

شکل 3. بلاست توالی حاصل از سکانس نمونه در پایگاه داده NCBI برای مشخص‌کردن میزان شباهت توالی ژنوم باکتری خالص‌شده با باکتری F. nucleatum

Figure 3. Sequence blast obtained from the sample sequence in the NCBI database to determine the degree of similarity of the purified bacterial genome sequence with F. nucleatum bacteria.

بحث و نتیجه‌گیری

اهمیت F. nucleatum در ایجاد بیماری پریودنتال و همچنین عفونت در سایر اندام‌ها، به‌دلیل پتانسیل بیماری‌زایی، فراوانی در ضایعات پریودنتال، نقش در ایجاد عفونت‌های مختلط و توانایی آن در تشکیل تجمعاتی با سایر پاتوژن‌ها درخور توجه قرار گرفته است. باکتری‌های پریودنتال زمانی بیماری‌زا می‌شوند که 1 درصد از کل ارگانیسم‌ها در یک بیوفیلم دندانی شوند؛ اما جداسازی و تشخیص آنها در عفونت‌های دندانی و سایر عفونت‌ها به حساسیت و ویژگی روش استفاده‌شده بستگی دارد. خالص‌سازی و شناسایی دقیق، علاوه بر طبقه‌بندی، برای درمان مناسب عفونت‌ها نیز ضروری است؛ زیرا حساسیت باکتری‌های مختلف و حتی گونه‌های مختلف از فوزوباکتریوم به آنتی‌بیوتیک‌ها بسیار متفاوت است (17). به همین دلیل، دستیابی به روشی بهینه برای جداسازی فوزوباکتریوم به‌منظور بررسی بیماری‌های مختلف و علت آنها، میزان حضور باکتری در بافت، مشخص‌کردن زیرگونه و تعیین نوع درمان بسیار حائز اهمیت است. در این مطالعه دو روش نمونه‌گیری مستقیم و غیرمستقیم برای خالص‌سازی F. nucleatum بررسی شده‌اند. در روش اول، نمونه بلافاصله پس از جداشدن از پاکت‌های پریودنتال در محیط انتقالی تریپتیک سوی براث قرار داده شد و به آزمایشگاه، منتقل و در مدت کوتاهی نمونه از محیط انتقالی تریپتیک سوی براث به محیط کلمبیا آگار منتقل شد؛ اما این روش در جداسازی F. nucleatum کارآمد نبود. در روش دوم، نمونه بلافاصله پس از جداسازی از پاکت‌های پریودنتال دندانی، روی محیط کلمبیا آگار حاوی ویتامین K1 و هِمین کشت داده شد و سپس در جار بی‌هوازی همراه با گاز پک نوع A به‌منظور ایجاد شرایط بی‌هوازی برای باکتری‌ها قرار داده و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 روز انکوبه شد. این روش در جداسازی F. nucleatum موفق بود. به نظر می‌رسد ناکارآمدی روش اول به این دلیل است که باکتری‌ها برای مدت طولانی‌تری در معرض هوا قرار می‌گیرند. در همین راستا در سال 2011، F O Nwaokorie و همکارانش، F. nucleatum را از عفونت‌های oro-facial جدا کردند و باکتری را با کشت مستقیم روی محیط کشت‌های Fusobacterium selective agar و fastidious anaerobic agar حاوی 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر هِمین، 1 میکروگرم بر میلی‌لیتر ویتامین k1 و 5 درصد خون دفیبرینه گوسفندی و استفاده از جار شیشه‌ای برای ایجاد شرایط بی‌هوازی در طول مدت 7 روز و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد خالص کردند (24). همچنین Jawad Abed و همکارانش در سال 2020، با جداسازی باکتری از حفره دهان و بافت سرطانی کولورکتال و سپس کشت مستقیم باکتری روی محیط کلمبیا آگار حاوی 5 درصد خون دفیبرینه گوسفندی و ایجاد شرایط بی‌هوازی آن را خالص کردند (15). در سال 2021 نیز مطالعه‌ای توسط Yaohui Gao انجام شد که نشان داد حضور F. nucleatum منجر به تقویت پاسخ درمانی بیماران مبتلا به سرطان کولورکتال به درمان با anti-PD-L1 می‌شود. در این مطالعه سویه‌های استاندارد F. nucleatum  را در محیط کلمبیا آگار حاوی 5 میکروگرم بر میلی‌لیتر هِمین، 1 میکروگرم بر میلی‌لیتر ویتامین k1 و 5 درصد خون دفیبرینه گوسفندی به‌عنوان مکمل و ایجاد شرایط بی‌هوازی و دمای 37 درجه سانتی‌گراد کشت دادند (25).

همچنین، بیشتر نمونه‌های F. nucleatum از بیماران با عمق پاکت بزرگ‌تر یا مساوی با 6 میلی‌متر گرفته شد. به نظر می‌رسد با توجه به بی‌هوازی اجباری بودن F. nucleatum، هرچه پاکت‌های پریودنتال عمیق‌تر باشند، احتمال وجود باکتری بیشتر می‌شود؛ به‌طوری‌که در یک مطالعه در سال 2001 که روی مکان حضور باکتری‌های مرتبط با بیماری پریودنتال در پاکت‌های پریودنتال انسان توسط Y. Noiri و همکاران انجام شد، گزارش شد که F. nucleatum و Treponema denticola به‌ویژه در ناحیه میانی و عمیق پاکت‌های پریودنتال قرار گرفته‌اند (26).

از سوی دیگر، F. nucleatum یکی از باکتری‌های اصلی ایجادکنندة بوی بد دهان است؛ به همین دلیل، بیمارانی که در این مطالعه F. nucleatum از آنها جدا شد، اغلب مبتلا به هالیتوز بودند. در این راستا مطالعه P.-F. Liu و همکاران در سال 2013 گزارش کردند تجمع F. nucleatum همراه با برخی باکتری‌ها در حفره دهان منجر به تشکیل بیوفیلم می‌شود که این ضایعات درنهایت عامل بوی بد دهان هستند. در این مطالعه بیان شده است FomA، پروتئین اصلی غشای خارجی F. nucleatum، منجر به اتصال و چسبیدن سایر باکتری‌های بیماری‌زای دهانی مانند Porphyromonas gingivalis به بیوفیلم درحال تشکیل در پاکت‌های پریودنتال می‌شود. واکسن هالیتوزیس که FomA باکتری را هدف قرار می‌دهد، به‌طور چشمگیری افزایش تجمع باکتری‌ها، شکل‌گیری بیوفیلم‌ها، تولید ترکیبات سولفور فرار و التهاب لثه را مختل می‌کند که به‌واسطة تعامل بین گونه‌های F. nucleatum  با P. gingivalis ایجاد می‌شود که نشان می‌دهد FomA F. nucleatum یک هدف بالقوه برای توسعه واکسن‌ها یا داروها علیه تشکیل بیوفیلم باکتریایی و بیماری‌زایی مرتبط با آن است (27). این نتایج حاکی از اهمیت دو عامل بوی بد دهان و عمق پاکت‌های پریودنتال در انتخاب بیماران هدف برای جداسازی F.nucleatum است.

پس از جداسازی و خالص‌سازی باکتری‌ها، با بررسی ماکروسکوپی و میکروسکوپی، آزمایش‌های بیوشیمیایی شامل تست ایندول، تولید لیپاز، تست‌های مقاومت آنتی‌بیوتیکی و همچنین آزمایش‌های مولکولی شامل PCR و تعیین توالی، وجود F. nucleatum را ثابت کردیم. در این راستا می‌توان به مطالعه F O Nwaokorie اشاره کرد که گونه‌های F. nucleatum از بیمارانی با عفونت‌های oro-facial مطالعه شدند. نمونه‌ها براساس مورفولوژی، مشاهده میکروسکوپی و رنگ‌آمیزی گرم، تولید لیپاز، حساسیت به کانامایسین، پنی‌سیلین و کلیستین و مقاومت به ونکومایسین مشخص شدند؛ درنهایت، هویت باکتری‌های جداشده با استفاده از آنالیز PCR تأیید شد (24).

به نظر می‌رسد ایجاد شرایط بی‌هوازی برای F. nucleatum  با استفاده از گاز پک و جار بی‌هوازی بلافاصله پس از نمونه‌برداری از اهمیت بالایی برخوردار باشد. همچنین آنتی‌بیوتیک‌های ونکومایسین و نورفلوکساسین و مکمل‌های هِمین و ویتامین K1 می‌توانند محیط کشت کلمبیا آگار را برای F. nucleatum انتخابی و غنی کنند و باعث رشد بهتر باکتری شوند. زمان 48 ساعت و دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای انکوباسیون نیز برای رشد F. nucleatum کمک‌کننده است. همچنین عمق پاکت‌های پریودنتال و بوی بد دهان از عوامل مهم در دستیابی به F. nucleatum از نمونه‌های دندانی هستند. علاوه بر موارد ذکرشده، از آنجایی که میکروبیوتای روده تحت‌تأثیر عوامل محیطی مانند منطقه جغرافیایی و نوع تغذیه قرار می‌گیرد، مطالعه نقش F. nucleatum در بیماری‌های مختلف با استفاده از سویه‌های بومی به‌جای استفاده از سویه‌های استاندارد، نتایج واقعی‌تری را منعکس می‌کند. همچنین دسترسی سخت به سویه استاندارد این باکتری اهمیت استفاده از سویه‌های بومی را بیشتر می‌کند. در این مقاله، ما با بررسی روش‌ها و تکنیک‌های مختلف جداسازی و کشت، ایجاد تغییرات در نوع و میزان آنتی‌بیوتیک‌ها و مواد مغذی کمک‌کننده به رشد باکتری، تغییر در زمان انکوباسیون و تغییر در تعداد پاساژها برای خالص‌سازی این باکتری، توانستیم به یک روش بهینه برای خالص‌سازی فوزوباکتریوم نوکلئاتوم از ریشه دندان‌های دارای پاکت‌های پریودنتال عمیق دست یابیم تا زمینه‌ای برای خالص‌سازی باکتری و بررسی نقش آن در ایجاد و پیشرفت بیماری‌های مختلف طی مطالعات آینده فراهم شود.

[1] Periodontal disease

[2] Etiology

[3] Bridge-bacterium

[4] Colorectal cancer

[5] Fusobacterium adhesin 2

[6] Fusobacterium autotrasporter protein 2

[7] B-catenin

[8] Paper point

[9] Trypticase soy broth

[10] Sulfide Indol Motility

[11] Egg Yolk Agar

[12] Boiling

[13] Brain Heart Infusion Broth

[14] Denaturation

[15] Annealing

[16] Extension

[17] Tris-borate-EDTA

[18] Kanamycin

[19] Colistin

[20] Penicilin

[21] Vancomycin