نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 گروه دامپزشکی، واحد بهبهان، دانشگاه آزاد اسلامی، بهبهان، ایران
2 گروه پرستاری و مامایی، واحد بهبهان، دانشگاه آزاد اسلامی، بهبهان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
This study aimed to evaluate the prevalence of Campylobacter isolates based on the presence of certain invasive genes. The experimental study tested 392 samples from Behbahan city. After culturing the samples, microbial identification was performed using Gram staining. Molecular identification of Campylobacter isolates was then conducted using PCR and suitable primers for invasive genes cdtA, B, C, cadF, pldA, ciaB, and 16S rRNA. According to the Gram staining results, 50 samples were infected with Campylobacter. Of these, 37 (74%) were chicken samples, 8 (16%) were cow samples, 2 (4%) were sheep and goat samples, and 3 (6%) were water samples. Analysis of the 16S rRNA gene sequence showed that 72% of the contamination was related to Campylobacter jejuni and 28% was related to Campylobacter coli. Overall, the prevalence of Campylobacter jejuni in isolated samples was significantly higher than that of general Campylobacter (p=0.012). Among the Campylobacter jejuni isolates, the highest prevalence was related to the CdtC toxin production gene (76.2%), and among the Campylobacter coli isolates, it was related to the CdtB toxin production gene (30.2%). Although chickens are considered the main sources of Campylobacter species, it is necessary to investigate the significance of other contamination sources, especially cattle and sheep, to assess their role in human infections. Therefore, necessary precautions must be taken for human consumption, and hygiene standards must be maintained in storage areas, along the slaughter line, and in stores.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
کمپیلوباکتر (Campylobacter)، باکتریهای گرم منفی مارپیچی، میلهای شکل یا منحنی هستند که بسته به گونه، یک تاژک قطبی واحد، تاژک دوقطبی یا بدون تاژک دارند. گونههای کمپیلوباکتر هاگ ساز نیستند، تقریباً 2/0 تا 8/0 در 5/0 تا 5 میکرومتر و شیمیوارگانوتروفهایی هستند، که منابع انرژی خود را از اسیدهای آمینه یا واسطههای چرخه اسید تری کربوکسیلیک به دست میآورند (1). این باکتریهای ترموفیل با دمای 30 تا 46 درجه سانتیگراد و میکروآئروفیل با O2 5% هستند و از خانواده Campylobacteraceae میباشند. بیشتر گونههای کمپیلوباکتر در شرایط میکروآروبی رشد میکنند و یک نوع متابولیسم تنفسی دارند. کمپیلوباکتر سردهای از باکتری است که میتواند باعث بیماری به نام کمپیلوباکتریوز شود (2). این بیماری معمولاً طی دو تا پنج روز پس از قرار گرفتن در معرض ارگانیسم منجر به علائمی مانند اسهال، گرفتگی عضلات، درد شکم و تب میشود. همچنین اسهال ممکن است خونی باشد و با حالت تهوع و استفراغ همراه باشد. این بیماری معمولا یک هفته طول میکشد (3).
کمپیلوباکتر یک پاتوژن مشترک بین انسان و دام است که در مجرای روده حیوانات اهلی و وحشی و پرندگان ساکن میباشد و میتواند انسان را از طریق مصرف آب آلوده، غذاهای مختلف مانند گوشت خام یا نپخته، شیر غیرپاستوریزه و تماس با حیوانات آلوده یا انسان (به ندرت) آلوده کند (4). این پاتوژن باکتریایی منتقله از غذا، عامل اصلی گاستروانتریت باکتریایی و سپتی سمی در انسان در کشورهای در حال توسعه و توسعه یافته است. در کشورهای توسعه یافته، باکتری کمپیلوباکتر مهمترین عامل ایجاد کننده عفونت دستگاه گوارش است (5). تخمین زده میشود که سالانه بین 400 تا 500 میلیون نفر در جهان به گونههای کمپیلوباکتر آلوده میشوند (6). مرکز کنترل و پیشگیری از بیماری تخمین میزند که عفونت کمپیلوباکتر سالانه 5/1 میلیون ساکن ایالات متحده را تحت تأثیر قرار میدهد (7).
شایعترین گونههای مرتبط با گاستروانتریت باکتریایی در انسان کمپیلوباکتر ژژونی (C. jejuni)، کمپیلوباکتر کلی (C. coli) و همچنین کمپیلوباکتر فتوس (C. fetus) مرتبط با عفونتهای سیستمیک هستند. اکثر ژنوتیپهای جدا شده از بیماریهای انسانی نیز به عنوان ساکنان گوارشی مشترک حیوانات اهلی و مخصوصا حیوانات خوراکی جدا شدهاند. علاوه بر این، ایزولههای بالینی زیرمجموعهای غیر تصادفی از این سویهها هستند. تصور میشود که حامل بدون علامت کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کلی در انسان، بهویژه در میان مردم کشورهای صنعتی، نادر است، که نشان میدهد انسان میزبان اصلی این ارگانیسمها در این مکانها نیست (2). علاوه بر این، در برخی موارد، این پاتوژنهای رودهای با دو عارضه دیررس مرتبط با سیستم ایمنی، یعنی سندرم گیلن باره و آرتریت واکنشی همراه هستند. شدت عفونتهای کمپیلوباکتر از یک بیماری خفیف و خود محدود شونده تا عفونتهای شدید متفاوت است (8).
چندین ژن مرتبط با بیماریزایی در کمپیلوباکتر توصیف شده است، از جمله ژن cadF که برای اتصال و کلونیزاسیون (تجمع) ضروری است، ژن pldA برای تهاجم ضروری است و ژنهای cdtB و cdtC که تولید توکسین میکنند. تاکنون مطالعه گسترده و جامعی بر روی بیماریزایی کمپیلوباکتر از لحاظ ژنتیک مولکولی صورت نگرفته است. از سوی دیگر استفاده از عوامل ضدمیکروبی در حیواناتی که گوشت آنها به مصرف میرسد موجب بروز و شیوع باکتریهای مقاوم در برابر عوامل ضد میکروبی شده است، بهخصوص کمپیلوباکتر مقاوم در برابر ضدمیکروبها، که به طور بالقوه، بر روی ایمنی مواد غذایی، هم در خصوص سلامت حیوان و هم در خصوص سلامت انسان، اثرات جدی از خود بر جای میگذارد. به نظر میرسد که وضعیت در کشورهای در حال توسعه با سرعت بیشتری رو به وخامت است زیرا در این کشورها، استفاده گسترده و کنترل نشدهای از آنتیبیوتیکها به عمل میآید. اطلاعات دریافتی از کشورهای کم درآمد و با درآمد متوسط حاکی از آن است که مشکلات بیماری ناشی از ابتلا به کمپیلوباکتر، قابلتوجه است (9). با توجه به اینکه کمپیلوباکتر میتواند از حیوانات و مواد غذایی به انسان منتقل شود، لازم است که یک استراتژی برای کنترل و پیشگیری از عفونت با کمپیلوباکتر تدوین گردد. بعلاوه ضروری است که منابع آلودگی و تشخیص مناسب کمپیلوباکترهای بدست آمده از منابع حیوانی که خطرناکتر هستند، توصیف شوند (10).
با توجه به اینکه استراتژیهای موثر برای کنترل آلودگی با کمپیلوباکتر هنوز محدود بوده، و دانش فعلی ما در مورد مکانیسمهای بیماریزایی، تهاجم و مکانیسم تعامل کمپیلوباکتر با میزبان خود یعنی طیور و گاو نسبتا ضعیف میباشد و همچنین با توجه به اینکه مرغ و گاو آلوده منبع اصلی کمپیلوباکتریوزیس در کشورهای صنعتی است، شناسایی عوامل تهاجم و کلونیزاسیون بدون شک منجر به کسب استراتژی جدید برای به حداقل رساندن کلونیزاسیون کمپیلوباکتر خواهد شد (11). از آنجایی که تاکنون هیچ تحقیقی در مورد ژنهای تهاجمی در کمپیلوباکتر صورت نگرفته است. بنابراین این مطالعه با هدف ارزیابی میزان شیوع جدایههای کمپیلوباکتر بر اساس وجود برخی ژنهای تهاجمی انجام گرفت.
مواد و روشها
این مطالعه تجربی در شهرستان بهبهان بر روی 4875 راس گاو و گوسفند و 505000 قطعه مرغ در سال 1401 انجام شد. نمونه آماری با استفاده از روش نمونهگیری تصادفی خوشهای چند مرحلهای و به حجم 400 نمونه بر حسب جدول تعیین حجم نمونه گرجسی-مورگان (12) انتخاب شدند. پس از کسب مجوزهای لازم و هماهنگی با مسئولین دامپزشکی شهرستان بهبهان، ابتدا از چهار بخش مرکزی، آقاجری، زیدون و تشان بهبهان، دو بخش مرکزی و آقاجری بهطور تصادفی انتخاب شدند. سپس دو دامداری و دو مرغداری از هر کدام از بخشهای مرکزی و آقاجری به صورت تصادفی انتخاب گردید و از هر دامداری و مرغداری بهطور تصادفی، 50 نمونه (از مدفوع گاو، گوسفند و بز، مرغ و آب مرغداری و دامداری) جمعآوری شد. در بررسی اولیه از این 400 نمونه گرفتهشده 8 نمونه به دلیل آلوده شدن و نداشتن شرایط انتقال استریل، کنار گذاشته شد، که پس از حذف آنها، در نهایت 392 نمونه مورد آزمایش قرار گرفت.
کشت و شناسایی میکروبی
از نمونههای جمعآوری شده میکروبها با استفاده از دستگاه کاپادنیس-باصری (KB) جداسازی شده، سپس بر روی محیط کشتهای بلاد آگار و مولر هینتون آگار بصورت منطقهای کشت داده شدند و به مدت 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد انکوبه شدند. سپس جدایهها با استفاده از خصوصیات ماکروسکوپی و میکروسکوپی شناسایی شدند. برای ارزیابی ویژگیهای فیزیکی و ویژگیهای مرفولوژیک از رنگ آمیزی گرم استفاده شد. کلنیهای کمپیلوباکتر بر روی محیط بلاد آگار، خاکستری، مرطوب، با سطحی برجسته و براق و بر روی محیط پایه انتخابی کمپیلوباکتر کلنیهای خاکستری و شفاف بودند.
شناسایی ملکولی جدایههای کمپیلوباکتر
بعد از اتمام تشخیص فنوتیپی، از 392 نمونه آزمایش شده، 50 نمونه مشکوک به کمپیلوباکتر بودند که پس از خالصسازی و کشت مجدد، DNA آنها استخراج و برای تایید نهایی بر روی نمونهها، PCR انجام گرفت. در مجموع 1 میلی لیتر از کشت مایع از هر ایزوله سانتریفیوژ شد و DNA نمونههای باکتری مورد نظر با استفاده ازکیت استخراج DNA (یکتا تجهیز آزما، ایران) به روش ستونی مطابق با پروتوکل کیت استخراج گردید. به منظور تعیین غلظت و درجه خلوص DNA استخراج شده از دستگاه اسپکتروفتومتر نانودراپ در طول موج ۲۶۰ نانومتر به ۲۸۰ نانومتر) که شاخص میزان خلوص DNA میباشد، استفاده شد. همچنین با استفاده از الکتروفورز و ژل آگارز 1% کیفیت باند DNA هر نمونه مورد بررسی قرار گرفت.
به منظور انجام PCR پرایمرهای مناسب برای ژنهای تهاجمی cdtA,B,C، cadF، pldA و ciaB و همچنین ژن عمومی (16S rRNA) باکتریهای گرم منفی (پرایمرهای 27Fو 1492R) به عنوان ژن رفرنس از شرکت ماکروژن کره جنوبی خریداری گردید (جدول 1). تکثیر در حجم واکنش 25 میکرولیتری حاوی الگوی DNA (1 میکرولیتر)، پرایمر (1 میکرولیتر)، و مخلوط اصلی PCR (یکتا تجهیز آزما، ایران) با استفاده از ترموسایکلر Bio-Rad تحت برنامه زیر انجام شد: مرحله دناتوراسیون (1 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد)، 34 چرخه amplification (مرحله دناتوراسیون، 20 ثانیه در 94 درجه سانتیگراد، مرحله annealing، 30 ثانیه در 55 درجه سانتیگراد، مرحله گسترش، 40 ثانیه در دمای 72 درجه سانتیگراد)، و گسترش نهایی، 2 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد. محصولات نهایی PCR از طریق یک ژل آگارز 2 درصد با بافر (X10) TBE الکتروفورز شده و توسط اتیدیوم بروماید و ترانس روشن کننده UV قابل مشاهده است. اندازه محصول مورد انتظار PCR تقریباً 1490 جفت باز که در نمونه عکس گرفته شد، مورد بررسی قرار گرفت.
جدول 1: پرایمرهای مورد استفاده برای شناسایی کمپیلوباکتر
Table 1: Primers used to identify Campylobacter
|
ژن |
پرایمرها |
توالی('5 به '3) |
طول پرایمر |
طول محصول PCR |
|
16S rRNA |
27F |
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG |
20 |
1490bp |
|
1492R |
CGGTTACCTTGTTACGACTT |
20 |
||
|
cdtA |
Forward |
CCTTGTGATGCAAGCAATC |
19 |
686bp |
|
Reverse |
ACACTCCATTTGCTTTCTG |
19 |
||
|
cdtB |
Forward |
CAGAAAGCAAATGGAGTGTT |
20 |
510bp |
|
Reverse |
AGCTAAAAGCGGTGGAGTAT |
20 |
||
|
cdtC |
Forward |
CGATGAGTTAAAACAAAAAGATA |
23 |
453bp |
|
Reverse |
TTGGCATTATAGAAAATACAGTT |
23 |
||
|
cadF |
Forward |
TTGAAGGTAATTTAGATATG |
20 |
777bp |
|
Reverse |
CTAATACCTAAAGTTGAAAC |
20 |
||
|
pldA |
Forward |
AAGCTTATGCGTTTTT |
16 |
706bp |
|
Reverse |
TATAAGGCTTTCTCCA |
16 |
||
|
ciaB |
Forward |
TTTTTATCAGTCCTTA |
16 |
1008bp |
|
Reverse |
TTTCGGTATCATTAGC |
16 |
آنالیز آماری
ابتدا مشخصات توصیفی متغیرها به صورت درصد و جدول توزیع فراوانی بیان شد و با استفاده از تست فیشر مورد بررسی قرار گرفتند. سپس دادههای کمی در صورت برخورداری از توزیع نرمال از روشهای آماری پارامتریک (آزمون کای دو) و در صورت عدم برخورداری از توزیع نرمال از روشهای غیر پارامتریک (آزمون یو من ویتنی) استفاده شد. در آزمونهای انجام شده ضریب اطمینان 95% در نظر گرفته شد. تحلیلها با استفاده از نرمافزار آماری SPSS ورژن 22 انجام شد.
نتایج
در کل از 392 نمونه بررسی شده، 182 (4/46%) نمونه مربوط به مرغ، 141 (36%) نمونه مربوط به گاو، 41 (5/10%) نمونه مربوط به گوسفند و بز و 28 (1/7%) نمونه مربوط به آب بوده است، که بیشترین نمونه گرفته شده مربوط به مرغ 182 و کمترین نمونه گرفته شده مربوط به آب بوده است.
نتایج رنگ آمیزی گرم نمونههای بدست آمده، نشان داد که احتمالا 50 نمونه آلوده به جنس کمپیلوباکتر میباشند. شکل 1 نشان دهنده رنگ آمیزی گرم است که در آن کمپیلوباکتر به صورت باسیلهای گرم منفی، میلهای شکل کوتاه، به شکل بال مرغی، مارپیچ و گاه تکی دیده میشود. براساس رنگ آمیزی گرم در کل 50 (7/12%) نمونه آلوده به کمپیلوباکتر بودند. که از این میان تعداد نمونههای مرغ 37 (74%) مورد، گاو 8 (16%) مورد، گوسفند و بز 2 (4%) مورد و آب 3 (6%) مورد آلوده به کمپیلوباکتر بودهاند. بنابراین بیشترین میزان شیوع کمپیلوباکتر در مرغ (3/20%) و کمترین میزان در گوسفند و بز (9/4%) بوده است.
شکل 1. نمایی از باسیلهای خمیده گرم منفی کمپیلوباکتر حاصل از رنگ آمیزی گرم (X 1000)
Figure 1. A view of curved gram-negative bacilli of Campylobacter obtained by gram staining (X 1000)
همچنین نتایج PCR مربوط به ژن 16S rRNA تایید کرد که تمامی 50 نمونه دارای باند 1490 نوکلئوتیدی بوده و در نتیجه آلوده به جدایههای کمپیلوباکتر میباشند (شکل 2).
شکل 2. ژل الکتروفورز محصول PCR ژن 16S rRNA. ستون c: مارکر وزن مولکولی (لدر) 100 bp، ستون -: کنترل منفی، چاهکهای 1 تا 50: نمونههای مثبت آلوده به کمپیلوباکتر.
Figure 2. Gel electrophoresis of PCR of 16S rRNA gene. Column c: molecular weight marker (ladder) 100 bp, column -: negative control, lanes 1 to 50: positive samples infected with Campylobacter.
آنالیز توالی ژن 16S rRNA در بانک ژنی با بیشترین شباهت با باکتریهای جدا شده با استفاده از نرم افزارNCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) انجام شد. جدول 2 منابع و کد دسترسی کمپیلوباکترهای جدا شده از مدفوع مرغ، گاو، گوسفند و بز و آب، بر اساس وجود توالی آنها در بانک ژنی NCBI نشان داده شده است. همچنین براساس نتایج به دست آمده از کل 50 جدایه کمپیلوباکتر 72% مربوط به کمپیلوباکتر ژژونی و 28% مربوط به کمپیلوباکتر کلی بوده است.
جدول 2: تأیید شناسایی کمپیلوباکترهای جداشده از نمونهها بر اساس توالی یابی ژن 16S rRNA (تعداد=50)
Table 2: Confirming the identification of Campylobacter isolated from samples based on 16S rRNA gene sequencing (n=50)
|
نمونه |
جنس و گونه |
کد دسترسی |
فراوانی (درصد) |
فراوانی (درصد) |
|
مرغ |
کمپیلوباکتر ژژونی |
CP020776.1 |
(36) 18 |
(58) 29 |
|
CP007193.1 |
(8) 4 |
|||
|
CP017862.1 |
(4) 2 |
|||
|
CP017456.1 |
(2) 1 |
|||
|
CP007191.1 |
(4) 2 |
|||
|
CP020045.1 |
(2) 1 |
|||
|
CP007188.1 |
(2) 1 |
|||
|
کمپیلوباکتر کلی |
CP007181.1 |
(8) 4 |
(16) 8 |
|
|
CP019977.1 |
(4) 2 |
|||
|
CP007183.1 |
(4) 2 |
|||
|
گاو |
کمپیلوباکتر ژژونی |
CP017862.1 |
(2) 1 |
(8) 4 |
|
CP020776.1 |
(2) 1 |
|||
|
CP007193.1 |
(2) 1 |
|||
|
CP007192.1 |
(2) 1 |
|||
|
کمپیلوباکتر کلی |
CP007183.1 |
(4) 2 |
(8) 4 |
|
|
CP006702.1 |
(2) 1 |
|||
|
CP019977.1 |
(2) 1 |
|||
|
گوسفند و بز |
کمپیلوباکتر ژژونی |
CP007193.1 |
(2) 1 |
(2) 1 |
|
کمپیلوباکتر کلی |
CP019977.1 |
(2) 1 |
(2) 1 |
|
|
آب |
کمپیلوباکتر ژژونی |
CP007188.1 |
(2) 1 |
(4) 2 |
|
CP017862.1 |
(2) 1 |
|||
|
کمپیلوباکتر کلی |
CP007183.1 |
(2) 1 |
(2) 1 |
از مجموع 36 نمونه دارای کمپیلوباکتر ژژونی، 29 نمونه (55/80%) مربوط به طیور و 5 مورد (88/13%) مربوط به بوده است. همچنین در میان 14 نمونه دارای کمپیلوباکتر کلی 8 مورد (14/57%) مربوط به طیور و 5 مورد (71/35%) مربوط به در دام بودهاند. براساس آنالیز آماری انجام شده در کل شیوع کمپیلوباکتر ژژونی در نمونههای جدا شده به طور معنیداری بیشتر از کمپیلوباکتر کلی بوده است (012/0= p). در حالی که ارتباط معنی داری بین جدایههای کمپیلوباکتر با نوع میزبان مشاهده نشد (252/0= p).
نمونهای از ژلهای بررسی شده مربوط به ژنهای تهاجمی در شکل 3 نشان داده شده است. بر اساس نتایج به دست آمده ژن cadF در 25 (5/73%) مورد، ژن ciaB در 27 (73%) مورد، ژن cdtA در 24 (6/70%) مورد، ژن cdtB در 30 (8/69%) مورد، ژن cdtC در 32 (2/76%) مورد و ژن pldA در 28 (70%) مورد از نمونهها مشاهده شد.
شکل 3. ژل الکتروفورز و تشخیص ژنهایcadF ، ciaB، cdtA، cdtB، cdtC و pldA جدایههای کمپیلوباکترها. ستونc: مارکر وزن مولکولی (لدر)bp100، ستون - کنترل منفی.
Figure 3. Gel electrophoresis and detection of cadF, ciaB, cdtA, cdtB, cdtC and pldA genes of Campylobacter isolates. Column c: molecular weight marker (ladder) bp100, column - negative control
شیوع ژنهای مرتبط با تهاجم با توجه به نوع کمپیلوباکتر شناسایی شده در جدول 3 نشان داده شده است. که در جدایه کمپیلوباکتر ژژونی بیشترین شیوع مربوط به ژن تولید سمCdtC (2/76 %)، در جدایه کمپیلوباکتر کلی مربوط به ژن تولید سم CdtB (2/30 %) بوده است. براساس آنالیز آماری بین شیوع ژنهای مرتبط با تهاجم با نوع کمپیلوباکتر ارتباط معنی داری وجود نداشت (05/0< p).
جدول 3. شیوع ژنهای مرتبط با تهاجم با توجه به نوع جدایههای کمپیلوباکتر
Table 3: Table 3. Prevalence of genes related to invasion according to the type of Campylobacter isolates
|
نقش ژن |
ژنهای تهاجمی |
کمپیلوباکتر ژژونی فراوانی (درصد) |
کمپیلوباکتر کلی فراوانی (درصد) |
χ2 |
P. value |
|
اتصالی |
CadF |
(5/73) 25 |
(5/26) 9 |
12/0 |
72/0 |
|
CiaB |
(73) 27 |
(27) 10 |
07/0 |
79/0 |
|
|
تولید سم |
CdtA |
(6/70) 24 |
(4/29) 10 |
1/0 |
74/0 |
|
CdtB |
(8/69) 30 |
(2/30) 13 |
76/0 |
38/0 |
|
|
CdtC |
(2/76) 32 |
(8/23) 10 |
29/2 |
13/0 |
|
|
pldA |
(70) 28 |
(30) 12 |
4/0 |
53/0 |
شیوع ژنهای مرتبط با تهاجم با توجه به نوع نمونه جمعآوری شده در جدول 4 نشان داده شده است. شود بیشترین شیوع ژن تهاجم مربوط به ژن cdtB به میزان 4/74% در جدایههای کمپیلوباکتر جدا شده از مرغ بوده است. در حالی که ژنهای cadF و cdtA در جدایههای کمپیلوباکتر جدا شده از گوسفند و بز مشاهده نشد. براساس آنالیز آماری بین شیوع ژنهای مرتبط با تهاجم با نوع نمونه ارتباط معنی داری وجود نداشت (05/0< p).
جدول 4. شیوع ژنهای مرتبط با تهاجم با توجه به نوع نمونه
Table 4: Prevalence of invasion-related genes according to sample type
|
نقش ژن |
ژنهای تهاجمی |
مرغ فراوانی (درصد) |
گاو فراوانی (درصد) |
گوسفند و بز فراوانی (درصد) |
آب فراوانی (درصد) |
χ2 |
P. value |
|
اتصالی |
CadF |
(4/79) 27 |
(8/11) 4 |
(0) 0 |
(8/8) 3 |
29/3 |
14/0 |
|
CiaB |
(7/75) 28 |
(8/11) 4 |
(4/5) 2 |
(8/8) 3 |
79/0 |
44/0 |
|
|
تولید سم |
CdtA |
(5/73) 25 |
(6/20) 7 |
(0) 0 |
(9/5) 2 |
14/0 |
99/0 |
|
CdtB |
(4/74) 32 |
(3/16) 7 |
(7/4) 2 |
(7/4) 2 |
05/0 |
99/0 |
|
|
CdtC |
(8/73) 31 |
(3/16) 7 |
(4/2) 1 |
(1/7) 3 |
65/2 |
15/0 |
|
|
pldA |
(70) 28 |
(5/17) 7 |
(5) 2 |
(5/7) 3 |
68/2 |
14/0 |
بحث
به دلیل اهمیت و نقش کمپیلوباکتر در ایجاد بیماریهای مشترک بین انسان و دام، و همچنین از آنجایی که تعداد موارد کمپیلوباکتریوز در آمریکای شمالی، اروپا و استرالیا افزایش یافته است و اطلاعات اپیدمیولوژیک از آفریقا، آسیا و خاورمیانه هنوز کامل نیست (13, 14). در این مطالعه میزان شیوع جدایههای کمپیلوباکتر را بر اساس ژنهای تهاجمی در نمونههای مرغ، گاو، گوسفند و آب در شهرستان بهبهان مورد بررسی قرار دادیم. براساس نتایج به دست آمده در کل نمونههای بررسی شده میزان شیوع کمپیلوباکتر 7/12 درصد بود، که بیشترین میزان شیوع مربوط به نمونههای مرغ و کمترین میزان مربوط به نمونههای گوسفندان بوده است. شیوع کمپیلوباکتر ژژونی در نمونههای جدا شده به طور معنیداری بیشتر از کمپیلوباکتر کلی بود، در حالی که شیوع ژن تهاجمی با نوع کمپیلوباکتر و نوع نمونههای جمعآوری شده ارتباط مشخصی نداشت.
Zbrun و همکاران در یک مطالعه متا آنالیز عنوان کردند که تقریباً 30 درصد از محصولات غذایی حیوانی، بدون توجه به گونههای حیوانی، دارای کمپیلوباکتر هستند. این نتیجه مهم است زیرا انتقال در طول زنجیره غذایی به طور کلی به عنوان رایجترین مسیر مورد استفاده توسط پاتوژن برای ایجاد کمپیلوباکتریوز انسانی پذیرفته شده است (15). حضور کمپیلوباکتر در محصولات غذایی حیوانی ممکن است حداقل تا حدی توسط سیستمهای تولید دام توضیح داده شود. این امر در دهههای گذشته شدیدتر بوده است. چندین عامل این فرضیه را در مورد اثرات نامطلوب سیستمهای مدرن تولید حیوانات بر ایمنی مواد غذایی پشتیبانی میکند. به این ترتیب، شیوع کمپیلوباکتر در کنسانتره به جای گاوهای علوفهای بیشتر گزارش شده است که احتمالاً به دلیل افزایش تراکم ذخایر، فراوانی دسترسی مشترک گاوها به غذای جامعه و چاههای آب و تماس فیزیکی مداوم با مدفوع سایر حیوانات در حین حبس است (16). مرادی و همکاران در شیراز میزان آلودگی گوشت مرغهای کشتار شده به این باکتری را 73/68 درصد گزارش نمودند (17). گیلانی و همکاران میزان شیوع کمپیلو باکتر در مرغها در شهر آمل را 7/60% گزارش کردند (18). همچنین در بررسی آلودگی گوشت سطح تهران که توسط سلطانی و همکاران انجام گرفت، میزان آلودگی به کمپیلو باکتر را 7/49 درصد اعلام نمودند (19). در مطالعه دیگر ایرانژاد و همکاران میزان شیوع کمپیلوباکتر در لاشه طیور طی مراحل کشتار در کشتارگاه نجف آباد اصفهان را 75/63 درصد گزارش کردند (20). در همین راستا مطالعه حاضر به وضوح اهمیت حیوانات اهلی (گاو و گوسفند) و مرغ در شهرستان بهبهان را به عنوان منابع کمپیلوباکتر نشان داد. همچنین نتایج نشان داد که شیوع کمپیلوباکتر در منطقه مورد مطالعه بالا است. با این حال، شیوع کمپیلوباکتر در منابع حیوانی و محصولات غذایی بالاتر یا کمتر از مقادیر گزارش شده در ژاپن (21)، کره (22) و ایالات متحده (23) بوده است. این تنوع را میتوان به این واقعیت نسبت داد که کمپیلوباکتریوز در این کشورها هیپرآندمیک است و به دلیل بهداشت نامناسب، مجاورت انسان و حیوانات اهلی، اندازههای مختلف نمونه برداری، استفاده از تکنیکهای مختلف آزمایشگاهی و تأثیر ویژگیهای جغرافیایی در مطالعات مختلف باشد.
نتایج مطالعه حاضر نشان داد که در طیور و گاو و گوسفند گونههای مختلف کمپیلوباکتر (کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کلی) وجود دارد، که این حیوانات میتوانند جایگاه و مخزنی برای این کمپیلوباکترهای پاتوژن باشند. همچنین شیوع کمپیلوباکتر ژژونی در نمونههای جدا شده به طور معنیداری بیشتر از کمپیلوباکتر کلی بود. بنابراین، تماس مستقیم افراد با حیوانات آلوده و مصرف محصولات غذایی به دست آمده از این حیوانات آلوده، میتواند دلیل اسهال ناشی از کمپیلوباکتر باشد. در همین راستا Hoepers و همکاران کمپیلوباکتر ژژونی در محصولات طیور شیوع بیشتری نسبت سایر گونههای کمپیلوباکتر داشته است (24). در آمریکای جنوبی و شمالی کمپیلوباکتر ژژونی شیوع بیشتری در بین حیوانات آلوده داشته است (5, 25). در حالی که نتایج مطالعه حاضر مشابه با اکثر مطالعات کمپیلوباکتر ژژونی به عنوان گونه غالب مشاهده کردیم، اما مرادی و همکاران در شیراز عنوان کردند که شیوع جدایه کمپیلوباکتر کلی در گوشت مرغهای کشتار شده شایعتر میباشد (17). از سوی دیگر، براساس جغرافیایی جدایهها، کمپیلوباکتر کلی در اسپانیا، ایتالیا و بلغارستان شیوع بیشتری دارد (26). بر اساس گزارش نویسندگان، تفاوت در فراوانی گونههای کمپیلوباکتر در مناطق مختلف مشاهده میشود، که این تفاوت میتواند به عواملی از جمله فصل نمونهگیری، منطقه جغرافیایی و اندازه نمونه بستگی داشته باشد (27). به طور کلی نتایج این مطالعه نشان داد که عفونت کمپیلوباکتر در نمونههای مرغ، گاو، گوسفند و آب در شهرستان بهبهان شیوع نسبتا بالایی دارد و این میزبانها را می توان منبع اصلی گونههای هر دو کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کلی و خطر احتمالی کمپیلوباکتریوز انسانی دانست.
گیلانی و همکاران ژن cdtC را به عنوان شایعترین ژن، در بین جدایههای کمپیلوباکتر به دست آمده از اردکها 6/92 درصد عنوان کردند، که توانایی کمپیلوباکتر را برای اتصال به فیبرونکتین میزبان و کلونیزاسیون روده افزایش میدهد (18). این نتیجه مشابه تحقیقات انجام شده توسط Kim و همکاران در کره جنوبی (93.3%) (28) و Rossler و همکاران در آرژانتین (92%) (29) بوده است. در مطالعه حاضر آنالیز شیوع ژن cdtC، نشان داد که با وجود گونهها و منشا آنها، 68 درصد گونههای کمپیلوباکتر جدا شده از مدفوع مرغ، گاو و گوسفند دارای این مارکر هستند. نتایج مشابهی با تحقیق ما برای ژن cdtC در نمونههای حیوانات، گوشت و انسان ارائه شده است (30, 31). در حالی که میزان شیوع پایین ژن cdtC در جوجه های گوشتی در آفریقای جنوبی (23.1%) مشاهده شده است (32). به طور کلی، شیوع ژنهای بیماریزای مسئول چسبندگی در کمپیلوباکترها بدون توجه به منبع و منطقه جغرافیایی بسیار زیاد است (33). همچنین ثابت شده است که گونههای فاقد cdtC نمیتوانند در روده طیور کلونیزه شوند. بنابراین، ژن cdtC، که برای کلونیزه شدن در روده ضروری است احتمالاً میتواند نقش مهمی در پاتوژنز عفونت انسانی داشته باشد (34).
نتایج تحقیق حاضر نشان داد که ژنهایCiaB ، cdtA، cdtB و cdtC در نمونههای بررسی شده وجود دارد. Rossler و همکاران ژنهای flaA، flhA، cadF که مسئول بیان چسبندگی و کلونیزاسیون کمپیلوباکتر هستند را در نسبت بالایی در سویههای ارزیابی شده شناسایی کردند (29). شیوع بالای ژنهای cdtA و flhA در بین جدایههای بهدستآمده در نقاط مختلف زنجیره تامین گوشت جوجههای گوشتی نشاندهنده نقش مهم این محصولات ژنی در پاتوژنز کمپیلوباکتر است و در عین حال تنظیم مختصات تحرک و ویرولانس را آشکار میکند (35). شیوع بالای ژن cadf برای جدایههای به دست آمده از نمونههای جوجههای گوشتی، اهمیت محصول این ژن را برای کلونیزاسیون روده جوجههای گوشتی تایید میکند. از سوی دیگر، فراوانی مشابهی از ژنهای cdt در جدایههای مزرعه و کشتارگاه مشاهده شده است. سموم تولید شده توسط کمپیلوباکتر ممکن است عامل دیگری باشد که به طور بالقوه در ایجاد بیماری نقش دارد (36). در مطالعه حاضر در بیش از نیمی از جدایههای کمپیلوباکتر یکی از سه ژن زیر واحد سم که برای بیان سیتوتوکسین صرف نظر از منشا و گونه جداسازی ضروری است، مشاهده شد. شیوع برخی از ژنهای بیماریزا بین کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کلی متفاوت بوده است، که ممکن است به دلیل ناهمگونی در مخزن ژنتیکی سویههای کمپیلوباکتر باشد. نتایج ما ممکن است نشان دهد که پتانسیل بیماریزای جدایههای کمپیلوباکتر ژژونی بالاتر از سویههای کمپیلوباکتر کلی، به ویژه آنهایی که مسئول تولید سم (ژنهای cdt)، و یا مسئول تهاجم سلولهای اپیتلیال (مارکر ciaB) است. علاوه بر این، توجه به این نکته مهم است که نرخ ژنهای بیماریزا میتواند در بین منابع متفاوت باشد، که میتواند تفاوتهای ژنتیکی شامل مکانیسمهای مختلف برای کلونیزاسیون، چسبندگی و بیماریزایی را در میان گونههای کمپیلوباکتر نشان دهد. بنابراین، حضور ژنهای ویرولانس، توانایی جدایههای کمپیلوباکتر را برای چسبیدن و حمله به سلولها تعیین میکند. لازم به ذکر است که وجود فاکتورهای ژنی خاص شواهد مستقیمی مبنی بر بیماریزا بودن این گونه سویهها برای انسان نیست. با این حال، قویا نشان میدهد که آنها ممکن است به طور بالقوه قادر به ایجاد بیماری باشند.
نتیجهگیری
با توجه به نتایج به دست آمده از این مطالعه چنین نتیجهگیری میشود که میزان آلودگی در طیور نسبتا بالا میباشد، که میتواند ابزار مهمی برای عفونتهای کمپیلوباکتر در انسان باشند. اگر چه مرغها به عنوان منابع اصلی گونههای کمپیلوباکتر مطرح هستند، اما لازم است که اهمیت دیگر منابع آلودگی به ویژه گاو و گوسفند برای ارزیابی نقش آنها در عفونتهای انسانی، نیز بررسی شود. بنابراین نقش مرغ، گاو و گوسفند به عنوان منابع این پاتوژنها ممکن است در درک اپیدمیولوژی عفونت کمپیلوباکتر مفید باشد. همچنین بر اساس شواهد به دست آمده، مرغها و گاوها مخازن کمپیلوباکتر ژژونی و کمپیلوباکتر کلی، و گوسفندان مخازن ثانویه این دو گونه کمپیلوباکتر محسوب میشوند. بنابراین برای مصرف انسان حتما باید احتیاطهای لازم به عمل آید و رعایت نکات بهداشتی در محل نگهداری، طول خط کشتار و در فروشگاهها صورت گیرد.
)