تاثیر GABA بر پاسخ‌های فیزیولوژیک اسپیرولینا پلاتنسیس، در شرایط تنش HgCl2

مقدمه

میکروجلبک‌ها، میکروارگانیسم‌های فتوسنتزکننده و سرشار از مواد مغذی (پروتئین، کربوهیدرات، لیپیدها و ...) هستند که هم به‌عنوان فیتوپلانکتون در آبزی‌پروری و هم به‌عنوان مدل‌های تحقیقاتی از اهمیت فراوانی برخوردار هستند(1-3). همچنین، این میکروارگانیسم‌های مفید با حذف فلزات سنگین، کربن، نیتروژن و فسفر از اکوسیستم‌های آبی، نقش مهمی در تصفیه پساب‌ها دارند (1). اسپیرولینا پلاتنسیس [1] یک جلبک سبز - آبی و سیانوباکتر غیرسمی است و به‌دلیل ارزش غذایی زیاد و وجود ترکیبات زیست فعال، یکی از میکروجلبک‌های مهم مطالعه‌شده از جنبه‌های مختلف در سراسر جهان است (4). اسپیرولینا دارای مقادیر زیادی پروتئین (70-55 درصد)، کربوهیدرات (25-15 درصد)، اسیدهای چرب ضروری (18 درصد)، ویتامین‌ها، مواد معدنی و رنگدانه‌هایی نظیر کلروفیل a، کاروتنوئید و فیکوبیلی پروتئین‌ها است (5، 6). علاوه بر این، اسپیرولینا در مطالعات پالایش آلاینده‌های فلزی حائز اهمیت است؛ زیرا علاوه بر محتمل‌بودن ورود بخشی از فلز به داخل سلول، سطوح سلولی سیانوباکترها به‌دلیل داشتن برخی گروه‌های عاملی شیمیایی، محل‌ اتصال بسیاری از کاتیون‌های سمی و فلزات سنگین هستند و ازطریق جذب سطحی، فلزات را از محیط حذف می‌کنند (7، 8). جیوه (Hg) از گروه فلز سنگین است و اثرات نامطلوبی بر محیط زیست و موجودات زنده آن می‌گذارد (9). فعالیت‌های فراصنعتی مانند احتراق سوخت (زغال‌سنگ و روغن‌های فسیلی)، استفاده از قارچ‌کش‌ها در کشاورزی و کاتالیزورهای حاوی جیوه در صنعت، به افزایش مداوم میزان جیوه محیط منجر شده‌اند (10). در اکوسیستم‌های آبی، جیوه معدنی ²)⁺(Hg ممکن است به جیوه متیله‌شده آلی، تبدیل و خطرناک‌تر شود؛ زیرا جیوه آلی سمی‌تر است و به غشاهای سلولی می‌تواند نفوذ کند و حتی در سلول‌های جانوران آبزی تجمع یابد (9، 11).

میکروجلبک‌ها می‌توانند در حذف فلزات سنگین از محیط آبی نقش داشته باشند؛ با این حال، تحقیقات نشان می‌دهند با توجه به خواص شیمیایی فلزات سنگین، غلظت‌های زیاد فلزات می‌توانند فعالیت‌های متابولیسمی و زیست پالایی سلول جلبک را مهار کنند و موجبات مرگ میکروجلبک را فراهم آورند (12). در این رابطه، تنش فلزات سنگین موجب القای تنش اکسیداتیو و تولید انواع اکسیژن فعال[2]، مهار فتوسنتز، تخریب غشای سلولی، مهار آنزیم‌ها و کاهش رشد مورفولوژیک غیرمعمول می‌شود (13، 14). در این رابطه برخی مولکول‌هایی که نقش سیگنالی دارند، ممکن است بتوانند سلول را در شرایط تنش فلزات سنگین یاری کنند و وضعیت را بهبود ببخشند (15، 16).

مواد و روش‌ها

آماده‌سازی محیط کشت جلبک S. platensis و طراحی تیمارها: در این تحقیق، مواد شیمیایی مورد نیاز برای تهیه محیط کشت میکروجلبک اسپیرولینا پلاتنسیس از شرکت‌های مرک و سیگما تهیه شدند و برای کشت آن از محیط کشت مغذی زاروک[7] (1996) استفاده شد (22). مقادیر مساوی میکروجلبک به ارلن‌های 250 میلی‌لیتری استریل‌شده انتقال پیدا کردند. تیمار کلرید جیوه [8] در غلظت‌های 4 (4H) و 8 (8H) میکرومولار و تیمار گابا در غلظت‌های 2  (2G)و 4  (4G)میلی‌مولار هریک به‌صورت مجزا و نیز به‌صورت تلفیق‌شده دارای کلرید جیوه به‌علاوه گابا (HgCl₂ +GABA )، (4H+2G, 4H+4G, 8H+2G, 8H+4G) به سوسپانسیون‌های سلولی میکروجلبک اعمال شدند. نمونه‌های فاقد کلرید جیوه و فاقد گابا به‌عنوان شاهد در نظر گرفته شدند. تمام آزمون‌ها در سه تکرار انجام گرفتند و نمونه‌ها قبل از شروع آزمون و همین‌طور در طی تیماردهی (به مدت 48 ساعت)، در شرایط کنترل‌شده نوری، 100 میکرومول فوتون بر مترمربع بر ثانیه و دمای 2±25 درجه سانتی‌گراد با فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار داده شدند. غلظت‌های استفاده‌شده کلرید جیوه براساس آزمون‌های مقدماتی به‌گونه‌ای انتخاب شدند که تأثیر کشندگی بر اسپیرولینا نداشته باشند و غلظت‌های گابا با استفاده از برخی مقالات (23-25) انتخاب شدند. پس از 48 ساعت تیماردهی، شاخص‌های فیزیولوژیک سنجش شدند. به‌منظور استخراج کامل ترکیبات درون‌سلولی میکروجلبک، چند مرحله فریز - ذوب و ورتکس در مجاورت گلوله‌های شیشه‌ای و سپس سونیکیشن توسط دستگاه سونیکاتور (مدلSONIC 4D ، شرکت جیمز انگلستان) هر مرتبه به مدت 5 دقیقه، در فرکانس 80 هرتز انجام شد.

سنجش وزن خشک: برای اندازه‌گیری وزن خشک جلبک، مقادیر همگنی از سوسپانسیون سلولی به مدت 15 دقیقه درg  13500 سانتریفوژ شد و برای حذف محیط کشت، سطح بیوماس تر، 2 تا 3 بار با آب دو بار تقطیر شستشو داده شد و پس از تخلیه کامل محلول رویی، بیوماس تر به‌دست‌آمده به مدت 24 ساعت در دمای 65 درجة سانتی‌گراد داخل آون، خشک و سپس توزین شد. وزن خشک براساس میلی‌گرم در میلی‌لیتر گزارش شد (26).

سنجش رنگدانه‌های فتوسننتزی: رنگدانه‌های کلروفیل (Chl a) a و کاروتنوئید کل(Car) ، با استفاده از متانول خالص از بیوماس تر اسپیرولینا استخراج شدند (27). جذب نمونه‌ها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر 96 چاهکی (مدل Epoch، شرکت بیوتک انگستان) در طول موج‌های 470، 665 و 720 نانومتر خوانده شد. سپس نتایج با استفاده از روابط زیر برحسب میکروگرم بر میلی‌گرم وزن تر ارائه شدند.

رابطه 1                                                 Chl a = 12.9447 (A₆₆₅-A₇₂₀)

رابطه 2Car = [1000 (A₄₇₀-A₇₂₀)-2.86 (Chl a)]/221                               

سنجش رنگدانه‌های فیکوبیلین: به‌منظور اندازه‌گیری میزان فیکوبیلین‌های موجود در اسپیرولینا، استخراج رنگدانه‌ها براساس روش مورائس[9] و همکاران (2011) با استفاده از بیوماس خشک میکروجلبک انجام شد (28). پس از خواندن جذب عصاره در طول موج‌های 615، 652 و 562 نانومتر با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر 96 چاهکی، محاسبه مقدار فیکوبیلین‌ها طبق روابط 3 تا 6 انجام شد (29) و مقادیر برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن خشک ارائه شدند.

Phycocyanin (C-PC) = {A₆₁₅ – (0.474 ×A₆₅₂)} /5.34                    رابطه‌ 3                       

Allophycocyanin (APC) = {A₆₅₂ – (0.208 ×A₆₁₅)} /5.09                            رابطه‌ 4

Phycoerythrin (PE) = {A₅₆₂ - (2.41× PC) - (0.849 × APC)} /9.62                  رابطه‌ 5

Total phycobiliprotein= PC + APC + PE رابطه‌ 6                                                       

سنجش فنل: عصاره حاوی فنل با استفاده از بیوماس خشک و آب مقطر، پس از انجام ورتکس و سونیک به مدت 5 دقیقه و قراردادن در بن‌ماری (دمای 80 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه) استخراج شد. پس از مخلوط‌کردن سلول‌ها با معرف فولین، محلول کربنات سدیم 20 درصد به آنها اضافه شد، نمونه‌ها ورتکس شدند و به مدت 1 ساعت در تاریکی و در دمای اتاق انکوبه شدند (30). میزان جذب در طول موج 765 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر 96 چاهکی خوانده شد. برای رسم منحنی استاندارد از گالیک اسید استفاده شد و مقدار فنل برحسب میلی‌گرم بر گرم وزن خشک ارائه شد.

سنجش کربوهیدرات محلول کل: پس از سانتریفیوژکردن سوسپانسیون سلولی برداشت‌شده در g 13500 (به مدت 15 دقیقه) و تخلیه محلول رویی، به‌منظور حذف تداخل رنگدانه‌ها، ابتدا از استون خالص، استفاده و سپس مجدداً سانتریفیوژ انجام شد (31). رسوب برداشت‌شده در اتانول 80 درصد با چندین بار‌ فریز - ذوب - سونیک و ورتکس هموژن شد و مجدداً سانتریفیوژ شد. پس از تخلیه محلول رویی، رسوب باقی‌مانده بار دیگر با اتانول هموژن شد و پس از ورتکس شدید و سانتریفیوژ، مایع رویی، جدا و با محلول به‌دست‌آمده از مرحلة قبل مخلوط شد. سپس ازطریق روش آنترون بر اثر واکنش با اسید سولفوریک (72 درصد) سنجش شد (32). میزان جذب در طول موج 625 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر 96 چاهکی، خوانده و برای رسم منحنی استاندارد از گلوکز خالص استفاده شد.

سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدی: پراکسیداسیون لیپیدی براساس میزان مالون دی‌آلدهید توسط روش هاجز [10]و همکاران (1999) ارزیابی شد (33). عصاره‌گیری با استفاده از بیوماس تازه و تری‌کلرواستیک اسید 5 درصد، تیوباربیتوریک اسید 5/0 درصد انجام شد. جذب نمونه‌ها در طول موج‌های 450، 532 و 600 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر 96 چاهکی خوانده شد و محاسبه میزان مالون دی‌آلدهید، طبق رابطه 7 انجام گرفت. مقادیر برحسب میکرومول بر گرم وزن تر گزارش شد.

MAD= 6.45 × (A532 − A600) − 0.56 × A450                                               رابطه 7

سنجش پروتئین محلول کل: برای تهیه عصاره، از Tricine–KOH براساس روش اسمیرنف و کولومب[11] (1998) (34)، استفاده و مقدار پروتئین محلول براساس روش برادفورد[12] (1976) (35) در طول موج 595 نانومتر سنجش شد. نتایج بر‌حسب میکروگرم بر میلی‌گرم وزن تر گزارش شدند و از پروتئین آلبومین گاوی به‌عنوان استاندارد استفاده شد.

سنجش فعالیت آنزیم‌های پراکسیداز کل و پلی‌فنل اکسیداز: عصاره‌گیری برای سنجش آنزیم پراکسیداز به روش اسمیرنف و کولومب (1998) انجام شد و سپس مراحل فریز - ذوب و اولتراسونیک روی نمونه انجام شدند. پس از سانتریفیوژ در g 13500 و دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 15 دقیقه، فعالیت آنزیم پراکسیداز با استفاده از پیروگالل در طول موج 430 نانومتر و با استفاده از ضریب خاموشی mM^-1cm^-1 47/2 براساس روش چنس و مائهلی [13](1995) (36) سنجش شد. برای آنزیم پلی‌فنل اکسیداز از بافر فسفات 50 میلی‌مولار و کلرید پتاسیم 100 میلی‌مولار استفاده شد و سنجش فعالیت آنزیم براساس روش ریموند[14] و همکاران (1993) (37) و خوانش جذب نمونه‌ها در طول موج 412 نانومتر انجام شد.

تحلیل آماری: تمام آزمایش‌ها در 3 تکرار انجام شدند و داده‌ها تحت آنالیز واریانس  (ANOVA) قرار گرفتند. مقایسة میانگین داده‌ها ازطریق آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0P <، انجام و برای بررسی آماری نتایج از نرم‌افزار SPSS نسخه 16 استفاده شد.

نتایج

نتایج به‌دست‌آمده از تحلیل واریانس داده‌ها نشان‌دهندۀ معنی‌داربودن اثرات اصلی عوامل تیمارهای گابا و کلرید جیوه (01/0 P˂) بر شاخص‌های ارزیابی‌شده میکروجلبک اسپیرولینا پلاتنسیس است (جداول 1 و 2).

جدول 1- تجزیه واریانس شاخص‌های فیزیولوژیک میکروجلبک اسپیرولینا پلاتنسیس پس از تیمار با غلظت‌های مختلف گابا (2 و 4 میلی‌مولار) و کلرید جیوه (4 و 8 میکرومولار)؛ وزن خشک، کلروفیل a ، کاروتنوئید کل، فیکوسیانین، آلوفیکوسیانین، فیکواریترین و فیکوبیلین کل.

Table 1- Variance analysis of physiological indices of S. platensis microalga after treatment by different concentrations of GABA (2 and 4 mM) and HgCl₂ (4 and 8 µM); Dry weight, Chlorophyll a, Phycocyanin, Allophycocyanin, Phycoerythrin and Total Phycobilin.

*، ** و ns به‌ترتیب بیان‌کنندة معنی‌داری در سطح احتمال 5 و 1 درصد و عدم معنی‌داری هستند.

جدول 2- تجزیه واریانس شاخص‌های فیزیولوژیک میکروجلبک اسپیرولینا پلاتنسیس پس از تیمار با غلظت‌های مختلف گابا (2 و 4 میلی‌مولار) و کلرید جیوه (4 و 8 میکرومولار)؛ فنل، کربوهیدرات، پروتئین، مالون دی‌آلدهید و فعالیت آنزیم‌های پلی‌فنل اکسیداز و پراکسیداز.

Table 2- Variance analysis of physiological indices of S. platensis microalga after treatment by different concentrations of GABA (2 and 4 mM) and HgCl₂ (4 and 8 µM); Phenol, Carbohydrate, Protein, Malondialdehyde, Polyphenol oxidase and Peroxidase enzyme activities.

*، ** و ns به‌ترتیب بیان‌کنندة معنی‌داری در سطح ا حتمال 5 و1 درصد و عدم معنی‌داری هستند.

بررسی نتایج حاصل از وزن خشک اسپیرولینا مطابق شکل 1، افزایش اندک مقدار وزن خشک تحت‌تأثیر تیمار 4G و کاهش آن در تمام تیمارهای حاوی جیوه را نشان می‌دهد؛ با این حال، تیمار گابا سبب بهبود وضعیت وزن خشک و افزایش آن نسبت به شرایط تیمار جیوه بدون گابا شد.

شکل 1. وزن خشک میکروجلبک‌ اسپیرولینا پلاتنسیس پس از تیمار با غلظت‌های مختلف 2 و 4 میلی‌مولار گابا  (G)و 4 و 8 میکرومولار کلرید جیوه(H)  به هر دو صورت منفرد و تلفیقی. مقادیر میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0P < براساس آزمون دانکن هستند.

Figure 1- Dry biomass of S. platensis microalga after treatment by different concentrations of GABA (G, 2 and 4 mM) and HgCl₂ (H, 4 and 8 µM), both individually and combined. Data is the average of three replicates±SD, and different letters indicate significant differences based on Duncan's test at p<0.05.

براساس نمودارهای A و B در شکل 2، تأثیر تیمارها بر مقدار کلروفیل a و کاروتنوئید کل، حاکی از وجود یک الگوی تقریباً مشابه در تغییرات رنگدانه‌ها تحت‌تأثیر تیمارهای کلرید جیوه و گابا بود که کاهش مقدار رنگدانه‌ها در تمام تیمارهای منفرد (کلرید جیوه یا گابا) و افزایش مقادیر آنها در غالب تیمارهای تلفیقی (گابا + کلرید جیوه) نسبت به تیمارهای منفرد ملاحظه شد. مقدار کلروفیل a حتی در تیمارهای 4H +2G ، 8H + 2G  و 8H + 4G  از مقدار آنها در شاهد نیز بیشتر بود.

شکل 2. مقدار کلروفیل a (A) و کاروتنوئید کل (B) در میکروجلبک‌ اسپیرولینا پلاتنسیس پس از تیمار با غلظت‌های مختلف 2 و 4 میلی‌مولار گابا  (G) و 4 و 8 میکرومولار کلرید جیوه(H)  به هر دو صورت منفرد و تلفیقی. مقادیر میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0P < براساس آزمون دانکن هستند.

Figure 2- Chl a and total Carotenoid contents of S. platensis microalga after treatment by different concentrations of GABA (G, 2 and 4 mM) and HgCl₂ (H, 4 and 8 µM), both individually and combined. Data is the average of three replicates±SD, and different letters indicate significant differences based on Duncan's test at p<0.05.

میزان رنگدانه‌های فیکوسیانین(PC) ، آلوفیکوسیانین (APC) و فیکواریترین(PE) ، تحت‌تأثیر تیمارهای مختلف کلرید جیوه و گابا، به‌طور مشابه و یکسان تغییر نکرد (شکل A, B, C, D3)؛ به‌طوری‌که مقدار PE در اغلب تیمارها نسبت به شاهد کاهش یافت؛ اما مقدار APC در غالب تیمارها افزایش نشان داد و فقط در دو تیمار 4H و 4G + 8H نسبت به شاهد کاهش مشاهده شد. رنگدانه PC نسبت به APC، افزایش کمتری تحت‌تأثیر تیمارها نشان داد. 2 میلی‌مولار گابا سبب افزایش چشمگیر و معنی‌دار (p<0.05) در تمام فیکوبیلین‌ها نسبت به شاهد شد؛ اما 4 میلی‌مولار گابا و تیمارهای 8H و 4H+4G نیز افزایش مقدار فیکوبیلین کل را نسبت به شاهد موجب شدند. دو تیمار 4H و 8H+4G سبب بیشترین کاهش در مقادیر فیکوبیلین‌ها شدند.

شکل 3. مقادیر رنگیزه‌های فیکوسیانین (A)، آلوفیکوسیانین (B)، فیکواریترین (C) و فیکوبیلی پروتئین کل (D) در میکروجلبک‌ اسپیرولینا پلاتنسیس پس از تیمار با غلظت‌های مختلف 2 و 4 میلی‌مولار گابا  (G)و 4 و 8 میکرومولار کلرید جیوه(H)  به هر دو صورت منفرد و تلفیقی. مقادیر میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0P ≤ براساس آزمون دانکن هستند.

Figure 3- The content of Phycocyanin (A), Allophycocyanin (B), Phycoerythrin (C) and Total Phycobilin (D) of S. platensis microalga after treatment by different concentrations of GABA (G, 2 and 4 mM) and HgCl₂ (H, 4 and 8 µM), both individually and combined. Data is the average of three replicates±SD, and different letters indicate significant differences based on Duncan's test at p<0.05.

مقدار فنل سلول‌ها تحت‌تأثیر تیمار 4G و تیمارهای تلفیقی آن با غلظت‌های متفاوت جیوه (4H+4G , 8H+4G) و نیز تیمار 8H+2G افزایش یافت (شکلA 4). کاهش چشمگیر در میزان فنل، تحت‌تأثیر غلظت‌های 4 و 8 تیمارهای منفرد کلرید جیوه یعنی 4H و 8H نسبت به شاهد مشاهده شد؛ اما تیمار گابا بر آن تأثیر مثبت و افزایشی داشت.

مقدار کربوهیدارت محلول کل در بیشتر موارد به‌طور کاهشی تحت‌تأثیر تیمارهای جیوه و گابا قرار گرفت (شکلB 4)؛ اما تیمار 8H+4G، افزایش چشمگیر مقدار قند نسبت به شاهد را موجب شد. بیشترین کاهش‌ها تحت‌تأثیر تیمارهای منفرد کلرید جیوه اتفاق افتادند.

محتوای پروتئین میکروجلبک در آزمون تحت‌تأثیر تیمارهای منفرد گابا و تیمارهای تلفیقی آن با کلرید جیوه نسبت به شاهد افزایش یافت؛ اما تیمارهای کلرید جیوه مقدار پروتئین سلول را کاهش دادند (شکلC4).

شکل 4. مقادیر فنل (A)، کربوهیدرات محلول کل (B) و پروتئین (C) در میکروجلبک‌ اسپیرولینا پلاتنسیس پس از تیمار با غلظت‌های مختلف 2 و 4 میلی‌مولار گابا  (G)و 4 و 8 میکرومولار کلرید جیوه(H)  به هر دو صورت منفرد و تلفیقی. مقادیر میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0P < براساس آزمون دانکن هستند.

Figure 4- The content of Phenol (A), total soluble carbohydrate (B) and Protein (C) of S. platensis microalga after treatment by different concentrations of GABA (G, 2 and 4 mM) and HgCl₂ (H, 4 and 8 µM), both individually and combined. Data is the average of three replicates±SD, and different letters indicate significant differences based on Duncan's test at p<0.05.

مقدار پراکسیداسیون لیپیدی غشا تحت‌تأثیر تمام تیمارهای آزمایش، نسبت به شاهد افزایش یافت (شکلA5)؛ اما مقدار آن توسط تیمارهای منفرد کلرید جیوه از بقیه بیشتر افزایش یافت. بیشتر تیمارهای تلفیقی کلرید جیوه + گابا، مقدار مالون دی‌آلدهید را نسبت به تیمارهای منفرد کاهش دادند.

فعالیت آنزیم پلی‌فنل اکسیداز در تمام تیمارها نسبت به شاهد افزایش یافت (شکلB5). بیشترین میزان افزایش‌ها تحت‌تأثیر غلظت‌های مختلف کلرید جیوه یعنی4H  و  8Hمشاهده شد. تیمارهای تلفیقی در بیشتر موارد مقدار فعالیت آنزیم پلی‌فنل اکسیداز را نسبت به تیمارهای منفرد کاهش دادند.

مقدار فعالیت آنزیم پراکسیداز کل نیز تحت‌تأثیر تمام تیمارها به استثنای تیمار تلفیقی 4H+2G، نسبت به شاهد افزایش یافت (شکلC5)؛ با این حال، غلظت بالاتر جیوه (8H) سبب افزایش کمتری در فعالیت آنزیم نسبت به غلطت پایین‌تر کلرید جیوه (4H) شد؛ اما هر دو غلظت گابا سبب افزایش بیشتر مقدار فعالیت آنزیم در تیمار تلفیقی آن با 8H نسبت به شاهد شدند.

شکل 5. مقدار مالون دی‌آلدهید (A)، فعالیت آنزیم پلی‌فنل اکسیداز (B) و فعالیت آنزیم پراکسیداز کل (C) در میکروجلبک‌ اسپیرولینا پلاتنسیس پس از تیمار با غلظت‌های مختلف 2 و 4 میلی‌مولار گابا  (G)و 4 و 8 میکرومولار کلرید جیوه(H)  به هر دو صورت منفرد و تلفیقی. مقادیر میانگین سه تکرار ± SD هستند. حروف متفاوت، بیان‌کنندة تفاوت معنی‌دار در سطح 05/0P < براساس آزمون دانکن هستند.

Figure 5- The content of Malondialdehyde (A), Polyphenol oxidase enzyme activity (B) and Peroxidase enzyme activity (C) of S. platensis microalga after treatment by different concentrations of GABA (G, 2 and 4 mM) and HgCl₂ (H, 4 and 8 µM), both individually and combined. Data is the average of three replicates±SD, and different letters indicate significant differences based on Duncan's test at p<0.05.

بحث و نتیجه‌گیری

گابا به‌عنوان یک مولکول سیگنال‌دهنده، به‌طور گسترده در گیاهان و جانوران مطالعه شده است؛ اما بررسی‌ها دربارة تأثیرات آن بر سیانوباکترها اندک است. به نظر می‌رسد گابا در شرایط نامطلوب، نقش مهمی در موجودات زنده دارد (38). در تحقیق حاضر، تأثیر گابا بر فیزیولوژی سیانوباکتر اسپیرولینا پلاتنسیس در شرایط تنش فلزی جیوه بررسی شد.

نتایج به‌دست‌آمده از تأثیر تیمار کلرید جیوه بر اسپیرولینا نشان دادند جیوه در هر دو غلظت به کار برده شده، سبب کاهش مقدار وزن خشک میکروجلبک اسپیرولینا شد (شکل 1)؛ اما تیمار گابا سبب بهبود وضعیت و افزایش مقداری وزن خشک در شرایط تنش جیوه شد؛ اگرچه مقدار آن در تیمارهای تلفیقی (H+G) کمتر از وزن خشک در شاهد باقی ماند. برخی دانشمندان نظیر سیمانجانتاک[xv] و همکاران (2016) گزارش کردند تیمار کلرید جیوه سبب کاهش تعداد سلول‌های میکروجلبک بوتریو کوکوس برونی[xvi] و مهار رشد آن شد. درواقع به‌علت سمیت جیوه، غلظت‌های فلز بیش از مقدار تحمل سلول، رشد سلول را مهار می‌کنند (39). این نتایج با نتایج به‌دست‌آمده از تحقیق حاضر مطابقت دارد که در آن غلظت 8 میکرومولار جیوه، رشد و تکثیر را بیش از غلظت 4 میکرومولار کاهش می‌دهد.

کاهش رشد بر اثر تأثیر فلزات سنگین نظیر جیوه، می‌تواند به‌دلایل ایجاد تغییر در نفوذپذیری غشا (40)، مهار جذب مواد مغذی (41)، تداخل با فعالیت‌ آنزیم‌ها (42)، افزایش فعالیت آنزیم کلروفیلاز (43)، جایگزین‌شدن فلز سنگین به‌جای یون منیزیم در رنگدانه کلروفیل و سایت‌های فعال آنزیم‌ها (44)، بروز تنش اکسیداتیو و تحریک تولید رادیکال‌های آزاد (45) صورت بگیرد. همچنین، کاهش رشد می‌تواند به‌دلیل نیاز به انرژی سلول‌ها به‌منظور مقابله با تجمع فلز جیوه اتفاق افتاده باشد (46).

برخی گزارش‌ها حاکی از آن هستند که مولکول گابا می‌تواند بر مراحل مختلف رشد و ویژگی‌های سلول تأثیر بگذارد. در آزمایشی غلظت‌های مناسب گابای اگزوژن سبب رشد سلول‌های هماتوکوکوس پلویالیس[xvii] در شرایط تنش شوری و نور شدند (47). گابا می‌تواند ازطریق افزایش اسمولیت‌های سازگار و تنظیم اسمزی نیز سبب بهبود وضعیت رشد شود (48). در این تحقیق، گابا در غلظت بالاتر (4 میلی‌مولار) و در عدم حضور جیوه، سبب تحریک افزایش وزن خشک به میزان کمی شد که تأثیر مثبت گابا بر تحریک متابولیسم سلول‌ها را نشان می‌دهد.

نتایج به‌دست‌آمده از این تحقیق نشان دادند مقدار رنگدانه‌های فتوسنتزی کلروفیل a و کاروتنوئید کل به‌صورت منفی تحت‌تأثیر تیمارهای جیوه و گابای منفرد قرار گرفتند (شکلA, B  2)؛ درحالی‌که تیمارهای تلفیقی، یعنی تیمار گابا در شرایط تنش جیوه (H+G)، اغلب سبب کاهش مقدار رنگدانه‌های فتوسنتزی نشده‌اند یا در شرایطی، حتی سبب مقداری افزایش شدند.

مشاهده شده است که قرارگرفتن در معرض جیوه می‌تواند بیوسنتز کلروفیل a را با جایگزین‌شدن به‌جای اتم منیزیم مرکزی (Mg²⁺) مهار کند (49، 50) و سبب ممانعت فتوسنتزی شود. علاوه بر جایگزین‌شدن جیوه، به‌جای یون‌های فلزی در رنگدانه‌های فتوسنتزی، کاهش مقدار کلروفیل همچنین به تنش اکسیداتیو ناشی از جیوه و کاهش جذب عناصر ضروری مانند منگنز و پتاسیم نسبت داده شده است (51). مهار فعالیت آنزیم‌هایی که بیوسنتز کلروفیل را کاتالیز می‌کنند نیز بر اثر تیمار جیوه تأیید شده است (52). در پژوهشی کاهش بازده کوانتومی فتوسنتز و بروز تغییرات در فتوشیمی فتوسیستم 2 میکروجلبک اسپیرولینا پلاتنسیس مشاهده شد که به مدت 2 ساعت در معرض حداکثر 20 میکرومولار جیوه قرار گرفته بود (53).

براساس گزارش‌ها، بروز تأثیر منفی فلزات سنگین بر بیوسنتز و تجمع کاروتنوئیدها نیز مشاهده شده است (54، 55). در تحقیقی بیوسنتز کلروفیل‌ها و کاروتنوئیدها به‌دلیل بروز اختلال و تأخیر در پیوستن این رنگدانه‌ها به فتوسیستم‌ها به‌دلیل تنش فلز سنگین مس کاهش یافت (56). در تحقیق دیگری، تنش کادمیوم بیوسنتز کلروفیل و کاروتنوئید را در میکروجلبک‌های مونورافیدیوم[xviii] و کلرلا وولگاریس[xix] مهار کرد (57، 58).

در تحقیق حاضر، غلظت بالاتر جیوه (8H) و غلظت بالاتر گابا(4G)  به‌ترتیب سبب کاهش بیشتر و کمتر مقدار رنگدانه‌های کلروفیل و کاروتنوئید در مقایسه با غلظت‌های پایین‌تر این ترکیبات شدند (شکل 2). بررسی‌ها نشان می‌دهند گابا می‌تواند با توجه به شرایط تنش، ازطریق کاهش یا افزایش رنگدانه‌های فتوسنتزی، سبب کنترل شرایط و بهبود وضعیت سلول شود (59). نقش گابا در کاهش اثرات تنش فلزی کادمیوم در برخی از جلبک‌ها نظیر مونورافیدیوم گزارش شده است (15). نقش محافظتی گابا در قبال فتوسنتز، می‌تواند با تنظیم بیوسنتز کلروفیل و با کاهش تجمع بیش‌ازحد کلروفیل a و پیش‌سازهای آن و حفظ یکپارچگی ساختار غشای کلروپلاست اعمال شود (59). از میان تیمارهای تلفیقی، صرفاً تیمار 4H+2G سبب افزایش چشمگیر کلروفیل و کاروتنوئید شد (شکل 2). مطالعات متعددی تأثیرات وابسته به غلظت گابا را در تنش‌ها نشان داده‌اند (47، 60).

فیکوبیلی‌پروتئین‌ها رنگدانه‌های فتوسنتزی مهمی در سیانوباکترها هستند و از آنها می‌توان در صنایع غذایی و دارویی به‌عنوان رنگ‌های فلورسانس، داروهای ضدسرطان و التهاب و درکل ترکیبات آنتی‌اکسیدان استفاده کرد (61). فیکوبیلین‌ها همچنین دارای قابلیت اتصال به فلزات هستند (62). در نتایج به‌دست‌آمده از این تحقیق، الگوی افزایش و کاهش فیکوبیلین‌ها تحت تیمارهای جیوه و همین‌طور گابا، با یکدیگر مشابه نبود و فیکواریترین غالباً حالت‌های کاهشی و آلوفیکوسیانین و فیکوسیانین در این رابطه، روند افزایشی نشان دادند (شکل A, B, C3). بررسی‌های بلامی - کارتر[xx] و همکاران (2022) نشان دادند اتصال فلزات مختلف به هریک از رنگدانه‌های فیکوبیلین به‌صورت متفاوت و با شدت تمایل متفاوتی اتفاق می‌افتد؛ برای مثال، نقره بیشتر به آلوفیکوسیانین متصل می‌شود تا فیکوسیانین و همچنین مس تأثیر اندکی بر ساختار آلوفیکوسیانین و اما تأثیر بسیار زیادی بر فیکوسیانین می‌گذارد (62). براساس منابع، در بیشتر آزمایش‌های انجام‌شده در حضور فلزات، میزان فیکوبیلین‌ها به‌دلیل اتصال به فلز و از بین رفتن ساختار رنگدانه، کاهش نشان داده است (62، 63)؛ با این حال، در برخی موارد نظیر تحقیقات زاکارو[xxi] در سال 2001، بر اثر تیمار با سرب، چهار برابر شدن میزان فیکوبیلین‌ها مشاهده شد. این مورد با نتایج به‌دست‌آمده از تحقیق حاضر که در غلظت 8 میکرومولار جیوه، میزان فیکوبیلین کل افزایش یافت مشابهت دارد. زاکارو و همکاران، افزایش فیکوبیلین‌ها را با وقوع برخی مکانیسم‌های محافظتی فتوسنتز و افزایش گیرنده‌های نوری تتراپیرول در شرایط تنش مرتبط دانسته‌اند. برخی نیز معتقدند غالباً در شرایط تنش، حجم منابع نیتروژنی سلول (مثلاً فیکوبیلین‌ها) افزایش می‌یابد (64).

تأثیر گابا (در هر دو غلظت استفاده‌شده) به‌طور منفرد و نیز در غالب تیمارهای تلفیقی به‌همراه جیوه، به‌صورت افزایش فیکوبیلین‌ها مشاهده شد (شکل 3). براساس منابع، گابا جذب نیتروژن را افزایش و تولید پروتئین را با تحریک فعالیت و نیز بیان ژن آنزیم‌های متابولیسم نیتروژن افزایش می‌دهد (65). این مورد، با نتایج ما مطابقت دارد که علاوه بر مقدار فیکوبیلین، در آن میزان پروتئین محلول کل نیز بر اثر تمام تیمارهای گابا (با جیوه یا بدون جیوه) افزایش می‌یابد (شکلC 4)؛ اما برعکس، مقدار پروتئین سلول‌ها بر اثر هر دو غلظت 4 و 8 میکرومولار جیوه کاهش یافت. سمیت زیاد Hg⁺² به‌علت میل ترکیبی زیاد آن با گروه‌های تیول است (50) و در میکروجلبک‌ها، سمیت فلزاتی نظیر جیوه می‌تواند به‌علت اتصال آنها به گروه‌های سولفیدریل پروتئین‌ها و تغییر ساختار آنها اتفاق بیافتد (66). در یک تحقیق، کاهش مقدار پروتئین سلول در گیاه نخود، در حضور فلز کادمیوم، به افزایش روند تخریب پروتئین به‌دلیل افزایش فعالیت آنزیم پروتئاز در شرایط تنش، نسبت داده شده است (67). همچنین، کاهش پروتئین در سلول‌های اسپیرولینا بر اثر تیمار با آلومینیوم مشاهده شده است (68).

ترکیبات فنلی از گروه متابولیت‌های ثانویه و دارای خاصیت آنتی‌اکسیدانی هستند (69). حضور گروه‌های هیدروکسیل و کربوکسیل در آنها به کلاته‌کردن فلزات کمک می‌کند و از این طریق سبب کاهش سمیت فلزات می‌شوند (70، 71). این ترکیبات با ارزش در شرایط طبیعی به میزان کمی در میکروجلبک اسپیرولینا یافت می‌شوند؛ بنابراین، برخی تحقیقات به‌منظور افزایش مقدار آنها در این میکروجلبک صورت گرفته است (72). در تحقیق حاضر، محتوای ترکیبات فنلی بر اثر تیمار با جیوه کاهش یافت؛ اما هر دو غلظت 2 و 4 میکرومولار گابا به‌طور منفرد و همین‌طور در تلفیق با تیمار جیوه سبب افزایش این ترکیبات شدند (شکل A4). گزارش‌هایی از تأثیر تحریک‌کنندة گابای اگزوژن بر تولید فنل‌ها در شرایط تنش و افزایش پتانسیل آنتی‌اکسیدانی در گیاهان وجود دارند (73). براساس تحقیقات برنارد و گوایگن‌ [xxii] در سال 2023، تنش فلزی بیش از اینکه بر تعداد ترکیبات فنلی میکروارگانیسم اوگلنا [xxiii] مؤثر باشد، بر تنوع مولکولی ترکیبات فنلی آن مؤثر بوده است (74)؛ بنابراین، افزایش‌نیافتن ترکیبات فنلی در میکروجلبک اسپیرولینا تحت‌تأثیر هر دو غلظت فلز جیوه ممکن است به همین دلیل باشد. افزایش فعالیت آنزیم پلی‌فنل اکسیداز در اسپیرولینای تیمارشده با جیوه، نشان‌دهندة افزایش اکسیداسیون ترکیبات فنلی در این شرایط است (شکل B5)؛ درحالی‌که با افزودن گابا، فعالیت این آنزیم، کاهش و به‌دنبال آن مقدار ترکیبات فنلی افزایش می‌یابد. افزایش فعالیت آنزیم پلی‌فنل اکسیداز در پاسخ به تنش‌های محیطی، در گذشته نیز گزارش شده است (75، 76).

در میکروجلبک اسپیرولینا بخش عمده‌ای از کربوهیدرات کل سلول را قندهای محلول تشکیل می‌دهند؛ درحالی‌که در گیاهان عالی، این بخش، بیشتر از قندهای نامحلول نظیر نشاسته تشکیل شده است (77). کاهش مقدار کربوهیدرات‌های محلول در اسپیرولینا تحت‌تأثیر تنش جیوه و همین‌طور گابا (به‌جز تیمار تلفیقی 8H+4G که بیشترین غلظت هر دو ترکیب را شامل شده است) مشاهده شد (شکل B4) که می‌تواند به‌دلیل مصرف سریع قندهای محلول برای مقابله با تنش طی ساعات اولیه یا به‌دلیل اختلال در متابولیسم کربن اتفاق افتاده باشد. استیبوروا[xxiv] و همکارانش در سال 1987 گزارش کردند کاهش محتوای کربوهیدرات سلول در شرایط تنش کادمیوم می‌تواند به‌دلیل مهار احتمالی متابولیسم کربن بر اثر برهمکنش کادمیوم با سایت‌های فعال آنزیم‌های ضروری مانند روبیسکو رخ داده باشد (78). همچنین رزا[xxv] و همکاران در سال 2009، تخلیه سریع محتوای قندهای محلول در شرایط تنش را به‌دلیل ایجاد اختلال در فتوسنتز دانستند (79).

بروز اختلال در فتوسنتز و تولید رادیکال‌های آزاد اکسیژن بر اثر تنش اکسیداتیو می‌تواند سبب آسیب‌رسانی به غشاها شود و پراکسیداسیون لیپیدی را افزایش دهد (80). مقدار مالون دی‌آلدهید که یک ترکیب حاصل از پراکسیداسیون لیپیدی غشاها است (81)، در تحقیق حاضر، در تمام تیمارها نسبت به شاهد افزایش یافت (شکل A5) و این افزایش در تیمارهای جیوه فاقد گابا از باقی تیمارها بیشتر بود. جیوه با اتصال به کلروپلاست‌ها بر فتوسنتز تأثیر می‌گذارد و سبب تولید گونه‌های فعال اکسیژن می‌شود (82).

مقدار فعالیت آنزیم‌های پراکسیدازی تقریباً در بیشتر موارد تیمار جیوه و نیز گابا افزایش یافت (شکل C5). پراکسیدازها آنزیم‌های کلیدی در شرایط تنش اکسیداتیو هستند که حذف پراکسید هیدروژن در شرایط تنش و کاهش اکسیژن فعال را موجب می‌شوند (83). همچنین، بررسی‌ها نشان دادند گابای اگزوژن می‌تواند سبب القای فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان کاتالاز، پراکسیداز و سوپراکسید دیسموتاز شود (84). این اتفاقات درون‌سلولی، در 48 ساعت اولیه مواجهه با تیمار کلرید جیوه برای وقوع سازگاری با تنش فلز سنگین ضروری می‌نماید؛ اما تحریک برخی شاخص‌های آنتی‌اکسیدانی سلول (نظیر آنزیم‌های پلی‌فنل اکسیداز و پراکسیداز) بر اثر تیمار با گابا (به‌طور منفرد) نشان‌دهندة به راه افتادن پیام‌های درون‌سلولی و نشانه تغییر شرایط سلولی به‌دلیل دریافت پیام‌های تأثیر گابای اگزوژن است. تحقیقات نشان می‌دهند گابا علاوه بر تأثیر بر سلول‌ها در شرایط تنش، بر سلول‌ها در شرایط غیرتنش نیز تأثیرگذار است و سبب به راه افتادن یکسری پیام‌های سلولی، مثلاً در خصوص بهبود وضعیت رشدی گیاهان می‌شود (85). همچنین، گابا در تمام موارد، به‌جز در یک مورد، افزایش مقدار پروتئین‌ها و کاهش مقدار کربوهیدرات را سبب شد که براساس منابع، نشان‌دهندة نقش گابا در تنظیم نسبت کربن به نیتروژن به‌ویژه در شرایط تنش است (86).

نتیجه‌گیری

نتایج به‌دست‌آمده درکل، حاکی از تأثیرات منفی کلرید جیوه بر سیانوباکتر اسپیرولینا پلاتنسیس بود که به‌صورت بروز بیشترین مقدار پراکسیداسیون لیپیدهای غشا و افت مقدار متابولیت‌های مهم سلول نظیر کربوهیدرات، پروتئین و رنگدانه‌های فتوسنتزی (کلروفیل a و کاروتنوئید) در 48 ساعت اول نمایان شد؛ در عین حال، گابا وضعیت شاخص‌های اسپیرولینا را در حضور کلرید جیوه در ساعات اولیه تنش بهبود بخشید. تیمار گابا در شرایط عدم حضور جیوه سبب تحریک سیستم اکسیدان / آنتی‌اکسیدان سلول شد که براساس منابع، نشان‌دهندة بروز یکسری وقایع در ساعات اولیه مرتبط با حالت سیگنالی گابا و تغییر متابولیسم سلولی می‌تواند باشد. تحقیقات نشان می‌دهند تحریک افزایش میزان گابای اندوژن نیز می‌تواند به‌سرعت در تیمار سلول با گابای اگزوژن اتفاق بیافتد که درنتیجه سبب به راه افتادن یکسری وقایع و پیام‌های درون‌سلولی و سازگاری سلول با شرایط جدید می‌شود.

[1]- Spirulina platensis

[2]- Reactive oxygen species (ROS)

[3]- Gama-aminobutyric acid (GABA)

[4]- Exogen

[5]- Endogen

[6]- GABA shunt pathway

[7]- Zarrouk

[8]- HgCl₂

[9]- Moraes

[10]- Hodges

[11]- Smirnoff and Colombe

[12]- Bradford

[13]- Chance and Maehly

[14]- Raymond

[xv]- Simanjuntak

[xvi]- Botryococcus braunii

[xvii]- Haematococcus pluvialis

[xviii]- Monoraphidium sp. QLY-1

[xix]- Chlorella vulgaris

[xx]- Bellamy-Carter

[xxi]- Zaccaro

[xxii]- Bernard and Guéguen

[xxiii]- Euglena

[xxiv]- Stiborov´a

[xxv]- Rosa