سنتز میکروبی نانوذرات اکسید مس با استفاده از سویه باکتری جدید (Bacillus cytotoxicus H2-7 ) و بررسی روش‌های مختلف سنتز و عوامل مؤثر بر آن

مقدمه

باکتری‌ها به‌طور مداوم در معرض شرایط محیطی سخت ناشی از غلظت بالای یون‌های فلزات سنگین در محیط اطراف خود هستند. با این حال، باکتری‌ها در طول تکامل، مکانیسم‌های دفاعی مختلفی را مانند جداسازی درون سلولی، پمپ‌های خروجی، تغییر در غلظت یون فلزی و رسوب‌گذاری خارج سلولی را برای مقابله با استرس ناشی از فلزات کسب کرده‌اند (1). آن‌ها توانایی منحصربه‌فردی در کاهش یون‌های فلزی به نانوذرات فلزی دارند و همچنین به‌دلیل سهولت کارکرد، نرخ رشد بالا و امکان دستکاری ژنتیکی، یکی از گزینه‌های مطلوب برای تولید زیستی نانوذرات محسوب می‌شوند (2).

رویکردهای بیولوژیکی، فیزیکی و شیمیایی مختلفی برای سنتز نانوذرات فلزی پیشنهاد شده است. بیونانوتکنولوژیست‌ها علاقه زیادی به بیوسنتز CuNPهای فلزی دستکاری‌نشده در یک فاز آبی دارند؛ زیرا به‌دلیل تمایل مس به اکسیدشدن سریع در دمای اتاق، سنتز مس پایدار با اندازه و شکل مطلوب و کنترل‌شده را بسیار دشوار می‌کند. به‌طور کلی، اسید اسکوربیک، اتیلن گلیکول، هیدرازین، بوروهیدرید سدیم و هیپوفسفیت سدیم به‌عنوان عوامل تثبیت‌کننده در سنتز CuNPs استفاده می‌شوند (3). در این میان، روش‌های بیولوژیکی، به‌ویژه روش‌های مبتنی بر باکتری، به‌دلیل ویژگی‌های عالی‌شان، مانند عدم نیاز به عوامل پایدار و تثبیت‌کنندة خارجی، هزینه کمتر و سهولت دستکاری سلول، نسبت به سایرین مزایای برتری دارند (4). به‌طور کلی، تشکیل نانوذرات فلزی می‌تواند به‌صورت خارج سلولی یا درون سلولی انجام شود (5). میکروارگانیسم‌های مختلف توانایی تولید نانوذرات فلزی را از هر دو طریق درون سلولی و برون سلولی دارند. در روش داخل سلولی، سلول میکروبی دارای سیستم انتقال یون است. به‌دلیل تعامل الکتروستاتیک، دیوارة سلولی که دارای بار منفی است، بار مثبت یون‌های فلزی را جذب می‌کند. علاوه بر آن، دیوارة سلولی حاوی آنزیم‌هایی است که یون‌های فلزی را ازطریق احیا به نانوذرات آن فلز تبدیل می‌کند. این مکانیسم شامل مراحل به دام انداختن یون فلزی، کاهش و پوشش‌گذاری است؛ درحالی‌که در روش خارج سلولی، سلول میکروبی ردوکتازهایی را ترشح می‌کند که این آنزیم‌ها موجب احیای یون فلزی می‌شوند (1). سنتز خارج سلولی شامل ترشح آنزیم و سپس کاهش یون فلزی و پوشش‌گذاری نانوذرات تولیدشده است. یافته‌های حاصل از پژوهش‌ها بیان می‌کنند تولید خارج سلولی نانوذرات به‌دلیل ساده‌تربودن و خلوص بیشتر بر تولید درون سلولی ارجحیت دارد (6).

مطالعات نشان داده‌اند متابولیت‌ها و آنزیم‌های ثانویه موجود در باکتری‌ها مسئول تشکیل نانوذرات در فرایندهای خارج سلولی هستند. به همین دلیل، یک سیستم باکتریایی منبع بالقوه‌ای برای بیوسنتز خارج سلولی نانوذرات فلزی بدون استفاده از حلال‌های سمی است (7).

تاکنون نانوذرات فلزی مختلفی مانند اکسید آهن مغناطیسی (8)، اکسید روی و دی‌اکسید تیتانیوم (4) سنتز شده‌اند. علاوه بر این، این مطالعات گزارش کردند برخی از این نانوذرات فلزی دارای فعالیت‌های بیولوژیکی و بیوشیمیایی مختلفی هستند که در این میان، اخیراً به CuNPها توجه شده است.

مس یکی از پرمصرف‌ترین مواد در جهان است، در تمام صنایع به‌ویژه در بخش برق به‌دلیل هزینه کم، اهمیت زیادی دارد و همچنین نقش‌های مختلفی در انسان دارد؛ ازجمله نقش کوفاکتور برای آنزیم‌های متعددی که در تولید نوروپپتید، تنظیم مسیر سیگنال‌دهی سلولی، دفاع آنتی‌اکسیدانی و عملکرد سلول‌های ایمنی نقش دارند. مس برای انواع فرایندهای متابولیک و فیزیکوشیمیایی گیاهان مورد نیاز است، یکی از مهم‌ترین عناصر کمیاب برای رشد گیاه محسوب می‌شود، هم در انسان و هم در گیاهان به مقدار بسیار کم وجود دارد و به‌دلیل نقش کوفاکتوری به تنظیم فعالیت‌های متابولیکی و زیستی مختلف کمک می‌کند. این ماده مسئول عملکرد طبیعی پروتئین‌ها و آنزیم‌های ضروری مختلف مانند آمینواکسیداز، سیتوکروم c اکسیداز و پلاستوسیانین است. از سوی دیگر، اکسید مس دارای خواص ضدباکتریایی، ضدمیکروبی، ضدقارچی، زیست‌کشی (بیوسیدال)، ابررسانایی، کاتالیزوری و نوری است (4). براساس این، استفاده از نانوذرات مس (CuNPs) به‌عنوان یک عامل زیست فعال امیدوارکننده برای به‌کارگیری در صنایع مختلف درخور توجه قرار گرفته است که در این میان محققان به سنتز سبز آن به‌خصوص با کمک میکروارگانیسم‌ها بسیار توجه کرده‌اند. ضمن اینکه استفاده از باکتری‌های جداشده از یک محیط چالش‌برانگیز مانند زیستگاه‌های نمکی، به‌دلیل داشتن پتانسیل برای تنظیم دقیق پایداری، اندازه و شکل NPها، از اهمیت دوچندانی برخوردار است (9) که در این میان سنتز نانوذرات به ظرفیت باکتری‌ها برای تحمل سطوح سمیت فلزات سنگین متکی است و این میکروب‌ها با احیای یون‌های فلزی به اکسید فلز خود، نانوذرات را تحت استرس سنتز می‌کنند (10). با این حال، مطالعات مربوط به سنتز باکتریایی نانوذرات اکسید مس به‌ویژه با استفاده از باکتری‌های جداشده از محیط‌های چالشبرانگیز محدود است. به همین دلیل، رویکرد بیوسنتز نانوذرات اکسید مس در این تحقیق شامل استفاده از میکروارگانیسم‌های جداشده از یک محیط سخت است. این مطالعه به سنتز سبز نانوذرات مس با استفاده از یک باکتری جدید Bacillus cytotoxicus H2-7 جداشده از دریاچه حوض سلطان در ایران در شرایط رشد بهینه اختصاص یافته است. نانوذرات اکسید مس بیوسنتزشده توسط UV-vis,FE-SEM, FTIR, DLS, XRD آنالیز شدند و درنهایت، فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات اکسید مس بیوسنتزشده تعیین شدند.

مواد و روش‌ها

نمونه‌ها در اکتبر 2019 از دریاچه نمک حوض سلطان (34°58'58.2" 50°54'11.1" شرقی) جمع‌آوری شدند که در حدود 40 کیلومتری شمال‌شرقی قم و 85 کیلومتری جنوب تهران، ایران قرار دارد. نمونه‌های آب، گل شور، نمک و خاک شور در مکان‌های خاص، هم در سطح و هم در عمق تا 10 سانتی‌متر جداسازی شدند. در زمان نمونه‌برداری، دما بین 19 تا 22 درجه سانتی‌گراد متغیر بود. pH محیط پس از انتقال نمونه‌ها به آزمایشگاه 3/8-4/6 تعیین شد. نمونه‌ها پس از جمع‌آوری در ظروف پلاستیکی استریل، 24 ساعت بعد کشت داده شدند و بلافاصله در یخچال در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. برای باکتری‌های نسبتاً هالوفیلیک، نمونه‌ها به‌ترتیب روی نوترینت آگار و براث غذایی با 10 و 20 درصد نمک دریایی (g/l) کشت داده شدند (NaBr 0.026, NaHCO3 0.06, KCl2 2, CaCl2 3.6, MgCl2.H2O 7.0, MgSO4.7H2O 9.7, and NaCl 81 ) (11).

 بررسی تحمل فلزی جدایه‌های باکتریایی

توانایی تحمل جدایه‌های باکتریایی نسبت به مس با استفاده از روش حداکثر غلظت قابل تحمل (MTC) تعیین شد. به‌منظور دستیابی به غلظت نهایی یون مس در محدوده‌های 5/0، 1، 5/2 و 5 میلی‌مولار، پلیت‌های آزمایشی (نوترینت آگار) با افزودن مقادیر مختلف سولفات مس تهیه شد. به‌عنوان شاهد، از صفحات بدون یون مس استفاده شد. پس از تقسیم هر پلیت به چهار بخش مساوی، باکتری‌های جداشده (108×1.5 CFU/ml) روی سطح محیط کشت توزیع شدند. پلیت‌ها در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 روز پس از تلقیح برای مشاهده رشد باکتری انکوبه شدند. MTC به‌عنوان حداکثر غلظت یون مس در محیطی تعریف شد که باکتری‌ها را قادر می‌کند در هر سه تکرار رشد کنند.

شناسایی جدایة باکتریایی

جدایه انتخاب‌شده براساس ویژگی‌های فیزیولوژیکی، مورفولوژیکی و بیوشیمیایی و پس از آن، برای تأیید هویت باکتری‌های جداشده، به‌صورت مولکولی شناسایی شد. تکنیک استخراج DNA ژنومی پیشنهادشده در این مقاله شامل جوشاندن ساده است (12). عصاره‌های DNA دست‌نخورده به‌عنوان الگو برای تکثیر PCR 16s rDNA با استفاده از پرایمرهای جهانی با توالی نوکلئوتیدی 8F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3) و 1492R(5-CACGGATCCTACGGGTACCTTGTTACGACTT-3) و دمای ذوب 55 درجه سانتی‌گراد استفاده شدند. از الکتروفورز در ژل آگارز برای آنالیز مقدار کمی محصول PCR استفاده شد. باندهای DNA مشاهده شدند و تصاویر با استفاده از UVP به دست آمدند. نزدیک‌ترین گونه‌ها با مقایسه توالی‌های نوکلئوتیدی حاصل با استفاده از خدمات شبکه اصلی ابزار جست‌وجوی هم‌ترازی محلی (BLAST) پایگاه داده NCBI شناسایی شدند. سپس توالی‌ها برای دریافت شماره‌های الحاق به GenBank ارسال شدند.

سنتز زیستی برون سلولی نانوذرات توسط عصاره عاری از سلول

برای سنتز خارج سلولی نانوذرات اکسید مس، ایزوله باکتریایی با حداکثر مقدار MTC انتخاب شد. در این تحقیق از روش‌های عصاره بدون سلول، مایع رویی، زیست‌توده زنده و مرده استفاده شد. باکتری منتخب شناسایی‌شده (Bacillus cytotoxicus H2-7 با شماره دسترسی OK175630.1 در پایگاه داده NCBI) در محیط کشت براث تلقیح شد و سپس به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد با هم‌زدن 150 دور در دقیقه انکوبه شد. هر دو زیست‌توده و مایع رویی پس از سانتریفیوژشدن کشت در 8000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه برای مطالعه بعدی جمع‌آوری شدند. زیست‌توده زنده به‌عنوان زیست‌توده معلق در 20 میلی‌لیتر آب یونیزه استریل‌شده با CuSO4.5H2O 5 میلی‌مولار ترکیب داده شد. مقدار کافی زیست‌توده زنده برای زیست‌توده مرده جمع‌آوری شد و در 15 psi به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سانتی‌گراد اتوکلاو شد. در روش رویی، 100 میلی‌لیتر مایع رویی به 50 میلی‌لیتر آب دیونیزه حاوی CuSO4.5H2O اضافه شد. پس از آن، هر دو روش (زیست‌توده و مایع رویی) در دمای 30 درجه سانتی‌گراد با هم‌زدن 150 دور در دقیقه انکوبه شدند تا فرایند بیوسنتز آغاز شود. تولید نانوذرات اکسید مس ازطریق مشاهدة تغییر رنگ و طیف‌سنجی ماورای‌بنفش- مرئی UV-vis ارزیابی شدند. این روش از بین پنج روش استفاده‌شده انتخاب شد. برای این کار، فلاسک حاوی براث مواد مغذی استریل با کشت خالص سویه H2-7 تلقیح شد و فلاسک به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و 180 دور در دقیقه انکوبه شد. پس از سانتریفیوژ، 2 درصد وزنی از زیست‌توده باکتریایی به 100 میلی‌لیتر آب استریل‌شده اضافه شد و به مدت 48 ساعت در شرایط مشابهی گرماگذاری شد که قبلاً توضیح داده شد. مایع رویی به‌دست‌آمده پس از سانتریفیوژ با عصاره بدون سلول یکسان بود. 20 میلی‌لیتر CuSO4.5H2O به فلاسک با عصاره بدون سلول اضافه شد و روی شیکر چرخشی (150 دور در دقیقه) در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 48 ساعت انکوبه شد. کنترل مثبت (عصاره بدون سلول) و کنترل منفی (محلول نمک پیش‌ساز خالص) با فلاسک‌های آزمایشی انکوبه شدند (13). به‌منظور جداسازی نانوذرات تولیدشده، محلول حاوی رسوب در دور rpm ۸۰۰۰ به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب به‌دست‌آمده با آب دیونیزه شست‌وشو داده و با دستگاه فریز درایر خشک شد.

تأثیر پارامترهای مختلف بر بیوسنتز نانوذرات اکسید مس

برای سنجش تأثیر پارامترهای مختلف در بیوسنتز نانوذرات اکسید روی، پارامترهای مختلفی ازجمله نمک فلزی (سولفات مس و کلرید مس)، غلظت نمک فلزی (10، 5/7، 5، 5/2 میلی‌مولار)، pH (2، 7، 10)، درجه حرارت (25، 30، 35 درجه سانتی‌گراد)، چرخش شیکر (100، 150، 200 دور در دقیقه) بر تولید نانوذرات اکسید مس به‌وسیلة عصارة سلولی جدایة H2-7 سنجش شدند (14). تمامی عوامل با 3 بار تکرار، آزمایش و با استفاده از طیف‌سنجی UV-vis مقایسه شدند.

شناسایی نانوذرات سنتزشده

آزمون پراش اشعه ایکس (XRD) برای تجزیه و تحلیل نانوذرات اکسید مس سنتزشده با استفاده از پراش‌سنج اشعه ایکس (Philips PW1730, Holland) استفاده شد. یک اسپکتروفتومتر (UV 1800، Shimadzu، توکیو، ژاپن) برای تشخیص طیف UV-vis تشکیل نانوذرات اکسید مس در محدوده 200-800 نانومتر استفاده شد. Cordouan Tech )WALLIS، VASCO2، فرانسه) برای انجام پراکندگی نور پویا (DLS) و پتانسیل زتا استفاده شد. TESCAN )MIRA II، جمهوری چک) با تجهیزات FE-SEM برای انجام طیف‌سنجی پراکنده انرژی (EDS) روی نمونه‌های خشک‌شده استفاده شد. دستگاه طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز (FTIR) در محدوده 400-4000 سانتی‌متر1- با استفاده از اسپکتروفتومتر TENSOR 27 انجام شد تا مشخص شود کدام ترکیبات زیست‌فعال موجود در عصاره باکتری در کاهش و تثبیت نانوذرات اکسید مس نقش دارند.

فعالیت ضدباکتریایی

انتشار چاهک بر سطح آگار

این روش در مرحله اول برای تجزیه و تحلیل فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات اکسید مس تولیدشده در برابر دو باکتری E.coli ATCC11725 و S.aureus ATCC25923 استفاده شد. ابتدا 100 میکرولیتر از یک سوسپانسیون باکتریایی 24 ساعته ( 1.5 × 108 CFU/ml) با استفاده از یک میله L شکل روی محیط کشت پخش شد. نانوذرات اکسید مس سنتزشده در آب مقطر رقیق شده و غلظت‌های مختلف آن (1، 2، 3، 4، 5 و 6 میلی گرم بر میلی لیتر) به کار گرفته شد و سپس محیط کشت‌ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. قطر (mm) ناحیه بازدارنده اندازه‌گیری و ثبت شد (15).

تعیین MIC و MBC

غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید مس (µg/ml 100،200،400،800،1600) با رقیق‌سازی مداوم نمونه‌ها با محیط براث غذایی در یک صفحه 96 چاهی به دست آمدند. غلظت نهایی سویه‌ها براساس پروتکل‌های منتشرشده تعیین شد. جذب پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‌گراد با دستگاه ELISA Reader ارزیابی شد. 100 میکرولیتر نمونه از چاه‌های بدون رشد روی نوترینت آگار قرار داده شد و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای ارزیابی حداقل غلظت باکتری‌کش (MBC) انکوبه شد (16).

تجزیه و تحلیل آماری

یافته‌های هر آزمایش در سه تکرار اجرا شد و مایکروسافت اکسل همه آنها را به‌صورت میانگین ± انحراف معیار (SD) گزارش کرد. برای ارزیابی آماری داده‌ها از ANOVA یک‌طرفه (p-value < 0.05) استفاده شد.

نتیجه و بحث

غربالگری باکتری‌ها از خاک شور و گل شور دریاچه نمک حوض سلطان منجر به جداسازی 30 جدایه براساس رشد بهینه در محیط‌های با غلظت‌های مختلف نمک شد. از بین تمامی جدایه‌ها، 15 جدایه نسبتاً هالوفیل (10 درصد) و 11 جدایه فوق‌العاده هالوفیل (20 درصد) هستند. به‌منظور سنتز نانوذرات مس به‌صورت خارج سلولی، جدایه باکتریایی با بالاترین مقدار MTC انتخاب شد. از بین 4 سویه باکتریایی با تحمل بالا به سولفات مس، یک سویه (Bacillus cytotoxicus H2-7) با بیشترین جذب توسط طیف‌سنجی  UV-visانتخاب شد. برای بررسی سنتز خارج سلولی نانوذرات اکسید مس، Bacillus cytotoxicus H2-7 انتخاب شد؛ زیرا سطح بالاتری از تحمل فلز مس را نسبت به دیگر جدایه‌های باکتری نشان داد که همین امر باعث می‌شود ضمن رهاشدن از اثرات سمی فلز سنگین بتواند با ظرفیت بیشتری آن را به نانوذرات تبدیل کند.

شکل 1. مشخصات تحمل به غلظت‌های مختلف سولفات مس توسط جدایه‌های باکتریایی که جدایه H2-7 و H2-6 به‌ترتیب بالاترین میزان تحمل را نشان دادند.

Figure 1. Characteristics of tolerance to different concentrations of copper sulfate by bacterial isolates, H2-7 and H2-6 isolates showed the highest levels, respectively.

بررسی تولید نانوذرات

در این مرحله با توجه به آزمایش‌های اولیه، روش عصارة عاری از سلول برای سنتز نانوذرات اکسید مس انتخاب شد. علت انتخاب این روش سریع‌بودن و عدم نیاز به جداسازی ترکیبات محیط کشت و اجزای سلولی از نانوذرات تولیدی است. براساس واین، نانوذرات تولیدشده با این روش خالص‌تر هستند (17). پس از اضافه‌شدن نمک مس سولفات به عصارة سلولی، تغییر رنگ از آبی به سبز پررنگ رخ می‌دهد. این تغییر رنگ به‌علت احیای یون مس به نانوذرات مس است. هنگامی که محلول نمکی مس سولفات در معرض آنزیم‌های سلولی قرار می‌گیرد، فرایند احیا رخ می‌دهد؛ درنتیجه، تغییر رنگ را می‌توان اولین نشانة تولید نانوذرات اکسید مس به حساب آورد (18). 10 دقیقه پس از افزوده‌شدن نمک مس سولفات به عصارة سلولی جدایة H2-7 رسوب سبز رنگی در انتهای ارلن تشکیل شد که بیان‌کنندة آغاز فرایند احیای یون مس بود. پس از سپری‌شدن دورة 48 ساعتة انکوباسیون، رنگ محلول واکنش به رنگ سبز پررنگ تغییر پیدا کرد که بیان‌کنندة تولید نانوذرات اکسید مس بود. مطالعات قبلی نشان دادند بهترین زمان برای انکوباسیون و تولید نانوذرات اکسید مس به‌صورت تک‌فاز و با بیشترین میزان تولید بین 48-36 ساعت است (19) که در مطالعه ما نیز چنین نتیجه‌ای حاصل شد.

 شکل 2. 1) سنتز نانوذرات اکسید مس توسط عصارة جدایه H2-7 پس از 48 ساعت (الف: کنترل عصارة سلولی H2-7 به همراه آب مقطر ب: کنترل نمک مس سولفات ج: عصارة سلولی به همراه نمک مس سولفات). 2) رسوب شسته‌شدة حاصل از سانتریفیوژ محلول حاوی نانوذرات اکسید مس تولیدشده توسط جدایة H2-7

Figure 2. 1) Synthesis of copper oxide nanoparticles by H2-7  isolate extract after 48  hours A: H2-7   cell extract control with distilled water B: copper sulfate salt control C: cell extract with copper sulfate salt). 2)Washed precipitate obtained from centrifugation of a solution containing copper oxide nanoparticles produced by H2-7 isolation.

علاوه‌ بر تغییر رنگ، تولید نانوذرات با مشاهدة پیک SPR در ناحیه‌ 300-200 نانومتر توسط طیف‌سنجی UV-vis بررسی شد. نانوذرات اکسید مس در این ناحیه دارای پیک هستند (20). طیف جذبی هر چهار جدایه در طول موج 800-200 نانومتر خوانده شد. جدایه‌های T3 و H2-5 در محدوده 300-200 نانومتر هیچ‌گونه پیکی ایجاد نکردند که به معنای عدم تولید نانوذرات توسط این دو جدایه است. دو جدایة H2-6 و H2-7 در ناحیه‌ ذکرشده بین 300-250 نانومتر پیک SPR داشتند که به معنای تولید نانوذرات اکسید مس است (21). پیک جذبی جدایة H2-7 نسبت به H2-6 بیشتر بود که می‌تواند به‌علت تولید بیشتر نانوذره، اندازة بیشتر ذرات یا پایداری بیشتر آنها باشد. علاوه بر آن، تغییر رنگ به‌علت احیای بیشتر یون مس در این سویه بیشتر بود. به همین دلیل، سویه‌ H2-7 به‌عنوان جدایة منتخب این پژوهش انتخاب شد و مابقی آزمایشات توسط این جدایه انجام شد. در پژوهش Tiwari که توسط Bacillus cereus صورت گرفته بود، دو پیک SPR، یکی در ناحیه‌ 300-200 نانومتر و دیگری در ناحیه‌ 630-570 شکل گرفته بود که نشان‌دهندة تولید نانوذرات به‌صورت اکسید مس و مس بود (22). علاوه بر آن، پیک SPR ایجادشده در پژوهش El-Saadony که با استفاده از Pseudomonas fluorescens اقدام به تولید نانوذرات مس کردند، در محدوده 550-600 نانومتر بود که این امر نشان‌دهندة تفاوت پیک جذبی نانوذرات مس و نانوذرات اکسید مس است (14).

شکل 3. مقایسة تولید نانوذرات اکسید مس توسط جدایه‌‌های منتخب در شرایط یکسان دما، pH و دور شیکر

Figure 3. Comparison of production of copper oxide nanoparticles by selected isolates under the same conditions of temperature, pH and shaker cycle

شناسایی ایزوله باکتریایی

پس از تعیین توالی ژن 16s rDNA سویه مدنظر و انفجار آن در محل NCBI، سویه انتخابی شناسایی شد. براساس نتایج حاصل از بلاست، این سویه شباهت 99 درصدی با سویه‌های متعلق به Bacillus subtilis داشت. پس از تعیین توالی ژن 16s rDNA، این ژن با شماره دسترسی OK175630.1 در پایگاه داده ژن ثبت شد. تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی همچنین تأیید کرد که سویه متعلق به جنس باسیلوس است. این سویه احتمالاً به‌عنوان سویه جدید باسیلوس سوبتیلیس طبقه‌بندی می‌شود. براساس تجزیه و تحلیل توالی ژن 16s rDNA، درخت فیلوژنتیک با روش همسایه-جوینینگ ترسیم شد (شکل 4) و موقعیت این سویه در بین گونه‌های دیگر نشان داده شد.

شکل 4- درخت فیلوژنی سویة H2-7 و اعضای دیگر جنس Bacillus بر مبنای ژن تکثیریافتة 16S rDNA

Figure 4. Phylogeny tree of strain H2-7and other members of the genus Bacillus based on the amplified  16S rDNA gene

بیوسنتز خارج سلولی نانوذرات اکسید مس

بهترین روش با استفاده از پیک‌های جذب به‌دست‌آمده از اسپکتروفتومتر UV-vis در شکل 5 مشخص شد. همان‌طور که مشاهده می‌کنید بالاترین پیک مربوط به روش عصاره سلولی است که با مطالعه قبلی ما نیز مطابقت دارد (11). روش عصاره سلولی به‌دلیل کارایی بالا و پیک جذب بالاتر نسبت به روش‌های دیگر برای مطالعه سنتز نانوذرات استفاده شد؛ اما روش‌های رقت، مایع رویی و زیست‌توده به‌دلایلی مانند ناخالصی نانوذرات تولیدشده و راندمان پایین کنار گذاشته شدند. پس از 48 ساعت، تمام رسوبات جمع‌آوری شدند و نانوذرات با شست‌وشو با آب دیونیزه خالص و با خشک‌کن فریز خشک شدند.

شکل 5. مقایسة روش‌های تولید نانوذره‌ اکسید مس به‌وسیلة جدایه H2-7  در شرایط یکسان دما، PH و دور شیکر که روش عصاره سلولی بالاترین بازدهی را به همراه داشت.

Figure 5. Comparison of copper oxide nanoparticle production methods by isolate H2-7under the same conditions of temperature, pH and shaker cycle, the cell extract method yielded the highest efficiency

بررسی عوامل بهینه سنتز

نوع نمک پیش‌ساز

برای به دست آوردن یک نوع NP می‌توان از نمک‌های پیش‌ساز مختلف استفاده کرد. مطالعات قبلی نشان دادند خواص نانوذرات تولیدشده ازطریق رویکردهای سبز را می‌توان به‌سادگی تحت‌تأثیر پیش‌ساز انتخابی قرار داد. با این حال، اطلاعات دربارة اثر نمک‌های پیش‌ساز مختلف بر ویژگی‌های NP سبز محدود است. دروپنو و همکاران نشان دادند نانوذره‌های اکسید روی با قطر تقریباً 107 نانومتر با مخلوط‌کردن استات روی و عصاره برگ Anacardium occidentale به دست آمده‌اند. استفاده از کلرید روی منجر به سنتز نانومیله‌های اکسید روی با طول 167 نانومتر و عرض 68 نانومتر شده است. با این حال، هر دو نمونه با تجمع مواجه شدند (23). نانوذرات ZnO سنتزشده از سولفات روی دارای مورفولوژی نانومیله و اندازه متوسط 30 نانومتر بودند. برعکس، نانوذرات به‌دست‌آمده با همان روش، اما با استفاده از نمک نیترات روی یا استات روی، مکعبی و در اندازه 15 تا 20 نانومتر بودند. علاوه بر این، تمایل آنها به تجمع و آگلومره‌شدن مشاهده شد. نکته جالب توجه اینکه استفاده از نمک‌های مختلف حتی می‌تواند بر فعالیت بیولوژیکی نانوذرات نیز تأثیر بگذارد. فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات اکسید روی به‌دست‌آمده از نیترات روی در برابر سویه‌های باکتریایی بارزتر بود؛ درحالی‌که آنهایی که با استفاده از سولفات روی تولید شدند، در برابر سویه‌های مختلف آسپرژیلوس کارآمدتر بودند (24). خلاصه اینکه نوع نمک پیش‌ساز در مقدار تولید، اندازه، شکل و پایداری نانوذرات اهمیت به‌سزایی دارد. نمک مس کلرید در مقایسه با نمک مس سولفات در تهیة نانوذرات با غلظت 5 میلی‌مولار بررسی شد. پس از سه بار تکرار آزمایش، مشخص شد براساس میزان جذب طیف UV-vis نمک سولفات مس توانایی بهتری در سنتز نانوذرات مس در مقایسه با نمک مس کلرید دارد؛ بنابراین، این نمک برای ادامه مطالعات انتخاب شد.

سطوح pH

مطالعات قبلی نشان دادند شکل و اندازه نانوذرات را می‌توان با سطوح pH کنترل کرد (25). پیک شناسایی‌شده در نمونه در pH اسیدی 2 نشان داد که pH پایین باعث کاهش بیوسنتز نانوذرات اکسید مس می‌شود که همین امر منجر به کوچک‌شدن پیک جذب مربوطه شده است؛ بنابراین، بیوسنتز نانوذرات اکسید مس در این مطالعه با pH پایین محدود شد. شکل نشان می‌دهد pH 7 بهترین شرایط برای بیوسنتز نانوذرات است. همان‌طور که قبلاً توسط ایسمیل و همکارانش بیان شد، Rhodopseudomonas capsulate در pH 7 بیشترین مقدار نانوذرات طلا را تولید می‌کند (3). رانی و شانتکریتی گزارش کردند که pH 7 به‌عنوان pH بهینه برای تولید CuNP توسط Pseudomonas fluorescens MTCC 103 است (18) که با نتایج به‌دست‌آمدة ما مطابقت دارد. pH قلیایی موجب تجمع ذرات و افزایش ابعاد آنها می‌شود.

درجه حرارت

این فاکتور در سه دمای مختلف 25، 30 و 35 درجه سانتی‌گراد بررسی شد. مقایسه پیک‌های حاصله نشان دادند دمای بهینه برای بیوسنتز نانوذرات اکسید مس توسط عصاره بدون سلول 30 درجه سانتی‌گراد است. شکل نتایج نشان داد بیوسنتز نانوذرات اکسید مس با افزایش دما کاهش می‌یابد و این کاهش می‌تواند به‌دلیل غیرفعال‌شدن یا تخریب ترکیبات زیستی در مخلوط واکنش مسئول فرایند کاهش زیستی رخ دهد (3). با افزایش دمای واکنش در مخلوط واکنش، هم سرعت سنتز و هم تبدیل به نانوذرات مس در محیط افزایش یافت؛ این نتیجه با مطالعات دیگر مطابقت دارد که نشان داده شد سرعت سنتز و تبدیل به نانوذرات با افزایش دمای واکنش بهبود می‌یابد (26).

غلظت CuSO4.H2O

برای مطالعه تأثیر غلظت CuSO4.H2O، از غلظت‌های 10، 5/7، 5، 5/2 میلی‌مولار استفاده شد. نمونه‌های کنترل هیچ پیک مشخصی را در محدوده مربوطه نشان ندادند که نشان‌دهندة عدم تشکیل CuNPs بودند. هنگامی که عصاره سلولی با غلظت 5 میلی‌مولار سولفات مس 5 آبه مواجه شد، پیک جذب شفافی نمایان شد؛ اما با افزایش بیشتر غلظت نمک مس، پیک‌های بعدی کوچک‌تر شدند. همان‌طور که در شکل نشان داده شده است، نتایج این قسمت نشان دادند غلظت 5 میلی‌مولار سولفات مس بهترین غلظت برای بیوسنتز نانوذرات مس است. هنگامی که غلظت نمک از این مقدار بیشتر یا کمتر شود، میزان جذب کاهش می‌یابد. افزایش غلظت بیشتر موجب اشباع ظرفیت باکتری در سنتز نانوذرات می‌شود (11). این نتایج با مطالعات قبلی نیز مطابقت دارد که با افزایش غلظت نمک مس تا یک مقدار مشخص بالاترین پیک به دست می‌آید؛ اما در اینجا افزایش غلظت موجب بالاتررفتن پیک نمی‌شود (3).

سرعت هم‌زدن (دور شیکر)

سرعت هم‌زدن یک عامل حیاتی در بیوسنتز و پایداری نانوذرات است. احتمال تماس یون‌های فلزی با مولکول‌های زیستی در مخلوطی بیشتر است که پیوسته هم زده می‌شود؛ بنابراین، رابطه بین سرعت واکنش سنتز و سرعت هم‌زدن باید مستقیماً متناسب باشد. این نقش هم‌زدن زمانی تأیید شد که نانوذرات آهن با استفاده از زیست‌توده قارچی سنتز شدند. آنالیزهای UV-Vis نشان دادند جذب مخلوط هم‌زده در مقایسه با جذب استاتیک دو برابر است (27). در مطالعه ما، اثر سه دور شیکر مختلف که عبارت‌اند از  rpm200، 150، 100 بر تولید نانوذرات اکسید مس ارزیابی شد. پس از سه بار تکرار آزمایش دور شیکر rpm 150 بالاترین پیک را ایجاد کرد؛ بنابراین، این عدد به‌عنوان دور مناسب برای تولید نانوذرات اکسید مس به‌وسیلة عصارة جدایه H2-7 انتخاب شد. این واقعیت که سرعت هم‌زدن می‌تواند سرعت واکنش را افزایش دهد نیز توسط مطالعه سلواکومار و همکاران تأیید می‌شود که در آن، سنتز NP نقره براساس مولکول‌های موجود در برگ‌های Acalypha hispida بود. با افزایش سرعت هم‌زدن، تشکیل نانوذرات سریع‌تر بود و به 7-5 دقیقه در 700 دور در دقیقه رسید. با این حال، نتایج نشان دادند سرعت بیش‌ازحد می‌تواند روی مولکول‌های زیستی درگیر در فرایند سبز تأثیر بگذارد. این می‌تواند دلیلی باشد که سرعت واکنش در سرعت هم‌زدن بیش از 700 دور در دقیقه تحت‌تأثیر منفی قرار می‌گیرد (28) که در مطالعه ما نیز با افزایش دور تا 200 میزان سنتز با کاهش مواجه شد.

شکل 6. مقایسه جذب طیف UV-vis فاکتورهای مختلف (الف) نمک پیش‌ساز (ب) pH (پ) درجه حرارت (ج) غلظت نمک (د) سرعت هم‌زدن در بیوسنتز نانوذرات مس توسط Bacillus cytotoxicus H2-7.

Figure 6:  Comparison of UV-vis absorption spectrum of different factors: (a) precursor salt  (b) pH  (c) temperature  (D)  salt concentration (E)  stirring speed in the biosynthesis of copper nanoparticles by Bacillus cytotoxicus  H2-7

شناسایی نانوذرات اکسید مس

آنالیز FE-SEM

تصاویر FE-SEM در دو بزرگ‌نمایی 1 میکرومتر و 100 نانومتر ثبت شدند. مورفولوژی نانوذرات اکسید مس تولیدشده با استفاده از عصارة سلولی جدایة H2-7 به شکل کروی است. نتایج این تصویربرداری مشخص می‌کند اندازه نانوذرات تولیدشده متنوع است؛ اما متوسط اندازة نانوذرات اکسید مس بین 80-50 نانومتر است. مطالعات قبلی نشان داده‌اند شکل و اندازة نانوذرات تابعی از فعالیت آنزیمی میکروارگانیسم‌ها، گروه‌های عاملی سطح نانوذرات و شرایط محیطی مانند دما است (1).

شکل 7. آنالیز FE-SEM نانوذرات اکسید مس تولیدشده (a: بزرگ‌نمایی 1 میکرومتر b: بزرگ‌نمایی 100 نانومتر)

Figure 7FE-SEM analysis of produced copper oxide nanoparticles  a: :1μm magnification. b :100 nm magnification

آنالیز FTIR

در این آنالیز پیک جذبی در ناحیة اثر انگشت، در دو طول‌موج cm-1 457 و cm-1 601 تأییدکنندة وجود نانوذرة CuO است. علاوه بر آن، هیچ‌گونه پیکی در محدودة cm-1 660-605 ثبت نشده است که بیان می‌کند نانوذرات اکسید مس به‌صورت Cu2O تولید نشده‌اند و به‌صورت تک‌فاز به فرم CuO هستند. همچنین پیک‌های ثبت‌شدة دیگر مربوط به گروه‌های عاملی هستند که به‌عنوان عامل احیاکننده، عامل پوششی و عامل پایدارکننده باعث تولید نانوذرات اکسید مس شده‌اند. این گروه‌های عاملی مربوط به آنزیم‌ها و ترکیبات موجود در باکتری تولیدکننده است (14). پیک جذبی در محدوه  cm-13550-3700 مربوط به پیوند O-H در الکل یا فنول است. پیک جذبی در cm-1 3418 مربوط به پیوندهای N-H در گروه‌های آمید یا آمین است. پیک جذبی در cm-1 2925 مربوط به پیوند C-H در متیلن است. پیک تیز در cm-1 1652 مربوط به کتون است. پیک جذبی در cm-1 1561 مربوط به پیوند N-H در آمین‌های نوع دو است. پیک‌های کوتاه و تیز در محدوده cm-1 1550-1450 مرتبط با حضور حلقه‌های آروماتیک است. پیک تیز و بلند در cm-1 1062 مربوط به پیوند C-O در الکل‌های نوع 1 است. پیک کوتاه و تیز در cm-1 794 بیان‌کنندة پیوند قوی بین C-Cl است. با توجه به نتیجة حاصل، پروتئین‌ها و ترکیبات آلی موجود در عصارة سلولی جدایه H2-7 باعث احیای یون فلزی مس و پوشش‌دهی نانوذرات تولیدشده به‌منظور پایدارسازی شده‌اند.

شکل 8- آنالیز طیف‌سنجی FTIR نانوذرات اکسید مس تولیدشده به‌وسیلة عصارة سلولی جدایة H2-7

Figure 8. FTIR spectroscopic analysis of copper oxide nanoparticles produced by the cell extract of isolate H2-7.

آنالیز DLS و پتانسیل زتا

میانگین شعاع هیدرودینامیکی نانوذرات اکسید مس تولیدشده، در حالتی که در آب مقطر پراکنده شده‌اند، برابر با 37/145 نانومتر است. با توجه به حضور مولکول‌های آب در اطراف ذرات و خطای آگلومره‌شدن ذرات، نتیجة حاصل از DLS بزرگ‌تر از FE-SEM است. شاخص پراکندگی اندازة ذرات[i] PDI برابر با 51874/0 است که بیان‌کنندة طیف نسبتاً گستردة اندازة ذرات است و نانوذرات اکسید مس تولیدشده به فرم Polydisperse نزدیک‌تر هستند. این نتیجه با تصاویر حاصل از FE-SEM مطابقت دارد که وجود ذرات با اندازه‌های مختلف را نشان می‌داد. پراکندگی اندازة ذرات به طیف مختلف ترکیبات احیاکننده و پوشش‌دهندة نانوذرات مرتبط است. پتانسیل زتا نیز برابر با 5/33- میلی‌ولت است که نشان‌دهندة بار سطحی مناسب نانوذرات برای ایجاد پایداری است. مقدار پتانسیل زتا بینشی از پایداری کلوئید است. نانوذرات مس و اکسید مس که پتانسیل زتای آنها بیشتر از 30+ میلی‌ولت یا کمتر از 30- میلی‌ولت باشند، پایدار محسوب می‌شوند. علاوه بر این، بر نتیجة آنالیز DLS و پتانسیل زتا شرایط محیطی آزمایش اعم از pH، دما، غلظت و ویسکوزیتة نمونه تأثیرگذار است (14).

مطالعات قبلی حاکی از آن است که نانوذرات CuO را می‌توان از باکتری گرم منفی متعلق به جنس Serratia سنتز کرد. Pseudomonas stutzeri غیربیماری‌زا می‌تواند CuNPهای کروی با محدوده اندازه بین 8 تا 15 نانومتر تولید کند. با این حال، می‌تواند CuNPهای مکعبی به اندازه 50 تا 150 نانومتر را سنتز کند. علاوه بر این، اشریشیا کلی می‌تواند نانوذرات CuO را با اندازه‌ها و شکل‌های متغیر سنتز کند (14). نانوذرات سنتزشده در این مطالعه ازنظر کروی‌بودن با مطالعات قبلی شباهت دارد؛ اما ازنظر روش سنتز و همچنین تأثیرگذاری پارامترهای مؤثر متفاوت بوده است.

شکل 9 - نتیجة آنالیز DLS و پتانسیل زتا نانوذرات اکسید مس تولیدشده

Figure  9.  The result of DLS analysis and zeta potential of produced copper oxide nanoparticles

آنالیز XRD

با استفاده از نرم‌افزار Match نسخه 3، نتایج حاصل از آنالیز XRD تحلیل و بررسی شدند. از این نرم‌افزار برای شناسایی نوع ماده، تعیین ساختار کریستالی، تعیین شکل و اندازة واحدهای سازندة یک ماده و تعیین فاز ازطریق تطابق با پایگاه ‌دادة [ii]COD بهره گرفته می‌شود. پیک‌های ثبت‌شده در موقعیت 2Ɵ نمونة پودر نانوذرات اکسید مس تولیدشده توسط نرم‌افزار با COD9016326 تطبیق داده شدند. نتیجه تأییدکنندة تولید نانوذرات اکسید مس بود. همچنین تعیین فاز نشان داد نانوذرات اکسید مس تولیدشده کاملاً تک‌فاز و به فرم CuO تولید شده‌اند که با نتیجة آنالیز FTIR نیز مطابقت داشت. وجود دو پیک تیز در موقعیت ˚37/35 و ˚59/38 بیان‌کنندة ساختار کاملاً کریستالة نانوذرات تولید شده است. الگوی ایجادشده مطابق موقعیت 2Ɵ ثبت‌شده در پژوهش سینگه در تولید با باکتری‌ E.coli بود (19). در این پژوهش نیز نانوذرات اکسید مس به‌صورت تک‌فاز CuO  تولید شدند؛ درنتیجه، زمان 48 ساعتة انکوباسیون برای تولید نانوذرات اکسید مس توسط جدایة H2-7 مناسب بود. نرم‌افزار مشخص کرد ساختار کریستالی نانوذرات اکسید مس تولیدشده از نوع Monoclinic است. همچنین مس 89/79 درصد و اکسیژن 11/20 درصد معلوم شد.

شکل 10- نتیجه‌ آنالیز پراش پرتو ایکس

Figure 10The result of X-ray diffraction analysis.

فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات بیوسنتزشده

در این مطالعه، از تکنیک انتشار چاه آگار و میکرودایلوشن برای ارزیابی فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات بیوسنتزشده علیه باکتری‌های E.coli و S.aureus استفاده شد. جدول 1 مقدار متوسط منطقه بازدارنده را در برابر این باکتری‌ها در غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید مس نشان می‌دهد. شکل همچنین 11 درصد بازدارندگی غلظت‌های مختلف نانوذرات مس را نشان می‌دهد. نتایج به‌دست‌آمده مقدار MIC و MBC را به‌ترتیب 800 و 1600 µg/ml برای E.coli و 1600 و 3200 µg/ml برای S.aureus تعیین کرد. افزایش چشمگیر در اثرات بازدارندگی با افزایش غلظت نانوذرات بیوسنتزشده مشاهده شد که به‌طور مشابه در مطالعات دیگری نیز گزارش شد (29). در تحقیق عمر و همکارانش نشان داده شد که S.aureus نسبت به E.coli به فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات اکسید روی بیوسنتزشده حساس‌تر است (30). معمولاً باکتری‌های گرم منفی به‌دلیل ساختار دیواره سلولی خاص خود (لایه ضخیم بیرونی غشای سلولی و وجود لیپو پلی‌ساکارید روی دیواره سلولی) به نانوذرات مقاوم‌اند (31)؛ اما نتایج به‌دست‌آمده در این مطالعه نشان دادند بیشترین اثر مهاری نانوذرات مس سنتزشده بر باکتری E.coli است که با نتایج مطالعات مشابه، کمی متفاوت است که شاید این امر به ساختار و عملکرد متفاوت نانوذرات مس مربوط باشد و نیاز است در این خصوص مطالعات دیگری صورت پذیرد.

جدول 1: نتایج فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات اکسید مس به روش‌ چاهک آگار

Table 1. . Results of antibacterial activity of copper oxide nanoparticles by agar well method

شکل 11. نتایج فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات اکسید مس به روش‌ میکرودایلوشن و تعیین MIC در باکتری E.coli و S.aureus

Figure 11. Results of antibacterial activity of copper oxide nanoparticles by microdilution method and MIC determination in E.coli and S.aureus bacteria

نتیجه‌گیری

براساس مطالعه حاضر، روشی مقرون‌به‌صرفه و کارآمد برای بیوسنتز نانوذرات اکسید مس با استفاده از Bacillus cytotoxicus H2-7. مقاوم به مس به‌دست‌آمده از دریاچه نمک حوض سلطان به کار گرفته شد. مشاهده پیک در طول ‌موج مرتبط با اکسید مس، تکنیک اولیه برای درک تشکیل نانوذرات بود. گروه‌های عاملی (گروه‌های کربوکسیل، هیدروکسیل و آمین) با استفاده از FTIR تعیین شدند و به‌عنوان عوامل تثبیت‌کننده و کاهنده عمل کردند. تجزیه و تحلیل DLS حاکی از پراکندگی متوسط ذرات بود و میکروگراف‌های الکترونی نشان دادند ذرات کروی شکل با متوسط اندازة 80-50 نانومتر هستند که به‌صورت CuO با ساختمان کاملاً کریستالی Monoclinic و با متوسط شعاع هیدرودینامیکی 145 نانومتر با پایداری مناسب ازنظر پتانسیل زتا (33- میلی‌ولت) هستند. علاوه بر این، ارزیابی فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات اکسید مس، در برابر اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس، فعالیت ضدباکتریایی قدرتمندی را نشان دادند؛ به‌خصوص اینکه روی باکتری گرم منفی مؤثرتر از گرم مثبت عمل کردند. به‌طور کلی، مطالعات ما نشان دادند باکتری‌ منتخب دریاچه نمک قم، نانوذرات اکسید مس با فعالیت‌های ضدباکتریایی چشمگیری سنتز کردند که در این میان پارامترهای مختلفی بر میزان نانوذرات سنتزشده مؤثر هستند که می‌توانند در صنایع مختلفی استفاده شوند.

[i] Polydispersity index

[ii] Crystallography Open Database