جداسازی و شناسایی باکتریوفاژ مؤثر بر سویه‌های Xanthomonas campestris به‌منظور کنترل زیستی آنها

نوع مقاله : پژوهشی- فارسی

نویسندگان

گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم زیستی، دانشگاه الزهرا، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: باکتری‌های بیماری‌زا در گیاهان ازجمله Xanthomonas campestris pv. campestris از مهم‌ترین عوامل کاهش بازدهی محصولات کشاورزی و مسئول خسارت‌های عمدۀ اقتصادی در صنعت کشاورزی هستند و روش‌های رویارویی با بیماری که تاکنون در برابر آنها استفاده شده‌اند، مقاومت باکتریایی و آسیب‌های محیطی را به ‌همراه دارند؛ بنابراین به روش‌های مؤثرتری نیاز است. در مطالعه‌های اخیر به باکتریوفاژها به‌عنوان عوامل جدید بازدارنده، ایمن و مؤثر در برابر باکتری‌های بیماری‌زای گیاهان توجه زیادی شده است.
مواد و روش‏‏ها: در پژوهش حاضر، جداسازی و شناسایی باکتریوفاژ لیتیک مؤثر بر سویه‌هایی از باکتری Xanthomonas campestris با هدف مهار دو فرم پلانکتونیک و بیوفیلم باکتری بررسی شد تا در آینده برای مبارزه با آلودگی محصولات کشاورزی به این باکتری بیماری‌زا استفاده شود. فاژ لیتیک مؤثر بر سویۀ Xanthomonas campestris pv. campestris DSM1706 از آب رودخانۀ کارون به روش آگار دولایه جدا شد. ریخت‌شناسی، طیف میزبانی فاژ، پایداری در برابر دما و اسیدیته، منحنی تکثیر یک‌مرحله‌ای و اثر فاژ بر بیوفیلم باکتری بررسی شد.
نتایج: بر مبنای ویژگی‌های مورفولوژیک، فاژ جداسازی‌شده به خانواده تکتی‌ویریده تعلق و علاوه بر سویۀ Xanthomonas campestris pv. campestris DSM1706، بر سه جدایۀ بیماری‌زای دیگر به‌دست‌آمده از مزارع آلودۀ کلم شامل SAM 4209، SAM 4211 و SAM 4212، اثر لیتیک دارد. این فاژ پایداری زیادی در محدودۀ دمایی منفی
20 تا 50 درجۀ سانتی‌گراد و فعالیت لیتیک مناسبی در محدودۀ اسیدیتۀ 5 تا 10 دارد. بر اساس منحنی تکثیر یک‌مرحله‌ای، چرخۀ تکثیر فاژ حدود 70 دقیقه به طول می‌انجامد که شامل مرحلۀ نهفتگی 25 تا 30 دقیقه‌ای و مرحلۀ آزادسازی فاژ
40 دقیقه‌ای است. فاژ 86 درصد اثر مهاری و 93 درصد اثر حذفی بر بیوفیلم این باکتری دارد.
بحث و نتیجه‏گیری: بر اساس نتایج پژوهش حاضر، فاژ لیتیک به‌دست‌آمده می‌تواند از عوامل زیستی با پتانسیل زیاد در مهار بیماری‌های گیاهی و جایگزین روش‌های مبارزۀ متداول باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Isolation and Identification of Bacteriophage Effective on Xanthomonas Campestris Strains for Their Biocontrol

نویسندگان [English]

  • Ameneh Elikaei
  • Sarina Poshtiban
  • Mohammad Reza Soudi
Department of Microbiology, Faculty of Biological Sciences, Alzahra University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: The genus Xanthomonas belongs to the Xanthomonadaceae family and the Gammaproteobacteria class, which includes short rod-shaped gram-negative bacteria that cause disease in more than 400 different plant hosts and are the most important pathogen in a wide range of plants, which results in a decrease in productivity in the agricultural industry.
Pathogenic bacteria in plants including Xanthomonas campestris pv. campestris are one of the most important factors that reduce the productivity of agricultural products and are responsible for major economic losses in the agricultural industry. This bacterial strain is pathogenic in a wide range of plants such as rice, wheat, citrus fruits, tomatoes, peppers, cabbage, melons, bananas, and seeds such as beans. The methods of dealing with the disease that has been used against them so far involve environmental damage, the accumulation of toxins in the soil, and bacterial resistance. Therefore, it seems that more effective methods are needed. Bacteriophages, Viruses infect bacteria, which are exclusive to their host attack, and as new, safe, and effective inhibitory agents against plant pathogenic bacteria, they have been much considered in recent studies.
In the studies conducted on isolated phages effective against Xanthomonas bacteria, promising results have been obtained in the field of plant disease management in laboratory and field conditions. In this regard, the identification and complete knowledge of the biological characteristics of phages effective against this bacterium is very crucial for the development of effective biological control products.
Materials and Methods: In the present study, isolation and identification of lytic bacteriophage effective on strains of Xanthomonas campestris bacteria were investigated to inhibit two forms of planktonic and biofilm bacteria so that it can be used in the future to fight the contamination of agricultural products with this pathogenic bacterium. Under sterile conditions and with a sterile loop, a single plaque was completely removed from the selective plate containing phage plaques and autoclaved in 5 ml of YMB medium and 10 μl of fresh suspension of the bacterial strain X. campestris DSM 1706 was added and incubated for 24 hours in the incubator was incubated at a temperature of 28 degrees Celsius and aeration at 150 rpm. Then the solution was centrifuged for 10 minutes at a speed of 6000 rpm and the supernatant was filtered with a 0.45 micron needle filter.
Lytic phage is effective on the strain Xanthomonas campestris pv. campestris DSM1706. It was separated from the water of the Karun River by the two-layer agar method. The phage host range to the staining method was checked. Then, phage morphology through transmission electron microscopy (TEM) imaging, phage stability against pH and different temperatures, one-step proliferation curve, and the effect of phage on removing and inhibiting bacterial biofilm were investigated.
Research Findings: In this study, clear phage plaques, caused by the proliferation of lysing phages of the desired strain, were observed. Phage isolated on the morphological characteristic was based on the tectonic family. In addition to the strain Xanthomonas campestris pv. campestris DSM 1706, it had a lytic effect on three other pathogenic isolates obtained from infected cabbage fields including SAM 4209, SAM 4211, and SAM 4212. This phage had high stability in the temperature range of 20 °C to 50 °C and was inactivated at -70 °C. It also had good lytic activity in the range of pH 5 to 10 and became inactive at pH 3. According to the one-step proliferation curve, the phage proliferation cycle lasts about 70 minutes which includes a 25–30-minute incubation phase and a 40-minute phage release phase. Phage showed an 86% inhibitory effect and 93% elimination effect on the biofilm of this bacterium.
In the present study, phage stability against different temperatures and acidity was studied as two main factors. The results showed that the phage has good lytic activity in acidity between 5 and 9, its performance decreases in alkaline acidity more than 9 and it becomes inactive in acidity 3 and does not show any lytic activity against the target bacteria. The best performance and the highest lytic activity were observed at an acidity of about 7.
Discussion of Results and Conclusions: Since the first discovery of phages in this study, it has been proven that phages as a biological control strategy are promising alternatives with many advantages for agricultural chemicals and antibiotics. Based on the results of this research, the obtained lytic phage has stability in the spectrum in laboratory conditions (a wide range of pH and temperatures) and was able to lyse the host bacteria in planktonic cell form and inhibit and remove the bacterial biofilm with a high percentage. As a result, it can be a biological agent with high potential in controlling plant diseases and replacing combat methods as a common and suitable candidate for phage therapy.
In several studies in this field, it has been shown that the use of different compounds mixed with solutions containing phage increases the persistence of phage on leaf surfaces. For example,
in one study, the use of skim milk and this combination led to improved control of tomato bacterial spot disease compared to standard treatment with chemical bactericides.
In line with this study, it is suggested to investigate the effect of phage on other pathogenic strains of Xanthomonas bacteria and also on their biofilm in different ways. Among other things, specific lytic bacteriophages of Xanthomonas bacteria can be used individually or in combination with other isolated bacteriophages along with antibiotics or other control agents such as copper compounds in preventive and therapeutic measures as phage therapy against bacterial infections.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bacteriophage
  • Biocontrol
  • Biofilm
  • Xanthomonas campestris

اصل مقاله

مقدمه

جنس Xanthomonas متعلق به خانوادۀ Xanthomonadaceae و ردۀ گاماپروتئوباکتریا[1] شامل باکتری‌های گرم منفی میله‌ای‌شکل کوتاهی است که در بیش از 400 میزبان گیاهی مختلف بیماری ایجاد می‌کنند و مهم‌ترین عامل بیماری‌زا در طیف وسیعی از گیاهان هستند که درنتیجه، کاهش بازدهی در صنعت کشاورزی را در پی دارد (1، 2)؛ برای نمونه، سویه‌های
X. campestris pv. campestris عامل بیماری پوسیدگی سیاه[2] در بسیاری از محصولات تیرۀ کلم[3] هستند که سبب ایجاد رگبرگ‌‌های سیاه و آسیب‌های نکروزی V-شکل[4] در حاشیۀ برگ می‌شود (3).
در پژوهش حاضر به بررسی قدرت مهار باکتری بیماری‌زای گیاهی توسط باکتریوفاژها پرداخته شد و ازآنجاکه باکتری‌های ساکن بیوفیلم در مقایسه با سلول‌های پلانکتونیک مقاومت بیشتری در برابر عوامل مهارکنندۀ رشد دارند، مطالعه دربارۀ هر دو ریخت سلولی در مقیاس آزمایشگاهی انجام شد.

باکتریوفاژها، ویروس‌های آلوده‌کنندۀ باکتری‌ها هستند که به‌طور اختصاصی به میزبان مخصوص خود حمله می‌کنند و برخلاف آنتی‌بیوتیک‌های وسیع‌الطیف، تنها باکتری‌های بیماری‌زای اختصاصی خود را بدون اثر مخرب بر محیط‌زیست از بین می‌برند (4).

باوجود تأثیر اقتصادی بیماری پوسیدگی سیاه بر محصولات تیرۀ کلم، روش‌های کنترل عفونت ناشی از سویۀ X. campestris pv. campestris بسیار محدود هستند و روش‌های مدیریت فعلی شامل جوانه‌زدایی، ریشه‌کن‌کردن[5]، دفن[6] و سوزاندن[7] بافت‌های آلودۀ گیاهی، استریل‌کردن ابزار باغبانی و درمان‌های شیمیایی مانند استفاده از آفت‎کش‌های بر پایۀ مس به دلیل گسترش مقاومت‌های باکتریایی، تجمع در خاک و نگرانی در زمینۀ آسیب‌های محیط‌زیست و سلامت انسان محدود شده‌اند؛ علاوه‌براین، استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها در تولید محصولات زراعی نامطلوب است و به گسترش مقاومت‌ها، اثر بر میکروبیوتای طبیعی و ایجاد پسماند در زنجیرۀ غذایی منجر می‌شود (10-5)؛ در نتیجه، اجرای روش‌های جایگزین سازگار با محیط‌زیست و سلامت انسان ازجمله استفاده از عوامل کنترل زیستی شامل باکتریوفاژها مطرح شده است که در آیندۀ نه‌چندان دور به گزینه‌ای مناسب برای کنترل و مدیریت بیماری‌ها تبدیل می‌شود. مهم‌ترین مزایای استفاده از فاژها عبارتند از: فاژها به‌طور طبیعی دردسترس و با محیط‌زیست سازگار هستند، اختصاصیت میزبانی دارند، یوکاریوت‌ها را آلوده نمی‌کنند، در برابر باکتری‌های مقاوم به چند دارو[8] مؤثرند، خودتکثیر و خودمحدود‌شونده هستند، روی بیوفیلم باکتری مؤثرند و دستکاری ژنتیکی آنها آسان است (11).

از اوایل قرن نوزدهم به کنترل زیستی بیماری‌های گیاهی ناشی از باکتری Xanthomonas توسط باکتریوفاژها توجه خاصی شده است؛ زمانی که محلول فیلترشده از کلم‌های درحال تجزیه توانست گسترش بیماری پوسیدگی کلم ناشی از X. campestris را متوقف کند (12) و دهه‌ها بعد که مایع حاوی فاژ، لکه‌های باکتریایی ناشی از X. camepstris را در هلو مهار کرد (13) تا زمان حاضر، موفقیت‌های مشابهی از طریق کنترل زیستی گزارش شده است.

مطالعه‌های بسیاری در این زمینه انجام شده‌اند که عبارتند از: مطالعۀ لکۀ باکتریایی گوجه‌فرنگی ایجاد‌شده توسط X. campestris  (14)، آتشک (بلایت) باکتریایی ژرانیوم ایجادشده توسط X. campestris pv. pelargonii (15)، آتشک (بلایت) برگ پیاز ناشی از آلودگی توسط X. axonopodis pv. Allii (16)، شانکر مرکبات و لکۀ باکتریایی مرکبات ایجادشده توسط X. axonopodis pv. citri و X. axonopodis pv. Citrumelo (17)، شانکر مرکبات آسیایی ناشی از X. axonopodis pv. citri (18) و X. citri subsp. citri (19) و آتشک (بلایت) باکتریایی برگ برنج ناشی از pv. oryzae X. oryzae (20، 21).

اگریفاژ[9] از کمپانی امنیلیتیکس[10] محصولات فاژی را برای کنترل X. campestris pv. Vesicatoria و
X. citri subsp. citri توسعه داده است و دو محصول فاژی تولیدشدۀ این کمپانی کنترل موفقیت‌آمیز بیماری‌های لکۀ گوجه‌فرنگی، لکۀ فلفل و شانکر مرکبات را نشان داده‌اند (10).

در پژوهش‌های انجام‌شده دربارۀ فاژهای جداسازی‌شدۀ مؤثر علیه باکتری Xanthomonas، نتایج امیدوار‌کننده‌ای در زمینۀ مدیریت بیماری‌های گیاهی در شرایط آزمایشگاهی و مزارع به دست آمده است؛ در این راستا، شناسایی و آگاهی کامل از ویژگی‌های زیستی فاژهای مؤثر علیه این باکتری برای توسعۀ محصولات کنترل زیستی مؤثر بسیار حیاتی است (10).

 

مواد و روش‌ها

.جداسازی باکتریوفاژ‌های اختصاصی علیه سویۀ Xanthomonas campestris: در پژوهش حاضر، سویۀ استاندارد Xanthomonas campestris DSM 1706 به‌عنوان باکتری هدف انتخاب شد؛ در گذشته، این سویه از مجموعۀ PTCCI تهیه شده است و در آزمایشگاه میکروبیولوژی صنعتی نگهداری می‌شود. نمونه‌برداری از آب رودخانۀ کارون شهر اهواز، آب جاری زیر پل سفید (مختصات: ۳۱°۱۹′شمالی و ۴۸°۴۱′شرقی) انجام و نمونه به‌سرعت به آزمایشگاه منتقل و در دمای 4 درجۀ سانتی گراد نگهداری شد.

ارلن حاوی 40 میلی‌لیتر نمونۀ آب، 5 میلی‌لیتر محیط (Yeast Malt Broth)YMB10X و 5 میلی‌لیتر سوسپانسیون باکتری که از پیش تهیه شده بود، به‌مدت
24 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد و سرعت 150 دوردردقیقه انکوبه شد. پس از آن، 10 میلی‌لیتر از سوسپانسیون یادشده به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 2500 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد و محلول رویی با فیلتر سرسرنگی 45/0 میکرون فیلتر شد.
1/0 میلی‌لیتر از مایع فیلترشده برای تهیۀ رقت‌های سریالی به میکروتیوب حاوی 9/0 میلی‌لیتر بافر فسفات‌سالین (PBS[11]) استریل اضافه شد و رقت‌های متوالی 1-10تا
8- 10 از آن تهیه شدند؛ پس از آن، 100 میکرولیتر از رقت‌های تهیه‌‌شده (به‌طور جداگانه) به همراه
500 میکرولیتر سوسپانسیون تازۀ سویۀ باکتری
X. campestris DSM 1706 (با کدورت معادل نیم مک‌فارلند) در لوله آزمایش ریخته شد و به‌منظور جذب فاژ‌های احتمالی به باکتری هدف، لوله‌ها به‌مدت 10 دقیقه در انکوباتور با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد انکوبه شدند؛ سپس به هر لولۀ آزمایش، 3 میلی‌لیتر محیط
YMA (Yeast Malt Agar) (0.7% Agar at 45°C) اضافه و مخلوط روی پلیت YMA(1.5% agar) ریخته شد. پلیتی نیز به‌عنوان پلیت شاهد به روش یادشده تهیه شد؛ با این تفاوت که محلول حاوی فاژ احتمالی را نداشت. پس‌از بسته‌شدن محیط، پلیت‌ها به‌مدت
48 ساعت در انکوباتور 28 درجۀ سانتی‌گراد انکوبه شدند (22، 23). وجود پلاک‌های فاژی (نواحی شفاف) نشان‌دهندۀ وجود فاژ‌های لیتیک در نمونۀ آب بود.

خالص‌سازی و غنی‌سازی باکتریوفاژ: پلیت‌های حاوی پلاک فاژی مشخص با تراکم مناسب علیه باکتری X. campestris pv. campestris DSM 1706 انتخاب و دو روش زیر برای خالص‌سازی و غنی‌سازی فاژ انجام شد:

روش اول: در شرایط استریل و با لوپ استریل، یک پلاک منفرد به‌طور کامل از پلیت انتخابی حاوی پلاک‌های فاژ برداشته و به 5 میلی‌لیتر محیط YMB از پیش تهیه و اتوکلاو‌ شده و 10 میکرولیتر سوسپانسیون تازۀ سویۀ باکتریایی X. campestris DSM 1706
(با کدورت معادل نیم مک‌فارلند) اضافه و به‌مدت 24 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد و هوادهی 150 دوردردقیقه انکوبه شد؛ سپس محلول به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 6000 دوردردقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی با فیلتر سرسرنگی
45/0 میکرون فیلتر شد (24، 25).

روش دوم: روی پلیت انتخابی حاوی پلاک‌های فاژی، 5 میلی‌لیتر بافر [12]SM ریخته و به‌مدت 6 ساعت روی شیکر با هوادهی 50 دوردردقیقه قرار داده شد. پس از 6 ساعت و در شرایط استریل، بافر حاوی فاژ با سرنگ استریل از روی پلیت جمع‌آوری و به 10 میلی‌لیتر سوسپانسیون تازۀ سویۀ باکتریایی X. campestris DSM 1706 (با کدورت معادل نیم مک‌فارلند) افزوده شد. محلول به‌‌مدت 24 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد و هوادهی 150 دوردردقیقه قرار داده شد و پس از آن، محلول به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 6000 دوردردقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی با فیلتر سرسرنگی 45/0 میکرون فیلتر شد (25،24).

تیتر فاژ در محلول رویی به‌دست‌آمده از هر دو روش غنی‌سازی مطابق روش زیر تعیین شد.

 

تیتراسیون باکتریوفاژ: رقت‌های متوالی 1-10 تا 12-12 از محلول رویی فیلترشدۀ حاوی فاژ تهیه و روش آگار دولایه انجام شد. پس از بسته‌شدن کامل، پلیت‌ها به‌مدت 48 ساعت در انکوباتور 28 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند و سپس تعداد پلاک‌های فاژی تشکیل‌‌شده روی پلیت‌های مربوط به رقت‌های 8-10 تا 12-12 شمارش شد و آخرین رقتی که در آن تعداد 30 تا 300 پلاک مشاهده شد، مبنای محاسبه قرار گرفت. تعداد فاژ موجود (PFU/ml)) از رابطۀ زیر محاسبه شد (26).

 

D=Dilution factor (رقت)

V=Volume of diluted added to the well(ml)

به‌منظور نگهداری مایع حاوی فاژ مدنظر و استفادۀ دوباره از آن، 500 میکرولیتر از محلول رویی فیلترشدۀ حاوی فاژ با 500 میکرولیتر گلیسرول 25 درصد استریل در کرایوویال ریخته و به‌خوبی مخلوط و سپس در فریزر منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد.

. .بررسی مورفولوژی فاژ با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM): به‌منظور آماده‌سازی نمونه، ابتدا نمونۀ حاوی باکتریوفاژ مدنظر با تیتر فاژی مناسب سانتریفیوژ و با فیلتر سرسرنگی 22/0 میکرون فیلتر شد. از مایع فیلترشده با PBS، رقت 1-10 تهیه شد. نمونه روی گرید مسی فرموار کربن مش 300 ثابت و تحت‌تأثیر فسفوتنگستیک‌اسید 2 درصد قرار گرفت و به‌طور منفی رنگ‌آمیزی شد؛ سپس اضافۀ رنگ گرفته و نمونه کاملاً خشک شد. نمونه با میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) شرکت پرتورایان رستاک(MODEL: EM208S Transmission Electron Microscope, (Philips بررسی و عکس‌برداری شد.

 

تعیین طیف میزبانی باکتریوفاژ: اثر لیتیک باکتریوفاژ جداسازی‌شده بر سویه‌های مختلف باکتری
X. campestris جداشده از خاک مزارع کلم آلوده شامل SAM4209، SAM4211 و SAM4212 به روش لکه‌گذاری بررسی شد. 500 میکرولیتر از سوسپانسیون تازۀ هر سویه با کدورت معادل نیم مک‌فارلد به 3 میلی‌لیتر محیط YMA (0.7% Agar at 45°C) اضافه و روی پلیت YMA(1.5%agar) ریخته شد. پلیتی نیز به‌عنوان پلیت شاهد تهیه شد. پس از بسته‌شدن کامل پلیت‌ها، مقدار
10 میکرولیتر از مایع حاوی فاژ فیلترشده در مرکز محیط‌کشت ریخته شد (27) و پلیت‌ها به‌مدت 48 ساعت در انکوباتور با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شدند.

 

.بررسی پایداری باکتریوفاژ جداسازی‌شده در برابر عوامل محیطی.

حساسیت به اسیدیته: به‌منظور بررسی اثر اسیدیته‌های مختلف بر عملکرد فاژ جداسازی‌شده، ابتدا محیط YMB با اسیدیته‌های مختلف شامل 3، 5، 7، 9 و 11 به کمک HCl یک مولار و NaOH نیم‌مولار تهیه و اتوکلاو شد. مقدار 1/0 میلی‌لیتر از نمونۀ فاژ مدنظر به 9/0 میلی‌لیتر محیط YMB با اسیدیته‌های مختلف اضافه شد و محلول‌ها به‌مدت یک ساعت در انکوباتور با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد قرار گرفتند. تیتر فاژ مدنظر در محلول‌های دارای اسیدیته‌های مختلف به روش آگار دولایه ارزیابی (28) و نمودار مربوطه با نرم‌افزار Microsoft Excel 2016 ترسیم شد.

حساسیت به دما: به‌منظور بررسی اثر دما‌های مختلف بر عملکرد فاژ، محیط YMB تهیه و اسیدیتۀ آن روی
7 تنظیم و سپس در 6 لولۀ آزمایش ریخته و اتوکلاو شد. مقدار 1/0 میلی‌لیتر از نمونۀ فاژ مدنظر به 9/0 میلی‌لیتر محیط YMB اضافه و محیط‌ها به‌مدت یک ساعت در دما‌های منفی 20، 4، 28، 50، 60 و 70 درجۀ سانتی‌گراد قرار گرفتند. پس از یک ساعت، تیتر فاژ مدنظر در دماهای مختلف به روش آگار دولایه ارزیابی (28) و نمودار مربوطه با نرم‌افزار Excel 2016 رسم شد.

سنجش زمان جذب فاژ به باکتری هدف: کشت باکتری X. campestris pv. campestris DSM 1706 در محیط YMB با میزان جذب OD600= 0.15 تهیه و سپس فاژ (PFU/ml:107) به باکتری تلقیح شد. دو لولۀ آزمایش حاوی فاژ و باکتری تهیه شدند و یکی از آنها به‌مدت 5 دقیقه و دیگری به‌مدت 10 دقیقه در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد قرار گرفت و سپس به‌مدت 10 دقیقه با سرعت 6000 دوردردقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی با فیلتر سرسرنگی 45/0 میکرون فیلتر شد. رقت‌های متوالی 1-10 تا 8-10 از مایع فیلترشده تهیه و تعداد فاژ موجود به روش آگار دولایه تعیین شد (29).

تعیین منحنی تکثیر یک‌مرحله‌ای‌ (one step curve) فاژ مدنظر: سوسپانسیون باکتری با OD600=0.4 تهیه و با فاژ مدنظر )حدود (PFU/ml:108 مخلوط شد. محلول تهیه‌شده به‌مدت 15 دقیقه درانکوباتور با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد انکوبه و سپس به‌مدت 1 دقیقه با سرعت 10000 دوردردقیقه در دمای 4 درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شد. محلول رویی به‌منظور حذف فاژهای جذب‌نشده دور ریخته شد و سپس 5 میلی‌لیتر محیط YMB تازه به رسوب فاژی باقیمانده اضافه شد. سوسپانسیون حاصل به‌مدت 90 دقیقه در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد و سرعت
150 دوردردقیقه گرماگذاری شد و سپس به‌مدت
90 دقیقه، هر 10 دقیقه، نمونه‌برداری از سوسپانسیون یادشده و بی‌درنگ آگار دولایه انجام شد. به‌منظور محاسبۀ تیتر فاژی، پلاک‌ها شمارش و نمودار تکثیر یک‌مرحله‌ای با نرم‌افزار Excel 2016 رسم شد (30).

بررسی اثر باکتریوفاژ جداسازی‌شده روی بیوفیلم سویۀ DSM1706: نخستین گام، تهیۀ پیش‌کشت یا سوسپانسیون استاندارد از سویۀ مدنظر و تهیۀ محیط‌کشت سنتزی Y بود (31). به‌منظور تهیۀ پیش‌کشت، نمونه‌برداری از کلنی باکتری رشدکرده روی محیط YMA انجام و نمونه در 5 میلی‌لیتر محیط مایع YMB تلقیح شد. نمونه حدود 8 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد و هوادهی 150 دوردردقیقه گرماگذاری و سپس با اضافه‌کردن محیط YMB، جذب نوری آن در طول موج 600 نانومتر روی
5/0 (OD600=0.5) تنظیم شد. مقدار 5/0 میلی‌لیتر از سوسپانسیون یادشده به 5/19 میلی‌لیتر YMB استریل اضافه و حدود 14 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد و میزان هوادهی 150 دوردردقیقه گرماگذاری شد. پس از آن، نمونه به‌مدت 15 دقیقه با سرعت 7000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شد، مایع رویی به‌طور استریل خالی و 10 میلی‌لیتر PBS استریل به رسوب باقیمانده اضافه و ورتکس شد؛ دوباره محلول سانتریفیوژ و مایع رویی آن خالی شد و مقداری PBS به رسوب باقیمانده اضافه شد تا به کدورت معادل نیم مک‌فارلند برسد (OD600=0.08-0.13). محلول یادشده به‌عنوان پیش‌کشت باکتری استفاده‌شده در چاهک‌ها در نظر گرفته شد (32).

تعیین میزان MBIC: مقدار 100 میکرولیتر محیط‌کشت Y در 10 چاهک از میکروپلیت 96 خانه ریخته و 100 میکرولیتر از محلول فاژی مدنظر به چاهک اول اضافه شد؛ مقدار 100 میکرولیتر از چاهک اول به چاهک دوم اضافه و به همین ترتیب، رقت‌های سریالی از فاژ مدنظر در چاهک‌های میکروپلیت تهیه شد و به هر چاهک، مقدار 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری منتقل شد (3 تکرار برای هر رقت در نظر گرفته شد). یک ردیف (ردیف چاهک شمارۀ 11) به‌عنوان کنترل مثبت حاوی 100 میکرولیتر محیط کشت Y و 100 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری و یک ردیف (ردیف چاهک شمارۀ 12) به‌عنوان کنترل منفی حاوی 200 میکرولیتر محیط کشت استریل Y (بدون افزودن باکتری) در نظر گرفته شد.

میکروپلیت به‌مدت 8 روز در انکوباتور با دمای
28 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد. پس از 8 روز، چاهک‌ها به‌آرامی تخلیه و 3 بار با بافر PBS استریل (4/7=pH) شستشو شدند و سپس 200 میکرولیتر کریستال‌ویوله 1/0 درصد به چاهک‌ها افزوده شد. میکروپلیت به‌مدت 30 دقیقه در دمای اتاق کنار گذاشته شد و پس از آن، رنگ از چاهک‌ها خالی شد و دوباره با بافر PBS استریل شستشو شدند و میکروپلیت به‌مدت
10 دقیقه کنار گذاشته شد تا خشک شود. سپس مقدار 150 میکرولیتر اتانول 70 درصد به چاهک‌ها اضافه و میزان جذب با دستگاه ELISA plate reader در طول موج 570 نانومتر اندازه‌گیری شد (32).

تعیین میزان MBEC: تلقیح میکروپلیت و چاهک‌های کنترل مثبت و منفی بر اساس روش MBIC انجام شد؛ با این تفاوت که چاهک‌های 1 تا 10 فاقد رقت‌های باکتریوفاژ و تنها حاوی محیط‌کشت Y و سوسپانسیون باکتریایی بودند. سپس میکروپلیت به‌مدت 8 روز در دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد. پس از
8 روز، محتویات هر چاهک (به‌جز چاهک‌های کنترل مثبت و منفی) تخلیه و هر چاهک 3 بار با بافر PBS استریل (4/7=pH) شستشو شد تا سلول‌های شناور خارج شوند. در مرحلۀ بعد، غلظت‌های سریالی 1-10 تا 10-10 از محلول فاژی مدنظر با بافر PBS استریل تهیه و مقدار
200 میکرولیتر از هر رقت به هر چاهک افزوده شد
(3 تکرار برای هر رقت در نظر گرفته شد). میکروپلیت به‌مدت 48 ساعت در دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد گرماگذاری شد و سپس محتویات هر چاهک به‌آرامی تخلیه و سه بار با بافر PBS استریل شستشو شد. سپس مقدار 200 میکرولیتر کریستال‌ویوله 1/0 درصد به هر چاهک افزوده شد. میکروپلیت به‌مدت 30 دقیقه در دمای اتاق کنار گذاشته شد و پس از آن، رنگ از چاهک‌ها خالی و دوباره سه بار با بافر PBS استریل شستشو شدند و میکروپلیت به‌مدت 10 دقیقه کنار گذاشته شد تا خشک شود. سپس مقدار 150 میکرولیتر اتانول 70 درصد به چاهک‌ها اضافه و میزان جذب با دستگاه ELISA plate reader در طول موج 570 نانومتر اندازه‌گیری شد (32).

 

نتایج

در نتیجۀ جداسازی باکتریوفاژها از نمونۀ آب به روش آگار دولایه، فاژهای لیزکنندۀ سویۀ مدنظر تکثیر و پلاک‌های فاژی شفاف روی پلیت‌ها دیده شدند
(شکل 1). پس از غنی‌سازی و تیتراسیون نمونۀ حاوی فاژ و مشاهدۀ پلاک‌های قابل‌شمارش، تیتر فاژی از رابطۀ یادشده در بخش تیتراسیون باکتریوفاژ محاسبه شد و تعداد فاژ موجود در سوسپانسیون PFU/ml 1013×3/9 بود.

تصویر به‌دست‌آمده (شکل 2) از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) نشان داد این باکتریوفاژ دارای یک سر چندوجهی با ابعاد 61/80×04/84 نانومتر است و دم ندارد. با‌توجه‌به ویژگی‌های مورفولوژیک و اندازۀ فاژ، این فاژ بیشترین شباهت را با باکتریوفاژ‌های خانوادۀ Tectiviridae دارد و احتمالاً یک تکتی‌ویروس[13] است. نتیجۀ یادشده بر اساس مقایسۀ تصویر با تصاویر باکتریوفاژهای سایر خانواده‌ها به ‌دست آمده است.

شکل 1- پلاک‌های ناشی از لیز باکتری X. campestris توسط فاژ موجود در نمونۀ آب رودخانۀ کارون

Fig 1 - Plaques caused by the lysis of X. campestris by the phage present in the water sample of the Karun River

طیف میزبانی باکتریوفاژ به‌منظور بررسی اثر لیتیک آن روی سویه‌های دیگر به روش لکه‌گذاری بررسی شد و نشان داد (شکل 3) باکتریوفاژ می‌تواند سه سویۀ دیگر از سویه‌های بیماری‌زای X. campestris را لیز کند.

شکل 2- تصویر میکروسکوپ الکترونی (TEM) فاژ جداسازی‌شده در مقیاس بار 300 نانومتر. فاژ دارای سر چندوجهی است و دم ندارد و بر این اساس به خانوادۀ Tectiviridae تعلق دارد.

Fig 2 - Transmission electron microscopy (TEM) image of isolated phage at 300 nm scale. Phage has a icosahedral head and no tail, So belongs to the Tectiviridae family.

شکل 3- لیز سویه‌های باکتری X. campestris توسط فاژ جداسازی‌شده به روش لکه‌گذاری. پلیت‌های شمارۀ 1 به سویه X. campestris DSM 1706 تعلق دارند (1a. پلیت حاوی فاژ، 1b. کنترل مثبت)، پلیت‌های شمارۀ 2 به سویۀ X. campestris SAM4211 تعلق دارند (2a. پلیت حاوی فاژ، 2b. کنترل مثبت)، پلیت‌های شمارۀ 3 به سویۀ X. campestris SAM4209 تعلق دارند (3a. پلیت حاوی فاژ، 3b. کنترل مثبت)، پلیت‌های شمارۀ 4 به سویۀ X. campestris SAM4212 تعلق دارند (4a. پلیت حاوی فاژ، 4b. کنترل مثبت)

Fig 3 - Lysis of X. campestris bacterial strains by phage isolated using spotting method. Plates #1 belong to X. campestris DSM 1706 (1a. plate containing phage, 1b. positive control), plates #2 belong to X. campestris SAM4211 (2a. plate containing phage, 2b. positive control), plates #1 No. 3 belong to X. campestris SAM4209 (3a. plate containing phage, 3b. positive control), plates No. 4 belong to X. campestris SAM4212 (4a. plate containing phage, 4b. positive control)

 

در مطالعۀ حاضر، پایداری فاژ در برابر دما و اسیدیته‌های مختلف به‌عنوان دو عامل اصلی مطالعه شد. نتایج نشان دادند (شکل 4)، فاژ در اسیدیته‌های بین 5 تا 9، فعالیت لیتیک مناسبی دارد، عملکرد آن در اسیدیته‌های قلیایی بیشتر از 9 کاهش می‌یابد و در اسیدیتۀ اسیدی 3 غیرفعال می‌شود و هیچ‌گونه فعالیت لیتیکی در برابر باکتری هدف از خود نشان نمی‌دهد. بهترین عملکرد و بیشترین فعالیت لیتیک در اسیدیتۀ حدود 7 مشاهده شد.

فاژ جداسازی‌شده پایداری مناسبی در برابر دماهای مختلف آزمایش‌شده نشان داد (شکل 5) و در دمای منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد، بیشترین فعالیت لیتیک را در برابر باکتری X. campestris داشت. فاژ در محدودۀ دمایی بین 4 تا 50 درجۀ سانتی‌گراد نیز فعالیت لیتیک مناسبی داشت که نتیجۀ خوبی برای استفاده از فاژ در مناطق مختلف است. فعالیت فاژ با افزایش دما و رسیدن به 60 درجۀ سانتی‌گراد کاهش یافت؛ به‌طوری که در دمای 70 درجۀ سانتی‌گراد، فعالیت آن به صفر رسید و غیرفعال شد.

 

شکل 4- نمودار اثر اسیدیته بر فاژ جداسازی‌شده. فاژ در اسیدیتۀ اسیدی 3 غیرفعال و با زیادشدن اسیدیته و رسیدن اسیدیته به 5، فعالیت لیتیک مناسبی از خود نشان می‌دهد. فاژ تا اسیدیتۀ 9 عملکرد مناسبی دارد و کاهش فعالیت فاژ در اسیدیتۀ 11 مشاهده می‌شود.

Fig 4- Diagram of the effect of acidity on isolated phage. Phage inactive at 3 acidity and show good lytic activity as the acidity increases and reaches 5. The phage has good performance up to 9 acidity, and a decrease in phage activity has been observed at 11 acidity.

 

شکل 5- نمودار اثر دما بر فاژ جداسازی‌شده. فاژ در دمای منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد، فعالیت لیتیک زیادی داشت، سپس تا دمای 50 درجۀ سانتی‌گراد، فعالیت لیتیک مناسبی داشت و در دمای 70 درجۀ سانتی‌گراد کاملاً غیرفعال شد.

Fig 5 - Diagram of the effect of temperature on isolated phage. The phage had a high lytic activity at minus 20°C, then it had a good lytic activity up to 50°C and was completely inactivated at 70°C.

 

در پژوهش حاضر، نتایج منحنی تکثیر یک‌مرحله‌ای (شکل 6) نشان دادند چرخۀ تکثیر فاژ حدود 70 دقیقه طول می‌کشد. مرحلۀ نهفتگی که نشان‌دهندۀ زمان لازم برای تکثیر فاژ در باکتری میزبان است، حدود 25 تا 30 دقیقه است و پس از آن، آزادسازی فاژها از سلول میزبان در محدودۀ زمانی 40 دقیقه‌ای رخ می‌دهد. این منحنی، اندازۀ انفجاری[14] (میانگین تعداد فاژهای تولیدشده توسط سلول‌های میزبان آلوده) را نیز نشان داد. فاژها با دورۀ نهفتگی کوتاه و اندازۀ انفجاری زیاد، نامزدهای مناسبی برای فاژتراپی هستند (21).

 

شکل 6- نمودار، منحنی تکثیر یک‌مرحله‌ای فاژ جداسازی‌شده، چرخۀ تکثیر و burst size فاژ را نشان می‌دهد. فاژ دارای چرخۀ تکثیر 70 دقیقه‌ای شامل مرحلۀ نهفتگی 25 تا 30 دقیقه‌ای و آزادسازی فاژ 40 دقیقه‌ای است.

Fig 6 -The graph of the one-step multiplication curve of the isolated phage, the multiplication cycle and burst size of the phage. The phage has a 70-minute replication cycle, including a 25-30-minute incubation phase and a 40-minute phage release.

 

معمولاً باکتری‌ها در ماتریکس بیوفیلم محافظت‌کننده‌ای متشکل از مواد پلیمری خارج‌سلولی[15] (EPS) در کنار هم تجمع می‌یابند و بیوفیلم را تشکیل می‌دهند که برای بقا و تکمیل چرخۀ بیماری‌زایی آنها ضروری است (33). عملکرد فاژها در حذف بیوفیلم باکتری ممکن است به دلیل عملکرد آنزیم‌های دپلیمراز فاژی در حذف EPS باشد (34). تداخل در تشکیل بیوفیلم می‌تواند عفونت باکتری بیماری‌زا را کاهش دهد و کنترل بیماری‌های گیاهی را تقویت کند (35).

اثر فاژ جداسازی‌شده در مهار تشکیل بیوفیلم باکتری بررسی شد. جذب نوری (OD) بیوفیلم Xanthomonas (چاهک کنترل مثبت) در طول موج 570 نانومتر برابر 009/1 و OD کنترل منفی که فقط حاوی محیط بدون افزودن باکتری و فاژ بود، برابر 192/0 بود. اثر رقت‌های سریالی که از فاژ مدنظر تهیه شده بود، به‌ترتیب بررسی شد و با OD کنترل مثبت که تشکیل بیوفیلم باکتری را نشان می‌دهد، مقایسه شد. در رقت 1-10، فاژ OD را تا 475/0 کاهش داد، در رقت‌های بعدی تا 3-10 نیز کاهش OD و مهار تشکیل بیوفیلم مشاهده شد؛ پس از آن، افزایش OD مشاهده شد، اما همچنان از OD بیوفیلم باکتری کمتر بود. فاژ در رقت 6-10، OD را تا 3/0
(برابر با 86 درصد) کاهش داد و بیشترین اثر مهاری به این رقت تعلق داشت.

عملکرد فاژ جداسازی‌شده در حذف بیوفیلم تشکیل‌شده توسط باکتری به روش سنجش میکروتیترپلیت استاندارد یادشده بررسی و جذب نوری در طول موج 570 نانومتر با دستگاه الایزاریدر خوانده و نمودار مربوطه رسم شد (شکل 7).

جذب نوری (OD) بیوفیلم Xanthomonas (چاهک کنترل مثبت) در طول موج 570 نانومتر برابر 585/0 و OD کنترل منفی که فقط حاوی محیط بدون افزودن باکتری و فاژ بود، برابر با 14/0 بود. اثر رقت‌های سریالی که از فاژ مدنظر تهیه شده بود، به‌ترتیب بررسی و با OD کنترل مثبت مقایسه شد. رقت‌های 1-10 تا 9-10 فاژ استفاده شد و همۀ رقت‌ها OD را کاهش دادند. فاژ در رقت 6-10، OD را تا 169/0کاهش داد که برابر با کاهش 93 درصدی بود و بیشترین اثر حذف بیوفیلم به این رقت تعلق داشت.

در حقیقت، فاژها در رقت‌های خاصی بهترین عملکرد را دارند که دلیل این امر می‌تواند تمایل اتصالی متفاوت فاژها در رقت‌های مختلف برای رسپتور خود باشد. در رقت‌های اخر، سرعت رشد باکتری باعث می‌شود نسبت تعداد باکتری به فاژ در واحد زمان بیشتر شود و فاژها قادر به حذف تمام باکتری‌ها نباشند و در رقت‌های اولیۀ فاژی می‌توان گفت رقابت فاژها برای اتصال به باکتری، باعث ناکارآمدی فاژها می‌شود (36، 37).

 

شکل 7- اثر باکتریوفاژ در مهار تشکیل و حذف بیوفیلم. اعداد 1 تا 9 نشان‌دهنده رقت‌های مختلف باکتریوفاژ به ترتیب از 1-10 تا 9-10 هستند. علامت ستاره روی نمودار، مناسب‌ترین رقت فاژ با بیشترین اثر مهارکنندگی بر تشکیل بیوفیلم فاژ و همچنین حذف بیوفیلم را نشان می‌دهد.

Fig 7 -The effect of bacteriophage in inhibiting the formation and removal of biofilm. Numbers 1 to 9 indicate different dilutions of bacteriophage from 1-10 to 10-9 respectively. The asterisk on the graph shows the most appropriate phage dilution with the greatest inhibitory effect on phage biofilm formation and also biofilm removal

 بحث و نتیجه‌گیری

از نخستین کشف فاژها تاکنون ثابت شده ‌است فاژها به‌عنوان راهبرد کنترل زیستی، جایگزین‌های امیدوارکننده با مزایای بسیار برای مواد شیمیایی کشاورزی و آنتی‌بیوتیک‌ها هستند. آنها می‌توانند شدت بیماری را کاهش دهند یا از رشد باکتری‌ها در محیط‌های مختلف جلوگیری کنند. دو محصول زیستی مبتنی بر فاژ به‌طور تجاری و برای کنترل بیماری‌های گیاهی ناشی از باکتری Xanthomonas موجود است و انتقال به محصولات تجاری ادامه دارد؛ با‌توجه‌به این مسئله که نخستین گام برای توسعۀ فاژتراپی، جداسازی فاژ مؤثر بر عامل بیماری گیاهی مدنظر و شناسایی ویژگی‌های فاژ جداسازی‌شده و اطمینان از ایمنی و پایداری آن است، مطالعه در این زمینه اهمیت زیادی دارد. در پژوهش حاضر، فاژ اختصاصی علیه باکتری Xanthomonas، سویۀ X. campestris pv. campestris DSM 1706 از نمونۀ آب رودخانۀ کارون جداسازی شد و اثر لیزکنندگی روی سویه‌های X. campestris بیماری‌زای جداشده از مزارع کلم داشت. پس از بررسی مورفولوژی و ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی و باتوجه‌به اینکه در شرایط آزمایشگاهی، فاژ مدنظر در طیف وسیعی از اسیدیته و دما دارای پایداری بود و توانایی لیز باکتری میزبان در شکل سلولی پلانکتونیک و مهار و حذف بیوفیلم باکتری با درصد زیاد را داشت، در کاهش شدت بیماری‌زایی باکتری و درنتیجه، کنترل بیماری‌های گیاهی بسیار مؤثر خواهد بود. باتوجه‌به اینکه یکی از راه‌های اطمینان‌‌ از مؤثر‌بودن فاژها در از‌بین‌بردن باکتری‌های میزبان، شبیه‌سازی محل اثر آنها است، پیشنهاد می‌شود در شرایط گلخانه‌ای شبیه‌سازی‌شده به شرایط گیاهی طبیعی با آلودگی باکتری Xanthomonas campestris، اثر فاژ جداسازی‌شدۀ اختصاصی باکتری Xanthomonas campestris در از‌بین‌بردن فرم پلانکتونیک و بیوفیلمی باکتری بررسی شود.

در چندین مطالعه در این زمینه نشان داده شده است استفاده از ترکیبات مختلفی که با محلول‌های حاوی فاژ مخلوط شده‌اند، ماندگاری فاژ در سطوح برگ را افزایش می‌دهد؛ برای نمونه، در مطالعه‌ای از شیر بدون چربی استفاده و این ترکیب به بهبود کنترل بیماری لکۀ باکتریایی گوجه‌فرنگی در مقایسه با درمان استاندارد باکتری‌کش‌های شیمیایی منجر شد (36).

بر اساس نتایج پژوهش حاضر و پژوهش‌های مکرر دیگر در این زمینه، باکتریوفاژهای لیتیک می‌توانند عوامل زیستی بالقوه با پتانسیل ضدباکتریایی بسیار مؤثر در کنترل بیماری‌های گیاهی و جایگزین عوامل کنترلی کنونی باشند.

در راستای این مطالعه پیشنهاد می‌شود اثر فاژ روی دیگر سویه‌های بیماری‌زای باکتری Xanthomonas و همچنین روی بیوفیلم آنها به روش‌های مختلف بررسی شود؛ از جمله می‌توان از باکتریوفاژهای لیتیک اختصاصی باکتری Xanthomonas به‌شکل منفرد یا به‌شکل ترکیب با باکتریوفاژهای جداسازی‌شدۀ دیگر همراه با آنتی‌بیوتیک‌ها یا عوامل کنترلی دیگر مانند ترکیبات مس در اقدامات پیشگیری‌کننده و درمانی با عنوان فاژ درمانی علیه عفونت‌های باکتریایی استفاده کرد.

 

سپاسگزاری

از یاری‌رسانی گروه زیست‌شناسی دانشگاه شهید چمران اهواز و زحمات کارشناسان محترم آزمایشگاه میکروبیولوژی صنعتی دکتر سپهر دانشگاه الزهرا (س) تهران کمال تشکر و قدردانی را داریم.

 

[1] Gammaproteobacteria

[2] Black rot

[3] Crucifers

[4] V-shaped necrotic lesions

[5] Uprooting

[6] Burying

[7] Burning

[8] Multi Drug Resistance

[9] AgriPhage

[10] OmniLytics

[11] Phosphate-Buffered Saline

[12] Sodium chloride Magnesium sulphate and gelatin

[13] Tectiviridae

[14] Burst Size

[15] Extracellular Polymeric Substances

 

مراجع

  • Ryan RP., Vorhölter F-J., Potnis N., Jones JB., Van Sluys M-A., Bogdanove AJ., et al. Pathogenomics of Xanthomonas: understanding bacterium–plant interactions. Nature Reviews Microbiology. 2011 May; 9(5): 344-55. https://doi.org/10.1038/ nrmicro2558
  • Jacques M-A., Arlat M., Boulanger A., Boureau T., Carrère S., Cesbron S., et al. Using ecology, physiology, and genomics to understand host specificity in Xanthomonas. Annual Review of Phytopathology. 2016; 54: 163-87. https://doi.org/10.1146/annurev-phyto-080615-100147
  • Vicente JG., Holub EB. X anthomonas campestris pv. campestris (cause of black rot of crucifers) in the genomic era is still a worldwide threat to brassica crops. Molecular Plant Pathology. 2013 Jan; 14(1): 2-18. https://doi.org/ 10.1111/j.1364- 3703.2012.00833.x
  • Abedon ST., Thomas-Abedon C., Thomas A., Mazure H. Bacteriophage prehistory: is or is not Hankin, 1896, a phage reference? 2011 May 1; 1(3): 174-8. https://doi.org/10.4161/bact.1.3.16591
  • Biruma M., Pillay M., Tripathi L., Blomme G., Abele S., Mwangi M., et al. Banana Xanthomonas wilt: a review of the disease, management strategies and future research directions. African Journal of Biotechnology. 2007; 6(8). https://www.ajol.info/index.php/ ajb/article/view/56989
  • Sundin GW., Wang N. Antibiotic resistance in plant-pathogenic bacteria. Annual Review of phytopathology. 2018 Aug 25; 56: 161-80. https://doi.org/10.1146/ annurev-phyto-080417-045946
  • La Torre A., Iovino V., Caradonia F. Copper in plant protection: Current situation and prospects. Phytopathologia Mediterranea. 2018 Aug 1; 57(2): 201-36. https://www.jstor.org/stable/ 26507086
  • Wellington EM., Boxall AB., Cross P., Feil EJ., Gaze WH., Hawkey PM., et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. The Lancet infectious diseases. 2013 Feb 1; 13(2): 155-65. https://doi.org/ 10.1016/S1473-3099(12)70317-1
  • Grenni P., Ancona V., Caracciolo AB. Ecological effects of antibiotics on natural ecosystems: A review. Microchemical Journal. 2018 Jan 1; 136: 25-39. https://doi.org/10.1016/ j.microc.2017.02.006
  • Nakayinga R., Makumi A., Tumuhaise V., Tinzaara W. Xanthomonas bacteriophages: a review of their biology and biocontrol applications in agriculture. BMC microbiology. 2021 Dec; 21(1): 1-20. https://doi.org/ 10.1186/s12866-021-02351-7
  • Sieiro C., Areal-Hermida L., Pichardo-Gallardo Á., Almuiña-González R., de Miguel T., Sánchez S., et al. A Hundred Years of Bacteriophages: Can Phages Replace Antibiotics in Agriculture and Aquaculture?. Antibiotics. 2020 Aug 7; 9(8): 493. https://doi.org/10.3390/ antibiotics9080493
  • Mallmann W., Hemstreet C. Isolation of an inhibitory substance from plants. Agric Res. 1924; 28(6): 599-602. https://www.cabidigitallibrary.org/doi/full/10.5555/19251100320
  • Civerolo E., Keil H. Inhibition of bacterial spot of peach foliage by Xanthomonas pruni bacteriophage. Phytopathology. 1969; 59: 1966-7. https://www.cabidigitallibrary.org/ doi/full/10.5555/19700305685
  • Flaherty J., Somodi G., Jones J., Harbaugh B., Jackson L. Control of bacterial spot on tomato in the greenhouse and field with H-mutant bacteriophages. 2000 Aug 1; 35(5): 882-4. https://journals.ashs.org/hortsci/view/journals/hortsci/35/5/article-p882.xml
  • Flaherty J., Harbaugh B., Jones J., Somodi G., Jackson L. H-mutant bacteriophages as a potential biocontrol of bacterial blight of geranium. 2001 Feb 1; 36(1): 98-100. https://journals.ashs.org/hortsci/ view/journals/hortsci/36/1/article-p98.xml
  • Lang JM., Gent DH., Schwartz HF. Management of Xanthomonas leaf blight of onion with bacteriophages and a plant activator. Plant disease. 2007 Jul; 91(7): 871-8. https://doi.org/10.1094/ PDIS-91-7-0871
  • Balogh B., Canteros BI., Stall RE., Jones JB. Control of citrus canker and citrus bacterial spot with bacteriophages. Plant Disease. 2008 Jul; 92(7): 1048-52. https://doi.org/10.1094/PDIS-92-7-1048
  • Ahmad AA., Askora A., Kawasaki T., Fujie M., Yamada T. The filamentous phage XacF1 causes loss of virulence in Xanthomonas axonopodis pv. citri, the causative agent of citrus canker disease. Frontiers in Microbiology. 2014 Jul 1; 5: 321. https://doi.org/10.3389/fmicb. 2014.00321
  • Ibrahim YE., Saleh AA., Al-Saleh MA. Management of asiatic citrus canker under field conditions in Saudi Arabia using bacteriophages and acibenzolar-S-methyl. Plant disease. 2017 May 13; 101(5): 761-5. https://doi.org/10.1094/ PDIS-08-16-1213-RE
  • Chae J-C., Nguyen BH., Yu S-M., Lee HK., Lee YH. Diversity of bacteriophages infecting Xanthomonas oryzae pv. oryzae in paddy fields and its potential to control bacterial leaf blight of rice. Journal of microbiology and biotechnology. 2014; 24(6): 740-7. 4014/jmb.1402.02013
  • Ranjani P., Gowthami Y., Gnanamanickam SS., Palani P. Bacteriophages: A new weapon for the control of bacterial blight disease in rice caused by Xanthomonas oryzae. Microbiology and Biotechnology Letters. 2018; 46(4): 346-59. https://doi.org/ 10.4014/ mbl.1807.07009
  • Kusradze I., Karumidze N., Rigvava S., Dvalidze T., Katsitadze M., Amiranashvili I., et al. Characterization and testing the efficiency of Acinetobacter baumannii phage vB-GEC_Ab-M-G7 as an antibacterial agent. Frontiers in microbiology. 2016 Oct 4; 7: 1590. https://doi.org/10.3389/fmicb.2016. 01590
  • Peng F., Mi Z., Huang Y., Yuan X., Niu W., Wang Y., et al. Characterization, sequencing and comparative genomic analysis of vB_AbaM-IME-AB2, a novel lytic bacteriophage that infects multidrug-resistant Acinetobacter baumannii clinical isolates. BMC microbiology. 2014 Dec; 14:1-4. https://doi.org/10.1186/1471-2180-14-181
  • Bonilla N., Barr JJ. Phage on tap: a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. 2016 Jul 26; 4: e2261. https://doi.org/10.7717/ peerj.2261
  • Manohar P, Tamhankar AJ, Lundborg CS, Ramesh N. Isolation, characterization and in vivo efficacy of Escherichia phage myPSH1131. PloS one. 2018 Oct 24; 13(10): e0206278. https://doi.org/ 10.1371/journal. pone.0206278
  • Zare L, Shenagari M, Mirzaei MK, Mojtahedi A. Isolation of lytic phages against pathogenic E. coli isolated from diabtic ulcers. Iran J Med Microbiol. 2018; 11(2): 34-41. https://ijmm.ir/ article-1-701-fa.html [In Persian].
  • Manjunath NS, Agsar D, Jagannath KV, Rangaswamy BE, Rao SC, Anand S. Characterization and in vitro efficacy studies of wide host range lytic bacteriophage Φdmec-1 Infecting Escherichia coli isolated from pyogenic skin infections. DAMA Int. 2013; 2(2): 47-54. https://B2n.ir/s15676
  • Ahmadi M, Karimi Torshizi MA, Rahimi S, Dennehy JJ. Prophylactic bacteriophage administration more effective than post-infection administration in reducing Salmonella enterica serovar Enteritidis shedding in quail. Frontiers in microbiology. 2016 Aug 9; 7: 1253. https://doi.org/10.3389/ fmicb.2016.01253
  • Drulis-Kawa Z, Mackiewicz P, Kęsik-Szeloch A, Maciaszczyk-Dziubinska E, Weber-Dąbrowska B, Dorotkiewicz-Jach A, Augustyniak D, Majkowska-Skrobek G, Bocer T, Empel J, Kropinski AM. Isolation and characterisation of KP34—a novel φKMV-like bacteriophage for Klebsiella pneumoniae. Applied microbiology and biotechnology. 2011 May; 90: 1333-45. https://doi.org/10.1007/s00253-011-3149-y
  • Wang Z, Zheng P, Ji W, Fu Q, Wang H, Yan Y, Sun J. SLPW: A virulent bacteriophage targeting methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro and in vivo. Frontiers in microbiology. 2016 Jun 15; 7: 934. https://doi.org/ 10.3389/fmicb.2016.00934
  • Sherwood Improved synthetic medium for the growth of Rhizobium. Journal of Applied Bacteriology. 1970 Dec; 33(4): 708-13. https://doi.org/ 10.1111/j.1365-2672.1970.tb02253.x
  • Choobkar N, Akhondzadeh Basti A, Sari AA, Gandomi H, Emami Rad AM. Effect of Zataria multiflora Boiss essential oil and nisin on shelf life in light salted fish fillet of silver carp (Hypophthalmichthys molitrix). Journal of Medicinal Plants. 2012 May 10; 11(42): 205-15. https://jmp.ir/article-1-463-en.html [In Persian].
  • Ramey BE, Koutsoudis M, von Bodman SB, Fuqua C. Biofilm formation in plant–microbe associations. Current opinion in microbiology. 2004 Dec 1; 7(6): 602-9. https://doi.org/10.1016/ j.mib.2004.10.014
  • Sutherland IW, Hughes KA, Skillman LC, Tait K. The interaction of phage and biofilms. FEMS microbiology letters. 2004 Mar 1; 232(1): 1-6. https://doi.org/ 10.1016/S0378-1097(04)00041-2
  • Worthington RJ, Rogers SA, Huigens III RW, Melander C, Ritchie DF. Foliar-applied small molecule that suppresses biofilm formation and enhances control of copper-resistant Xanthomonas euvesicatoria on pepper. Plant disease. 2012 Nov; 96(11): 1638-44. https://doi.org/10.1094/PDIS-02-12-0190-RE
  • Knezevic P, Petrovic O. A colorimetric microtiter plate method for assessment of phage effect on Pseudomonas aeruginosa biofilm. Journal of Microbiological methods. 2008 Aug 1; 74(2-3): 114-8. https://doi.org/10.1016/ j.mimet.2008.03.005
  • Bradley Basic characterization of a Pseudomonas aeruginosa pilus-dependent bacteriophage with a long noncontractile tail. Journal of Virology. 1973 Nov; 12(5): 1139-48. https://doi.org/10.1128/jvi.12.5.1139-1148.1973

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار