نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
In recent years, the need for L-asparaginase in different industries has increased. L-asparaginase obtained from microorganisms is cost-effective, has no harmful effects on the environment, and improves the quality of products. In the present study, L-asparaginase-producing microorganisms were isolated and optimized from different sources, and selected strain enzymes were produced.
L-asparaginase-producing yeasts were randomly isolated and purified from different parts of Isfahan. Strains were screened for L-asparaginase production. Then, the superior yeast strain with the highest enzymatic activity was selected for optimization. Under suitable pH, temperature, time, carbon source, and nitrogen source, multi-factor optimization was performed using response-level statistical software to investigate the simultaneous effect of several factors on production and the highest enzyme activity.
In the present study, 5S2 yeast isolate led to the formation of the highest halo of L-asparaginase. This strain was first introduced as the L-asparaginase-producing strain and was registered in the NCBI database under Diutina mesorugosa strain SBG-IAUF-2 with access number MZ901211. Yeast 5S2 with enzyme activity equivalent to 1722.8 u / ml was selected as the selected strain for optimization. The results of multivariate optimization of enzyme activity showed that at pH 7, a concentration of 2% glucose as carbon source, the attention of 10% L-asparagine, a temperature of 35°C, and a time of 120 hours, there is the highest enzyme production activity and curve RSM is located in the optimization area.
In the present study, after recording 5S2 yeast isolate for the first time as an L-asparaginase-producing strain in the NCBI database, extracellular L-asparaginase produced by the 5S2 yeast strain was introduced due to its high enzymatic activity as a potent strain in the production of L-asparaginase enzyme.
Introduction
L-asparaginase as a food processing aid, is capable of significantly reducing acrylamide formation in starchy foods by over 90% without altering their taste or appearance. L-asparaginase enzymes are produced by various microorganisms, including bacteria like Streptomyces goulbarjensis, Enterobacter cloacae, and Serratia marcescens, as well as fungi and yeasts. Different isoforms of L-asparaginase originating from plants, eukaryotes, and prokaryotes have been identified, with those isolated from microorganisms, especially bacteria, proving more effective. Microorganisms producing L-asparaginase are found across diverse ecological areas, showcasing desirable enzymatic activity. The most effective isoforms of L-asparaginase currently available as anticancer drugs and produced commercially are sourced from microbial origins like Escherichia coli, Erwinia carotovora, and various Bacillus strains. Reports also mention the enzyme's production by filamentous fungi and yeasts such as Saccharomyces cerevisiae and Candida. Like Saccharomyces cerevisiae, Yeast is highlighted for its single-cell nature, rapid reproduction in cultivation environments, and its significance in various ecosystems like soil, swamps, and rivers due to its cellular processes post-translation and lack of endotoxins. Saccharomyces cerevisiae intricately regulates L-asparagine metabolism through complex pathways involving unrelated citrate products. The current study focuses on isolating, purifying, and identifying yeast strains producing L-asparaginase, optimizing its production under various environmental conditions to find an optimal method for generating these enzymes with reduced side effects and increased therapeutic potential.
Materials and Methods
Sampling and isolation of L-asparaginase-producing yeast: Soil samples were collected randomly from various points in Isfahan, particularly from agricultural fields, and diverse yeasts were isolated from these samples. For initial enrichment of the yeasts, 1 gram of collected soil samples was mixed in 100 milliliters of L-asparagine culture medium. This mixture was placed on a shaker for 3 days at 31 degrees Celsius and a speed of 130 rotations per minute, repeated thrice. Subsequently, 1 milliliter of the culture medium was taken and transferred to YPG agar medium.
Yeast screening based on L-asparagine enzyme production: A rapid assay method was employed using a minimum asparagine agar medium. Colonies were placed on this medium and incubated at 30 degrees Celsius for 24 to 72 hours. Changes in color and halo diameter were examined every 24 hours. Yeasts capable of producing the enzyme hydrolyze asparagine in the culture medium, releasing ammonia and alkalinizing the medium. As a result, a shift in pH from acidic to alkaline changed the color of the medium from yellow to pink. Yeasts producing the enzyme caused an alkalinity shift, changing the medium color to a pinkish hue. Yeasts that did not produce this pink halo were eliminated.
Molecular Identification of Superior Yeast Species Producing L-Asparaginase Enzyme: For molecular identification, the selected strains were incubated in YPG culture medium for 72 hours at 37 degrees Celsius. The colony-PCR method was employed to identify the genus and species of the yeasts. The DNA of each sample was added to the respective vials, and after adding the required reaction components and the designed primers, they were placed inside the thermocycler. Consequently, a 655 base pair fragment resulting from amplifying the gene encoding 18S-rRNA (ITS4, ITS1) using the forward and reverse primer was amplified via a polymerase chain reaction.
Optimization of Enzyme Production via RSM Statistical Design: Multiple factors, including pH, carbon source, nitrogen source, temperature, time, and their various concentrations of carbon and nitrogen sources were examined in enzyme production. Based on the available sources in the culture medium, enzyme activity of Sizopek's Dax was subjected to various concentrations of glucose (from 1.5% to 2.5%) as a carbon source, a pH range from 5 to 9, L-asparagine as a nitrogen source (from 6% to 14%), temperature between 25 to 45 degrees Celsius, and time from 80 to 160 hours as factors in the optimization process using the Response Surface Methodology (RSM).
Research Findings
In this study, yeast 5S2 was examined for the first time to produce the L-asparaginase enzyme. After sequencing and obtaining the relevant file, the sequence underwent evaluation and editing using the Choromas software. Sequence comparison via the BLASTN server in the NCBI database revealed that the 18S-rDNA sequence of the 5S2 yeast strain bears the highest similarity and coverage with a strain of Diutina mesorugosa. Following assessments, this isolate was registered as a new strain for L-asparaginase production under the name Diutina mesorugosa strain SBG-IAUF-2 with accession number MZ901181 in the NCBI database. The highest enzyme activity during the optimization stage was achieved in test number 6, with 2% glucose, pH at 7, a duration of 120 hours, a temperature of 35 degrees Celsius, and 10% L-asparagine. This resulted in an enzyme activity of 1722.8 U/mL, indicating the maximum level of enzyme activity. In the optimization of L-asparaginase enzyme from the 5S2 strain, the highest activity was observed at pH 7, showing sensitivity to both acidic and alkaline conditions. Additionally, the enzyme was temperature-sensitive, exhibiting the highest activity at 35 degrees Celsius but decreasing notably at 45 degrees Celsius.
Discussion of Results and Conclusions
Glucose and L-asparagine levels influenced enzyme production, achieving optimal enzyme yields at their moderate levels. Time was also a significant factor affecting enzyme production. This research successfully produced L-asparaginase using the isolated yeast strain 5S2 from the soil, optimizing its activity through the response surface method. The increased enzyme activity suggests the potential application of these results in various industries, including food processing and nanotechnology. The enzyme production levels in the optimization process suggest the potential for enhanced enzyme yields through strain optimization.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
آنزیم‌های دارویی کاربردهای فراوانی در درمان بسیاری از بیماری‌های انسانی دارند (1). به‌‌کارگیری هدفمند آنزیم‌ها بهمنظور مداخله در مسیر واکنش‌های شیمیایی و بیوشیمیایی همواره یکی از موضوع‌های درخور توجه صنعت و پزشکی بوده است (2). پیش‌ماده (سوبسترا) و محصول این آنزیم‌ها نقش‌های مهمی را در سازوکار تمام موجودات ایفا می‌کنند؛ ازاینرو، این آنزیم‌ها نقش‌های فیزیولوژیک بسیاری دارند و کنترل بیان و فعالیت آنها سبب تعادل بین میزان آمینواسیدهای بدن می‌شود (3).
ال- آسپاراژیناز، آنزیمی است که به دلیل درمان انواع مختلف سرطان و عمدتاً لوسمی لنفوبلاستی حاد در شیمی‌درمانی کاربرد فراوانی دارد (4). عملکرد اختصاصی آنزیم ال-آسپاراژیناز (ال-آسپاراژیناز آمیدوهیدرولاز، E.C.3.5.1.1) سبب شده است این آنزیم به‌عنوان دارویی باارزش در درمان بیماری‌های مختلف مانند لوسمی لنفوبلاستی حاد دوران کودکی، لوسمی میلومونوستیک، سارکوم رتیکولوم، سارکوم ملانوما، لنفوم غیرهوچکین، سرطان پانکراس و سارکوم لنفوم گاوی استفاده شود (5). آنزیم ال-آسپاراژیناز، آمیدوهیدرولازی است که با دآمیناسیون ال-آسپاراژین، آن را به ال-آسپارتیک‌اسید[1] و آمونیاک[2] تبدیل و به میزان کمتری نیز واکنش هیدرولیز گلوتامین به گلوتامیک‌اسید را کاتالیز می‌کند (6).
سلول‌های توموری و سرطانی به دلیل نداشتن آنزیم ال-آسپاراژین‌سنتتاز، آمینواسید ال-آسپاراژین موردنیاز خود را از جریان خون تأمین می‌کنند؛ بنابراین، تزریق داخل وریدی آنزیم ال-آسپاراژیناز سبب کاهش غلظت آمینواسید ال-آسپاراژین در خون و جلوگیری از رشد سلول‌های سرطانی می‌شود (7). این آنزیم با فعالیت اختصاصی و انتخابی خود روی سلول‌های سرطانی، به‌شکل دارو یا عامل شیمی‌درمانی عمل می‌کند و سبب مرگ سلول‌های یادشده می‌شود. ال-آسپاراژینازها در بیوسنتز خانوادۀ آسپارتیک‌آمینواسیدها نیز نقش حیاتی دارند (8).
آسپاراژیناز به‌عنوان کمک‌کننده به فرآوری مواد غذایی می‌تواند میزان تشکیل اکریل‌آمید در مواد نشاسته‌دار را تا بیش از ۹۰ درصد کاهش دهد؛ بدون این که طعم و ظاهر مادۀ غذایی دستخوش تغییر شود (9).
بسیاری از ریزموجودات شامل باکتری‌ها مانند استرپتومایسس گولبارجنسیس[3]، انتروباکتر کلوآکه[4] و سراشیا مارسنس[5]، قارچ‌ها و مخمرها آنزیم‌های
ال-آسپاراژیناز را تولید می‌کنند (12-10). تاکنون ایزوآنزیم‌های متفاوتی از این آنزیم با منشأ گیاهی، یوکاریوتی و پروکاریوتی شناسایی شده‌اند (13)؛ باوجوداین، ایزوآنزیم‌های جداسازی‌شده از ریزموجودات به‌ویژه باکتری‌ها از سایر ال-آسپاراژینازها مؤثرترند (14). ریزموجودات تولیدکنندۀ ال-آسپاراژیناز در طیف وسیعی از مناطق اکولوژیک یافت می‌شوند و در این راستا، باکتری‌های متعددی از آب و خاک جدا شده‌اند که فعالیت ال-آسپاراژینازی مطلوبی از خود نشان می‌دهند (15). مؤثرترین ایزوآنزیم‌های
ال-آسپاراژیناز که امروزه به‌عنوان داروی ضدسرطان در دسترس هستند و به‌شکل تجاری تولید می‌شوند، از منابع میکروبی مانند اشریشیا کلی[6]، اروینیا کاراتوورا[7] و سویه‌های باسیلوس[8] به دست می‌آیند (16).
گزارش‌هایی نیز دربارۀ تولید آنزیم توسط قارچ‌های رشته‌ای (17) و مخمرهای ساکارومایسس سرویزیه[9] (18) و کاندیدا[10] (19) وجود دارند. مخمرها در انواع محیط‌ها مانند خاک، تالاب‌ها و رودخانه‌ها یافت می‌شوند و بخشی از فلور میکروبی اکوسیستم‌های طبیعی را تشکیل می‌دهند (5). مخمرها به دلیل قابلیت انجام فرایندهای سلولی پس از ترجمه و نداشتن اندوتوکسین، اهمیت فراوانی در صنعت دارند (20).
مخمر ساکارومایسس سرویزیه، موجودی تک‌سلولی است که از طریق جوانه‌زدن هر سلول در محیط‌کشت به‌سرعت تکثیر می‌شود (24-21). در ساکارومایسس سرویزیه، تنظیم سازوکار آسپاراژین پیچیده است. سنتز ال-آسپاراژین در مسیری ناشناخته از طریق محصولات دو سیسترون غیرمرتبط (ASN1 و ASN2) تحت‌تأثیر قرار می‌گیرد. در این گونه، مصرف ال-آسپاراژین توسط دو شکل متفاوت آسپاراژیناز انجام می‌شود:
1) ال-آسپاراژیناز I که به‌طور ساختاری سنتز می‌شود و تنها روی ال-آسپاراژین درون‌سلولی فعال است و آن را دآمینه می‌کند. ۲) ال-آسپاراژیناز II، گلیکوپروتئینی است که می‌تواند هر دو نوع ال و دی آسپاراژین را وقتی خارج از سلول هستند، دآمینه کند.
باوجوداینکه آنزیم ال-آسپاراژیناز تیپ II در مقایسه با سایر داروهایی که در شیمی‌درمانی استفاده می‌شوند، سازگاری بسیار زیادی با بافت و سازوکارهای حیاتی بدن دارد، مانند داروهای دیگر ممکن است آثار جانبی نامطلوبی را نشان دهد؛ ازاینرو، پژوهشگران برای دستیابی به آسپاراژینازی که توان درمانی زیاد و عوارض جانبی کمی داشته باشد، در تلاشند. در پژوهش حاضر، جداسازی، خالص‌سازی و شناسایی مخمرهای مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز و سپس بهینه‌سازی تولید آنزیم با استفاده از شرایط محیطی مختلف بهمنظور یافتن روشی بهینه برای تولید آنزیم‌های آسپاراژینازی بررسی شد.
مواد و روش‌ها
نمونه‌گیری و جداسازی ریزموجودات مولد ال-آسپاراژیناز
بهمنظور جداسازی مخمرهای مولد آنزیم
ال-آسپاراژیناز، نمونه‌های خاک به‌طور تصادفی از نقاط مختلف شهر اصفهان و به‌ویژه مزارع کشاورزی جمع‌آوری و مخمرهای گوناگون از این نمونه‌ها جداسازی شدند. بهمنظور غنی‌سازی اولیۀ مخمرها،
1 گرم از نمونه‌های خاک جمع‌آوری‌شده به
100 میلی‌لیتر محیط‌کشت ال-آسپاراژین‌براث ]آسپاراژین (3 گرمبرلیتر)، دی‌پتاسیم‌هیدروژن‌فسفات
(1 گرمبرلیتر)، منیزیم‌سولفات‌هیدرات (5 گرمبرلیتر) و پتاسیم‌سولفات‌هیدرات (10 گرمبرلیتر) تکمیل‌شده با 05/0 درصد کلرامفنیکل[ با اسیدیتۀ 7/4 افزوده و نمونه به‌مدت 3 روز در دمای 31 درجۀ سانتیگراد و سرعت 130 دوردردقیقه روی شیکر گرماگذاری شد؛ این آزمایش سه بار تکرار شد. درنهایت، 1 میلی‌لیتر از محیط رویی برداشته و برای جداسازی مخمرها به محیط‌کشت YPG آگار ]عصارۀ مخمر (10 گرمبرلیتر)، پپتون
(20 گرمبرلیتر)، گلوکز (20 گرمبرلیتر) و آگار
20 (گرمبرلیتر) تکمیل‌شده با 05/0 کلرامفنیکل[ تلقیح و به‌شکل خطی کشت داده شد. پس از طی‌شدن زمان گرماگذاری، رنگ‌آمیزی ساده با رنگ متیلن‌بلو برای نمونه‌های رشدکرده انجام و هرکدام از کلن‌های متفاوت با روش کشت خطی روی محیط‌های YPG آگار خالص شد (25).
غربال‌گری مخمرها از نظر تولید آنزیم
بهمنظور شناسایی مخمرهای تولیدکنندۀ آنزیم آسپاراژیناز بر اساس روش سنجش سریع از محیط حداقل آسپاراژینآگار ]آسپاراژین (1 گرمبرلیتر)، سولفات‌منیزیم (05/0 گرمبرلیتر)، کلراید‌پتاسیم
(05/0 گرمبرلیتر)، کلراید‌سدیم (02/0 گرمبرلیتر)، فنل‌رد (012/0 گرمبرلیتر) و آگار (5/1 گرمبرلیتر)[ استفاده شد. یک کلنی از هر نمونه روی محیط قرار داده شد و گرماگذاری به‌مدت 24 تا 72 ساعت در دمای
30 درجۀ سانتیگراد انجام شد. هر 24 ساعت یک بار، محیط‌ها از نظر تغییر رنگ و قطر هالۀ ایجادشده بررسی شدند. آنزیم ال-آسپاراژیناز با هیدرولیز آسپاراژین موجود در محیط‌کشت سبب آزادسازی آمونیوم و قلیایی‌شدن محیط‌کشت می‌شود؛ در نتیجه با تغییر اسیدیتۀ محیط از اسیدی به قلیایی، تغییر رنگ محیط از زرد به صورتی مشاهده می‌شود. در پژوهش حاضر، مخمرهایی که آنزیم تولید کردند، توانستند آمونیاک را در محیط آزاد کنند، اسیدیته را تغییر دهند و هالۀ ارغوانی‌رنگ ایجاد کنند. مخمرهایی که هالۀ ارغوانی ایجاد نکردند، حذف شدند (25).
سنجش تولید آنزیم آسپاراژیناز
بهمنظور کشت مخمرها و تهیۀ مایع تلقیح، از هر مخمر به ارلن 100 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر محیط YPD براث ]عصارۀ مخمر (10 گرمبرلیتر)، پپتون
(20 گرمبرلیتر) و دکستروز (20 گرمبرلیتر)[ تلقیح شد و نمونه به‌مدت 24 ساعت در انکوباتور شیکردار
(130 دوردردقیقه) با دمای 30 درجۀ سانتیگراد گرماگذاری شد. جذب مایع تلقیح در طول موج
600 نانومتر با اسپکتروفتومتر خوانده شد و با رسیدن به جذب 5/0، مقدار 1 درصد (1 میلی‌لیتر) از مایۀ تلقیح به محیط تولید آنزیم (50 میلی‌لیتر محیط سیزپکس داکس[11]) اضافه و به‌مدت 24 ساعت در انکوباتور شیکردار (130 دوردردقیقه) با دمای 30 درجۀ سانتیگراد نگهداری شد.
محیط سیزپکس داکس، محیط تولید آنزیم آسپاراژیناز است که برای تولید آسپاراژیناز در ارلن استفاده شد. 50 میلی‌لیتر محیط‌کشت سیزپکس داکس ]گلوکز (2 گرمبرلیتر)، آسپاراژین (10 گرمبرلیتر)، فسفات‌هیدروژن‌دی‌پتاسیم (25/1 گرمبرلیتر)، کلراید‌پتاسیم (52/0 گرمبرلیتر)، سولفات‌آهن
(03/0 گرمبرلیتر) و سولفات‌روی (52/0 گرمبرلیتر)[ در ارلن‌های 250 میلی‌لیتری تهیه و سپس در شرایط استریل، 1 درصد (1 میلی‌لیتر) مایع تلقیح به محیط‌کشت تولیدشده منتقل و میزان رشد مخمرها پس از 24 ساعت گرماگذاری در دمای 30 درجۀ سانتیگراد با سرعت 130 دوردردقیقه بررسی شد. میزان تولید آسپاراژیناز به روش رنگ‌سنجی بر پایۀ تغییر رنگ آمونیاک بر اساس روش ایمادا و با دستگاه اسپکتروفتومتر سنجیده شد (25).
سنجش فعالیت آنزیمی
روش تیتراسیون برای سنجش فعالیت آسپاراژیناز به کار رفت. در مرحلۀ نخست، 1 میلی‌لیتر از محیط‌های کشت مخمر نمونه‌برداری شد و نمونه‌ها به‌مدت 30 دقیقه در 10000 دور‌‌بر‌‌دقیقه سانتریفیوژ شدند. سپس
1/0 میلی‌لیتر از محلول رویی (محلول آنزیمی) به
9/0 میلی‌لیتر ال-آسپاراژین 01/0 مولار و 1 میلی‌لیتر بافر تریس-HCL 5/0 مولار با اسیدیتۀ 8/6 اضافه شد. مخلوط حاصل به‌مدت 30 دقیقه در بنماری با دمای
37 درجۀ سانتیگراد گرماگذاری و پس از این زمان، واکنش با اضافه‌کردن 1/0 میلی‌لیتر تری‌کلرواستیک‌‌‌اسید 5/1 مولار متوقف شد. بهمنظور حذف رسوبات، نمونه به‌مدت 10 دقیقه در دمای اتاق با 10000 دوردردقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی برای مرحلۀ بعد استفاده شد. آمونیاک آزادشده در محلول رویی با اضافه‌کردن
25/0 میلی‌لیتر معرف نسلر[12] (سیگما) به لوله‌های حاوی 5/0 میلی‌لیتر سوپرناتانت و 75/1 میلی‌لیتر آب مقطر به روش رنگ‌سنجی شناسایی شد. پس از ورتکس، لوله‌ها به‌مدت 10 دقیقه در دمای اتاق گرماگذاری شدند. جذب نمونه‌ها در طول موج 450 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر در برابر شاهد دارای 1/0 میلی‌لیتر آب مقطر خوانده شد. هر واحد فعالیت آنزیم آسپاراژیناز معادل مقدار آنزیمی است که 1 میکرومول آمونیاک را در مدت یک دقیقه از ال-آسپاراژین آزاد می‌کند. مقدار آمونیاک آزادشده در این آزمایش در ازای 30 دقیقه گرماگذاری در دمای 37 درجۀ سانتیگراد، 1/0 میلی‌لیتر محلول آنزیم بود (25).
بهمنظور تبدیل جذب نوری نمونه‌های نامشخص به واحد آنزیمی از منحنی استاندارد استفاده شد. محلول 6 میلی‌مولار آمونیوم‌سولفات تهیه و حجم‌های 05/0، 1/0، 15/0، 2/0، 25/0، 3/0، 35/0، 4/0 و 45/0 میلی‌لیتر از این محلول به لوله‌های آزمایش اضافه و سپس مراحل سنجش فعالیت آنزیم انجام شد. آزمایش در 3 تکرار انجام و میانگین جذب داده‌ها محاسبه شد.
شناسایی مولکولی گونه‌های مخمری برتر مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز
بهمنظور شناسایی مولکولی، ابتدا سویه‌های انتخاب‌شده به‌مدت 72 ساعت در محیط‌کشت YPG و در دمای 37 درجۀ سانتیگراد گرماگذاری شدند. از روش کلنی-PCR برای شناسایی جنس و گونۀ مخمرها استفاده شد؛ به این منظور، پرایمر با نرم‌افزار طراحی شد. در این روش، مقداری از یک تک کلنی مخمر در
10 میکرولیتر آب مقطر حل و به‌مدت 10 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر (PCR) قرار داده شد. DNA هر نمونه به ویال‌های مربوطه افزوده و پس از اضافه‌کردن ترکیبات لازم برای واکنش و پرایمرهای طراحی‌شده، درون دستگاه ترموسایکلر قرار داده شد. قطعۀ 655 جفت بازی حاصل از تکثیر ژن کدکنندۀ 18S-rRNA (ITS4، ITS1) به‌وسیلۀ پرایمر رفت ('CCTTACTACTTGGATAACCGTGG3'5) و برگشت ('CCCTATTATCATTACGATGGTCC3'5) طی واکنش زنجیره‌ای پلیمرازی تکثیر شد.
واکنش PCR با شرایط دمایی 30 ثانیه واسرشت‌شدن ابتدایی در دمای 95 درجۀ سانتیگراد و سپس 35 چرخه شامل واسرشت‌شدن در دمای 94 درجۀ سانتیگراد به‌مدت 30 ثانیه، مرحلۀ اتصال با دمای 55 درجۀ سانتیگراد به‌مدت 30 ثانیه، مرحلۀ سنتز در دمای
72 درجۀ سانتیگراد به‌مدت 60 ثانیه و مرحلۀ گسترش نهایی به‌مدت 30 ثانیه در دمای 72 درجۀ سانتیگراد انجام شد. پس از بررسی کیفیت محصول PCR حاصل از تکثیر قطعۀ مربوط به ژن کدکنندۀ rDNA 18S- (ITS4، ITS1) از نظر تک‌باند‌بودن، 30 میکرولیتر محصول PCR برای تعیین توالی ارسال شد. نتایج با نرم‌افزار 1/2 Chromas بررسی و تصحیح و به کمک سرور BASTN در پایگاه NCBI ارزیابی و گونۀ مربوطه یا نزدیک شناسایی شد.
بهینه‌سازی تک‌فاکتوره و چندفاکتوره با طراحی آزمون آماری RSM
بر اساس مطالعه‌های پژوهشگران در زمینۀ بهینه‌سازی آنزیم ال-آسپاراژیناز، می‌توان گفت عوامل متعددی ازجمله اسیدیته، منبع کربن، منبع نیتروژن، دما، زمان و غلظت‌های مختلف آنها روی فرایند بهینه‌سازی آنزیم تأثیر می‌گذارند؛ علاوه‌‌بر این عوامل که به‌طور مستقل تأثیر دارند، میان‌کنش آنها نیز در فرایند یادشده مهم و سبب ایجاد نتایج متفاوت می‌شود؛ ازاینرو، در آزمایش حاضر از آزمون مرکب مرکزی سطح پاسخ بهره گرفته شد تا ضمن به‌حداقل‌رساندن اثر عوامل محیطی، بتوان میان‌کنش متغیرهای مختلف را نیز بررسی کرد. در این آزمایش بر اساس منابع موجود در محیط‌کشت سیزپکس داکس، پنج متغیر غلظت‌های مختلف گلوکز
(5/1 تا 5/2 درصد) به‌عنوان منبع کربن، محدودۀ اسیدیتۀ 5 تا 9، ال-آسپاراژین به‌عنوان منبع نیتروژن (6 تا 14 درصد)، دما بین 25 تا 45 درجۀ سانتیگراد و زمان بین 80 تا 160 ساعت به‌عنوان فاکتورهای مؤثر در فرایند بهینه‌سازی در روش سطح پاسخ (RSM) به کار برده شدند. آزمون شمارۀ 6 با شرایط 2 گرمبرلیتر گلوکز،
10 گرمبرلیتر ال-آسپاراژیناز، اسیدیتۀ 7، دمای 35 درجۀ سانتیگراد و زمان 120 ساعت، برترین و نخستین آزمون با داشتن بیشترین اثر تعیین شد. آزمون‌های شمارۀ 1 و شمارۀ 18 به‌ترتیب آزمون‌های دوم و سوم بودند که بیشترین اثر را داشتند (جدول 1).
جدول 1- طراحی بدون فعالیت آنزیم ال- آسپاراژیناز طی 49 آزمایش طراحی‌شده با RSM
Table 1 – RSM design experiments for L-asparaginase activity evaluation of isolated yeast
فاکتورها و سطوح مختلف بهینه‌سازی در شکل 1 آورده شده‌اند. متغیرهای عددی در دو سطح بالا (1+) و یک سطح پایین (1-) مطالعه شدند. بهمنظور طراحی آزمایش از نرم‌افزار Design-Expert، نسخه‌ی 11 استفاده شد و پس از واردکردن متغیرها و سطوح آنها در نرم‌افزار، فرایند بهینه‌سازی طی 51 مرحله آزمون بررسی و در نهایت، تأثیر سطوح مختلف پارامترهای انتخاب‌شده بررسی شد.
شکل 1- فاکتورهای عددی و سطوح بررسی‌شدۀ بهینه‌سازی به روش سطح پاسخ (RSM)
Fig 1 – Factors and levels of RSM in optimization test
تجزیه‌وتحلیل داده‌ها
در مطالعۀ حاضر از نرم‌افزار RSM برای تجزیه‌وتحلیل آزمایش‌ها استفاده شد. اطلاعات با آنالیز واریانس ANOVA تحلیل شدند و تأثیر فاکتورها بررسی شد.
نتایج
جداسازی سویۀ اولیه
پس از جداسازی و خالص‌سازی نمونه‌های جمع‌آوری‌شده، سویه‌هایی انتخاب شدند که هالۀ صورتی پررنگ‌تر یا بزرگ‌تری داشتند
(شکل‌های 2 تا 4) و فعالیت آنزیمی با استفاده از کشت مایع برای سویۀ 5s تعیین شد.
شکل 2- تغییر رنگ محیط‌کشت مخمر Ew2 از کنار پلیت پس از 72 ساعت الف) پیش از 24 ساعت، ب) پس از 24 ساعت
Fig 2 – Color changing in EW2 yeast culture medium after 72 hours incubation (a) before 24 hours
(b) after 24 hours
شکل 3- تغییر رنگ محیط‌کشت مخمر 5S2 پس از 72 ساعت الف) پیش از 24 ساعت، ب) پس از 24 ساعت
Fig 3 – Color changing in 5S2 yeast culture after 72 hours incubation (a) before 24 hours (b) after 24 hours
شکل 4- تغییر رنگ محیط‌کشت آب راکد wj پس از 72 ساعت الف) پیش از 24 ساعت، ب) پس از 24 ساعت
Fig 4 - Color changing in WJ yeast culture after 72 hours incubation (a) before 24 hours (b) after 24 hours
جداسازی مخمرهای مولد آنزیم
ال-آسپاراژیناز
بر اساس مقدار آمونیوم آزادشده، مخمر 5S2 از بین سویه‌های جداشده به‌عنوان سویۀ اصلی برای ادامۀ کار انتخاب شد. شکل 5، منحنی تولید آنزیم توسط این سویه را نشان می‌دهد. این سویه نسبت به سویه‌های دیگر، بیشترین تولید آنزیم را در کمترین زمان (چهاردهمین ساعت) از منحنی رشد خود نشان داد و بنابراین به‌عنوان سویۀ اصلی برگزیده شد. تمام مراحل بهینه‌سازی با توجه به بیشترین زمان تولید انجام شد.
جدول 2، میزان آسپاراژیناز تولیدشده توسط مخمر 5S2 و OD سنجیده‌شده با دستگاه اسپکتروفتومتر بر اساس زمان را نشان می‌دهد. باتوجهبه نتایج، بیشترین فعالیت آنزیم در این مخمر پس از 120 ساعت و معادل u/ml 9/3245 اندازه‌گیری شد.
جدول 2- سنجش فعالیت ال-آسپاراژیناز برای مخمر 5S2
Table 2 – L-Asparaginase activity of 5S2 yeast isolate
شکل 5- تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز توسط سویۀ مخمر در محیط‌کشت اختصاصی سیزپکس داکس در مدت زمان -120 ساعت،
دمای 30 درجۀ سانتیگراد و سرعت هوادهی 130 دوردردقیقه
Fig 5 – L-Asparaginase production by yeast isolate after 120 hours at 30°C and 130 RPM of aeration speed
شناسایی مخمر مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز
بررسی ویژگی‌های ظاهری و میکروسکوپی این سویه نشان داد کلنی‌های صاف بزرگ، گرد، سفید یا کرم دارد و نتیجۀ رنگ‌آمیزی گرم نیز سلول‌های ریز کروی، بیضی‌شکل را نشان داد.
تعیین توالی و ثبت نمونه‌ها
پس از انجام تعیین توالی و دریافت فایل مربوطه، توالی مدنظر با نرم‌افزار Choromas ارزیابی و ویرایش شد. قطعۀ 18S-rDNA تکثیرشده توسط سویۀ 5S2 در شکل 6 آورده شده است.
شکل 6- الکتروفورز محصول قطعۀ 655 جفت بازی حاصل از تکثیر ژن کدکننده (ITS4، ITS1) برای سویۀ مخمر 5S2 روی ژل آگارز
1 درصد (M: لدر bp 100).
Fig 6 – Electrophoresis of the product of the 655 bp fragment resulting from amplification of the coding gene (ITS4, ITS1) for yeast strain 5S2 on 1% agarose gel (M: ladder bp 100).
در پژوهش حاضر برای نخستین‌بار، مخمر 5S2 بهمنظور تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز بررسی شد. پس از خوانده‌شدن توالی و دریافت فایل مربوطه، توالی مدنظر با نرم‌افزار Choromas ارزیابی و ویرایش شد. مقایسۀ توالی‌ها با استفاده از سرور BASTN در پایگاه NCBI نشان داد توالی 18S-rDNA سویۀ مخمر 5S2 دارای بیشترین شباهت و پوشش با سویه‌ای از دیویتینا مسروگوسا[13] است. شکل 7، درخت فیلوژنی قطعۀ ترادف‌یابی شدۀ جدایۀ 5S2 را نشان می‌دهد.
پس از بررسی‌های انجام‌شده، این جدایه با نام سویۀ Diutina mesorugosa strain SBG-IAUF-2 با شماره دسترسی MZ901181 در پایگاه اطلاعاتی NCBI به‌عنوان جدایه‌ای جدید در تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز ثبت شد (شکل 5).
شکل 7- درخت فیلوژنی قطعۀ توالی‌یابی‌شده در سویۀ 5S2 گرفته‌شده از پایگاه اطلاعاتی NCBI
Fig 7 - Phylogeny tree of the sequenced fragment in strain 5S2 from NCBI
بهینه‌سازی با استفاده از آزمون آماری RSM
ازآنجاکه تمام بررسی‌های انجام‌شده نشان دادند مخمر 5S2 بهترین فعالیت آنزیمی را دارد، بهینه‌سازی برای نمونۀ 5S2 انجام شد. 49 آزمایشی که با نرم‌افزار Design-Expert، نسخۀ 11 (شرکت Stat-Ease, Inc شهر مینه‌پولیس آمریکا) طراحی شده بودند، انجام شدند و تأثیر 5 فاکتور غلظت‌های مختلف گلوکز (5/1 تا 5/2 درصد) به‌عنوان منبع کربن، ال-آسپاراژین به‌عنوان منبع نیتروژن (6 تا 14 درصد)، دما بین 25 تا 45 درجۀ سانتیگراد، سطوح مختلف اسیدیته و زمان بین 80 تا 160 ساعت در فرایند بهینه‌سازی آنزیم ال-آسپاراژیناز سویۀ 5S2 بررسی شد. بیشترین فعالیت آنزیم
ال-آسپاراژیناز بهینه‌سازی‌شده با شماره آزمایش‌های مربوطه در جدول 3 آورده شده است. بر اساس نتایج، بیشترین فعالیت آنزیم (u/ml 8/1722) در مرحلۀ بهینه‌سازی در آزمون شمارۀ 6 با مقدار گلوکز 2 درصد، اسیدیتۀ 7، زمان 120 ساعت، دمای 35 درجۀ سانتیگراد و ال-آسپاراژین 10 درصد به دست آمد که نشان‌دهندۀ بیشترین مقدار فعالیت آنزیم است.
جدول 3- نتایج حداکثر میزان فعالیت آنزیم ال- آسپاراژیناز در بهینه‌سازی طی 49 آزمایش طراحی شده توسط RSM به ترتیب حداکثر میزان فعالیت آنزیمی
Table 3- The maximum L-asparaginase activity in optimization during 49 experiments designed by RSM
داده‌های به دست آمده از طراحی Burman Plackett یا PBD روی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز توسط سویۀ 5S2 در معرض تحلیل واریانسی ANOVA قرار گرفتند و نرم‌افزار آماری Design Expert 11 (جدول 4)،
تحلیل آماری و آنالیز واریانسی ANOVA نشان‌دهنده اثر هر متغیر در کنار ضریب همبستگی مربوطه یعنی P-value وF-value بودند.
جدول 4- تحلیل آماری و آنالیز واریانس ANOVA در بهینه‌سازی تولید آنزیم ال- آسپاراژیناز توسط سویۀ 5S2
Table 4- Statistical analysis and analysis of variance ANOVA in optimization of L-asparaginase enzyme production by strain 5S2
بر اساس تحلیل رگرسیون (جدول 4) مشخص شد غلظت‌های مختلف ال-آسپاراژین، سطوح مختلف اسیدیته و زمان‌های مختلف، فاکتورهای سیگنال مثبت هستند. مقدار P-value کمتر از 05/0 نشان داد فاکتورهای یادشدۀ مدل معنادار هستند و به‌طور معنا‌داری بر تولید آنزیم اثر می‌گذارند؛ بنابراین، ارتباط بین
ال-آسپاراژین-دما (BE)، ال-آسپاراژین-زمان (BC)، دما-اسیدیته (DE)، گلوکز-دما (AE)، گلوکز-زمان (AC)، گلوکز-اسیدیته (AD) و زمان- اسیدیته (CD) با مقادیر P-value کمتر از 05/0 معنادار است. همچنین مقدار Lack of Fit بیشتر از 05/0 نشان داد عدم‌تناسب بین داده‌ها وجود ندارد.
بیشترین میزان فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز بهینه‌سازی‌شده با شماره آزمایش‌های مربوطه در
جدول 3 آورده شده است. نتایج این بخش نشان دادند بیشترین فعالیت آنزیم طی مرحلۀ بهینه‌سازی، در آزمون شمارۀ 6 با مقدار گلوکز 2 درصد، اسیدیتۀ 7، زمان
120 ساعت، دمای 35 درجۀ سانتیگراد و ال-آسپاراژین
10 درصد به دست می‌آید و فعالیت آنزیمی u/ml 8/1722 حاصل شد که نشان‌دهندۀ بیشترین میزان فعالیت آنزیم است. داده‌های به‌دست‌آمده از طراحی Burman Plackett یا PBD روی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز توسط سویۀ 5S2 در معرض تحلیل واریانسی ANOVA قرار گرفتند و نرم‌افزار آماری Design Expert 11 (جدول 4)، تحلیل آماری و آنالیز واریانسی ANOVA نشان‌دهندۀ اثر هر متغیر در کنار ضریب همبستگی مربوطه یعنی P-value و F-value بودند. بر اساس تحلیل رگرسیون مشخص شد غلظت‌های مختلف
ال-آسپاراژین، سطوح مختلف اسیدیته و زمان‌های مختلف، فاکتورهای سیگنال مثبت هستند. مقدار
P-value کمتر از 05/0 نشان داد فاکتورهای یادشدۀ مدل معنادار هستند و به‌طور معنا‌داری بر تولید آنزیم اثر می‌گذارند؛ بنابراین، ارتباط بین ال-آسپاراژین-دما (BE)، ال-آسپاراژین-زمان (BC)، دما- اسیدیته (DE)، گلوکز-دما (AE)، گلوکز-زمان (AC)، گلوکز-اسیدیته (AD) و زمان-اسیدیته (CD) با مقادیر P-value کمتر از 05/0 معنادار هستند. همچنین مقدار Lack of Fit بیشتر از 05/0 نشان داد عدم تناسب بین داده‌ها وجود ندارد.
شکل 8 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، بررسی دوفاکتوری اثر غلظت‌های مختلف ال-آسپاراژین و اسیدیته بر بهینه‌سازی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2 را نشان می‌دهد. ارتباط بین ال-آسپاراژین-اسیدیته (BD) با مقدار P-value بیشتر از 05/0 معنادار نیست (جدول 4)؛ باوجوداین، منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ‌دهندۀ آنها در منطقۀ بهینه (منطقۀ قرمزرنگ) قرار می‌گیرد. باتوجهبه منحنی ارتباط دوبهدو، این فاکتورها بر میزان بازده تولید آنزیم اثر مستقیم دارند و باتوجهبه اطلاعات جدول 4، این اثر از نظر آماری معنادار نیست.
شکل 8- منحنی سه بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف ال-آسپاراژین و اسیدیته بر بهینه‌سازی تولید ال-آسپاراژیناز از سویه 5S2
Fig 8 -The three-dimensional response surface curve showing the effect of different L-asparagine concentrations and acidity on the optimization of L-asparaginase production from strain 5S2
شکل 9 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، بررسی دوفاکتوری اثر غلظت‌های مختلف ال-آسپاراژین و دما بر بهینه‌سازی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2 را نشان می‌دهد. ارتباط بین ال-آسپاراژین-دما (BE) با مقدار P-value کمتر از 05/0 معنادار است (جدول 4) و منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ‌دهندۀ آنها در منطقۀ بهینه (منطقۀ قرمزرنگ) قرار می‌گیرد. باتوجهبه منحنی ارتباط دوبهدو، این فاکتورها بر میزان بازده تولید آنزیم اثر مستقیم دارند.
شکل 9- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف ال-آسپاراژین و دما بر بهینه‌سازی تولید ال-آسپاراژیناز از سویه 5S2
Fig 9 – The three-dimensional curve of the response surface showing the effect of different concentrations of L-asparagine and temperature on the optimization of L-asparaginase production from strain 5S2
شکل 10 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، بررسی دوفاکتوری اثر غلظت‌های مختلف ال-آسپاراژین و زمان بر بهینه‌سازی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2 را نشان می‌دهد. ارتباط بین ال-آسپاراژین-زمان (BC) با مقدار P-value کمتر از 05/0 معنادار است (جدول 4)؛ باوجود این، منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ‌دهندۀ آنها در منطقۀ بهینه (منطقۀ قرمزرنگ) قرار می‌گیرد. باتوجهبه منحنی ارتباط دوبهدو، این فاکتورها بر میزان بازده تولید آنزیم اثر مستقیم دارند.
شکل 10- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف ال-آسپاراژین و زمان بر بهینه‌سازی تولید ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2
Fig 10 – Three-dimensional response surface curve showing the effect of different concentrations of L-asparagine and time on the optimization of L-asparaginase production from strain 5S2
شکل 11 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، بررسی دوفاکتوری اثر غلظت‌های مختلف دما و اسیدیته در بهینه‌سازی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2 را نشان می‌دهد. ارتباط بین دما و اسیدیته (DE) با مقدار P-value کمتر از 05/0 معنادار است (جدول 4)؛ باوجوداین، منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ‌دهندۀ آنها در منطقۀ بهینه (منطقۀ قرمزرنگ) قرار می‌گیرد. باتوجهبه منحنی ارتباط دوبهدو، این فاکتورها بر میزان بازده تولید آنزیم اثر مستقیم دارند.
شکل 11- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف دما و اسیدیته بر بهینه‌سازی تولید ال-آسپاراژیناز از سویه 5S2
Fig 11 – The three-dimensional curve of the response surface showing the effect of different concentrations of temperature and acidity on the optimization of L-asparaginase production from strain 5S2
شکل 12 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، بررسی دوفاکتوری اثر غلظت‌های مختلف زمان و اسیدیته بر بهینه‌سازی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2 را نشان می‌دهد. ارتباط بین زمان و اسیدیته (CD) با مقدار P-value کمتر از 05/0 معنادار است (جدول 4)؛ باوجوداین، منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ‌دهندۀ آنها در منطقۀ بهینه (منطقۀ قرمزرنگ) قرار می‌گیرد. باتوجهبه منحنی ارتباط دوبهدو، این فاکتورها بر میزان بازده تولید آنزیم اثر مستقیم دارند.
شکل 12- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف زمان و اسیدیته بر بهینه‌سازی تولید ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2
Fig 12 – The three-dimensional curve of the response surface showing the effect of different concentrations of time and acidity on the optimization of L-asparaginase production from strain 5S2
شکل 13 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، بررسی دوفاکتوری اثر غلظت‌های مختلف زمان و دما بر بهینه‌سازی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2 را نشان می‌دهد. ارتباط بین زمان و دما (CE) با مقدار P-value بیشتر از 05/0 معنادار نیست (جدول 4)؛ باوجوداین، منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ‌دهندۀ آنها در منطقۀ بهینه (منطقۀ قرمزرنگ) قرار می‌گیرد. باتوجهبه منحنی ارتباط دوبهدو، این فاکتورها بر میزان بازده تولید آنزیم اثر مستقیم دارند و باتوجهبه اطلاعات جدول 4، این اثر از نظر آماری معنادار نیست.
شکل 13- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف زمان و دما بر بهینه‌سازی تولید ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2
Fig 13 – The three-dimensional curve of the response surface showing the effect of different concentrations, time, and temperature on the optimization of L-asparaginase production from strain 5S2
شکل 14 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، بررسی دوفاکتوری اثر غلظت‌های مختلف گلوکز و
ال-آسپاراژین بر بهینه‌سازی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2 را نشان می‌دهد. ارتباط بین گلوکز و
ال-آسپاراژین (AB) با مقدار P-value بیشتر از 05/0 معنادار نیست (جدول 4)؛ باوجوداین، منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ‌دهندۀ آنها در منطقۀ بهینه (منطقۀ قرمزرنگ) قرار می‌گیرد. باتوجهبه منحنی ارتباط دوبهدو، این فاکتورها بر میزان بازده تولید آنزیم اثر مستقیم دارند و باتوجهبه اطلاعات جدول 4، این اثر از نظر آماری معنادار نیست.
شکل 14- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف گلوکز و ال-آسپاراژین بر بهینه‌سازی تولید ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2
Fig 14 – The three-dimensional curve of the response surface showing the effect of different concentrations of glucose and L-asparagine on the optimization of L-asparaginase production from strain 5S2
شکل 15 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، بررسی دوفاکتوری اثر غلظت‌های مختلف گلوکز و اسیدیته بر بهینه‌سازی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2 را نشان می‌دهد. ارتباط بین گلوکز و اسیدیته (AD) با مقدار P-value کمتر از 05/0 معنادار است (جدول 4)؛ باوجوداین، منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ‌دهندۀ آنها در منطقۀ بهینه (منطقۀ قرمزرنگ) قرار می‌گیرد. باتوجهبه منحنی ارتباط دوبهدو، این فاکتورها بر میزان بازده تولید آنزیم اثر مستقیم دارند.
شکل 15- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف گلوکز و اسیدیته بر بهینه‌سازی تولید ال-آسپاراژیناز از سویه 5S2
Fig 15 – Three-dimensional response surface curve showing the effect of different concentrations of glucose and acidity on the optimization of L-asparaginase production from strain 5S2
شکل 16 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، بررسی دوفاکتوری اثر غلظت‌های مختلف گلوکز و دما بر بهینه‌سازی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2 را نشان می‌دهد. ارتباط بین گلوکز و دما (AE) با مقدار
P-value کمتر از 05/0 معنادار است (جدول 4)؛ باوجوداین، منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ‌دهندۀ آنها در منطقۀ بهینه (منطقۀ قرمزرنگ) قرار می‌گیرد. باتوجهبه منحنی ارتباط دوبهدو، این فاکتورها بر میزان بازده تولید آنزیم اثر مستقیم دارند.
شکل 16- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف گلوکز و دما بر بهینه‌سازی تولید ال-آسپاراژیناز از سویه 5S2
Fig 16 – The three-dimensional response surface curve showing the effect of different glucose concentrations and temperatures on the optimization of L-asparaginase production from strain 5S2
شکل 17 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، بررسی دوفاکتوری اثر غلظت‌های مختلف گلوکز و زمان در بهینه‌سازی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2 را نشان می‌دهد. ارتباط بین غلظت‌های مختلف گلوکز و زمان (AC) با مقدار P-value کمتر از 05/0 معنادار است (جدول 4)؛ باوجوداین، منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ‌دهندۀ آنها در منطقۀ بهینه (منطقۀ قرمزرنگ) قرار می‌گیرد. باتوجهبه منحنی ارتباط دوبهدو، این فاکتورها بر میزان بازده تولید آنزیم اثر مستقیم دارند.
شکل 17- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف گلوکز و زمان بر بهینه‌سازی تولید ال-آسپاراژیناز از سویۀ 5S2
Fig 17 – Three-dimensional response surface curve showing the effect of different glucose concentrations and time on the optimization of L-asparaginase production from strain 5S2
شکل 18 (منحنی دوبعدی سطح پاسخ)، فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز را بر اساس سطوح مختلف فاکتورهای ال-آسپاراژیناز، دما، زمان، گلوکز و اسیدیته نشان می‌دهد. ازآنجاکه این منحنی در ناحیۀ بهینه (ناحیۀ قرمزرنگ) قرار گرفته است، مخمر 5S2 در این بخش از بهینه‌سازی، بیشترین میزان فعالیت را در غلظت گلوکز
2 درصد، ال-آسپاراژیناز 10 گرمبرلیتر، زمان
120 ساعت، دمای 37 درجۀ سانتیگراد و اسیدیتۀ 7 نشان می‌دهد.
شکل 18- منحنی دوبعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف گلوکز، ال-آسپاراژین، دما، زمان و اسیدیته بر بهینه‌سازی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2
Fig 18 – Two-dimensional response surface curve showing the effect of different concentrations of glucose,
L-asparagine, temperature, time and acidity on the optimization of L-asparaginase enzyme production
from 5S2 yeast
بهینه‌سازی منبع نیتروژن روی فعالیت آنزیمی
شکل 19 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، تأثیر غلظت‌های مختلف تک‌فاکتور ال-آسپاراژین بر تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2را نشان می‌دهد. در این منحنی، هرچه شیب خط فاکتوری بیشتر باشد، تأثیر آن فاکتور بر پاسخ و تولید آنزیم بیشتر را نشان می‌دهد و هرچه شیب خط ملایم‌تر باشد، نشان‌دهندۀ تأثیر کمتر آن فاکتور بر پاسخ است. در این آزمون، در شرایطی که غلظت گلوکز (2 گرمبرلیتر)، دما (35 درجۀ سانتیگراد)، اسیدیته 7 و زمان (120 ساعت) برابر مقادیر واقعی در نظر گرفته شود، بیشترین فعالیت آنزیمی در غلظت
10 گرمبرلیتر فاکتور ال-آسپاراژین مشاهده می‌شود؛ بنابراین، این غلظت می‌تواند غلظت بهینه برای تولید آنزیم توسط مخمر 5S2 معرفی شود.
شکل 19- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف ال-آسپاراژین در بهینه‌سازی روی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2
Fig 19 – The three-dimensional curve of the response surface showing the effect of different concentrations of
L-asparagine in optimizing the production of L-asparaginase enzyme from 5S2 yeast.
بهینه‌سازی اسیدیتۀ اولیۀ محیط تولید آنزیم
شکل 20 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، تأثیر مقادیر مختلف تک‌فاکتور اسیدیته بر تولید آنزیم
ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2را نشان می‌دهد. در این آزمون، در شرایطی که غلظت گلوکز (2 گرمبرلیتر)، دما (35 درجۀ سانتی گراد)، غلظت ال-آسپاراژین
(10 گرمبرلیتر) و زمان (120 ساعت) برابر مقادیر واقعی در نظر گرفته شود، بیشترین فعالیت آنزیمی در اسیدیتۀ 7 مشاهده می‌شود؛ درنتیجه، این مقدار می‌تواند مقدار بهینۀ اسیدیته برای تولید آنزیم توسط مخمر 5S2 معرفی شود.
شکل 20- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر مقادیر مختلف اسیدیته در بهینه‌سازی روی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2
Fig 20 – The three-dimensional curve of the response surface showing the effect of different amounts of acidity in optimization on the production of L-asparaginase enzyme from 5S2 yeast.
بهینه‌سازی دما روی فعالیت آنزیمی
منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ شکل 21 تأثیر مقادیر مختلف تک‌فاکتور دما بر تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2را نشان می‌دهد. در این آزمون، در شرایطی که غلظت گلوکز (2 گرمبرلیتر)، اسیدیتۀ 7، غلظت
ال-آسپاراژین (10 گرمبرلیتر) و زمان (120 ساعت) برابر مقادیر واقعی در نظر گرفته شود، بیشترین فعالیت آنزیمی در دمای 35 درجۀ سانتیگراد مشاهده می‌شود؛ درنتیجه، این مقدار می‌تواند مقدار بهینۀ دما برای تولید آنزیم توسط مخمر 5S2 معرفی شود.
شکل 21- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر مقادیر مختلف دما در بهینه‌سازی روی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2
Fig 21 – Three-dimensional response surface curve showing the effect of different temperature values in optimization on the production of L-asparaginase enzyme from 5S2 yeast.
بهینه‌سازی زمان روی فعالیت آنزیمی
شکل 22 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، تأثیر مقادیر مختلف تک‌فاکتور زمان بر تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2را نشان می‌دهد. در این آزمون، در شرایطی که غلظت گلوکز (2 گرمبرلیتر)، دما (35 درجۀ سانتی گراد)، اسیدیته 7، غلظت ال-آسپاراژین
(10 گرمبرلیتر) و زمان (120 ساعت) برابر مقادیر واقعی درنظر گرفته می‌شود، بیشترین فعالیت آنزیمی در زمان برابر120 ساعت مشاهده می‌شود؛ بنابراین، مقدار یادشده می‌تواند مقدار بهینۀ زمان برای تولید آنزیم توسط مخمر 5S2 معرفی شود.
شکل 22- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر مقادیر مختلف زمان در بهینه‌سازی روی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2
Fig 22 – Three-dimensional curve of the response surface showing the effect of different amounts of time in optimization on the production of L-asparaginase enzyme from 5S2 yeast.
بهینه‌سازی منبع کربن برای بررسی تولید آنزیم
نتایج نشان دادند این سویه در تمام منابع کربنی آزمایش‌شده قـادر بـه رشـد است و فعالیـت آنزیمـی دارد، اما بیشترین فعالیت آنزیمی در محیط حاوی نشاسته و کمترین فعالیت آنزیمی در حضور مالتوز مشاهده می‌شود. بهترین درصد نشاسته برای بیشترین فعالیت آنزیمی در مقدار
9/1 درصد نشاسته به دست آمد و میزان فعالیت آنزیمی اختصاصی 567/7 واحد بر میلی‌گرم پروتئین محاسبه شد. شکل‌های 3 و 4 به ترتیب بهینه‌سازی منابع مختلف کربنی و بهینه‌سازی درصدهای مختلف بهترین منبع کربنی (نشاسته) را نشان می‌دهند.
شکل 23 (منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ)، تأثیر غلظت‌های مختلف تک‌فاکتور گلوکز روی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2 را نشان می‌دهد. در این آزمون، در شرایطی که زمان
(120 ساعت)، دما (35 درجۀ سانتیگراد)، اسیدیته 7، غلظت ال-آسپاراژین (10 گرمبرلیتر) برابر مقادیر واقعی در نظر گرفته می‌شود، بیشترین فعالیت آنزیمی در غلظت گلوکز برابر با
2 گرمبرلیتر مشاهده می‌شود؛ بنابراین، غلظت یادشده می‌تواند غلظت بهینۀ گلوکز برای تولید آنزیم توسط مخمر 5S2 معرفی شود.
شکل 23- منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف گلوکز در بهینه‌سازی روی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2
Fig 23 – Three-dimensional response surface curve showing the effect of different glucose concentrations in optimization on the production of L-asparaginase enzyme from 5S2 yeast.
منحنی سه‌بعدی سطح پاسخ تأثیر فاکتورهای مختلف روی تولید آنزیم ال-آسپاراژینار در شکل 24 آورده شده است. هرچه شیب خط فاکتوری بیشتر باشد، تأثیر آن فاکتور بر پاسخ و تولید آنزیم بیشتر و هرچه شیب خط ملایم‌تر باشد، تأثیر آن فاکتور بر پاسخ کمتر است. در این آزمون، فاکتور C که نشان‌دهندۀ زمان است، شیب خط بیشتری نسبت به سایر فاکتورها داشت؛ بنابراین، فاکتور زمان تأثیرگذاری بیشتری روی تولید آنزیم دارد.
شکل 24- منحنی سه‌بعدی تأثیر فاکتورهای نشان‌دهندۀ اثر غلظت‌های مختلف گلوکز، ال-آسپاراژین، دما، زمان و اسیدیته در بهینه‌سازی روی تولید آنزیم ال-آسپاراژیناز از مخمر 5S2
Fig 24 – The three-dimensional curve of the effect of factors showing the effect of different concentrations of glucose, L-asparagine, temperature, time, and acidity in optimizing the production of L-asparaginase enzyme from 5S2 yeast
در شکل 25، حداکثر مقادیر پیش‌بینی‌شدۀ تولید آنزیم در بهینه‌سازی توسط نرم‌افزار آورده شده است. بیشترین میزان فعالیت آنزیم در مرحلۀ بهینه‌سازی که نرم‌افزار پیش‌بینی کرد، در غلظت گلوکز
07/2 گرمبرلیتر، ال-آسپاراژین 06/10 گرمبرلیتر، زمان 99/119 ساعت، اسیدیتۀ 7 و دمای 35 درجۀ سانتیگراد برابر با u/ml 77/1717 بود؛ از سویی، حداکثر میزان فعالیت آنزیم در آزمایش‌های طراحی‌شده در شرایط مشابه طی آزمایش‌های شمارۀ 6 و 1 به‌ترتیب برابر با u/ml 8/1722 و u/ml 54/1719 بود (جدول 3)؛ درنتیجه، این نتایج و نتایج پیش‌بینی‌شده توسط RSM به‌طور تقریبی با یکدیگر مطابقت دارند.
در شکل 26، بررسی مقایسه‌ای مقادیر واقعی و مقادیر پیش‌بینی‌شده با نرم‌افزار نشان داده شده است. همان‌طور که در این شکل مشاهده می‌شود، هرچه قدر نتایج آزمایش‌ها و مقادیر پیش‌بینی‌شده با نرم‌افزار روی خط مورب قرار گرفته باشند و با یکدیگر مطابقت داشته باشند، نشان‌دهندۀ درستی آزمایش‌های انجام‌شده است.
شکل 25- پیش‌بینی‌های انجام‌شده توسط نرم‌افزار RSM برای میزان فعالیت آنزیم در بهینه‌سازی
Fig 25 – Predictions made by RSM software for the amount of enzyme activity in optimization
شکل 26- بررسی مقادیر واقعی در برابر مقادیر پیش‌بینی‌شده در بهینه‌سازی
Fig 26 – Checking the actual values against he predicted values in the optimization
بحث و نتیجه‌گیری
پارامترهای بسیاری بر تولید و فعالیت آنزیم تأثیر می‌گذارند. در آزمایش جاضر، بر اساس منابع موجود در محیط‌کشت تشخیص کمی فعالیت آنزیم 5 متغیر غلظت‌های مختلف گلوکز (5/1 تا 5/2 درصد) به عنوان منبع کربن، محدوده‌ی pH بین 5 تا 9، ال-آسپاراژین به عنوان منبع نیتروژن (6 تا 14 درصد)، دما بین 25 تا
45 درجه سانتیگراد و زمان بین 80 تا 160 ساعت به عنوان فاکتورها در فرآیند بهینه‌سازی با روش سطح پاسخ (RSM) به کار برده شدند.
در بررسی حاضر با استفاده از نتایج بهینه‌سازی تک‌فاکتوره، بهمنظور افزایش فعالیت آنزیم سویۀ 5S2، 49 آزمایش با استفاده از روش سطح پاسخ (RSM) طراحی شد و غلظت‌های مختلف 5 فاکتور یادشده بررسی و بهینه‌سازی شدند. نتایج نشان دادند بیشترین فعالیت آنزیم در آزمایش شمارۀ 6 (جدول 3) به دست می‌آید. مطابق شکل 6، منحنی سطح پاسخ فعالیت آنزیم در ناحیۀ قرمز رنگ قرار دارد و به نقطۀ بهینه‌سازی رسیده است.
در این بخش از بهینه‌سازی، بیشترین میزان فعالیت آنزیم ال- آسپاراژیناز به‌دست‌آمده از سویۀ 5S2 در اسیدیتۀ 7 مشاهده شد. در اسیدیته‌های قلیایی یا اسیدی، فعالیت آن کاهش یافت و نسبت به شرایط قلیایی و اسیدی حساس بود. آنزیم تولیدشده توسط سویۀ یادشده نسبت به حرارت حساس بود؛ به‌طوری‌که در دمای 35 درجۀ سانتیگراد، بیشترین میزان فعالیت آنزیم مشاهده و در دمای 45 درجۀ سانتیگراد، فعالیت آنزیم کاهش چشم‌گیری داشت. میزان گلوکز و ال-آسپاراژیناز نیز بر تولید آنزیم تأثیر داشتند، به‌طوری‌که در میزان متوسط آنها، بهترین تولید آنزیم انجام شد. زمان نیز از دیگر فاکتورهایی است که در تولید آنزیم تاثیر داشت و طبق شکل 12 و شیب خط، زمان مهم‌ترین و تأثیرگزارترین فاکتور روی تولید آنزیم بود.
بنابراین سویۀ قارچی 5S2 جداسازی‌شده بیشترین میزان فعالیت آنزیم ال- آسپاراژیناز را در دمای 35 درجۀ سانتیگراد، مدت زمان گرماگذاری 120 ساعت، اسیدیتۀ 7، 10 درصد ال-آسپاراژین و 2 درصد گلوکز به‌عنوان منبع کربن داشت و فعالیت آنزیم u/ml 8/1722 تعیین شد.
در پژوهش حاضر با استفاده از سویۀ مخمری 5S2 جداسازی‌شده از خاک بازار ماهی، آنزیم
ال-آسپاراژیناز تولید و آنزیم به روش سطح پاسخ بهینه و فعالیت آن افزایش یافت. باتوجهبه استقبال روزافزون صنایع مختلف ازجمله صنایع فراورده‌های مواد غذایی و نانوایی، نتایج پژوهش حاضر کاربردهای گوناگونی خواهد داشت. نتایج پژوهش حاضر در بخش میزان فعالیت آنزیم تولیدشده قابل مقایسه با پژوهش‌های پیشین است. باتوجهبه اینکه میزان تولید آنزیم در فرایند بهینه‌سازی افزایش یافت، پیشنهاد می‌شود با بهینه‌سازی شرایط تولید آنزیم، میزان تولید آنزیم توسط سویه مخمری افزایش یابد.
[1] Aspartic acid
[2] Ammonia
[3] Streptomyces gulbargensis
[4] Enterobacter cloacae
[5] Serratia marcescens
[6] Escherichia coli
[7] Erwinia caratovora
[8] Bacillus
[9] Saccharomyces cerevisiae
[10] Candida
[11] Czapex Dox’s medium
[12] Nessler's reagent
[13] Diutina mesorugosa
degradation studies. Bioresource technology, 2012 Dec 1;125:11-6. https://doi.org/ 10.1016/j.biortech.2012.08.086
)