نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی ، واحد لاهیجان ، لاهیجان ، ایران
2 داشکده علوم پایه داشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان،گروه میکروبیولوژی
3 آزمایشگاه تحقیقاتی نانو ، دانشکده علوم پایه،دانشگاه آزاد اسلامی ، واحد لاهیجان، لاهیجان ،ایران
4 گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه ، دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان ،لاهیجان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
The development of rapid and highly sensitive diagnostic methods has received significant attention. Enzymatic nanobiosensors are a promising approach, offering fast results based on specific interactions between nanoparticles, enzyme, and target molecules. This study investigated the potential of ZnO nanoparticles, SnO, and multiwall carbon nanotubes (MWCNTs) as marker molecules in a system using beta-galactosidase enzyme for bacterial detection. Following nanoparticle synthesis, their structure was confirmed using XRD, FTIR, UV-DRS analyses. Enzyme activity was evaluated in the presence of the substrate ONPG. Different nanoparticle concentrations were tested with a constant amount of enzyme to determine the optimal concentration for inhibiting lactase activity. Subsequently, varying concentrations of Escherichia coli were introduced, and the ability of each nanoparticle type to detect bacteria was compared. Due to their small size, high surface area, and strong reactivity, these nanomaterials demonstrated the potential to detect low bacterial concentrations in the environment.Bacteria likely attached to the nanoparticles, hindering their intraction with the enzyme and consequently affecting enzyme activity. The results revealed MWCNTs to be most effective for bacterial identification, detecting as low as 10 CFU/mL bacteria within 15 min. This approach has promising applications in the food industry for rapid detection of low-level bacterial contamination.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
بیمارگرهای میکروبی در چند دهه گذشته، عامل بسیاری از عفونت‌ها، بیماری‌ها و حتی مرگ‌و‌میر در سراسر دنیا بوده‌اند. این امر، آسیب‌های جبران‌ناپذیری به سلامت عمومی وارد کرده است (1، 2). به همین دلیل، تشخیص و شناسایی عوامل میکروبی در زمینه‌های پزشکی، صنایع غذایی و محیط زیست بسیار مهم است (3). استفاده از روش‌های سنتی در تشخیص آلودگی‌های میکروبی، حساس، ارزان و در عین حال بسیار وقت‌گیر است (4). این روش‌ها شامل کشت در پلیت، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز[1]، کروماتوگرافی[2]، کمی لومیننس[3]، اسپکتروسکوپی جرمی و الایزا [4]هستند که به ابزارها و تنظیمات آزمایشگاهی پیشرفته وابسته‌اند (5). اشرشیا کلای شاخصی از آلودگی میکروبی است که به راحتی در غذاهایی مانند گوشت خوک، گاو و مرغ یافت می‌شود. شناسایی و اندازه‌گیری اشریشیا کلای در منابع آبی، برای ردیابی آلودگی مدفوعی با منشأ انسانی و حیوانی و به حداقل رساندن شیوع بیماری‌های عفونی ازجمله اسهال خونی، نارسایی کلیه و تشخیص آن در صنعت مواد غذایی به‌عنوان یکی از معیارهای بهداشتی مطرح است؛ زیرا ممکن است در صورت درمان‌نشدن به مرگ منجر شود (6)؛ بنابراین، شناسایی این باکتری، به‌ویژه در مواردی که غلظت آن در نمونه ناچیز است، به روش‌هایی با دقت و سرعت بالاتر نیاز دارد.
پیشرفت‌های اخیر در نانوتکنولوژی، به توسعه و پیدایش سیستم‌های تشخیصی جدید با حساسیت و اختصاصیت بالا برای شناسایی عوامل بیماری‌زا منجر شده است؛ ازجمله بیوسنسورها که می‌توانند آلودگی میکروبی را در مواد غذایی، طی یک دوره کوتاه، براساس واکنش‌های آلی پیشرفته تشخیص دهند (7، 8). بیوسنسورها، ابزارهای تحلیلی‌اند که از دقت بالا برخوردارند و عوامل محیطی نظیر دما و pH بر آنها تأثیری ندارند (9).
جفت‌شدن مولکول‌های تشخیصی و انتقال‌دهنده، اغلب یک مرحله اصلی و تعیین‌کننده در سنسورها بوده است که می‌تواند با واسطه به دام‌اندازی غشایی، جذب فیزیکی، به دام انداختن ماتریکسی یا اتصال کوالانی با سایر اجزا انجام شود (10، 11). بیوسنسورها شامل دو جزء اصلی هستند که در نزدیکی هم واقع شده‌اند: یک عامل تشخیصی که قادر به واکنش با مولکول هدف بوده است و یک انتقال‌دهنده که این واکنش را به یک سیگنال قابل اندازه‌گیری تبدیل می‌کند (12). در بیوسنسورها معمولاً از آنزیم‌ها استفاده می‌شود؛ زیرا اختصاصیت بالا دارند. درواقع به‌کارگیری بیوسنسورها نیازمند یک سیستم آنزیمی ثابت‌شده با فعالیت بالا است که به حفظ اتصال مناسب بین مولکول هدف و بخش انتقال‌دهنده کمک می‌کند (13). ازجمله آنزیم‌های تشخیصی، آنزیم بتاگالاکتوزیداز است که یک آنزیم هیدرولیزکننده است و سبب شکسته‌شدن لاکتوز به گلوکز و گالاکتوز می‌شود. این آنزیم از قارچ‌ها (مانند آسپرژیلوس اریزا و آسپرژیلوس نایجر)، مخمرها (مانند کلوورومایسس نایجر و کلوورومایسس فراجیلیس)، باکتری‌ها (مانند اشرشیا کلای، لاکتوباسیلوس ترموفیلس و باسیلوس سرکولانس)، گیاهان و جانوران به‌صورت نوترکیب به دست می‌آید (14). ایموبلیزه‌کردن این آنزیم‌ها در بیوسنسورها سبب بهبود مقاومت و استفاده مجدد از آنها می‌شود. این امر از طریق جذب با واسطه سطوح آلی و غیرآلی، اتصال کوالانتی و تجمع شیمیایی، میکروانکپسوله‌کردن و به دام انداختن صورت می‌گیرد (15). ازجمله روش‌های ایموبلیزه‌کردن، استفاده از نانوساختارها است که نسبت سطح به حجم بالا دارد و این ویژگی سبب بالابردن حساسیت در شناسایی مولکول هدف می‌شود؛ زیرا سطح وسیع‌تری در اتصال آنزیم به ماتریکس دخالت می‌کند و از واسرشت‌شدن پروتئین جلوگیری می‌کند و انعطاف‌پذیری بیشتری به فعالیت آنزیمی می‌بخشد (16). در سال‌های اخیر، نانوذرات مغناطیسی توجه زیادی را به خود جلب کرده‌اند. ازجمله نانوذرات اکسید روی که با گاف انرژی برابر با eV 37/3، خاصیت نیمه‌رسانایی، مساحت سطحی بالا، ویژگی‌های پیزوالکتریک و پیروالکتریک، نقش مهمی در سنسورهای نوری و مکانیکی دارند. نانوساختارهای اکسید روی علاوه بر سازگاربودن با محیط، غیرسمی‌بودن و داشتن پایداری شیمیایی، ویژگی‌های بیومتریک و انتقال الکترونی بالا را نیز نشان می‌دهند (17). اکسید قلع یک اکسید فلزی نیمه‌رسانای اِن-تایپ با یک گاف انرژی وسیع است که کاربردهای فراوان در زمینه‌های سنجش گاز و انرژی خورشیدی دارد. چند منظوره بودن کاربرد نانوساختارهای SnO2 به‌علت مساحت سطحی بالا، شکاف باند بزرگ، نیمه‌رسانایی بالا به اندازه meV130 در دمای اتاق (K 300)، مقاومت چشمگیر در برابر تغییرات در محیط گازی، ثبات مکانیکی، حرارتی، شیمیایی و غیره است (18، 19). در میان تمامی نانوساختارها، نانولوله‌های کربنی (CNTs) توجه بسیاری از متخصصان آنزیمولوژی را به خود معطوف کرده است و این امر به‌دلیل ویژگی‌های منحصربه‌فرد آنهاست که شامل مساحت سطحی بالا، مقاومت دمایی و مکانیکی زیاد، توزیع منظم منفذ با اندازه مناسب، ظرفیت جذبی بالا و نفوذپذیری کنترل‌شده برای انتشار آزادانه سوبستراها و محصولات واکنش‌دهنده است. علاوه بر این، ویژگی‌های الکتریکی فوق‌العاده، سازگاری زیستی عالی، حساسیت و دقت بیشتر، محدودیت‌های کمتر در آشکارسازی و ترابرد یا انتقال الکترونی سریع‌تر، آنها را در زمینه‌های زیست پزشکی کاربردی می‌کند (20).
هدف پژوهش حاضر، تبیین یک روش حساس برای پایش اشرشیا کلای مبتنی بر نانوساختارهای اکسید روی، اکسید قلع و نانولوله‌های کربنی ساده و عامل‌دار است.
مواد و روش‌ها
از زینک استات دی‌هیدرات (108802cat.no.)، متانول (106007cat. No.) و دی‌اتانول آمین (803116cat. no.) برای سنتز نانوذرات اکسید روی و از تین کلراید دی‌هیدرات (107815cat. no.)، اتانول (102371cat. no.) و اتیلن گلیکول (100949cat. no.) برای سنتز نانوذرات اکسید قلع استفاده شد که از شرکت مرک آلمان خریداری شدند. نانولوله‌های کربنی چند دیواره ساده و عامل‌دار (کربوکسیله) از شرکت نانوبازار و بتاگالاکتوزیداز (cat. no. N1127)، گلوتارآلدهید (cat. no. 354400) و اورتو-نیتروفنیل-بتاگالاکتوزیداز (cat. no. 48277) از شرکت سیگما الدریچ آمریکا خریداری شدند. برای رشد باکتری‌ها از محیط‌های کشت EMB آگار (cat. no. 1.01347)، LB براث (cat. no.1.10285) و LB آگار (cat. no. 1.10283) استفاده شد که از شرکت مرک خریداری شدند.
سنتز نانوذرات اکسید روی: به روش سُل-ژل انجام شد (21). ابتدا 5/2 گرم پیش‌ماده روی (Zn) یعنی استات روی دوآبه در 30 میلی‌لیتر حلال متانول اضافه شد. محلول به‌دست‌آمده در دمای اتاق به کمک همزن مغناطیسی به مدت 30 دقیقه مخلوط شد تا استات روی به خوبی در متانول حل شود. پس از آن، به‌منظور افزایش چسبندگی سُلِ تهیه‌شده و نیز انجام فرایند ژلاسیون از 1 میلی‌لیتر پایدارساز دی‌اتانول آمین، استفاده و با همزن مغناطیسی به مدت یک ساعت مخلوط شد و فرایند حلالیت به خوبی صورت گرفت و سُل شفاف و بدون رنگ به دست آمد. برای پیشرفت فرایند هیدرولیز و پیش‌آغاز ژلاسیون، محلول به‌دست‌آمده به مدت 24 ساعت در دمای اتاق نگهداری شد. سپس داخل بوته‌چینی ریخته و در کوره پس از رسیدن به دمای 550 درجه سانتی‌گراد به مدت دو ساعت حرارت داده شد. پس از عمل پخت در کوره، نانوپودرهای سفید رنگ ZnO به دست آمد.
سنتز نانوذرات اکسید قلع: از روش سُل-ژل استفاده شد (22). ابتدا مقدار 4/3 گرم از پیش‌ماده اکسید قلع وزن شد و به 30 میلی‌لیتر اتانول افزوده و به مدت 30 دقیقه استیرر شد. سپس مقدار 3 میلی‌لیتر اتیلن گلیکول به آن اضافه شد و بار دیگر به مدت 2 ساعت روی استیرر قرار گرفت. در مرحله بعد، به مدت 5 ساعت در دمای 80 درجه سانتی‌گراد ریفلاکس شد. در نهایت، به مدت 30 دقیقه در دمای 450 درجه سانتی‌گراد کوره‌گذاری شد.
آنالیز نانوذرات: برای انجام آنالیز XRD، مقدار 1/0 میلی‌گرم از نانوپودر به‌صورت یک قرص نازک درآورده شد و در جا نمونه‌ای تحت تابش پرتوی X در محدوده 10<2θ<94 قرار گرفت (23). مطالعه بیناب‌نگاری (FTIR) نانوپودرها به‌منظور بررسی تغییرات درون ساختاری و همچنین وجود مولکول‌های آب در درون ساختار صورت گرفت. ابتدا 15-5 میلی‌گرم نانوپودر با 400 میلی‌گرم از KBr خالص و خشک مخلوط شد تا به‌صورت پودر نرم و یکنواخت درآید و با فشار زیاد به یک قرص نازک و شفاف تبدیل شد. سپس قرص در مقابل تابش اشعه مادون قرمز در محدوده طول موج‌های 4000-400 نانومتر قرار داده شد تا تغییرات درون ساختاری نانوپودر سنتزشده آشکار شود (24). همچنین آنالیز جذب UV با استفاده از دستگاه اندازه‌گیری اسپکتروفتومتر مدل UV-2550 ساخت شرکت Shimadzu ژاپن انجام شد. به این ترتیب که از نمونه‌های پودری به همراه ماده مرجع (سولفات باریم) به نسبت 1:10، قرصی به ضخامت کمتر از 5/1 میلی‌متر ساخته شد و تحت تابش نور قرار گرفت. برای هر نمونه، طیف‌های بازتاب / عبور پخشی در ناحیه 300 تا 900 نانومتر اندازه‌گیری شدند (25).
آماده‌سازی نانوذرات اکسید روی و اکسید قلع: از هرکدام از نانوپودرهای اکسید روی و اکسید قلع پس از توزین‌کردن به مقدار 06/0 میلی‌گرم، در 6 میلی‌لیتر آب مقطر استریل ریخته و برای دستیابی به هموژنیزه‌کردن بیشتر، مخلوط به مدت زمان 60 دقیقه روی همزن برقی (استیرر) قرار داده شد؛ بدین ترتیب، غلظت 001/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر (mg/ml) به دست آمد (26).
فعال‌کردن نانولوله‌های کربنی ساده و عامل دار: ابتدا یک کاغذ صافی روی یک بشر قرار داده و یک گرم از نانولوله‌های کربنی ساده و عامل‌دار به کاغذ اضافه شد و پس از دو بار شست‌وشو با آب مقطر، به مدت 10 دقیقه در rpm2000 سانتریفیوژ شدند. سپس محتویات لوله درون گلوتار آلدهید 5/0 مولار در rpm 150 توزین شدند و به مدت 6 ساعت روی استیرر قرار گرفتند. پس از این مدت، بار دیگر به مدت 10 دقیقه در rpm 2000 سانتریفیوژ شدند. سپس محتویات لوله با آب مقطر دو بار شست‌وشو داده شد تا بقایای گلوتار آلدهید متصل‌نشده از محیط خارج شوند. در نهایت، نانولوله‌های کربنی فعال‌شده با بافر پتاسیم فسفات (7=pH ، 1/0 مولار) شست‌وشو داده و درون بافر در دمای 4 درجه سانتی‌گراد تا زمان انجام آزمون نگهداری شدند. برای تهیه غلظت 001/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر (mg/ml)، مقدار 06/0 میلی‌گرم از نانولوله‌های کربنی فعال به 6 میلی‌لیتر از بافر پتاسیم فسفات اضافه شد ( 27-30).
سنجش فعالیت آنزیمی: فعالیت یک واحد (U1) از آنزیم بتاگالاکتوزیداز به مقداری از آنزیم گفته می‌شود که یک میکرومول از ONPG را در هر دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و در 7 pH= تجزیه کند که براساس روش ارجاع داده شده از شرکت سیگما آلدریچ انجام شد (31). مطابق با پروتوکل شرکت سیگما آلدریچ برای هر مرحله از خواندن جذب، ابتدا در هر کووت طبق جدول 1، واکنشگرهای A(بافر فسفات 100 میلی‌مولار با 7=pH)، C (محلول 30 میلی‌مولار سدیم کلراید)، D (محلول 36/3 میلی‌مولار مرکاپتو اتانول) و E (محلول حاوی U/ml 2 آنزیم بتاگالاکتوزیداز) افزوده شدند. سپس در یک دستگاه اسپکتروفتومتر، دما در 37 درجه سانتی‌گراد و طول موج در 405 نانومتر تنظیم شد و پس از ثابت‌شدن، از واکنشگر B (محلول 68 میلی‌مولار ONPG) بر طبق جدول در هر کووت و در شاهد اضافه شد. حجم کل 200 میکرولیتر در نظر گرفته شد. مواد حاصل بلافاصله مخلوط شدند و جذب در طول موج 405 نانومتر ثبت شد. از آنجایی که این آنزیم وقتی رقیق می‌شود از مقاومت کمی برخوردار است، بلافاصله آزمون شد. تمامی واکنش‌ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 7pH= انجام شدند.
جدول 1- مقادیر افزوده شده از واکنشگرهای A تا E برای سنجش فعالیت بتاگالاکتوزیداز
Table 1- Added values of reactants (A-E) for beta galactosidase activity
|
ماده |
مقدار (میکرولیتر) |
شاهد |
||||||||||||
|
واکنشگر A(بافر) |
160 |
150 |
140 |
130 |
120 |
110 |
100 |
90 |
80 |
70 |
60 |
50 |
40 |
170 |
|
واکنشگر B (ONPG) |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
|
واکنشگر C (سدیم کلراید) |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
|
واکنشگر D (مرکاپتو اتانول) |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
|
واکنشگر E (آنزیم بتاگالاکتوزیداز) |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
110 |
120 |
130 |
- |
سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانوذره: سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز به‌طور جداگانه در حضور هریک از نانوذرات مطالعه‌شده انجام شد؛ به این ترتیب که درون پلیت 96 خانه‌ای، مقادیر مختلف (10 تا 120 میکرولیتر) از نانوذره با غلظت 001/0 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و مقدار ثابتی از آنزیم بتاگالاکتوزیداز (60 میکرولیتر) اضافه شد. سپس با بافر پتاسیم فسفات به حجم 200 میکرولیتر رسیدند. پلیت‌ها در دمای ثابت 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 30 دقیقه برای اتصال آنزیم انکوبه شدند. بعد از گذشت این مدت زمان به هریک از خانه‌ها مقدار ثابتی از ONPG (10 میکرولیتر) افزوده شد. سپس هر ۲۰ ثانیه جذب هریک از خانه‌ها در طول موج 405 نانومتر به مدت 30 دقیقه در دستگاه میکروپلیت ریدر (شرکت واریان استرالیا) ثبت شد (جدول 2). مقداری از نانوذره که سبب مهار فعالیت آنزیم شد، انتخاب و برای مرحله شناسایی و تشخیص باکتری استفاده شد (32-35).
جدول 2- مقادیر افزوده‌شده از واکنشگرها برای سنجش فعالیت بتاگالاکتوزیداز در حضور نانوذره
Table 2- Added values of reactants for beta galactosidase activity in the presence of nanoparticle
|
واکنشگر |
مقدار (میکرولیتر) |
شاهد |
|||||||||||
|
بافر |
120 |
110 |
100 |
90 |
80 |
70 |
60 |
50 |
40 |
30 |
20 |
10 |
130 |
|
نانوذره |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
110 |
120 |
- |
|
ONPG |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
10 |
|
بتاگالاکتوزیداز |
60 |
60 |
60 |
60 |
60 |
60 |
60 |
60 |
60 |
60 |
60 |
60 |
60 |
کشت و تهیه غلظت‌های مختلف از باکتری: در این مطالعه باکتری هدف اشرشیا کلای بوده است که از کلکسیون باکتری‌ها و قارچ‌های سازمان پژوهش‌های علمی - صنعتی ایران تهیه شد (1533PTCC No:) و برای اطمینان از خالص‌بودن باکتری، رنگ‌آمیزی گرم انجام گرفت و در محیط انتخابی EMB، پرگنه‌های این باکتری با جلای فلزی جداسازی شد. به 10 میلی‌لیتر از محیط کشت برین هرت براث، یک پرگنه از باکتری، تلقیح و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور شیکردار انکوبه شد (rpm 200). کدورت‌های مختلف از استوک با بافر پتاسیم فسفات تهیه شدند و پس از تکرار چندین مرحله کشت از سوسپانسیون میکروبی و خواندن جذب در میکروپلیت ریدر، لوله حاوی سوسپانسیون باکتری با جذب 129/0 در طول موج 600 نانومتر روی محیط تریپتیکاز سوی آگار (TSA) تعدادCFU/ml 108×2 از باکتری به دست آمد. سپس با افزودن یک میلی‌لیتر از آن به 9 میلی‌لیتر بافر، سوسپانسیونی برابر CFU/ml 107×2 حاصل شد. در نهایت، سری رقت‌های CFU/ml 108 - 101 از باکتری تهیه شدند تا آنالیز شوند.
.شناسایی باکتری با استفاده از هریک از نانوذرات: بدین منظور، درون پلیت 96 خانه‌ای مقادیر یکسان از نانوذره (مقداری که در مرحله قبل تعیین شد و از آن مقدار به بعد آنزیم بتاگالاکتوزیداز دیگر فعالیتی از خود نشان نداد) و مقادیر ثابتی از آنزیم بتاگالاکتوزیداز (60 میکرولیتر) اضافه شدند. سپس به هریک از خانه‌ها غلظت‌های مختلف از باکتری (108-101) تلقیح شدند. برای زمان‌دادن به محیط واکنش برای رقابت بین باکتری و آنزیم بر سر اتصال به نانوذره، پلیت به مدت 30 دقیقه در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس ONPG با مقدار ثابت (10 میکرولیتر) به هریک از خانه‌ها اضافه شد. در نهایت، جذب در زمان‌های 15 و 30 دقیقه در طول موج 405 نانومتر در دستگاه میکروپلیت ریدر خوانده شد.
در این پژوهش، از طرح آماری ANOVA ، برای آنالیز آماری فاکتورهای غلظت و زمان استفاده شد و داده‌ها توسط نرم‌افزار SPSS 16.0 تجزیه و تحلیل شدند. برای مقایسه میانگین مقادیر در سطح 95 درصد (p < 0.05) از آزمون چندگانه دانکن استفاده شد.
اندازه بلورهای نانوذرات اکسید روی براساس نتایج حاصل از XRD (شکل 1) و به کمک رابطه شرر برحسب پهنای پیک ماکزیمم پراش اشعه X در نصف ارتفاع و سایر شرایط محاسبه شدند (36).
با توجه به شکل 1، سه پیک پراش (100)، (002) و (101) مربوط به ساختار کریستالی نانوذرات ZnO غالب بودند. پیک‌های شارپ مشاهدهشده نشان‌دهنده ساختار بلوری خوب نمونه بودند و با استاندارد JCPDS 05-0664 مطابقت داشتند. اندازه دانه بررسی‌شده توسط فرمول شرر 23 نانومتر محاسبه شد.
اندازه بلورهای نانوذرات اکسید قلع براساس نتایج حاصل از XRD (شکل 2) و به کمک رابطه شرر محاسبه شد. تشکیل ساختار کریستالی نانوذرات اکسید قلع با مشاهده پیک‌های شارپ تأیید شد. نتایج تجزیه و تحلیل پراش پرتو ایکس، توزیع تقریباً یکنواخت اندازه ذرات را نشان داد. سه پیک پراش (110)، (101)، (200)، (211)، (220)، (310)، (112) و (301) مربوط به ساختار کریستالی نانوذرات اکسید قلع غالب بودند و با استاندارد JCPDS 77- 0452 مطابقت داشتند. اندازه دانه بررسی‌شده توسط فرمول شرر 25 نانومتر محاسبه شد. اندازه بلورهای MWCNT ساده و عامل‌دار براساس نتایج حاصل از XRD (شکل‌های 3 و 4) و به کمک رابطه شرر، 10-8 نانومتر محاسبه شدند. الگوهای پراش نانولوله‌های کربنی ساده و عامل‌دار، پیک قوی را در 2Ɵ = 26˚ (002) نشان دادند. پیک‌های پراش (100) و (101) با شدت کم در اطراف ⸰43 و ⸰44 نیز مشاهده شدند (36). شدت پیک پراش (002) درMWCNT های عامل‌دار، به‌مراتب قوی‌تر از MWCNTهای اولیه بود. الگوهای XRD برای نمونه‌ها نشان دادند ناخالصی در آنها نبوده است و ساختار آنها به خوبی شکل گرفتند.
شکل 1- نتایج آنالیز الگوی پراش پرتو ایکس (XRD) نانوذرات اکسید روی
Fig 1- X-ray diffraction patterns for ZnO NPs
شکل 2- نتایج آنالیز الگوی پراش پرتو ایکس (XRD) نانوذرات اکسید قلع
Fig 2- X-ray diffraction patterns for SnO NPs
شکل 3- نتایج آنالیز الگوی پراش پرتو ایکس (XRD) مربوط به MWCNTهای ساده
Fig 3- X-ray diffraction patterns for pristine MWCNTs
شکل 4- نتایج آنالیز الگوی پراش پرتو ایکس (XRD) مربوط به MWCNTهای عامل‌دارشده
Fig 4- X-ray diffraction patterns for carboxyl functionalized MWCNTs
طیف FTIR نانوذرات اکسید روی در محدوده cm-1 4000-400 در شکل 5 نشان داده شده است. پیک قوی 1-cm 3430 مربوط به پیوند OH و جذب مولکول‌های آب روی ZnO و پیک‌های موجود در اطراف 1-cm 1632 و 1- cm1381 به‌ترتیب مربوط به ارتعاشات نامتقارن و متقارن بودند (26).
شکل 6، طیف‌های FTIR را برای اکسید قلع، در محدوده cm-1 4000-400 نشان می‌دهد. پیک قوی تقریباً 1-cm 3482 مربوط به ارتعاشات جذب مولکول‌های آب روی اکسید قلع و ایجاد پیوند OH و پیک -1cm 1384 مربوط به تشکیل پیوند C-H بودند.
شکل 7 (a و b)، طیف‌های FTIR را برای MWCNTهای خالص و عامل‌دار نشان می‌دهد. پیک مشاهدهشده در بازه زمانی cm-1۱۳۹۰ مربوط به پیوند C-N بود (37). پیک قوی در cm-1۱۶۳۰مربوط به پیوند دوگانه C=C بوده است که تشکیل دیوار کناری چارچوب نانولوله کربنی را تأیید کرد (38). نتایج نشان دادند پیک‌های FTIR برای نمونه عامل‌دار، قوی‌تر از نمونه‌های خالص بوده که بیان‌کننده افزودن مؤثر گروه کربوکسیل است.
شکل 5- نتایج آنالیز بیناب‌نگاری (FTIR) نانوذرات اکسید روی
Fig 5- FTIR spectra for ZnO NPs
شکل 6- نتایج آنالیز بیناب‌نگاری (FTIR) نانوذرات اکسید قلع
Fig 6- FTIR spectra for SnO NPs
شکل 7- نتایج آنالیز بیناب‌نگاری (FTIR) مربوط به MWCNTهای ساده (a) و عامل‌دارشده (b)
Fig 7- FTIR spectra for (a) pure MWCNTs and (b) carboxyl functionalized MWCNTs
نتایج آنالیز جذب UVبرای نانوذرات ZnO (شکل 8) نشان دادند جذب در ۳۶۶ نانومتر مطابق با eV ۳۹/3 اتفاق افتاد که نشان‌دهنده یک انتقال آبی در مقایسه با مقدار بولک ZnO یعنی مقدار eV 3/3 بود. ایجاد این اثر کوانتومی نشان داد ساختار نانوذرات شکل گرفت. شکل 9، مربوط به آنالیز UV نانوذرات اکسید قلع بوده است که یک پیک جذب را در ۲۳۴ نانومتر نشان داد. در طول موج ۲۴۰ نانومتر، بدون هیچ فرایند هیدروترمال پیک دیده شد. شکل 10، مربوط به طیف جذبی MWCNTهای ساده و عامل‌دار است. MWCNTهای ساده یک پیک جذب عمده را در ۲۳۴ نانومتر مطابق با مقدار استاندارد نشان دادند (39). پیک جذب در حدود ۲۲۹ نانومتر پس از افزودن گروه کربوکسیل به MWCNTهای اولیه، تحت یک انتقال آبی قرار گرفت. این امر نشان داد در شکل عامل‌دارشده، MWCNTها توانستند دامنه وسیعی از طیف UV- vis را پوشش دهند.
شکل 8. نتایج آنالیز جذب UV نانوذرات اکسید روی
Fig 8- UV–Vis DRS of ZnO nanoparticles
شکل 9- نتایج آنالیز جذب UV نانوذرات اکسید قلع
Fig 9- UV–Vis DRS of SnO nanoparticles
شکل 10- نتایج آنالیز جذب UV مربوط به MWCNTهای ساده و عامل‌دار
Fig 10- UV–Vis DRS results of pristine and carboxyl functionalized MWCNTs
نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانوذرات: با توجه به جدول 3 مقداری از آنزیم که قادر به تجزیه کامل سوبسترای ONPG شد، برابر60 میکرولیتر بود؛ زیرا جذب پس از این مقدار با اختلاف معنادار (05/0p<) ثابت ماند. این مقدار برای انجام مراحل بعدی آزمون استفاده شد و دیگر سوبسترایی برای تجزیه نمانده بود.
جدول 3- مقادیر جذب حاصل از تجزیۀ سوبسترای ONPG توسط بتاگالاکتوزیداز
Table 3- Absorbance values of ONPG degradation via beta galactosidase
|
بتاگالاکتوزیداز (میکرولیتر) |
0 |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
110 |
120 |
130 |
|
جذب |
000/0 |
051/0 ± 019/0 |
112/0 ± 0855/0 |
192/0 ± 045/0 |
251/0 ± 130/0 |
*321/0 ± 015/0 |
470/0 ± 001/0 |
470/0 ± 001/0 |
471/0 ± 001/0 |
471/0 ± 001/0 |
472/0 ± 001/0 |
472/0 ± 001/0 |
472/0 ± 001/0 |
473/0 ± 001/0 |
نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانوذرات اکسید روی: جدول 4 نشان می‌دهد نانوذرات اکسید روی در تمامی زمان‌ها، با مقدار 80 میکرولیتر قادر به مهار کامل آنزیم بتاگالاکتوزیداز بودند. در زمان 30 دقیقه در مقدار 50 میکرولیتر مقدار زیادی از سوبسترا تجزیه شده بود؛ زیرا در هیچ یک از زمان‌ها از این مقدار به بعد، تغییر محسوسی در کدورت به‌صورت معنادار مشاهده نشد (05/0p>)؛ بنابراین ما مقدار 80 میکرولیتر را در نظر گرفتیم.
جدول 4- نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانوذرات اکسید روی
Table 4- Results of β‑Gal Activity Assay in the Presence of ZnO NPs
|
نانوذره (میکرولیتر) زمان (دقیقه) |
0 |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
110 |
120 |
130 |
|
0 |
47/0 |
45/0 |
45/0 |
45/0 |
44/0 |
43/0 |
43/0 |
43/0 |
4/0 |
35/0 |
32/0 |
31/0 |
31/0 |
3/0 |
|
5 |
56/0 |
53/0 |
51/0 |
49/0 |
48/0 |
45/0 |
44/0 |
42/0 |
4/0 |
36/0 |
34/0 |
33/0 |
33/0 |
33/0 |
|
10 |
73/0 |
67/0 |
61/0 |
58/0 |
55/0 |
52/0 |
51/0 |
48/0 |
43/0 |
37/0 |
36/0 |
35/0 |
34/0 |
34/0 |
|
15 |
85/0 |
79/0 |
72/0 |
69/0 |
66/0 |
63/0 |
61/0 |
59/0 |
53/0 |
37/0 |
36/0 |
35/0 |
34/0 |
34/0 |
|
20 |
92/0 |
86/0 |
81/0 |
76/0 |
69/0 |
65/0 |
6/0 |
56/0 |
54/0 |
38/0 |
37/0 |
36/0 |
35/0 |
34/0 |
|
25 |
09/1 |
98/0 |
9/0 |
81/0 |
77/0 |
7/0 |
65/0 |
58/0 |
55/0 |
38/0 |
37/0 |
36/0 |
35/0 |
35/0 |
|
30 |
28/1 |
12/1 |
03/1 |
01/1 |
95/0 |
91/0 |
89/0 |
88/0 |
86/0 |
38/0 |
37/0 |
37/0 |
36/0 |
35/0 |
.نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانوذرات اکسید قلع: نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانوذرات اکسید قلع در جدول 5 آمده‌اند. برای این نانوذرات، در زمان 15 دقیقه اولین تفاوت معنادار در مقدار 100 میکرولیتر مشاهده شد. با گذشت زمان این نانوذرات توانستند در مقادیر کمتری با اختلاف معنادار سوبسترا را تجزیه کنند (05/0p<)؛ برای مثال، در زمان 25 و 30 دقیقه در مقدار 80 میکرولیتر مقدار زیادی از سوبسترا تجزیه شده بود و ما مقدار 90 میکرولیتر را در نظر گرفتیم؛ زیرا در هیچ یک از زمان‌ها از این مقدار به بعد، تغییر کدورت محسوسی با اختلاف معنادار مشاهده نشد (05/0p>).
جدول 5- نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانوذرات اکسید قلع
Table 5- Results of β‑Gal Activity Assay in the Presence of SnO NPs
|
نانوذره (میکرولیتر) زمان (دقیقه) |
0 |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
110 |
120 |
130 |
|
0 |
47/0 |
45/0 |
46/0 |
45/0 |
45/0 |
45/0 |
44/0 |
44/0 |
44/0 |
43/0 |
33/0 |
33/0 |
32/0 |
32/0 |
|
5 |
56/0 |
55/0 |
53/0 |
52/0 |
5/0 |
49/0 |
47/0 |
46/0 |
43/0 |
42/0 |
35/0 |
34/0 |
34/0 |
34/0 |
|
10 |
73/0 |
7/0 |
66/0 |
61/0 |
57/0 |
55/0 |
53/0 |
51/0 |
5/0 |
49/0 |
37/0 |
35/0 |
35/0 |
34/0 |
|
15 |
85/0 |
81/0 |
78/0 |
75/0 |
72/0 |
69/0 |
66/0 |
63/0 |
58/0 |
55/0 |
37/0 |
36/0 |
35/0 |
34/0 |
|
20 |
92/0 |
91/0 |
88/0 |
82/0 |
78/0 |
73/0 |
69/0 |
62/0 |
58/0 |
55/0 |
37/0 |
36/0 |
36/0 |
35/0 |
|
25 |
09/1 |
05/1 |
1 |
96/0 |
89/0 |
82/0 |
77/0 |
72/0 |
66/0 |
61/0 |
37/0 |
37/0 |
36/0 |
35/0 |
|
30 |
28/1 |
12/1 |
08/1 |
05/1 |
03/1 |
01/1 |
95/1 |
9/0 |
88/0 |
86/0 |
41/0 |
38/0 |
36/0 |
35/0 |
.نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانولوله‌های کربنی: نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانولوله‌های کربنی در جداول 6 و 7 آمده‌اند. مقدار نانولوله‌های کربنی ساده با خاصیت مهارکنندگی برابر60 میکرولیتر بود. در زمان 15 دقیقه، اولین تفاوت معنادار در مقدار 70 میکرولیتر مشاهده شد (05/0p<).
جدول 6- نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانولوله‌های کربنی ساده
Table 6- Results of β‑Gal Activity Assay in the Presence of pristine MWCNTs
|
نانوذره (میکرولیتر) زمان (دقیقه) |
0 |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
110 |
120 |
130 |
|
0 |
47/0 |
43/0 |
43/0 |
43/0 |
42/0 |
41/0 |
4/0 |
33/0 |
32/0 |
32/0 |
31/0 |
31/0 |
31/0 |
31/0 |
|
5 |
57/0 |
47/0 |
46/0 |
43/0 |
41/0 |
4/0 |
42/0 |
33/0 |
32/0 |
32/0 |
31/0 |
31/0 |
3/0 |
31/0 |
|
10 |
73/0 |
58/0 |
49/0 |
49/0 |
43/0 |
43/0 |
42/0 |
33/0 |
32/0 |
32/0 |
31/0 |
31/0 |
31/0 |
31/0 |
|
15 |
85/0 |
66/0 |
63/0 |
58/0 |
56/0 |
53/0 |
51/0 |
34/0 |
33/0 |
33/0 |
32/0 |
32/0 |
31/0 |
31/0 |
|
20 |
92/0 |
74/0 |
72/0 |
66/0 |
63/0 |
6/0 |
59/0 |
35/0 |
35/0 |
35/0 |
34/0 |
34/0 |
34/0 |
32/0 |
|
25 |
09/1 |
85/0 |
79/0 |
75/0 |
74/0 |
71/0 |
69/0 |
36/0 |
35/0 |
35/0 |
33/0 |
34/0 |
33/0 |
33/0 |
|
30 |
28/1 |
97/0 |
9/0 |
88/0 |
86/0 |
85/0 |
81/0 |
37/0 |
35/0 |
35/0 |
34/0 |
32/0 |
31/0 |
33/0 |
برای نانولوله‌های کربنی عامل‌دار، در زمان 15 دقیقه اولین تفاوت معنادار در مقدار 60 میکرولیتر مشاهده شد و با گذشت زمان توانست سوبسترا در مقادیر کمتری با اختلاف معنادار (05/0p<) تجزیه کند؛ برای مثال، در زمان 30 دقیقه در مقدار 40 میکرولیتر مقدار زیادی از سوبسترا تجزیه شده بود و ما مقدار 50 میکرولیتر را در نظر گرفتیم؛ زیرا از این مقدار به بعد در هیچ یک از زمان‌ها، تغییر محسوسی در کدورت با اختلاف معنادار مشاهده نشد (05/0p>).
جدول 7- نتایج حاصل از سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانولوله‌های کربنی عامل‌دارشده
Table 7- Results of β‑Gal Activity Assay in the Presence of carboxyl functionalized MWCNTs
|
نانوذره (میکرولیتر) زمان (دقیقه) |
0 |
10 |
20 |
30 |
40 |
50 |
60 |
70 |
80 |
90 |
100 |
110 |
120 |
130 |
|
0 |
47/0 |
41/0 |
41/0 |
41/0 |
39/0 |
38/0 |
32/0 |
31/0 |
31/0 |
31/0 |
31/0 |
3/0 |
3/0 |
3/0 |
|
5 |
56/0 |
45/0 |
46/0 |
43/0 |
41/0 |
4/0 |
32/0 |
32/0 |
32/0 |
32/0 |
32/0 |
31/0 |
3/0 |
3/0 |
|
10 |
73/0 |
49/0 |
49/0 |
49/0 |
43/0 |
41/0 |
32/0 |
32/0 |
32/0 |
32/0 |
31/0 |
31/0 |
31/0 |
3/0 |
|
15 |
85/0 |
55/0 |
55/0 |
53/0 |
5/0 |
43/0 |
35/0 |
34/0 |
32/0 |
32/0 |
31/0 |
31/0 |
31/0 |
31/0 |
|
20 |
92/0 |
65/0 |
62/0 |
61/0 |
58/0 |
52/0 |
38/0 |
36/0 |
34/0 |
34/0 |
31/0 |
31/0 |
31/0 |
31/0 |
|
25 |
09/1 |
74/0 |
71/0 |
69/0 |
65/0 |
6/0 |
4/0 |
39/0 |
37/0 |
35/0 |
32/0 |
31/0 |
31/0 |
3/0 |
|
30 |
28/0 |
87/0 |
86/0 |
84/0 |
76/0 |
71/0 |
42/0 |
41/0 |
39/0 |
36/0 |
32/0 |
31/0 |
3/0 |
34/0 |
.نتایج حاصل از شناسایی باکتری با استفاده از نانوذرات: در شناسایی باکتری اشرشیا کلای توسط نانوذرات اکسیدروی، در زمان 15 و 30 دقیقه، شناسایی با غلظت cfu/ml 100 و با اطمینان 95 درصد صورت گرفت (05/0p<) که مشابه با نتایج نانوذرات اکسید قلع بود (جداول 8 و 9). نتایج حاصل از شناسایی باکتری با استفاده از نانولوله‌های کربنی در جداول 10 و 11 آمده‌اند. با توجه به جداول مربوط به نانولوله‌های کربنی، باکتری اشرشیا کلای در غلظت cfu/ml10 ردیابی شد؛ زیرا در غلظت cfu/ml 100 تفاوت معنادار نسبت به غلظت cfu/ml 10 مشاهده شد (05/0p<). نانوله های کربنی عامل‌دار نیز در غلظت cfu/ml 100 از باکتری با اختلاف معناداری جذب آنها افزایش یافت (05/0p<) و این یعنی باکتری در غلظت cfu/ml 10 شناسایی شد؛ اما برخلاف نانولوله‌های کربنی ساده با گذشت زمان 15 دقیقه، کدورت محیط یا جذب خوانده‌شده، با حضور باکتری با اختلاف معنادار افزایش یافت که به‌دلیل تفاوت در واکنش‌پذیری آنهاست.
جدول 8- نتایج حاصل از شناسایی باکتری با استفاده از نانوذرات اکسید روی
Table 8- Results of Bacteria detection using ZnO NPs
|
باکتری (میلی لیترcfu/) زمان (دقیقه) |
0 |
10 |
100 |
103 |
104 |
105 |
106 |
107 |
108 |
|
0 |
36/0 |
36/0 |
41/0 |
42/0 |
42/0 |
43/0 |
43/0 |
43/0 |
44/0 |
|
15 |
43/0 |
43/0 |
53/0 |
59/0 |
64/0 |
67/0 |
72/0 |
75/0 |
8/0 |
|
30 |
73/0 |
73/0 |
76/0 |
81/0 |
87/0 |
89/0 |
96/0 |
08/1 |
19/1 |
جدول 9- نتایج حاصل از شناسایی باکتری با استفاده از نانوذرات اکسید قلع
Table 9- Bacteria detection using SnO NPs
|
باکتری (میلی لیترcfu/) زمان (دقیقه) |
0 |
10 |
100 |
103 |
104 |
105 |
106 |
107 |
108 |
|
0 |
36/0 |
36/0 |
39/0 |
4/0 |
4/0 |
41/0 |
41/0 |
42/0 |
42/0 |
|
15 |
43/0 |
43/0 |
51/0 |
57/0 |
57/0 |
65/0 |
68/0 |
72/0 |
79/0 |
|
30 |
73/0 |
73/0 |
75/0 |
8/0 |
8/0 |
87/0 |
92/0 |
04/0 |
15/1 |
جدول 10- نتایج حاصل از شناسایی باکتری با استفاده از نانولوله‌های کربنی ساده
Table 10- Results of Bacteria detection using pristine MWCNTs
|
باکتری (میلی لیترcfu/) زمان (دقیقه) |
0 |
10 |
100 |
103 |
104 |
105 |
106 |
107 |
108 |
|
0 |
36/0 |
36/0 |
44/0 |
44/0 |
44/0 |
44/0 |
45/0 |
45/0 |
46/0 |
|
15 |
43/0 |
44/0 |
55/0 |
62/0 |
68/0 |
73/0 |
78/0 |
79/0 |
83/0 |
|
30 |
73/0 |
75/0 |
8/0 |
85/0 |
9/0 |
93/0 |
09/1 |
18/1 |
21/1 |
جدول 11- نتایج حاصل از شناسایی باکتری با استفاده از نانولوله‌های کربنی عامل‌دار
Table 11- Results of Bacteria detection using carboxyl functionalized MWCNTs
|
باکتری (میلی لیترcfu/) زمان (دقیقه) |
0 |
10 |
100 |
103 |
104 |
105 |
106 |
107 |
108 |
|
0 |
36/0 |
44/0 |
45/0 |
45/0 |
45/0 |
46/0 |
47/0 |
47/0 |
47/0 |
|
15 |
43/0 |
52/0 |
62/0 |
66/0 |
75/0 |
8/0 |
82/0 |
83/0 |
83/0 |
|
30 |
73/0 |
81/0 |
89/0 |
94/0 |
99/0 |
16/1 |
21/1 |
22/1 |
22/1 |
بحث و نتیجه‌گیری
سنتز و مطالعه ساختاری و نوری نانوذرات: استفاده از روش سُل-ژل در سنتر نانوذرات بسیار شایان توجه قرار می‌گیرد؛ زیرا در تولید نانوپودرهای با خلوص بالا با استفاده از یک پیش‌ماده خالص بسیار مؤثر است. مزایای دیگر آن، سنتز در دماهای نسبتاً پایین و قابلیت کنترل سنتتیک مراحل مختلف واکنش‌های شیمیایی مانند هیدرولیز، چگالش، جوانه‌زنی و رشد ذرات اولیه کلوئیدی برای به دست آوردن نانوساختار با اندازه و توزیع خاص است. همچنین، این روش به کنترل همه فرایندها و حفظ همگنی مقیاس اتمی کمک می‌کند (40)؛ به همین دلیل، از روش سُل-ژل برای سنتز نانوذرات استفاده شد. نتایج حاصل از آنالیز نانوذرات نشان دادند نانومواد به‌کاررفته از ساختار قابل قبولی برخوردار و قادر به ارائه ویژگی‌های منحصربه‌فرد خود در اندازه نانو بودند.
آماده‌سازی نانوذرات: راجع به توزیع نانوذرات فلزی در مایعات اطلاعات کمی وجود دارد. برای اصلاح سطح نانوذرات، توزیع مناسب و حفظ ماهیت شیمیایی آنها، از دستگاه‌های توزیع‌کننده‌ای مانند همزن چرخشی، هموژنایزر اولتراسونیک، دیسک میل و اس-رولرمیل استفاده می‌شود. استفاده از مواد شیمیایی مانند عوامل توزیع‌کننده به خوبی مطالعه نشده است. این عوامل سبب پایداری و جلوگیری از تجمع نانوذرات بعد از مراحل توزیع می‌شود (41، 42). در مطالعه ما برای کاهش ممانعت فضایی الکترواستاتیک بین نانوذرات و آزادشدن سطح قابل قبولی از یون‌ها، از استیرر یا همزن مغناطیسی، طبق بررسی که قبلاً صورت گرفت، استفاده شد (26).
در این مطالعه، از گلوتارالدهید به‌عنوان لینکر برای بهبود واکنش‌پذیری MWCNT استفاده شد. گلوتارآلدهید یک لینکر مناسب برای اتصال متقابل مولکول‌های آنزیم بتاگالاکتوزیداز است. MWCNTهای پیوندیافته با گلوتارآلدهید، قادر به اتصال به ترکیبات آنیونی هستند که گروه آمین آنزیم نیز در این اتصال شرکت می‌کند. به‌دلیل خاصیت آبگریزی MWCNTها، واکنش‌پذیری آنها با آنزیم در تجمع آنزیمی، با واسطه آمینواسیدها انجام می‌شود. این امر در یک محیط هیدروفیلیک مثل یک بافر آبی به‌دلیل اثر جداسازی (Partitioning effect) شدت می‌یابد. علاوه بر برهمکنش هیدروفوبیک، الکترون‌های سطح MWCNT با الکترون‌های مقابل خود در حلقه آروماتیک اسیدهای آمینه مانند فنیل‌آلانین و تریپتوفان واکنش می‌دهد و سبب جذب آنزیم در MWCNT می‌شود (43). مورفولوژی MWCNTها قبل و بعد از عامل‌دارشدن تغییر می‌کند. این تغییرات با کاهش طول همراه است. حضور گروه‌های کربوکسیل روی سطح CNT، انحلال‌پذیری آنها را از حالت هیدروفوبیک به هیدروفیلیک تغییر می‌دهد که درواقع با تسهیل پراکندگی نانولوله‌ها در محلول آبی همراه است. این امر در انتشار بهتر آنها در بافر تأثیرگذار است. MWCNTها با طول کوتاه‌تر تمایل کمتری به ایجاد تجمعات بزرگ دارند و استفاده از آنها برای آماده‌سازی یک سوسپانسیون یکدست آسان‌تر است.
سنجش فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز در حضور نانوذرات: در شکل 11 (a) نشان داده شده است که آنزیم بتاگالاکتوزیداز با اتصال سوبسترا (ONPG) به جایگاه فعالش، عمل تجزیه را انجام می‌دهد؛ اما پس از ورود نانوذرات به محیط، نانوذرات دارای بار مثبت به آنزیم با بار منفی متصل می‌شوند. یک شارژ منفی در نزدیکی محل اتصال گالاکتوز (جایگاه فعال) وجود دارد. این بار منفی به کربن آنومری این آنزیم نزدیک است (44)؛ بنابراین، پس از اتصال به آنزیم، مانع اتصال سوبسترا به جایگاه فعال و کاهش فعالیت کاتالیتیکی بتاگالاکتوزیداز می‌شود. با افزایش مقدار نانوذرات و با گذشت زمان، این ممانعت افزایش می‌یابد و در نهایت فعالیت آنزیم متوقف خواهد شد. در یک مقدار مشخص از نانوذره، فعالیت آنزیم کاملاً مهار می‌شود.
بار سطحی ZnO در pH خنثی، مثبت است و از طریق انحلال به‌صورت ZnO و +2Zn تغییر می‌یابد (45). در تمام مراحل آزمایش 7=pH نیز با افزودن بافر تسهیل شد. یون‌های Zn2+ آزادشده در معرض مولکول‌های بتاگالاکتوزیداز با بار منفی قرار گرفتند و به آنها متصل شدند و مقدار جذب سوبسترا و فعالیت آنزیمی را کاهش دادند. با توجه به جدول 4، با افزایش مقدار نانوذرات اکسید روی، در مقدار 80 میکرولیتر، فعالیت آنزیمی کاملاً مهار شد. این همان مقدار لازم برای مهار کامل فعالیت آنزیم هدف بود. این فرایند در مورد نانوذرات اکسید قلع و MWCNTهای ساده و عامل‌دار نیز صادق بود. با توجه به جدول 5 مقدار مهارکنندگی نانوذرات اکسید قلع برابر 90 میکرولیتر بود که از آن مقدار به بعد، عدد جذب تقریباً ثابت شد. این امر ناشی از برهمکنش یون‌های Sn2+ با بار منفی سطح بتاگالاکتوزیداز بود؛ زیرا نانوذرات اکسید قلع پس از توزیع در محیط، به‌صورت یون‌های Sn2+ و O2- دیده می‌شوند که قابلیت سریع واکنش با هم را دارند. با توجه به جدول 6 و 7 مقدار مهارکنندگی MWCNTهای ساده و عامل‌دار به‌ترتیب برابر 60 و 50 میکرولیتر بود و مقدار جذب در مقادیر بعدی ثابت ماند. نتایج نشان می‌دهند MWCNTها در مهار فعالیت بتاگالاکتوزیداز، نسبت به نانوذرات ZnO و SnO عملکرد بهتری از خود نشان دادند؛ زیرا در مقادیر پایین‌تری توانستند مانع از تجزیه سوبسترا شوند و این به‌دلیل خواص ساختاری و شیمیایی آنهاست که به آنها اشاره می‌کنیم. گفتنی است با توجه به سطح انرژی بالای نیروی واندروالس در سطح نانوذرات اکسید روی و اکسید قلع، آنها تمایل به تجمع دارند؛ بنابراین، مراحل واکنش‌ها و خواندن جذب در کمترین زمان، با سرعت مناسب و به‌صورت پی‌درپی انجام گرفت.
علاوه بر شکل، اندازه و مقدار نانوذره، از سایر فاکتورهای محیطی مؤثر بر واکنش فوق می‌توان به دما، pH و زمان اشاره کرد. pHاپتیمم برای فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز کلوورومایسس فراجیلیس در دمای بهینه ۳5-۳0 درجه سانتی‌گراد به میزان 5/6، 6/6 و 7 است (46). از طرفی دمای 37 درجه سانتی‌گراد برای فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز مناسب است و در این شرایط بیشترین فعالیت را از خود نشان می‌دهد (47). بدین منظور، پلیت‌ها با 7=pH در انکوباتوری قرار داده شد که دارای دمای کنترل‌شده و ثابت 37 درجه سانتی‌گراد بوده است و واکنش‌ها در آن صورت گرفت.
شناسایی باکتری با استفاده از نانوذرات: از اشرشیا کلای به‌عنوان باکتری هدف استفاده شد؛ زیرا تشخیص سریع آن می‌تواند برای سلامت عمومی مفید باشد. تحقیقات بسیاری حاکی از آن است که باکتری‌ها دارای سطح شارژ منفی هستند که اولین‌بار توسط بچهلد در سال ۱۹۰۴مطرح شد. این امر به‌وسیله کروماتوگرافی با اثر الکترواستاتیک اثبات شد. دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت، متشکل از یک لایه ضخیم پپتیدوگلایکان هستند که تیکوئیک‌اسید یکی از اجزای آن است. در باکتری‌های گرم منفی، پپتیدوگلایکان دارای لیپوپلی‌ساکارید است. در حقیقت، بار منفی باکتری به‌دلیل وجود این ترکیبات بوده است و نانوذرات با بار مثبت می‌توانند با واکنش‌های الکترواستاتیک به باکتری متصل شوند (48).
در این مطالعه، پس از انکوباسیون نانوذرات / آنزیم / باکتری، اتصال بین باکتری و نانوذرات صورت گرفت و این امر مانع از اتصال نانوذرات به آنزیم آزاد موجود در محیط شد؛ بنابراین، پس از افزودن ONPG، سوبستراها به جایگاه فعالشان روی آنزیم‌ها متصل شدند و فعالیت آنزیمی آغاز شد. شروع فعالیت آنزیمی نشان‌دهنده وجود باکتری در محیط بوده است و بنابراین با گذشت زمان، تعداد بیشتری از میکروارگانیسم‌ها شناسایی شدند و تعداد مولکول‌های NPG در محیط و در نتیجه شدت جذب افزایش یافت. گفتنی است نانوذرات با بار مثبت، دارای فعالیت باکتریوسیدالی و باکتریواستاتیکی هستند که این فعالیت‌ها، وابسته به مقدار نانوذرات و مدت زمان مواجه‌شدن آنها با باکتری یا به عبارت دیگر، مدت انکوباسیون است (26)؛ بنابراین، اتصال نانوذرات به باکتری سبب مهار فعالیت باکتریایی اشرشیا کلای می‌شود؛ ازجمله آنها، فعالیت بتاگالاکتوزیدازی این باکتری است که با اتصال ذرات با بار مثبت به آنزیم باکتریایی متوقف می‌شود (49). از طرفی ژن کدکننده این فعالیت در نبود سوبسترا خاموش است و پس از حضور سوبسترا در محیط بیان می‌شود (50). در این مطالعه پس از انکوباسیون نانوذرات / آنزیم / باکتری به مدت 30 دقیقه و پس از اتصال یافتن نانوذرات به سطح باکتری، سوبسترا اضافه شد؛ بنابراین، با این دلایل می‌توان از نقش آنزیم بتاگالاکتوزیدازی باکتری اشرشیا کلای چشم‌پوشی کرد. این مراحل در شکل 11 (b) به‌صورت شماتیک بیان شده است.
طبق جدول 10 و 11، MWCNTها نتایج بهتری نسبت به سایر نانوذرات داشتند. آنها در مقدار مشابه و در زمان ۱۵ دقیقه توانستند حداقل غلظت باکتری (CFU/ml ۱۰) در محیط را شناسایی کنند. این مقدار برای نانوذرات اکسید روی و اکسید قلع، CFU/ml 100 تعیین شد. پس از افزودن غلظت‌های مختلف از باکتری، کدورت محیط افزایش یافت و فعالیت آنزیمی آغاز شد. درواقع شناسایی باکتری زمانی صورت گرفت که نرخ جذب افزایش یافت. در حضور نانوذرات ZnO، میزان جذب خوانده‌شده در غیاب باکتری و در غلظت CFU/ml 10 از آن تقریباً ثابت بود. یعنی پس از افزودن CFU/ml 10 از باکتری اشرشیا کلای، تغییر چشمگیری در کدورت و میزان جذب در حضور نانوذرات اکسید روی و اکسید قلع مشاهده نشد. با افزایش غلظت باکتری (CFU/ml 100) کدورت افزایش یافت. این تغییر در کدورت برای MWCNTها در پایین‌ترین غلظت (CFU/ml 10) مشاهده شد. میزان جذب در غلظت CFU/ml 10 از باکتری در حضور MWCNTها و در غلظت CFU/ml 100 از باکتری در حضور نانوذرات ZnO، از جذب در غیاب باکتری بالاتر بود؛ بنابراین، MWCNTها توانایی بالاتری در شناسایی باکتری هدف داشتند؛ زیرا دارای اندازه کوچکتر، نسبت سطح به حجم بالاتر و سطوح دسترسی وسیع‌تر در واکنش با آنزیم بودند. تحقیقات نشان می‌دهند با کاهش اندازه ذره به مقیاس نانومتر، خواص پارامغناطیسی نیز افزایش می‌یابد (51). بنابراین هرچه اندازه نانوذره کوچکتر باشد، حرکت الکترونها و واکنش‌پذیری آنها افزایش می‌یابد. مهم‌تر از همه، توانایی اتصال آنها به باکتری و آنزیم را به‌طور مؤثر و گسترده فراهم می‌آورد و در نهایت سرعت تشخیص باکتری‌ها را بهبود می‌دهد. با وجود این، نانوذرات اکسید روی و اکسید قلع نیز از قدرت شناسایی قابل قبولی در تشخیص باکتری برخوردار بودند که به‌دلیل خواص منحصربه‌فرد آنهاست. نانوذرات اکسید روی به نسبت نانوذرات اکسید قلع، غلظت مشابهی از باکتری هدف را در مدت زمان کمتر تشخیص دادند و نرخ افزایش کدورت در آن بالاتر بود. درواقع نسبت سطح به حجم بالا، سازگاری خوب، حداقل سمیت، پایداری شیمیایی و تبادل زیاد و مناسب الکترون، نقطه ایزوالکتریک بالا، حضور اتم‌های +2Zn و 2-O در ساختار بلوری نانوذرات ZnO، آنها را بسیار کارآمد کرده است؛ زیرا مساحت سطحی بالا به جذب آسان‌تر پروتئین‌ها (مانند آنزیم‌ها) منجر می‌شود. یک ماده نیمه‌رسانا که خواص نوری، الکترونیکی و کاتالیتیکی عالی دارد (52، 53).
نیمه‌رساناها انواع مختلفی از ساختارهای کریستالی دارند که منجر به خواص الکترونیکی و اپتیکی متفاوتی می‌شوند. نانوذرات اکسید قلع نیز ازجمله آنهاست که دارای خواص مشابهی با نانوذرات اکسید روی هستند. آنها مزایای زیادی در مقایسه با نیمه‌رساناهای غیراکسیدی دارند. SnO یک ماده نیمه‌رسانا با گاف انرژی نسبتاً وسیع است که آنها را مناسب برای انواع واکنش می‌کنند (54). اندازه بزرگ‌تر نانوذرات اکسید قلع و مساحت سطحی پایین‌تر ازجمله علل تفاوت آن در مقایسه با نانوذرات اکسید روی در تشخیص باکتری است. از سوی دیگر، نانولوله‌های کربنی دارای مساحت سطحی بسیار بالاتر، مقاومت مکانیکی و رسانایی الکتریکی عالی هستند که آنها را در واکنش‌پذیری و کاربرد در زمینه‌های مختلف مؤثر می‌کنند (55). رسانایی الکتریکی بالا و مقاومت بالای آنها نسبت به دماهای بالا در CNTهای فلزی به‌دلیل حضور حداقل الکترونها در آنهاست (56). همچنین دارای ویژگی‌های منحصربه‌فردی ازجمله مساحت سطحی، مقاومت حرارتی و مکانیکی، توزیع منظم منافذ با اندازه مناسب، قابلیت جذب، حساسیت و دقت بالا، محدودیت‌های کمتر در تشخیص و نفوذپذیری کنترل‌شده در بسیاری از زمینه‌ها هستند. مساحت سطحی بالای نانولوله‌های کربنی، توانایی حرکت تعداد زیادی از ترکیبات را در سطح آنها فراهم می‌کند. MWCNTها قطر بین ۲ و ۱۰۰ نانومتر دارند و برای تشخیص مولکول‌های هدف براساس واکنش‌های الکتروشیمیایی مناسب هستند؛ زیرا قادر به اتصال و تجمیع آنالیت‌ها یا مولکول‌های هدف هستند (57).
اصلاح ساختار CNTها با گروه‌های مختلف شیمیایی برای افزایش حلالیت و سازگاری زیستی آنها استفاده می شود. عامل‌دارکردن کووالانتی به‌وسیله اکسیداسیون برای افزودن گروه‌های کربوکسیلیک‌اسید یا گروه‌های کربوکسیله‌شده در سطح CNT، یکی از پرکاربردترین استراتژی‌های استفاده‌شده است. مولکول‌های مختلف را می‌توان بیشتر به سطح CNTها (CNTs – COOH) برای کاربردهای مدنظر پیوند داد (58)؛ بنابراین، افزودن گروه کربوکسیل در مطالعه ما، از دلایل افزایش واکنش‌پذیری نانولوله‌های کربنی عامل‌دار است.
همچنین می‌توان از ترکیب نانوذرات اکسید روی، اکسید قلع با نانولوله‌های کربنی به نتایج بسیار بهتری دست یافت. سنتز ساختارهای نانو با ابعاد پایین‌تر برای پژوهش‌های بنیادی و کاربردی مهم است. رشد نانوساختارها با پایداری مورفولوژیکی و ثبات شیمیایی، اهمیت بسیار زیادی دارد. انتظار می‌رود اصلاح اندازه، آلیاژ و تشکیل ساختار هسته سبب اصلاح خواص ساختاری، نوری و الکترونیکی نانوذرات شود. ترکیب‌شدن با یک ماده مناسب دیگر نیز منجر به افزایش پایداری در ویژگی‌های ساختاری و اکسیداسیون نوری آنها می‌شود. گزارش شده است که پوشش‌های کربن در نانوذرات نیمه‌رسانا سبب افزایش پایداری، بهبود ظرفیت جذب و فعالیت فتوکاتالیتیک آنها خواهد شد. همچنین ترکیب‌شدن نانوذرات فلزی با ماتریس کربن یا لایه‌های کامپوزیت کربن - کربن به‌دلیل افزایش تخلخل و نسبت سطح به حجم، خواص جدیدی از خود بروز خواهد داد (59).
شکل 11- یک نمای شماتیک از فعالیت آنزیمی بتاگالاکتوزیداز (a) و تشخیص باکتری در محیط با استفاده از نانوذرات (b)
Fig 11- Schematic illustration of (a) enzymatic function of β-galactosidase and (b) bacteria detection using nanoparticles
برخی مطالعات، تشخیص سریع باکتری‌ها را با به کارگیری مواد نانو گزارش کرده‌اند؛ برای مثال، میراندا و همکاران[v] یک روش کالرومتریک براساس نانوذرات طلا و بتاگالاکتوزیداز گزارش کردند. در مطالعه آنها، ابتدا اتصال نانوذرات طلا و مهار فعالیت آنزیمی آنالیز شد و سپس سوبسترای آنزیم بازنشانی شد. با استفاده از این روش، آنها توانستند باکتری را در غلظت‌های CFU/ml ۱0۲ در محلول شناسایی کنند (60) که در مقایسه، مطالعه ما نتایج بهتری از خود نشان داد و MWCNTها حداقل غلظت را تشخیص دادند.
در مطالعه‌ای که توسط ورما و همکاران[vi] صورت گرفت، از نانوذرات طلا برای برهمکنش با لیپوپلی‌ساکارید در سطح اشرشیا کلای استفاده کردند. بتاگالاکتوزیداز روی نانوذرات طلا از طریق فعل و انفعالات الکترواستاتیک، جذب و بعد از حضور اشرشیا کلای، نانوذرات طلا به باکتری متصل شد و آنزیم شروع به فعالیت کرد (61).
مطالعه کریران و همکاران[vii] روی روش‌های تشخیص کم‌هزینه آلودگی آب انجام شد. آنها از یک واکنش کالرومتریک استفاده کردند که اجازه تشخیص چشمی آلودگی با باکتری‌ها را داد (62).
بنابراین از نانوذرات استفاده‌شده در این مطالعه نیز می‌توان برای تشخیص آلودگی مدفوعی انواع آب‌ها استفاده کرد. از طرف دیگر، باکتری‌های گرم مثبت، تیکوئیک‌اسید و لیپوتیکوئیک‌اسید در لایه پپتیدوگلایکان و دیواره سلولی دارند (57)؛ بنابراین، ما می‌توانیم از نانوذرات کاتیونی برای تشخیص باکتری‌های گرم مثبت نیز استفاده کنیم. گفتنی است تجزیه ONPG به NPG با تغییر رنگ همراه است (تغییر کیفی) و می‌توان در بررسی آلودگی‌ها از روش کیفی استفاده کرد؛ اما از آنجایی که کار انجام‌شده در مطالعه ما، یک روش مقایسه‌ای بود، استفاده از نتایج کیفی برای مقایسه قابل استناد نبود.
به‌طور کلی نانومواد، ترکیبات بسیار جذاب و کاربردی هستند. به‌دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی و نسبت سطح به حجم بالا در آنها، واکنش‌پذیری آنها بالا بوده و به‌عنوان یک مبدل عمل می‌کنند و حساسیت و محدودیت تشخیص آنالیت را افزایش می‌دهند و استفاده از آنها در بیوسنسورها بسیار کاربردی است.
نتایج این تحقیق نشان دادند نانوذرات به‌دلیل حضور مقادیر بالای بار مثبت در آنها و نسبت سطح به حجم بالای خود، دارای قابلیت تشخیص باکتری‌ها در غلظت کم و در کمترین زمان بودند و این امر می‌تواند زمینه‌ساز تحقیقات بیشتر در این حوزه شود. همچنین ارزیابی این توانایی در نانوذرات اکسید روی، اکسید قلع و نانولوله‌های کربنی ساده و عامل‌دار نشان داد MWCNTها از قدرت شناسایی بیشتری برخوردارند که به‌دلیل نسبت سطح به حجم و واکنش‌پذیری بالاتر آنهاست. به‌طور کلی این مکانیزم تشخیصی می‌تواند پس از بهبود، توسعه و تبدیل آنها به نانوبیوسنسورها، جایگزین مناسبی برای روش‌های شناسایی و تشخیصی سنتی شود که بسیار زمان‌بر است و در صورت بهینه‌سازى مى‌توان انتظار داشت حتى در غلظت‌های پایین‌تر بتواند به نحو مؤثر، آلودگی‌ها را تشخیص دهد؛ ازاین‌رو انتظار می‌رود در آینده، پس از انجام آزمون‌هاى تکمیلى به‌عنوان یک دستگاه بیوسنسور تشخیصی در صنعت غذا و دارو استفاده شود.
[1]. Polymerase Chain Reaction
[2]. Chromatography
[3]. Chemiluminescence
[4]. Elisa
[v]. Miranda et al.
[vi]. Verma et al.
[vii]. Creran et al.
)