نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 پژوهشکده زیست فناوری، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران
2 استادیار ژنتیک ملکولی،پژوهشکده زیست فناوری،سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران
3 گروه تحقیقات بیوتکنولوژی صنعتی، پژوهشکده بیوتکنولوژی، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران
4 پژوهشکده زیست فناوری، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
The stability of enzymes to heat and pH is one of the most important determining factors in their application. In this research, achieving thermostable and pH-stable cellulase was aimed by screening in one of the Hot springs of Garab in northeast Iran. The samples collected from one of the Hot springs of Garab, in Razavi Khorasan province in Iran, were used to isolate, screen, and identify bacteria capable of producing thermostable cellulase. The cultures were cultured at 45°C and under aerobic conditions. The bacteria were isolated on a CMC agar medium. Initial screening of the isolates was done based on specific culture medium, salt tolerance, and temperature changes. Then, their additional screening was done by evaluating endoglucanase activity at different temperatures and pH using qualitative and quantitative methods. Finally, the molecular identification of the selected isolate was done by 16S rRNA gene sequencing. The results of this study, led to the introduction of a selected strain identified primarily as Bacillus sp. G362, a moderate halophile growing in 6%(w/v) salt concentration. It showed high endoglucanase stability at 55°C and high stability in a wide range of acidic and alkaline pH. The studied Hot spring, like some other Iranian Hot springs, has cellulase-producing bacteria, which Bacillus sp. G362 is capable of producing endoglucanase showing the thermostablity and pH stability at a wide range of alkaline and Acidic pH. In addition, the specific endoglucanase gene of G362 Bacillus sp. can be identified through molecular methods and used for further research including structural studies. It may even be used as a protein template in protein engineering.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
سلولازها بهعنوان یکی از پرکاربردترین آنزیمهای صنعتی هستند که باید در برابر شرایط خاص فرایندها ازجمله دمای بالا و pH پایین یا بالا پایداری نشان دهند (1)؛ بنابراین، دستیابی به منابع سلولازهای مقاوم به حرارت و pH، به عوامل دناتورهکننده مانند حلالهای آلی، شویندهها و بازدارندهها شایان توجه محققان است (1، 2). گرچه قبلاً به منابع قارچی توجه شده است، غربالگری در منابع جدید با منشأ باکتریایی بهواسطه برخی مزایای انجام فرایندهای تولیدی نیز مدنظر بوده است (3، 4) و حضور گسترده باکتریهای سلولولیتیک در زیستگاههای طبیعی متنوع مانند خاک، دریاچهها، فضولات حیوانات، مواد درحال تجزیه، دستگاه گوارش برخی حیوانات ازجمله موریانه گزارش شده است (5). علاوه بر این، چشمههای آب گرم بهعنوان زیستگاه اصلی باکتریهای اکسترموفیل گرمادوست (6)، برای دستیابی به باکتریهای تولیدکنندة سلولاز مقاوم به حرارت درخور توجه بسیاری از محققان بوده است (13-6).
ترموفیلها موجوداتی با قابلیت زندمانی و رشد بهینه بهترتیب در دمای 41 تا 122 و 60 تا 108 درجه سانتیگراد هستند که در سه گروه گرمادوستهای متوسط، گرمادوست شدید و فراگرمادوستها طبقهبندی میشوند که بهترتیب دارای رشد بهینه در دامنه دمایی 60-50، 80-60 و 110-80 درجه سانتیگراد هستند (14). با هدف شناسایی تنوع زیستی و بهرهبرداری از ذخایر ژنتیکی ایران، در مطالعه حاضر یکی از چشمههای آب گرم گراب واقع در شمال شرق کشور در خراسان رضوی مطالعه شد تا ضمن ارزیابی پتانسیل باکتریایی تجزیهکنندة سلولز آن بتوان در صورت امکان باکتری یا باکتریهایی با توان تولید آنزیم سلولاز مقاوم به حرارت و pH قابل توجه جداسازی کرد.
مواد و روشها.
نمونهبرداری و جداسازی باکتریها: نمونهبرداری از چشمههای آب گرم شمال شرق واقع در دو منطقه مختلف با نامهای گرماب (طاقانکوه) و گراب انجام شد (شکل 1). مختصات جغرافیایی، دما و pH محل در زمان نمونهبرداری ثبت شد. موقعیت جغرافیایی گراب و طاقانکوه در جدول 1 ارائه شده و بهترتیب با دمای 25 و 30 درجه سانتیگراد ثبت شدند. نمونهگیری در دو فصل مختلف پاییز و زمستان انجام شد که با pH 6/6-5/5 متغیر بود. گفتنی است دمای این چشمه تا 50 درجه در سایر فصول گزارش شده است. در منطقه گراب، چشمههای متعدد به فاصله 300-50 متر از چشمه اصلی منشعب شدهاند که در این تحقیق از منطقه G3 آن با طول و عرض جغرافیایی بهترتیب 59°.63`6684” و 35°.98`8392”، pH بین 6/6-5/5 و دمای 50-25 درجه سانتیگراد نمونهگیری و در ظروف شیشهای استریل و فلاسک در حداقل زمان به آزمایشگاه منتقل شد. جداسازی سویههای باکتریایی مولد سلولاز، طبق روش قبلاً معرفیشده انجام شد (8). برای کشت و جداسازی باکتریها، گرمخانهگذاری در دماهای 37، 45، 50 و 55 درجه سانتیگراد انجام شد. در مرحله بعدی، همه جدایهها روی محیط کشت مندلس (3) با درصدهای نمک 5/0 درصد، 3 درصد و 6 درصد کشت داده شدند (جدول 2). غنیسازی باکتریایی در محیط کشت حاوی سبوس گندم انجام شد. سپس باکتریهای جداسازیشده، روی همان محیط کشت مندلس خالصسازی شدند و باکتریهای خالصسازیشده، روی همان محیط کشت جداشده کشت داده شدند.
برای تعیین دمای رشد، همه باکتریهای در دماهای 37، 45، 50 و 55 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شدند. در مرحله بعدی، همه جدایهها روی محیط کشت مندلس تغییریافته با درصدهای نمک 5/0 درصد، 3 درصد و 6 درصد کشت داده شدند.
جدول 1- مختصات جغرافیایی نقاط نمونهبرداری
Table 1- Geographic coordinates of sampling points
|
دما (سانتیگراد) |
pH |
طول جغرافیایی (E) |
عرض جغرافیایی (N) |
استان |
منطقه |
|
50-25 |
6/6-5/5 |
59°.63`6684” |
35°.98`8392” |
خراسان رضوی |
گراب 3 (G3) |
|
30 |
6 |
58°14`55.84” |
36°3`141.29” |
خراسان رضوی |
طاقانکوه (گرماب) (T1) |
شکل 1- موقعیت جغرافیایی چشمه گراب 3
Figure 1- Geographical location of Garab 3 hot spring
جدول 2- ترکیبات موجود در محیط کشت مندلس
Table 2- Compounds in Mendels culture medium
|
ردیف |
ترکیب |
مقدار |
|
1 |
(NH4)2SO4 |
g L-1 4/1 |
|
2 |
KH2PO4 |
g L-1 2 |
|
3 |
CaCl2 |
g L-1 3/0 |
|
4 |
MgSO4 |
g L-1 3/0 |
|
5 |
ZnSO4.7H2O |
mL-1 1 |
|
6 |
CoCl2.6H2O |
mL-1 1 |
|
7 |
FeSO4.7H2O |
mL-1 1 |
|
8 |
MnSO4.7H2O |
mL-1 1 |
|
9 |
Proteose peptone |
g L-1 75/0 |
|
10 |
Tween 80 |
g 2 |
|
11 |
CMC-Na |
g L-1 10 |
|
12 |
Urea |
g L-1 3/0 |
ارزیابی اولیه فعالیت اندوگلوکانازی و غربالگری جدایهها: برای ارزیابی تولید آنزیم در جدایهها، ابتدا جدایهها در محیط پیشکشت کشت داده شدند که حاوی ترکیبات موجود در محیط کشت Mendels مطابق جدول 2 بودند. سپس به میزان 2 درصد از پیشکشت به محیط کشت اصلی تولید آنزیم تلقیح شد که مشابه با همان محیط مندلس بود، با این تفاوت که تنها منبع کربن آن سبوس گندم (5/2 درصد) بود و سپس به مدت 48 ساعت در انکوباتور 45 درجه سانتیگراد گرمخانهگذاری شدند. بعد از آن، محیط کشتهای حاوی آنزیم با دور rpm 10000 و به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی حاصل بهعنوان محلول آنزیمی در مراحل بعدی استفاده شد. غربالگری اولیه باکتریهای جداشده براساس شاخص فعالیت کیفی اندوگلوکاناز روی محیط حاوی کربوکسی متیل سلولز 1/0 درصد و آگارز با رنگآمیزی قرمز کنگو و براساس بزرگی و شفافیت هاله انجام شد که نشاندهندة فعالیت سلولازی بود (8).
سنجش کمی فعالیت اندوگلوکانازی: با هدف غربالگری و مقایسه فعالیت اندوگلوکانازی جدایهها میزان فعالیت آنزیمها با یکدیگر مقایسه شدند (شکل 2). برای سنجش فعالیت آنزیم از روش میلر و حضور معرف دینیترو سالسیلیک اسید ([1]DNS) استفاده شد. فعالیت اندوگلوکاناز به روش DNS ازطریق مقدار قندهای کاهنده آزادشده در طول هیدرولیز اندازهگیری شد. در این روش آنزیمهای خام در معرض سوبسترای کربوکسی متیل سلولز و در دمای 50 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه تیمار شدند. برای توقف واکنش محلول DNS به آن اضافه شد (15). یک واحد فعالیت آنزیم سلولاز معادل مقدار آنزیم مورد نیاز برای آزادسازی یک میکرومول گلوگز در یک دقیقه از سوبسترا در شرایط آزمایش است. برای غربالگری اولیه سویههای مولد آنزیم، از اندوگلوکاناز تجاری شرکت نوآزایم (Novozymes A/S (Bagsværd, Denmark) بهعنوان کنترل مثبت استفاده شد.
شناسایی مولکولی سویه منتخب: در گام نخست رنگآمیزی گرم و مشاهده میکروسکوپی برای شناسایی سویهها بهرهبرداری شد (16). در ادامه و با هدف شناسایی مولکولی باکتری منتخب مولد سلولاز، آزمون PCR با استفاده از آغازگرهای عمومی شامل 4f: 5'- TATCGGAGAGTTTGATCCTGG -3' و 1541r: 5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3' بهمنظور تکثیر ژن 16S rRNA انجام شد. به این منظور، DNA ژنومی جدایه منتخب با استفاده از کیت (PGA Bacterial DNA Extraction) استخراج شد. برنامه PCR در 35 چرخه بعد از دناتوراسیون اولیه در 95 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه، شامل دناتوراسیون، اتصال و طویلسازی در دمای 93، 53 و 72 درجه سانتیگراد بهترتیب برای مدت 45، 60 و 90 ثانیه و با مرحله طویلسازی نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انجام شد. برای بررسی محصول PCR الکتروفورز انجام شد. تخلیص محصول PCRبا استقاده از کیت FavorPrep purification Mini kit صورت گرفت. پس از تخلیص، غلظت DNAژنومی در طول موج 260 نانومتر سنجش شد و بهمنظور تعیین توالی به شرکت Bioneer کره جنوبی ارسال شدند. همگونیابی نوکلئوتیدی براساس توالیهای 16S rRNA با استفاده از پایگاه اطلاعاتی EzTaxon انجام شد (https://www.ezbiocloud.net). درخت فیلوژنتیک با استفاده از نتایج حاصل از مقایسه توالیها براساس پایگاه داده EzBiocloud (17) و توسط نرمافزار MEGA X 11 ساخته شد (18). آنالیز فیلوژنی با روش آماری Neighbor-Joining با 1000 بوت استرپ (Bootstrap) انجام شد.
شکل 2- نمودار منحنی استاندارد گلوکز
Figure 2- Glucose standard curve diagram
پایداری حرارتی اندوگلوکانازها: برای مقایسه پایداری حرارتی باکتریهای منتخب اولیه، فعالیت باقیمانده اندوگلوکانازی آنها طی تیمار حرارتی در دماهای 55، 60، 70 و 80 درجه سانتیگراد با فواصل زمانی 1، 2 و 3 ساعت انجام شد. آنزیم اولیه بدون هیچگونه تیمار حرارتی بهعنوان مبنا و 100 درصد فعالیت در نظر گرفته شد. سپس سنجش فعالیت آنزیمی نمونههای تیمارشده با روش DNS ارزیابی شد (8، 15، 19).
ارزیابی پایداری حرارتی pH اندوگلوکانازها: برای مقایسه پایداری pH، محلولهای آنزیمی در pHهای مختلف شامل 4، 7 و 10 با غلظت 05/0 مولار تیمار شدند. فعالیت باقیمانده اندوگلوکانازهای جدایهها، طی 1، 2 و 3 ساعت تیمار، در شرایط استاندارد فعالیت آنزیم توسط بافرهای pH مختلف و با روش DNS بررسی شد (8، 15).
تجزیه و تحلیل آماری دادهها: تمامی آزمونهای انجامشده در این تحقیق در سه تکرار انجام شدند. آنالیزها به روش ANOVA One-way و ANOVA Two-way انجام شدند. 0 /05 P < بـرای نمونـهها بـهعنـوان اختلاف معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
جداسازی باکتری: براساس غربالگری اولیه از نمونههای جمعآوریشده از چشمههای طاقانکوه، باکتری هیدرولیزکنندة سلولز در شرایط استفادهشده جداسازی نشد؛ با وجود این، این غربالگری روی نمونههای مرتبط با چشمه G3 آب گرم گراب منجر به رشد، جداسازی و خالصسازی 8 جدایه باکتریایی تولیدکنندة سلولاز پس از 18 ساعت گرمخانهگذاری در دمای 37 و 45 درجه سانتیگراد شد (جدول 1). طی غربالگری ثانویه این جدایهها روی محیط کشت معرفیشده و در محیط نمکی 5/0 درصد، 3 درصد و 6 درصد بهترتیب 1، 5 و 2 جدایه جداسازی شد (جدول 1).
تعیین مشخصات میکروسکوپی جدایهها: شناسایی اولیه باکتریهای رشدیافته براساس فنوتیب و رنگآمیزی گرم (شکل 3)، گرم مثبت بودن جدایههای رشدیافته شامل G3M1، G331، G334، G335 و G362 را آشکار کرد. براساس این ارزیابیها 2 جدایه شامل G333 و G361 گرم منفی تشخیص داده شدند. همچنین، مشاهدات میکروسکوپی نشان داد دو جدایه G362 و G3M1 جزء باسیلهای گرم مثبت تشکیلدهندة اسپور هستند.
شکل 3- ارزیابیهای میکروسکوپی برخی جدایههای رشدیافته پس از رنگآمیزی گرم
Figure 3- Microscopic evaluations of some isolates grown after gram staining
ارزیابی فعالیت آنزیمی: سنجش فعالیت اندوگلوکانازی 8 جدایه انتخابی به روش کیفی و کمی در مقایسه با آنزیم صنعتی بهعنوان کنترل انجام شد. ارزیابی اندازه و شفافیت هاله ناشی از فعالیت اندوگلوکانازی جدایههای انتخابی روی بستر حاوی کربوکسی متیل سلولز 1/0 درصد بهعنوان شاخص کیفی مبنای اولیه انتخاب جدایههای فوق برای آزمونهای تکمیلی قرار گرفت (شکل 4). علاوه بر این، میزان فعالیت کمی جدایه با روش DNS انجام شد که در مجموع چهار جدایه شامل G362، G3M1، G331 و G335 بهترتیب با فعالیت 37/0، 3/0، 12/0 و 1/0 میکرومول بر دقیقه بر میلیلیتر فعالیت بیشتری نشان دادند (جدول 3 و شکل 4-الف). براساس این، میتوان چنین جمعبندی کرد که بیشترین فعالیت اندوگلوکانازی بهترتیب در جدایههای G362 و G3M1 بود. برای ارزیابی تحملپذیری و رشد باکتریها در نمک، تمامی جدایههای مولد اندوگلوکاناز در 3 محیط کاملاً مشابه با میزان نمکهای متفاوت 5/0، 3 و 6 درصد کشت داده شدند و هریک از این جدایهها قادر به تحمل نمک متفاوتی بودند که در جدول 3 نشان داده شدهاند.
جدول 3- مشخصات، قابلیت رشد و فعالیت جدایههای مولد اندوگلوکاناز
Table 3- Characteristics, growth ability and activity of endoglucanase producing isolates
|
|
نام جدایه |
تحمل نمک % |
دمای رشد |
نوع گرم |
فعالیت اندوگلوکانازی (µmol min-1 mL-1) |
|
1 |
G362 |
6 |
45/37 |
مثبت |
37/0 |
|
2 |
G361 |
6 |
45/37 |
منفی |
04/0 |
|
3 |
G332 |
3 |
45/37 |
مثبت |
03/0 |
|
4 |
G333 |
3 |
45/37 |
منفی |
04/0 |
|
5 |
G334 |
3 |
45/37 |
مثبت |
04/0 |
|
6 |
G3M1 |
0.5 |
45/37 |
مثبت |
03/0 |
|
7 |
G335 |
3 |
45/37 |
مثبت |
1/0 |
|
8 |
G331 |
3 |
45/37 |
مثبت |
12/0 |
|
- |
آنزیم صنعتی (کنترل) |
- |
- |
- |
47/0 |
|
|
|
|
الف (A) |
ب (B) |
شکل 4- سنجش کیفی (الف) و کمی (ب) فعالیت اندوگلوکانازی 8 جدایه . الف) مرکز پلیت آنزیم صنعتی بهعنوان کنترل مثبت. اعداد 1-8 نشاندهندة کد جدایهها به شرح زیر هستند: 1:G362, 2: G332, 3:G333, 4: G334, 5: G334, 6: G3M1, 7:G335, 8: G331. ب) نمودار فعالیت اندوگلوکانازی 8 جدایه باکتریایی. علامت **** بیانکنندة سطح اختلاف معنیدار با گروه کنترل است (p < 0 /0001).
Figure 4- Qualitative (A) and quantitative (B) measurement of endoglucanase activity of eight isolates. A) industrial enzyme in the center of plate as a positive control. The numbers 1-8 show the code of isolates as follows: 1:G362, 2:G332, 3:G333, 4:G334, 5:G334, 6:G3M1, 7:G335, 8:G331. b) endoglucanase activity of eight bacterial isolates. The sign **** indicates the level of significant difference with the control group (p < 0.0001).
ارزیابی پایداری حرارتی اندوگلوکانازها: برای ارزیابی اولیه پایداری حرارتی اندوگلوکاناز دو جدایه منتخب از لحاظ فعالیت کمی، یعنی G362 و G3M1 میزان فعالیت باقیمانده طی تیمار حرارتی در دماهای 55 درجه سانتیگراد طی سه ساعت، در مقابل دو سویه دیگر مولد سلولاز مقاوم حرارت (G162 و G25031) بررسی شد که در تحقیق مکمل در دست انتشار به دست آمده است. نتایج فعالیت باقیمانده جدایههای انتخابی براساس آزمون کیفی شفافیت و اندازه هاله ناشی از فعالیت اندوگلوکانازی طی تیمار حرارتی نشان دادند جدایه G3M1 طی 3 ساعت تیمار حرارتی نسبت به سویه کنترل خود (G25031) میزان بیشتری از فعالیت آنزیمی خود را حفظ کرد (شکل 5-الف). همچنین طی تیمار حرارتی 55 درجه سانتیگراد، اندوگلوکاناز حاصل از جدایه G362، نسبت به سویه کنترل خود (G161) تقریباً عمده فعالیت خود را طی دو ساعت اول حفظ کرد؛ گرچه در ساعت سوم افت فعالیت نشان داد (شکل 5-ب).
|
الف (A) |
ب (B) |
شکل 5- ارزیابی اولیه پایداری حرارتی اندوگلوکانازهای جدایههای منتخب به روش کیفی طی 3 ساعت تیمار حرارتی در دمای 55 درجه سانتیگراد. الف) شمارههای 1-4 و 5-8 بهترتیب مربوط به فعالیتهای مبنا و باقیمانده اندوگلوکانازی جدایههای G3M1 و G25031 طی ساعتهای یک تا سه تیمار حرارتی است. ب) شمارههای 1-4 و 5-8 بهترتیب مربوط به فعالیتهای مبنا و باقیمانده اندوگلوکانازی جدایههای G162 و G362 طی ساعتهای یک تا سه تیمار حرارتی است.
Figure 5- Qualitative evaluation of the thermal stability of endoglucanases of the selected isolates during 3 hours of heat treatment at 55°C. Numbers 1-4 and 5-8 show the primary and residual endoglucanase activities of G3M1 and G25031 isolates in (A) and of G162 and G362 in (B), respectively.
در ادامه ارزیابی کمی و مقایسهای میزان فعالیت اندوگلوکانازی باقیمانده 2 جدایه انتخابی در دماهای 60، 70 و 80 درجه سانتیگراد طی مدت زمان 3 ساعت تیمار حرارتی، با فاصله زمانی 1 ساعت بررسی شد. در بررسی پایداری حرارتی میزان فعالیت باقیمانده آنزیم سویه G362 و G3M1 نسبت به هریک از کنترلهای آنها بهطور معناداری (p < 0 /0001) کاهش یافت؛ درحالیکه در جدایه G3M1 در دمای 60 درجه سانتیگراد با گذشت 3 ساعت در مقایسه با کنترل، پایداری حرارتی آنزیم بهطور معناداری (p < 0 /0001) افزایش یافت. در سویه G3M1 در دمای 70 درجه سانتیگراد با گذشت زمان در مقایسه با کنترل، پایداری حرارتی آنزیم بهطور معناداری (p < 0 /0001) کاهش یافت و در دمای 70 درجه سانتیگراد به مدت 2 ساعت فقط 50 درصد از فعالیت خود را حفظ کرد. در سویه G362 در دمای 60 درجه سانتیگراد با گذشت 3 ساعت در مقایسه با کنترل، پایداری حرارتی آنزیم بهطور معناداری (p < 0 /0001) کاهش یافت و در دمای 70 درجه سانتیگراد در همان 1 ساعت اول فعالیت خود را ازدست داد؛ اما در دمای 80 درجه سانتیگراد هر دو جدایه G362 و G3M1 فعالیت خود را کاملاً از دست دادند (شکل 6).
شکل 6- مقایسه میزان پایداری حرارتی فعالیت اندوگلوکانازی جدایههای انتخابی، مبنا: در زمان صفر و بدون تیمار حرارتی، H-60: در دمای ۶۰ درجه سانتیگراد، H-70: در دمای ۷۰ درجه سانتیگراد و H-80: در دمای ۸۰ درجه سانتیگراد در طول مدت 1، 2 و 3 ساعت تیمار حرارتی. گروه کنترل آنزیم بدون هیچگونه تیمار حرارتی است. علامت **** بیانکنندة سطح اختلاف معنیدار با گروه کنترل است (p < 0 /0001).
Figure 6. The thermal stability of endoglucanase activity in the selected isolates. The control group represents the enzyme without any heat treatment. The reference points include H-60 (at 60°C), H-70 (at 70°C), and H-80 (at 80°C) for durations of 1, 2, and 3 h of heat treatment. The notation **** indicates a statistically significant difference compared to the control group (p < 0.0001).
سنجش قابلیت پایداری pH اندوگلوکانازها: نتایج حاصل از ارزیابی پایداری آنزیم سویه G362 و G3M1 در pHهای 4، 7 و 10 در بازه زمانی 6 ساعت بررسی شدند. براساس این، در pHهای 7 و 4 طی دو ساعت اولیه فعالیت آنزیم تغییر محسوسی نشان نداد. به عبارتی میزان فعالیت باقیمانده نسبت به هریک از کنترلهای آنها طی 2 ساعت غیرمعنادار بود (p > 0.05).
نتایج ارزیابی اثر pHبر فعالیت اندوگلوکانازی 2 جدایه منتخب در pH 4 در بازههای زمانی 4 و 6 ساعت نشان دادند درصد فعالیت باقیمانده آنزیمی در جدایه G362 در pH 4 بهترتیب 85/80 و 65/80 درصد بود که بهطور معناداری فعالیت اندوگلوکانازی حفظ شده است؛ درحالیکه در مورد جدایه G3M1، بهترتیب 96 و 93 درصد بود که بهطور معناداری کاهش یافت؛ اما طی 6 ساعت افت فعالیت نشان نداد (شکل 7).
با افزایش pH به 10، فعالیت باقیمانده آنزیم جدایههای G362 طی بازههای زمانی 2، 4 و 6 ساعت بهترتیب 62/91، 51/88 و 71/88 درصد بود؛ درحالیکه در مورد جدایه G3M1 فعالیت باقیمانده آنزیم بهترتیب 03/88، 97/87 و 78/68 درصد است که این نشان داد فعالیت باقیمانده جدایه G3M1 بهطور معناداری کاهش داشته است؛ اما فعالیت اندوگلوکانازی جدایه G362 بهطور معناداری در pH قلیایی حفظ شده است (شکل 7). این ارزیابیها حفظ قابلیت اندوگلوکانازی جدایههای انتخابی بهترتیب در ارتباط با G362، G3M1 را در محدوده وسیع pH آشکار کرد. بهطور کلی نتایج حاصل از این ارزیابیها به معرفی اندوگلوکاناز حاصل از جدایه G362 و G3M1 با قابلیت مقاومت به اسید و قلیا در محدوده pH 4 تا 10 منجر شد. همچنین، تحملپذیری 6 درصدی سویه G362 در مقابل تحملپذیری 5/0 درصدی G3M1 و میزان کمیت فعالیت آن قابل توجه بود؛ براساس این، جدایه G362 بهعنوان سویه منتخب برای مطالعات بیشتر در نظر گرفته شد.
شکل 7-مقایسه فعالیت باقیمانده اندوگلوکانازی جدایهها در مدت زمان 6 ساعت و در بازههای زمانی 2، 4 و 6 ساعت در pH 4 ، pH 7 و pH 10 . علامت * بیانکنندة سطح اختلاف معنیدار با گروه کنترل است ( 0/016:p). علامت ** بیانکنندة سطح اختلاف معنیدار با گروه کنترل است (p: 0/0013). علامت *** بیانکنندة سطح اختلاف معنیدار با گروه کنترل است (p: 0 /0004). علامت **** بیانکنندة سطح اختلاف معنیدار با گروه کنترل است (p: 0 /0001). علامت ns بیانکنندة سطح غیرمعنادار است.
Figure 7. The residual endoglucanase activity in selected isolates over a 6h period at intervals of 2, 4, and 6 h at pH 4, pH 7, and pH 10. * indicates a statistically significant difference compared to the control group (p < 0.016). ** indicates a statistically significant difference compared to the control group (p < 0.0013). *** indicates a statistically significant difference compared to the control group (p < 0.0004). **** indicates a statistically significant difference compared to the control group (p < 0.0001). ns indicates a non-significant level.
.شناسایی مولکولی و آنالیز فیلوژنتیک جدایه انتخابی: پس از غربالگریهای فوقالذکر جدایهها، جدایه منتخب G362، برای شناسایی مولکولی مبتنی بر تکثیر ژن 16S rRNA انتخاب شد. به این منظور، پس از استخراج ژنوم جدایههای انتخابی و تکثیر ژن هدف با استفاده از واکنش PCR، قطعات ژنی به اندازه تقریبی 1500 نوکلئوتیدی روی ژل آگارز 1 درصد آشکار شدند (شکل 8). پس از تعیین توالی این قطعات، جدایه G362 براساس توالی 16S rRNA در بانک ملی اطلاعات بیوتکنولوژی در GeneBank ثبت شد و با شماره شناسایی OP957018.1 در دسترس قرار گرفت. در همین راستا، شباهت توالی نوکلئوتیدی جدایه G362 با سویههایBacillus cabrialesii TE3 ، Bacillus tequilensis KCTC 13622 و Bacillus inaquosorum KCTC 13429 به میزان 93/99 درصد و با سویه باکتریایی Bacillus subtilis به میزان 86/99 درصد آشکار شد (شکل 8).
شکل 8– شناسایی مولکولی جدایه منتخب. درخت فیلوژنتیک پیوستگی - همسایگی براساس مقایسه توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA. شمارههای دسترسی برای توالیهای بهدستآمده از پایگاههای داده در پرانتز آورده شده است. درصدهای بوت استرپ در هر گره، وقوع با درختهایی با 1000 بوت استرپ را نشان میدهد. نوار 01/0 جایگزینی در هر موقعیت نوکلئوتیدی را نشان میدهد.
Figure 8- Molecular identification of the selected isolate. Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene nucleotide sequence comparison. Accession numbers for sequences obtained from databases are given in parentheses. Bootstrap percentages per node represent occurrences with trees with 1000 bootstraps. Bars indicate 0.01 substitutions at each nucleotide position.
بحث و نتیجهگیری
در این مطالعه جداسازی باکتریهای آبکافتکنندة سلولز از چشمههای طاقانکوه، گراب هدفگذاری شد. از چشمه طاقانکوه در شرایط بررسیشده در این تحقیق باکتری جداسازی نشد که میتواند دلایل مختلفی داشته باشد که نیازمند بررسی بیشتر است. تعداد محدود باکتری موجود، محدودیت مواد شیمیایی و غذایی محیط کشت استفادهشده یا وجود محدودکننده در آب چشمه، میتواند دلایل احتمالی عدم جداسازی باکتری هدف باشد. چشمه آب گرم گراب با دمای حداکثری 55 درجه سانتیگراد بهعنوان یک نقطه بکر در شمال شرق ایران که تاکنون به تنوع زیستی ریزسازوارههای آن توجه نشده است، برای اولینبار برای شناسایی باکتریهای تجزیهکنندة هوازی سلولز بررسی شد. در این تحقیق، هشت باکتری مولد سلولاز جداسازی شدند که قادر به رشد در دمای 45 درجه سانتیگراد و نمک ( 6-5/0 درصد وزنی / حجمی) بودند؛ اما هیچیک از جدایههای معرفیشده در اینجا قادر به رشد در دمای بالاتر از دمای محل نمونهبرداری (دمای چشمه گراب 50 درجه سانتیگراد) نبودند (جدول 1)؛ بنابراین، براساس طبقهبندیهای صورتگرفته جدایههای باکتریایی مولد سلولاز جداسازیشده در این تحقیق در دسته باکتریها تحملکنندة حرارت و نمک تولیدکنندة اندوگلوکاناز هستند؛ گرچه برخی از جدایههای این چشمه، آنزیمهای اندوگلوکانازی تولید کردند که در دمای بالاتر از 50 درجه سانتیگراد فعالیت نشان دادند (شکل 5 و 6). در همین راستا، اندوگلوکاناز استخراجشده از جدایه G362، به مدت 3 ساعت در دمای 55 درجه سانتیگراد فعال و پایدار بود که در مقایسه با جدایه قبلی جداشده از چشمه آب گرم دهلران، یعنی ایزوپتریکولا وریابلیس سویه IDAH9[ii] در ساعت اول تیمار تقریباً مشابه بود و نزدیک 80 درصد فعالیت اولیه را حفظ کرد؛ اما پس از 3 ساعت تیمار حرارتی افت فعالیت چشمگیری نشان داد؛ درحالیکه آنزیم جدایه G362 نزدیک به 20 درصد فعالیتش بیشتر باقی نمانده بود؛ در مورد ایزوپتریکولا این مقدار حدود 40 درصد بود (7). همچنین آنزیم بهدستآمده از این جدایه با 37/0 IU/ml فعالیت در pHهای 4، 7 و 10 بهترتیب 95، 90 و 91 درصد فعالیت باقیمانده را طی 2 ساعت حفظ کرد و افزایش زمان تیمار به 6 ساعت حداکثر 20 درصد افت فعالیت را موجب شد. ضمن اینکه جدایه منتخب در این تحقیق تحمل نمک 6 درصد را نشان داد؛ بنابراین، این جدایه از لحاظ پایداری در دامنه وسیع pH میتواند شایان توجه قرار گیرد. طبق گزارشاتی، جدایههای باکتریایی نمکدوست برای تولید آنزیمهایی مانند آمیلاز، پروتئاز، لیپاز و گلوتامیناز از رسوبات در هند شناسایی و تعیین مشخصات شدند که فعالیتهای ترکیبی هیدرولیتیک این جدایههای باکتریایی نمکدوست را میتوان برای تبدیل زیستی مواد ارگانیک به محصولات مفید استفاده کرد (20). در مطالعات دیگر حفظ فعالیت و پایداری اندوگلوکانازهای باکتریهای جداسازیشده از چشمههای آب گرم و همچنین خصوصیات بیوشیمیایی یک اندوگلوکاناز جدید از خانواده 5 گلیکوزید هیدرولاز مقاوم به حرارت و نمک از متاژنوم چشمههای آب گرم تعیین شد ( 22، 21).
با توجه به پایداری و مقاومت اندوگلوکاناز مشتق از جدایه باسیلوس G362 در طیف گستردهای از pH و تحملپذیری به نمک 6 درصد، میتواند بهعنوان سویه نسبتاً هالوفیل (23)، گزینهای مناسب برای بهرهبرداری مستقیم و غیرمستقیم برای بهینهسازی و کاربرد در صنایع وابسته باشد (1).
از سوی دیگر، تعیین توالی ژن 16S rRNA و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیک جدایههای منتخب از چشمه آب گرم گراب در شمال شرق ایران، همردیفی 99 تا 100 درصد این توالی با اطلاعات توالیهای ذخیرهشده در پایگاه داده GenBank و EzTaxon را آشکار کرد. آنالیز فیلوژنتیک برحسب همردیفیهای آشکارشده برای تعیین ارتباط تکاملی و وابستگی جدایه منتخب G362 تعلق جدایه به گونههای باسیلوس را آشکار کرد (شکل 8) که این نتایج در توافق با سایر تحقیقات در خصوص حضور غالب جنس باسیلوس در محیطهای افراطی و سخت از لحاظ دما است (16). بهطور کلی باکتریهای متعلق به جنس Bacillus و Thermus بیشتر بهعنوان هوازی، گرمادوست هتروتروف و در سیستمهای حرارتی با pH خنثی تا قلیایی یافت میشوند (16) که این موضوع در ارتباط با برخی جدایههای حاصل از این تحقیق همخوانی دارد.
غربالگری باکتریهای تحملکنندة حرارت با قابلیت تولید سلولاز مقاوم به حرارت و pH و دستیابی به گونههای جدید برای افزودن به ذخایر ژنتیکی کشور، راهبردی در مسیر ایجاد بانک میکروبی و استفاده از آنها است که نتایج حاصل از این ارزیابیها منجر به معرفی اندوگلوکاناز مقاوم به اسید و قلیا در محدوده pH 4 تا 10 حاصل از باسیلوس سویه G362 شد که میتوان پس از همسانهسازی برای شناسایی ژن اختصاصی اندوگلوکاناز و ارزیابی قابلیت کاربردی آن به طریق مهندسی پروتئین بیشتر بررسی کرد.
سپاسگزاری
از همکاری سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، بهویژه پژوهشکده زیست فناوری و مرکز کلکسیون میکروارگانیسمهای صنعتی ایران و همچنین دانشگاه فردوسی مشهد بهویژه پژوهشکده زیست فناوری صمیمانه تشکر میشود.
[1]. Dinitrosalicylic acid (DNS)
[ii]. Isoptericola variabilis sp. IDAH9
Kumar S, Karan R, Kapoor S, Singh SP, Khare SK. Screening and isolation of halophilic bacteria producing industrially important enzymes. Brazilian Journal of Microbiology. 2012 Oct 1;43(4):1595.-603. https://doi.org/10.1590/S1517-83822012000400044
)