اثر ضدمیکروبی نانوذرات اکسید ساماریوم سنتزشده با کورکومین روی سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم چند دارویی

مقدمه

فناوری نانو به‌عنوان بخشی پویا و درحال توسعه در جهان پدیدار شده است. نانوذرات به‌عنوان یک ذره در مقیاس نانو از 1 تا 100 نانومتر تعریف می‌شوند. نانوذرات به‌دلیل نسبت سطح به حجم بیشتر، خواص منحصربه‌فرد و بهبودیافته‌ای دارند (1). نانوذرات دارای طیف وسیعی از کاربردها در زیست پزشکی، تغذیه، شیمی‌دارویی، سیستم‌های تحویل دارو و غیره هستند. محصولات مبتنی بر نانوذرات در زمینه‌های مختلفی ازجمله زیست‌فناوری^[1]، بیوانفورماتیک و پزشکی استفاده می‌شوند. مواد بیوسنتزی مبتنی بر نانو برای کاربردهای پزشکی مفید، سازگار با محیط زیست، غیرسمی و ارزان هستند. نانومواد مزایای بی‌شماری در صنایع داروسازی ارائه می‌دهند. از نانوذرات فلزی در تشخیص بیماری برای ساخت دستگاه‌ها و همچنین کنترل بیماری‌هایی مانند سرطان و عفونت باکتریایی استفاده می‌شود (2).

به‌منظور سنتز نانوذرات از روش‌های فیزیکی آسیاب گلوله‌ای، تبخیر حرارتی و لیتوگرافی و همچنین روش‌های مختلف شیمیایی نظیر الکترولیز، احیای شیمیایی، پیرولیز و سل-ژل استفاده می‌شود. از معایب این روش‌ها می‌توان به استفاده از مواد شیمیایی و سمی، استفاده از فشار، دما و انرژی‌های بالا در فرایند واکنش، هزینه تولید بالا و دشواربودن تصفیه محصول نهایی اشاره کرد؛ با این حال، کوتاه‌بودن زمان سنتز، بازدهی بالا، باریک‌بودن محدوده توزیع اندازه ذرات، قابلیت تولید در مقیاس بالا و قابلیت کنترل اندازه و شکل نانوذرات از مزایای این روش‌ها به شمار می‌روند (3).

سنتز سبز نانوذرات، با استفاده از عوامل زیستی مختلف مانند میکروارگانیسم‌ها، آنزیم‌ها یا عصاره گیاهی به‌عنوان جایگزین‌های سازگار با محیط زیست برای روش‌های شیمیایی و فیزیکی پیشنهاد شده است. این روش یک واکنش تک‌مرحله‌ای است و یون‌های فلزی بدون نیاز به سورفکتانت و سایر عوامل پایدارکننده به نانوذره تبدیل می‌شوند (4)؛ بنابراین، محققان در سال‌های اخیر برای سنتز نانوذرات به سیستم‌های زیستی روی آورده‌اند؛ برای مثال، مونیاپان^[2] و همکاران در سال 2021، از کورکومین استخراج‌شده از گیاه کورکوما سودوموناتا^[3] برای تولید نانوذرات طلا استفاده کردند (2). همچنین نامبیار^[4] و همکاران در سال 2018، از کورکومین برای سنتز نانوذرات طلا استفاده کردند (5).

کورکومین، دمتوکسی کورکومین و بیس دمتوکسی کورکومین، ترکیبات کورکومینوییدی موجود در ریزوم گیاه زردچوبه^[5] با نام علمی کورکوما لونگا^[6] هستند (6). در این تحقیق از کورکومین برای سنتز نانوذرات اکسید ساماریوم^[7] استفاده شد. نانوذرات عناصر کمیاب خاکی مانند ساماریوم، سریم، ایتریوم، اربیوم و یوروپیوم به‌دلیل ویژگی‌های منحصربه‌فرد مغناطیسی و پایداری شیمیایی، در تشخیص پزشکی و زمینه‌های درمانی استفاده می‌شوند (7). اکسید ساماریوم (Sm₂O₃)، یکی از مهم‌ترین اکسیدهای فلزی متعلق به سری لانتانید (III)، به‌ترتیب نقاط ذوب و جوش 2335 و 4118 درجه سانتی‌گراد دارد. پرتودرمانی متاستازهای استخوانی استئوبلاستیک، تحویل دارو، به‌عنوان ردیاب در سیستم تحویل دارو و خواص ضدباکتریایی نمونه‌هایی از کاربردهای پزشکی و تشخیصی ترکیبات حاوی ساماریوم هستند (8).

مقاومت آنتی‌بیوتیکی یکی از بزرگ‌ترین چالش‌های بهداشتی در سراسر جهان است. استفاده بیش از‌ حد از آنتی‌بیوتیک‌ها به ظهور سویه‌های باکتریایی مقاوم به چند دارو^[8] منجر شده است که با انتقال به نسل‌های بعدی موجب گسترش بیماری‌های عفونی می‌شوند. این سویه‌های مقاوم، به عدم پاسخ باکتری‌ها به درمان استاندارد ضد‌میکروبی، ماندگاری بیماری و افزایش خطر مرگ منجر می‌شوند (9)؛ بنابراین، برای جلوگیری از رشد باکتری‌ها باید به دنبال عوامل ضد‌باکتریایی جدید بود. در بسیاری از مطالعات، استفاده از نانوذرات فلزی نتایج امیدوارکننده‌ای را در برابر مقاومت آنتی‌بیوتیکی نشان داده است (10).

سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس از عوامل بیماری‌زای مهم و عوامل شایع عفونت‌های بیمارستانی هستند که مقاومت آنها به آنتی‌بیوتیک‌های رایج به سرعت درحال افزایش است. این باکتری‌ها مسئول طیف وسیعی از عفونت‌ها نظیر عفونت‌های تنفسی، درماتیت، باکتریمی، عفونت‌های گوارشی، ادراری، دستگاه تنفس تحتانی و فوقانی، سندرم شوک سمی، مننژیت، استئومیلیت و اندوکاردیت هستند (11، 12). مطالعات متعددی اثر ضدمیکروبی نانوذرات مختلف را نشان داده‌اند؛ با این حال، مطالعات بسیار اندکی در رابطه با پتانسیل ضدباکتریایی نانوذرات اکسید ساماریوم انجام شده است. بنابراین در این مطالعه، هدف ما تعیین پتانسیل ضدباکتریایی نانوذرات اکسید ساماریوم علیه سویه‌های بالینی و استاندارد سودوموناس آئروژینوزا^[9] و استافیلوکوکوس اورئوس^[10] برای نخستین‌بار است.

 مواد و روش‌ها

سنتز نانوذرات اکسید ساماریوم: در این مطالعه، سنتز زیستی نانوذرات اکسید ساماریوم با استفاده از کورکومین انجام شد. در ابتدا محلول 1/0 مولار ساماریوم نیترات 6 آبه^[11] در 20 میلی‌لیتر آب مقطر تهیه شد. در بشر جداگانه‌ای محلول 2/0 مولار کورکومین در 20 میلی‌لیتر سود 5/0 مولار، تهیه و به‌صورت قطره‌ای به 20 میلی‌لیتر محلول 1/0 مولار ساماریوم نیترات اضافه شد و روی همزن مغناطیسی با دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 ساعت قرار گرفت. با انجام واکنش‌های اکسیداسیون - احیا، احیای یون‌های ساماریوم به نانوذرات اکسید ساماریوم صورت گرفت. سپس سانتریفیوژ با سرعت 4000 دور در دقیقه به مدت 30 دقیقه انجام گرفت و رسوب به‌دست‌آمده به‌ترتیب با آب و اتانول شستشو داده و به مدت 1 ساعت در آون 80 درجه سانتی‌گراد خشک شد. درنهایت، تکلیس^[12] در کوره صدا خفه کن^[13] به مدت 4 ساعت در 700 درجه سانتی‌گراد انجام گرفت (13).

بررسی ویژگی‌های نانوذرات: با استفاده از میکروسکوپ الکترونی عبوری^[14] (TEM)، شکل نانوذرات سنتزشده شناسایی شد و با کمک نرم‌افزارهای imageJ و Origin اندازه متوسط نانوذرات به دست آمد. نانوذرات به‌منظور آماده‌سازی برای تصویربرداری، ابتدا در آب مقطر به‌صورت سوسپانسیون درآمدند و با استفاده از حمام اولتراسونیک، سونیکیت شدند. سپس یک قطره از آن روی شبکه مسی با پوشش کربن قرار گرفت و اجازه داده شد در دمای اتاق خشک شود؛ درنهایت، تصویربرداری با میکروسکوپ الکترونی عبوری (EM208S, 100 kV, Philips, Netherlands) انجام گرفت. همچنین با استفاده از پراش اشعه ایکس^[15] (XRD) (Philips PW 1730, Netherlands)، ساختار کریستالی نانوذرات، بررسی و از روش پراش انرژی پروتو ایکس (EDX)^[16] (EDS, Ultim Max, Oxford Instruments, UK) برای تجزیه و تحلیل عنصری نانوذرات سنتزشده استفاده شد. اندازه‌گیری فشار هیدرودینامیکی و تعیین میزان بار الکتریکی نانوذرات سنتزشده به‌ترتیب با استفاده از آزمون‌های پراکنش دینامیک نور (DLS)^[17] و پتانسیل زتا با دستگاه (SZ-100 Horiba nanoparticle analyzer, Japan) انجام شد. برای انجام آزمون DLS، نانوذرات در آب به‌صورت سوسپانسیون درآمدند و پس از سونیکیت‌شدن، زیر تابش نور لیزر قرار گرفتند؛ براساس پراکندگی و تغییرات شدت نور، توزیع اندازه ذرات محاسبه شد.

باکتری‌های مطالعه‌شده: کشت‌های لیوفیلیزه سویه‌های استاندار سودوموناس آئروژینوزا PTCC 1430 و استافیلوکوکوس اورئوس PTCC 1431 از مرکز کلکسیون قارچ‌ها و باکتری‌های صنعتی ایران تهیه شدند. برای فعال‌سازی سویه‌های لیوفیلیزه، سوسپانسیونی در محیط تریپتیک سوی‌براث^[18]، تهیه و در محیط تریپتیک سوی‌آگار در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت دو بار کشت داده شد. همچنین سویه‌های مقاوم چند دارویی سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس جداشده از نمونه خون بیماران مراجعه‌کننده به بیمارستان قائم شهرستان رشت دریافت شدند.

.ارزیابی مقاومت آنتی‌بیوتیکی سویه‌های مطالعه‌شده: برای سنجش حساسیت آنتی‌بیوتیکی سویه‌های مطالعه‌شده، از روش استاندارد کربی - بائر و طبق دستورالعمل کمیته ملی معیارهای آزمایشگاهی بالینی^[19] M100-S28 2018 استفاده شد (14، 15). بدین منظور از کشت 24 ساعته باکتری‌ها، سوسپانسیونی با کدورت نیم مک‌فارلند در محیط مولر هینتون براث تهیه شد. سپس با استفاده از سواب پنبه‌ای سترون از سوسپانسیون باکتریایی به‌صورت یکنواخت در سطح محیط مولر هینتون آگار تلقیح شد. پس از چند دقیقه، دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی با استفاده از پنس سترون در سطح محیط کشت قرار داده شد. پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه‌ سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. پس از اتمام زمان گرماگذاری، اندازه‌گیری قطر هاله عدم رشد با استفاده از خط‌کش صورت گرفت و با استفاده از جدول استاندارد، وضعیت مقاومت و حساسیت هریک از سویه‌های بالینی و استاندارد به هریک از آنتی‌بیوتیک‌ها مشخص شد. دیسک‌های آنتی‌بیوتیکی استفاده‌شده در این مطالعه از شرکت پادتن‌طب تهیه شد که برای سودوموناس آئروژینوزا شامل ایمی‌پنم (10)، جنتامایسین (10)، سیپروفلوکساسین (5) و نورفلوکساسین (10) و برای استافیلوکوکوس شامل اورئوس سیپروفلوکساسین (5)، کلیندامایسین (2)، اریترومایسین (15) و پنی‌سیلین (10) بودند.

.بررسی خاصیت ضدمیکروبی نانوذرات با روش انتشار از دیسک: به‌منظور بررسی خاصیت ضدمیکروبی نانوذرات با روش انتشار از دیسک، ابتدا سوسپانسون میکروبی معادل نیم مک‌فارلند از باکتری‌های مطالعه‌شده (بالینی و استاندارد) تهیه و در محیط مولر هینتون آگار توسط سواپ استریل به‌صورت یکنواخت کشت داده شد. سپس از هر رقت نانوذره (200-6/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر) به مقدار 30 میکرولیتر روی دیسک‌های بلانک (قطر 6 میلی‌متر) اضافه شد و روی کشت باکتری هدف قرار گرفتند. بعد از گرماگذاری به مدت 24 ساعت در 37 درجه‌ سانتی‌گراد، قطر هاله عدم رشد محاسبه شد (14).

تعیین حداقل غلظت بازدارندگی رشد و حداقل غلظت کشندگی: حداقل غلظت بازدارندگی رشد^[20] نانوذرات با استفاده از روش میکرودایلوشن براث تعیین شد. برای این منظور از میکروپلیت استریل 96 خانه‌ای Nest استفاده شد. ابتدا غلظت‌های سریالی 200-56/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر از نانوذره در مولر هینتون براث تهیه شدند. سپس از هریک از غلظت‌های تهیه‌شده 100 میکرولیتر برداشته و داخل خانه‌های میکروپلیت ریخته شد. سپس به خانه‌ها 100 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی 10⁶ x5/1 اضافه شد. در یک ردیف تنها محیط کشت به‌عنوان کنترل منفی و یک ردیف محیط کشت و سوسپانسیون به‌عنوان کنترل مثبت اضافه شد. میکروپلیت به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. سپس، چاهک‌ها ازنظر کدورت بررسی شدند. چاهک حاوی کمترین غلظت نانوذره که هیچ کدورتی در آن مشاهده نشد، به‌عنوان حداقل غلظت بازدارندگی رشد در نظر گرفته شد.

برای تعیین حداقل غلظت کشندگی^[21]، از چاهک‌هایی که کدورتی در آن مشاهده نشد روی محیط مولر هینتون آگار کشت داده شد و پس از 24 ساعت گرماگذاری، کمترین غلظتی از نانوذره که باکتری در آن رشد نکرد به‌عنوان حداقل غلظت کشندگی گزارش شد (15).

بررسی تأثیر نانوذرات ساماریوم بر تولید .فاکتورهای بیماری‌زایی (رنگدانه پیوسیانین و .آلژینات) در باکتری سودوموناس آئروژینوزا

.بررسی تولید رنگدانه پیوسیانین: از کشت تازه سودوموناس سوسپانسیونی با کدورت 04/0 در دانسیته نوری 600 نانومتر به ارلن‌های حاوی 25 میلی‌لیتر مولر هینتون براث بدون و همراه با غلظت 5/0 MIC نانوذره تلقیح شد. سپس ارلن‌ها به مدت 48 ساعت در شیکر انکوباتور 37 درجه سانتی‌گراد، با چرخش 200 دور در دقیقه قرار گرفتند. پس از گرماگذاری، مایع رویی کشت^[22] توسط 10 دقیقه سانتریفیوژ با چرخش 4000 دور در دقیقه جداسازی شد. سپس به 6 میلی‌لیتر از مایع رویی کشت، 3 میلی‌لیتر کلروفرم اضافه شد و 10 مرتبه به مدت 2 ثانیه توسط همزن ادغام شدند. کلروفرم در ته لوله قرار گرفت و به تدریج رنگ آن آبی مایل به سبز شد؛ زیرا پیوسیانین در کلروفرم حل می‌شود. نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه با چرخش 1000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند و 2 میلی‌لیتر از لایه آبی رنگ در ته لوله (کلروفرم و پیوسیانین) به لوله جدید، منتقل و 1 میلی‌لیتر از اسید کلریدریک^[23] 1/0 نرمال به آن اضافه شد و توسط همزن ادغام شدند تا محیط اسیدی شود. رنگ محیط از آبی به صورتی تغییر کرد. نمونه‌ها به مدت 2 دقیقه با چرخش 1000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. 1 میلی‌لیتر از مایع صورتی رنگ به کووت انتقال داده و جذب آن در طول موج 520 نانومتر خوانده شد (16). غلظت پیوسیانین با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:

(حجم اسید کلریدریک) 1 x (ضریب تضعیف مولی) 072/17 x (520 نانومتر) میزان جذب = غلظت پیوسیانین (میکروگرم/میلی‌لیتر)

بررسی تولید آلژینات: سودوموناس آئروژینوزا در محیط مولر هینتون آگار بدون و همراه با غلظت 5/0 MIC نانوذرات کشت داده شد. پس از 24 ساعت گرماگذاری، گرانروی^[24] آلژینات با استفاده از آزمون رشته‌ای^[25] بررسی شد (17).

 نتایج.

بررسی ویژگی‌های نانوذرات: نتایج به‌دست‌آمده از میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM) سنتز نانوذرات اکسید ساماریوم با ساختار مکعبی را تأیید کردند (شکل 1). بررسی الگوی پراش اشعۀ ایکس نانوذرات سنتزشده که در زوایای °80-10=θ2 انجام شد، 4 پراش در زوایای ° 28.26، ° 32.74، ° 46.99 و ° 55.74 به‌ترتیب مربوط به صفحات 222، 400، 440 و 622 را نشان داد که با نمونه استاندارد (JCPDS card) با کد مرجع 01-088-2166 مطابقت دارد و تأییدکنندة سنتز صحیح نانوذرات اکسید ساماریوم است (شکل 3). حضور عناصر ساماریوم و اکسیژن در نانوذرات سنتزشده با تجزیه و تحلیل طیف‌سنجی EDX، تأیید و پیک مربوط به اتم‌ ساماریوم در محدوده Kev 1 مشاهده شد. وجودنداشتن عناصر دیگر، خلوص نانوذرات سنتزشده را تأیید کرد (شکل 4). نتایج حاصل از آنالیز پراش دینامیک نور (DLS) نشان دادند نانوذرات به‌طور متوسط قطر 90 نانومتر داشتند (شکل 5). درواقع در این روش اندازه نانوذرات در محیط مایع بررسی می‌شود و به‌دلیل آگلومره‌شدن نانوذرات، اندازه به‌دست‌آمده در این روش بیشتر از اندازه نانوذرات در TEM است. همچنین مقدار پتانسیل زتا برای نانوذرات اکسید ساماریوم به‌طور متوسط 4/9- میلی‌ولت ثبت شد که نشان‌دهندة پایداری کلوییدی نسبتاً خوب نانوذرات بود (شکل 6).

شکل 1- تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری نانوذرات اکسید ساماریوم

Figure 1- Transmission electron microscope image of samarium oxide nanoparticles

 شکل 2- نمودار میانگین اندازه نانوذرات اکسید ساماریوم براساس تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری

Figure 2- Size distribution histogram of samarium oxide nanoparticles based on transmission electron microscope image

شکل 3- الگوی پراش اشعه ایکس نانوذرات اکسید ساماریوم

Figure 3- X-ray diffraction pattern of samarium oxide nanoparticles

 شکل 4- نمودار پراش انرژی پرتو ایکس نانوذرات اکسید ساماریوم

Figure 4- X-ray energy diffraction diagram of samarium oxide nanoparticles

 شکل 5- شعاع هیدرودینامیکی نانوذرات اکسید ساماریوم حاصل از آنالیز تفرق نورپویا

Figure 5- Hydrodynamic radius of samarium oxide nanoparticles obtained from dynamic light scattering analysis

شکل 6- نتایج آزمون پتانسیل زتا نانوذرات اکسید ساماریوم

Figure 6- Zeta potential results of samarium oxide nanoparticles

 نتایج حاصل از تست حساسیت میکروبی مطابق شکل شماره 7 نشان دادند سویه‌های بالینی استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا به تمام آنتی‌بیوتیک‌های استفاده‌شده در این مطالعه مقاوم‌اند. همان‌طور که در شکل مشاهده می‌شود، هیچ هاله عدم رشدی در سویه بالینی سودوموناس آئروژینوزا مشاهده نشد و تنها آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین باعث ایجاد هاله عدم رشد 12 میلی‌متری در سویه بالینی استافیلوکوکوس اورئوس شد.

همچنین نتایج تست حساسیت آنتی‌بیوتیکی برای سویه‌های استاندارد در جدول 1 آورده شده‌اند. براساس نتایج، سویه‌های استاندارد سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس به تمام آنتی‌بیوتیک‌های استفاده‌شده حساس بودند (شکل 8).

در این مطالعه اثر ضدمیکروبی نانوذرات اکسید ساماریوم علیه سویه‌های استاندارد و بالینی استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا به روش هاله عدم رشد (انتشار از دیسک) بررسی شد (شکل 9 و 10). براساس نتایج حاصل از این مطالعه، نانوذرات سنتزشده به‌وسیلة کورکومین، فعالیت ضدمیکروبی مؤثری علیه سویه‌های مطالعه‌شده نشان دادند و سویه‌های بالینی نسبت به سویه‌های استاندارد خود حساسیت کمتری نشان دادند. سویه استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس و سویه بالینی سودوموناس آئروژینوزا به‌ترتیب بیشترین و کمترین میزان حساسیت را به نانوذرات داشتند. میزان هاله عدم رشد باکتری‌ها برحسب میلی‌متر در جدول 2 آمده است.

شکل 7- تست آنتی‌بیوگرام سویه بالینی سودوموناس آئروژینوزا (چپ) و سویه بالینی استافیلوکوکوس اورئوس (راست)

Figure 7- Antibiogram test of clinical strain of Pseudomonas aeruginosa (left) and clinical strain of Staphylococcus aureus (right)

 شکل 8- تست آنتی‌بیوگرام سویه استاندارد سودوموناس آئروژینوزا (چپ) و سویه استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس (راست)

Figure 8- Antibiogram test of Pseudomonas aeruginosa standard strain (left) and Staphylococcus aureus standard strain (right)

 جدول 1- نتایج حساسیت آنتی‌بیوتیکی سویه‌های استاندارد سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس

Table 1- Antibiotic susceptibility results of standard strains of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus

 شکل 9- هاله عدم رشد غلظت‌های مختلف (200-6/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر) نانوذرات اکسید ساماریوم علیه سویه‌های بالینی و استاندارد سودوموناس آئروژینوزا

Figure 9- Growth inhibition halo of different concentrations (1.6-200 mg/ml) of samarium oxide nanoparticles against clinical and standard strains of Pseudomonas aeruginosa

 شکل 10- هاله عدم رشد غلظت‌های مختلف (200-6/1 میکروگرم بر میلی‌لیتر) نانوذرات اکسید ساماریوم علیه سویه‌های بالینی و استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس

Figure 10- Growth inhibition halo of different concentrations (1.6-200 mg/ml) of samarium oxide nanoparticles against clinical and standard strains of Staphylococcus aureus

 جدول 2- قطر هاله عدم رشد (میلی‌متر) ناشی از غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید ساماریوم علیه باکتری‌های آزمایش‌شده

Table 2- Diameter of the growth inhibition halo (mm) caused by different concentrations of samarium oxide nanoparticles against the tested bacteria

 .حداقل غلظت بازدارندگی رشد و حداقل غلظت کشندگی: در این پژوهش پس از سنتز نانوذرات اکسید ساماریوم، فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات تولیدی علیه سویه‌های بالینی و استاندارد استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا بررسی شد و حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) نانوذرات اکسید ساماریوم سنتزشده و به دنبال آن آزمون تعیین حداقل غلظت کشندگی (MBC) برای هریک از نمونه‌ها انجام شد. همان‌طور که در جدول 3 نشان داده شده است، مقادیر MIC و MBC نانوذرات اکسید ساماریوم برای باکتری‌های مطالعه‌شده به‌ترتیب در محدوده 25-12/3 و 50-25/6 میکروگرم بر میلی‌لیتر بود. کمترین مقدار MIC نانوذره مربوط به سویه استاندارد استافیلوکووس اورئوس برابر با 12/3 میکروگرم بر میلی‌لیتر و بیشترین مربوط به سویه بالینی سودوموناس آئروژینوزا برابر با 25 میکروگرم بر میلی‌لیتر بود. همچنین کمترین و بیشترین میزان MBC به‌ترتیب مربوط به سویه استاندارد استافیلوکووس اورئوس و سویه بالینی سودوموناس آئروژینوزا بود.                                                                   

جدول 3- مقادیر حداقل غلظت مهاری و حداقل غلظت کشندگی نانوذرات اکسید ساماریوم

Table 3- Minimum inhibitory concentration and the minimum bactericidal concentration values of samarium oxide nanoparticles

.بررسی تأثیر نانوذرات اکسید ساماریوم بر تولید رنگدانه پیوسیانین: در این مطالعه برای بررسی اثر نانوذره بر تولید پیوسیانین، سویه‌های بالینی و استاندارد سودوموناس آئروژینوزا در محیط بدون و حاوی غلظت 5/0 MIC از نانوذره کشت داده شدند. براساس نتایج، غلظت پیوسیانین پس از تیمار با نانوذرات در سویه بالینی از 10/0±20/16 به 10/0±60/11 و در سویه استاندارد از 07/0±92/12 به 07/0± 61/6 میکروگرم بر میلی‌لیترکاهش یافت (شکل 11).

شکل 11- غلظت پیوسیانین تولیدشده توسط سویه‌های سودوموناس پس از تیمار با نانوذرات اکسید ساماریوم

Figure 11- Concentration of pyocyanin produced by Pseudomonas strains after treatment with samarium oxide nanoparticles

بررسی تولید آلژینات: به‌منظور بررسی اثر نانوذره بر تولید آلژینات، پس از رشد سویه‌های بالینی و استاندارد سودوموناس در محیط بدون و حاوی غلظت 5/0 MIC از نانوذره، تولید آلژینات با مشاهده میزان ویسکوزیته و چسبناکی کلنی‌ها بررسی شد. نتایج این بررسی، مهار کامل تولید آلژینات توسط غلظت 5/0 MIC از نانوذره در مقایسه با گروه کنترل دارای ویسکوزیته و چسبناکی بالا در سویه استاندارد را نشان دادند. همچنین غلظت 5/0 MIC از نانوذره باعث کاهش ویسکوزیته و چسبناکی سویه بالینی در مقایسه با گروه کنترل شد (شکل 12a-c ).

شکل 12- کاهش تولید آلژینات توسط سویه بالینی سودوموناس آئروژینوزا پس از تیمار با غلظت 5/0 MIC از نانوذرات اکسید ساماریوم (a) در مقایسه با گروه کنترل با ویسکوزیته بالا (b). مهار کامل تولید آلژینات در سویه استاندارد (c، سمت چپ) در مقایسه با گروه کنترل (c، سمت راست)

Figure 12- Reduction of alginate production by clinical strain of Pseudomonas aeruginosa after treatment with 0.5 MIC concentration of samarium oxide nanoparticles (a) compared to high viscosity control group (b). Complete inhibition of alginate production in the standard strain (c, left) compared to the control group (c, right)

بحث و نتیجه‌گیری

ظهور باکتری‌های مقاوم چند دارویی در سال‌های اخیر به سرعت افزایش یافته و تبدیل به مشکل فزاینده‌ای شده است که جهان را تحت‌تأثیر قرار داده و عدم کارایی نسل قدیمی آنتی‌بیوتیک‌ها را به همراه داشته است. استفاده نادرست از آنتی‌بیوتیک‌های سنتی برای مبارزه با عفونت باکتریایی به چالش فعلی و عمده باکتری‌های مقاوم، به‌ویژه باکتری‌های مقاوم چند دارویی منجر شده است (9). فناوری نانو راه‌حل بالقوه‌ای برای از بین بردن میکروب‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک است که می‌تواند سنتز نسل جدیدی از آنتی‌بیوتیک‌ها را تحریک کند. فناوری نانو نقش مهمی در تسهیل درمان بیماری‌های باکتریایی بسیار بدخیم دارد؛ به‌ویژه آنهایی که در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها مقاوم‌اند و کنترل آنها با درمان‌های سنتی دشوار است (10).

در این تحقیق از کورکومین به‌عنوان عامل احیاکننده برای احیای یون‌های ساماریوم نیترات و تولید نانوذرات اکسید ساماریوم استفاده شد. مطولاکشمی و همکاران در سال 2019، از عصاره برگ آندروگرافیس پانیکولاتا^[xxvi] برای سنتز نانوذرات اکسید ساماریوم استفاده کردند (18). همچنین در مطالعه دیگری از عصاره برگ کاسالپینیا پولچریما^[xxvii] برای سنتز نانوذرات اکسید ساماریوم استفاده شد (19).

مطالعات اندکی در ارتباط با اثر ضدمیکروبی نانوذرات ساماریوم انجام شده است؛ برای مثال، در یک مطالعه، فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات اکسید ساماریوم در شرایط روشنایی در برابر چهار سویه استافیلوکوکوس اورئوس، انتروکوکوس فکالیس^[xxviii]، اشرشیا کلی^[xxix] و سودوموناس آئروژینوزا بررسی شد. براساس نتایج، مقادیر MIC برای سودوموناس آئروژینوزا در شرایط روشنایی 5/6 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر و در شرایط تاریکی 7/16 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بود. مقدار MIC برای استافیلوکوکوس اورئوس در شرایط نوری 7/16 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر بود (20). در مطالعه دیگری، فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات هیدروکسی آپاتیت الحاق‌شده با ساماریوم^[xxx] در برابر اشرشیا کلی ATCC 25922، استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25923 و کاندیدا آلبیکنس^[xxxi] ATCC 10231بررسی شد. نتایج مطالعه یک فعالیت ضدمیکروبی قوی در برابر سویه‌های میکروبی آزمایش‌شده نشان دادند؛ به‌طوری‌که پوشش‌ها پس از 48 ساعت گرماگذاری، رشد همه سویه‌های میکروبی آزمایش‌شده را با مقدار 6/0 لگاریتم واحد تشکیل‌دهندة کلنی در میلی‌لیتر مهار کردند (21).

در این مطالعه فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات اکسید ساماریوم سنتزشده با کورکومین، علیه سویه‌های بالینی و استاندارد سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس بررسی شد. نتایج حاصل از روش انتشار از دیسک، اثرات ضدباکتریایی بالای نانوذرات اکسید ساماریوم علیه سویه‌های مطالعه‌شده را نشان دادند؛ به‌طوری‌که با افزایش غلظت نانوذرات، قطر هاله عدم رشد نیز افزایش یافت. همچنین سویه‌های استاندارد و بالینی استافیلوکوکوس اورئوس حساسیت بیشتری نسبت به سویه‌های استاندارد و بالینی سودوموناس آئروژینوزا نشان دادند. تفاوت در میزان مهار، حاکی از تفاوت در ساختار دیواره سلولی است. استافیلوکوکوس اورئوس یک لایه ضخیم حاوی قندها و اسیدهای آمینه دارد (22)؛ درحالی‌که سودوموناس آئروژینوزا دارای لایه‌های متعددی از پروتئین‌ها و لیپید‌ها است (23).

براساس نتایج، سویه‌های بالینی مقاومت بیشتری نسبت به سویه‌های استاندارد نشان دادند. به نظر می‌رسد یکی از دلایل مقاومت بالاتر سویه‌های بیماری‌زا، فعال‌بودن مکانیسم‌های بیماری‌زایی در آنها و مکانیسم‌های مقاومت دارویی ازجمله فعالیت بالاتر پمپ‌های افلاکس در آنها در مقایسه با سویه‌های استاندارد باشد. MexAB-oprM مهم‌ترین سیستم برای آزادسازی ترکیبات ضدمیکروبی از سلول‌ها و مقاومت دارویی ذاتی در سودوموناس آئروژینوزا است (24). همچنین NorA و NorB از مهم‌ترین سیستم‌های افلاکس پمپ چند دارویی در استافیلوکوکوس اورئوس هستند که روی کروموزوم قرار دارند (25).

مکانیسم‌های محافظت از بیوفیلم نیز در سویه‌های بالینی نسبت به سویه‌های استاندارد تکامل‌یافته‌تر هستند که موجب مقاومت بیشتر آنها می‌شوند. مواد پلیمری خارج سلولی (EPSs)^[xxxii] نقش مهمی در حفاظت از بیوفیلم دارند. Psl، Pel، آلژینات، DNA خارج سلولی (eDNA)، لیپیدها و پروتئین‌ها، اجزای اساسی EPSs در سودوموناس آئروژینوزا هستند. Pel و Psl بیوفیلم را تثبیت و به‌عنوان داربستی برای ساختار بیوفیلم عمل می‌کنند. eDNA به‌عنوان ترکیب پیوندی سلول به سلول در توسعه اولیه بیوفیلم نقش داشته و همچنین یک منبع غذایی برای باکتری‌ها در طول گرسنگی است (26). در استافیلوکوکوس اورئوس نیز چندین پروتئین سطحی ازجمله پروتئین مرتبط با بیوفیلم Bap، SasC، SasG و پروتئین‌های متصل‌شونده به فیبرونکتین FnBPA و FnBPB، نقش اساسی در فاز تجمع بیوفیلم دارند (27). سویه‌های استاندارد به‌دلیل ماهیت غیربیماری‌زایی معمولاً مقاومت کمتری در برابر ترکیبات ضدمیکروبی نشان می‌دهند؛ اگرچه به‌منظور بررسی دقیق‌تر این موضوع، انجام مطالعات بیشتر ضروری به نظر می‌رسد.

اثر ضدباکتریایی نانوذرات اکسید ساماریوم می‌تواند به‌دلیل انتشار کاتیون‌های فلزی از نانوذرات ‌باشد که کاتیون‌های آزادشده توسط باکتری‌ها جذب می‌شوند. کاتیون‌های متصل‌شده به سطح فسفولیپید‌های باکتریایی موجب آزاد‌سازی مواد سلولی از باکتری‌ها شده که با تنش اکسیداتیو، آسیب DNA و درنهایت مرگ سلول باکتریایی همراه است. همچنین نانوذرات اکسید ساماریوم به‌دلیل اندازه کوچک، قادر به اتصال به غشای سلولی باکتری و متعاقباً شکستن این ساختارند (28، 29). در مطالعه مطولاکشمی و همکاران، نانوذرات ساماریوم اکسید سنتزشده توسط عصاره برگ آندروگرافیس پانیکولاتا، اثر ضدباکتریایی خوبی علیه استافیلوکوکوس اورئوس و اشرشیا کلی نشان داد.

در این مطالعه، تأثیر نانوذرات اکسید ساماریوم بر تولید عوامل حدت شامل پیوسیانین و آلژینات توسط سودوموناس آئروژینوزا بررسی شد. پیوسیانین رنگدانه‌ای متعلق به گروه فنازین است که توسط سودوموناس آئروژینوزا تولید شده است و به‌عنوان یک عامل حدت در مقاومت آنتی‌بیوتیکی نقش دارد. پیوسیانین، در سلول‌های یوکاریوتی به‌عنوان یک سیگنال سلولی، با تأثیر بر بین ژن‌ها تغییر پاسخ‌های سلولی را موجب می‌شود. همچنین غلظت این رنگدانه در ریه بیماران مبتلا به عفونت مزمن فیبروز کیستیک ممکن است عملکرد سلول‌های اپی‌تلیال را مختل کند و پاسخ ایمنی را کاهش دهد (30).

براساس نتایج، پس از تیمار سودوموناس آئروژینوزا با غلظت 5/0 MIC از نانوذرات اکسید ساماریوم، غلظت پیوسیانین در سویه بالینی و استاندارد به‌ترتیب 39/28 و 83/48 درصد در مقایسه با گروه کنترل کاهش یافت. در مطالعه‌ای نانوذرات نقره به‌طور وابسته به غلظت تولید رنگدانه پیوسیانین در سودوموناس آئروژینوزا را کاهش دادند؛ به‌طوری‌که غلظت‌های 20-5 میکروگرم بر میلی‌لیتر از نانوذره به‌ترتیب موجب کاهش 100-15 درصدی پیوساینین شد (31). در مطالعه‌ای دیگر اثر غلظت 15 میکروگرم بر میلی‌لیتر از نانوذرات نقره بر میزان تولید پیوسیانین در سویه‌های بالینی سودوموناس آئروژیوزا بررسی شد. براساس نتایج، غلظت پیوسیانین در تمام سویه‌ها به‌طور چشمگیری کاهش یافت که این کاهش برابر 64/74-6/66 درصد بود (32).

آلژینات، پلیمر خطی بدون انشعاب حاوی پیوند بتا-(1 → 4) دی-مانورونیک^[xxxiii] و آلفا-ال-گلورونیک‌اسید^[xxxiv] با نقش اصلی در ثبات ساختاری و حفاظت از بیوفیلم‌ها است. همچنین، تولید بیش از حد آلژینات می‌تواند به مقاومت آنتی‌بیوتیکی منجر شود (33). در این مطالعه، سویه‌های بالینی و استاندارد سودوموناس پس از تیمار با نانوذرات سنتزشده ازنظر وسیکوزیته بررسی شدند. نتایج این آزمون بیان‌کنندة پتانسیل بالای نانوذرات در مهار تولید آلژینات بود.

در مطالعه حاضر از کورکومین به‌عنوان عامل کاهنده برای سنتز نانوذرات اکسید ساماریوم استفاده شد. احیای یون‌های ساماریوم در دمای اتاق با روشی ارزان و سازگار با محیط زیست انجام شد. روش‌های طیف‌سنجی و بررسی میکروسکوپی، سنتز نانوکریستال‌های مکعبی با اندازه متوسط 61/32 نانومتر با پایداری خوبی را نشان دادند.

براساس نتایج، نانوذرات اکسید ساماریوم فعالیت ضدباکتریایی مؤثری علیه سویه‌های مطالعه‌شده نشان دادند؛ به‌طوری‌که با افزایش غلظت نانوذرات، فعالیت ضدباکتریایی آنها نیز افزایش یافت. همچنین، سویه‌های گرم مثبت و استاندارد در مقایسه با سویه‌های گرم منفی و بالینی حساسیت بیشتری نسبت به نانوذرات سنتزشده نشان دادند که بیان‌کنندة فعال‌بودن مکانیسم‌های بیماری‌زایی و مقاومت دارویی بالاتر در سویه‌های بالینی در مقایسه با سویه‌های استاندارد بود.

براساس نتایج به‌دست‌آمده از مطالعه حاضر، از نانوذرات اکسید ساماریوم می‌توان به‌عنوان یک عامل ضدباکتریایی مناسب علیه سویه‌های بالینی مقاوم چند دارویی استفاده کرد. همچنین انجام مطالعات بیشتر به‌منظور پی‌بردن به مکانیسم مولکولی فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات اکسید ساماریوم پیشنهاد می‌شود.

[1] Biotechnology

[2] Muniyappan

[3] Curcuma pseudomontana

[4] Nambiar

[5] Turmeric

[6] Curcuma longa

[7] Samarium oxide nanoparticles

[8] Multidrug-resistant (MDR)

[9] Pseudomonas aeruginosa

[10] Staphylococcus aureus

[11] Samarium (III) nitrate hexahydrate

[12] Calcination

[13]  Muffle furnace

[14] Transmission Electron Microscopy

[15] X-Ray Diffraction

[16] Energy Dispersive X- ray Spectrometer

[17] Dynamic Light Scattering

[18] Tryptic soy broth

[19] Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)

[20] Minimum Inhibitory of Concentration: MIC

[21] Minimum Bactericidal Concentration: MBC

[22] Supernatant

[23] Acide chlorhydrique

[24] Viscosity

[25] String test

[xxvi] Andrographis Paniculata

[xxvii] Caesalpinia pulcherrima

[xxviii] Enterococcus faecalis

[xxix] Escherichia coli

[xxx] Samarium doped hydroxyapatite nanoparticles (Sm:HAp-NPs)

[xxxi] Candida albicans

[xxxii] Extracellular polymeric substances (EPSs)

[xxxiii] β (1→4) D-mannuronic

[xxxiv] α-L-guluronic acid