نوع مقاله : مروری
نویسندگان
1 گروه زیست‌شناسی سلولی مولکولی و میکروبیولوژی، دانشکده علوم و فناوری‌های زیستی دانشگاه اصفهان، اصفهان
2 دانشیار گروه زیست‌شناسی سلولی مولکولی و میکروبیولوژی، دانشکده علوم و فناوری‌های زیستی دانشگاه اصفهان، اصفهان
3 استاد مرکز سوئدی بازیافت منابع، دانشگاه بوروس، بوروس، سوئد
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Fossil fuels are the main sources of water, soil, and air pollution that threaten human life and other organisms on Earth. Nowadays, the climate change and pollution are critical issues; however, many countries still use polluting fossil fuels. Therefore, finding alternative and clean fuels is a concern for many environmental activists and scientists. One of these alternative fuels is ethanol, which ignites cleaner due to its higher hydroxyl groups and lack of sulfur and nitrogen in its formula. Ethanol can be produced both chemically and biologically. Till now, four generations of bioethanol have been introduced. In the second generation, lignocellulosic materials are used as the main source for bioethanol production. These materials are frequently found in plant biomasses and agricultural residues, which are inexpensive and environmentally sustainable. Therefore, it is of importance to improve the production process and find novel techniques that increase final yields and process efficacy. In this study, the structural properties of lignocellulosic materials, pretreatment techniques, the second-generation bioethanol production process, and the effective bacterial and fungal strains in this procedure are investigated.
Materials and Methods: This review study is a narrative review in which a logical search approach was selected. For data analysis, a comparative approach between the different methods was expressed in each section.
Results: Among four bioethanol generations, the second generation has received remarkable attention due to its non-competition with human food and its industrial potential rather than other generations. Therefore, it is of particular significance to improve the production process of bioethanol second generation. A deep understanding of lignocellulosic components, pretreatment methods optimization, and increasing hydrolysis and fermentation processes efficiency make bioethanol production industrially possible and cost-effective.
Discussion and Conclusion: However, despite extensive studies to select the most suitable microorganisms during the fermentation stage, Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis are still at the forefront of studies.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
امروزه بنزین و دیزل، جزء سوخت‌های اصلی به‌ویژه در زمینة حمل‌و‌نقل هستند. مصرف جهانی بنزین طی دهه‌های اخیر به مراتب افزایش یافته است؛ درحالی‌که این سوخت‌ها تجدیدناپذیرند و مصرف بی‌رویة آنها به آسیب‌های زیست‌محیطی جبران‌ناپذیری مانند آلودگی هوا، تولید پساب‌های خطرناک و گرم‌شدن زمین منجر می‌شود. هنگامی که سوخت‌های فسیلی به‌طور کامل می‌سوزند، یعنی با اکسیژن موجود در هوا ترکیب می‌شوند، دی‌اکسیدکربن و آب تولید میکنند. حال اگر عمل سوختن کامل نباشد، به جای مقداری از دی‌اکسیدکربن، منواکسید‌کربن تولید می‌شود که ماده‌ای بسیار خطرناک و سمی است. همچنین برخی از اتم‌های کربن موجود در ترکیبات هیدروکربنی به‌صورت کامل نمی‌سوزند و همراه با ذرات جامد کربن روی هم انباشته می‌شوند و از اگزوز اتومبیل‌ها به‌صورت دوده خارج می‌شوند. علاوه بر این، هیدروکربن‌های سوخته‌نشده به همراه مقادیری از سوخت که پیش از ورود به موتور، تبخیر و به هوا منتشر می‌شوند، در مجاورت نور خورشید با ترکیبات اکسیدهای نیتروژن حاصل از عمل احتراق در موتور، ترکیب می‌شوند و تولید ازون میکنند. ازون در لایه استراتوسفر مانع از عبور نور فرابنفش و رسیدن آن به سمت زمین می‌شود؛ اما در سطح زمین از مهم‌ترین عوامل ایجاد مه‌دود شیمیایی و مواد سمی مضر برای سلامتی انسان محسوب می‌شود (1)؛ بنابراین، جایگزینی منابع تجدیدپذیر و دوستدار محیط زیست مانند سوخت‌های زیستی از دغدغه‌های اصلی پژوهشگران در زمینة انرژی و سوخت است (2, 3). براساس گزارش‌های آژانس بین‌المللی انرژی[1] دو سوم کل تأمین انرژی در سال 2050 از انرژی باد، خورشید، زیست‌توده، زمین گرمایی و آب خواهد بود. انرژی خورشیدی بزرگ‌ترین منبع انرژی است که یک پنجم از منابع انرژی را به خود اختصاص می‌دهد. سوخت‌های زیستی تولیدشده از ضایعات، پسماندها و ترکیباتی که با محصولات غذایی رقابت نمی‌کنند (مانند محصولات کشت‌شده در زمینهای حاشیه‌ای) 45 درصد از سوخت‌های زیستی مصرف‌شده در سال 2030 را تشکیل خواهند داد؛ درحالی‌که در سال 2020 این مقدار در حدود 7 درصد تخمین زده می‌شد (4).
مطابق منابع موجود، سوخت زیستی به سوختی اطلاق می‌شود که از ترکیبات زیست‌توده (شامل مواد آلی زنده یا مواد آلی که زمانی زنده بوده‌اند) طی فرایندهای تولید به دست آید که می‌تواند مایع یا گاز باشد (5, 6). به‌طور کلی، سوخت‌های زیستی قابلیت تجزیه توسط میکروارگانیسم‌های موجود در آب و خاک را دارند و بنابراین اگر لکه‌ای از سوخت‌ها در محیط پخش شود، به راحتی توسط میکروارگانیسم‌ها از بین می‌رود. همچنین، این سوخت‌ها فاقد گوگرد هستند و فرایند تولیدشان قابل کنترل است تا دیگر آلاینده‌های جوی همانند اکسیدهای نیتروژن نیز در کمترین حد خود در این سوخت‌ها وجود داشته باشند؛ درحالی‌که سوخت‌های فسیلی به‌ویژه زغال مقادیر بالایی گوگرد دارند که با سوختن آنها گوگرد، آزاد و وارد اتمسفر می‌شود و سپس به‌صورت باران‌های اسیدی به زمین بازمی‌گردد. علاوه بر این، اگر این سوخت‌ها طی فرایند کاملاً درست و قابل کنترل تولید شوند (استفاده از کمترین مقدار حلال، اسید، باز یا دیگر ترکیبات لازم که ممکن است برای محیط زیست خطرناک باشند)، نه‌تنها به افزایش گازهای گلخانه‌ای منجر نمی‌شوند، بلکه به میزان چشمگیری از انتشار آنها جلوگیری میکنند. توصیف این مسئله به استفادة گیاهان از دی‌اکسیدکربن برمی‌گردد که مهم‌ترین گاز گلخانه‌ای است. گیاهان قادرند مقداری از دی‌اکسیدکربن موجود در اتمسفر را مصرف و اثر گلخانه‌ای را در زمین کاهش دهند. تولید سوخت‌های زیستی از این گیاهان، به نوعی موازنة دی‌اکسیدکربن را متعادل می‌کند؛ زیرا موقع سوختن این سوخت‌ها، دوباره دی‌اکسیدکربن تولیدشده توسط گیاهان مصرف می‌شود. همچنین، استفاده از انرژی خورشیدی در مراحل مختلف تولید این سوخت‌ها سبب کاهش انتشار گازهای گلخانه‌ای می‌شود (7). دربارة سوخت‌های زیستی می‌توان به مقالات داتا[2] و همکاران (8)، علوی نائینی و همکاران (9) و استریمایکین[3] و همکاران (10)، استناد و برای مطالعه بیشتر به آنها رجوع کرد.
اتانول زیستی[4] یکی از انواع سوخت‌های زیستی است. شکل‌گیری صنعت اتانول امروزی تقریباً یک قرن به طول انجامید. نسل اول اتانول عمدتاً از قندهای گیاهی یا نشاسته و درواقع به‌طور مستقیم از محصولات غذایی تولید می‌شود. در ابتدا، ذرت تنها ماده اولیه در دسترس برای تولید اتانول بود. ذرت، گندم و نیشکر عمده‌ترین مواد اولیه استفاده‌شده هستند. ایراد اصلی سوخت‌های زیستی نسل اول بحران غذا در برابر سوخت است که یکی از دلایل افزایش قیمت مواد غذایی، افزایش تولید این سوخت‌ها است؛ بنابراین، جستجو برای جایگزین‌های کارآمدتر و مولدتر آغاز شد. زیست‌توده‌های گیاهی پسماندی، عمدتاً حاوی ترکیبات لیگنوسلولزی، منابع خوبی برای تولید اتانول هستند. نسل دوم اتانول زیستی به‌گونه‌ای طراحی شده است که از درگیری غذا و سوخت جلوگیری می‌کند و بر بقایای کشاورزی و ضایعات جنگلی متمرکز شده که عمدتاً شامل انواع مختلف ترکیبات لیگنوسلولزی است. نسل دوم فرایندهای تولید اتانول زیستی در ابتدا مشکلات زیادی داشت؛ اما با پیشرفت در استراتژی‌های فرایند زیستی، کاهش هزینه‌ها و در دسترس بودن منابع پایدار درخور توجه قرار گرفت (11)؛ البته امروزه نسل سوم اتانول زیستی نیز ایجاد شده است که از زیست‌تودة جلبکی برای اهداف تولید استفاده می‌کند. ناهاک[5] و همکاران گزارش دادند خزه‌های دریایی و جلبک‌های دریایی مانند گونه‌های انترومورفا[6] حاوی 70 درصد کربوهیدرات (براساس وزن خشک) هستند که می‌توان آنها را برای تولید اتانول زیستی بررسی کرد. با توجه به پتانسیل تبدیل زیست‌توده با کربن بالا، امروزه تحقیقات بیشتری در زمینة تولید سوخت‌های زیستی نسل سوم، به‌ویژه سوخت‌های زیستی از جلبک‌ها یا ریز‌جلبک‌ها انجام می‌شود. بسیاری از پژوهشگران استدلال میکنند سوخت‌های زیستی جلبکی می‌توانند بهترین جایگزین برای سوخت‌های زیستی نسل اول و دوم باشند. اشکال عمده این است که به‌طور مستقیم قندهای قابل تخمیر در این روش ایجاد نمی‌شوند و نیاز ضروری به پیش‌تیمارهای بهینه و بیشتر دارند (12). تاکنون تمرکز پژوهشگران عمدتاً بر استفاده از قندهای گیاهی برای تولید دیزل زیستی و اتانول بوده است. در زمان حاضر، رویکردهای جدیدتر و راهگشا مانند واردکردن ژن‌های خاص به اشریشیا کلای[7] برای تجزیة زیست‌تودة لیگنوسلولزی و درنتیجه ایجاد قند فراوان و ارزان شانس بالایی دارند؛ به‌ویژه به‌دلیل اینکه این میکروارگانیسم بسیار خوب مطالعه شده است و تغییرات ژنتیکی را به خوبی انجام می‌دهد. علاوه بر این، این گونه سه برابر سریع‌تر از مخمر و 100 برابر سریع‌تر از بیشتر میکروب‌های کشاورزی رشد می‌کند. مشکل عمده در ارتباط با باکتری اشریشیا کلای این است که حداکثر قندی که ایجاد می‌شود تنها 10 درصد است و تا زمانی که بازدهی به 70 تا 90 درصد نرسد، تجاری‌سازی مشکل خواهد بود. این مشکل را می‌توان با استفاده از تکنیک‌های مهندسی متابولیک برای افزایش بازدهی قند حل کرد؛ زیرا مسیر متابولیک آن به خوبی درک شده است (13). به‌تازگی نسل چهارم اتانول زیستی نیز معرفی شده است که ازطریق تثبیت دی‌اکسیدکربن موجود در اتمسفر با کمک گیاهان ایجاد می‌شود (14). در سیستم‌های تولید نسل چهارم، گیاهان و جلبک‌ها دستکاری می‌شوند تا بتوانند به‌عنوان دستگاه‌هایی برای جذب کارآمد کربن عمل کنند که دی‌اکسیدکربن را از اتمسفر، خارج و آن را در شاخه‌ها، تنه‌ها و برگ‌های خود تثبیت کنند. این زیست‌تودة غنی از کربن سپس به سوخت تبدیل می‌شود. یافته‌های کلیدی دو گروه از پژوهشگران در طراحی درختانی که دی‌اکسید کربن بیشتری نسبت به نمونه‌های معمولی خود ذخیره میکنند، افق‌های جدیدی را برای دسترسی به قند قابل تخمیر ارزان‌تر باز کرده است. آنها برای گیاهان اکالیپتوس و لارچ داهوریان[8] به‌ترتیب در شمال شرقی آسیا و سیبری به این موفقیت دست یافتند (15).
امروزه به‌دلیل تغییرات اقلیمی، توجه به زیست‌توده‌های لیگنوسلولزی برای تولید سوخت زیستی و دیگر ترکیبات با ارزش افزوده بیش از گذشته است؛ زیرا این نسل مشکلات نسل اول را ندارد و نسبت به نسل‌های جدیدتر که هنوز در مرحله آزمایشگاهی‌اند، توانسته است در مرحله نیمه‌صنعتی وارد شود. علاوه بر این، با توجه به جایگاه کشاورزی در صنعت ایران و به همان نسبت تولید ضایعات لیگنوسلولزی فراوان مرتبط، اهمیت این ترکیبات برای تولید سوخت زیستی بیش از پیش مشخص شده است؛ بنابراین، در این مقاله مروری سعی شده است فرایندهای نسل دوم، یعنی تولید اتانول زیستی از منابع لیگنوسلولزی به‌طور دقیق بررسی شود. در این مقاله در ابتدا، اتانول در جایگاه یک سوخت زیستی بررسی شده و سپس ساختار ترکیبات لیگنوسلولزی توضیح داده شده است. در ادامه، انواع پیش‌تیمارهای لازم به تفکیک بیان شده و انواع روش‌های تولید اتانول زیستی مشخص شده‌اند. درنهایت، میکروارگانیسم‌های استفاده‌شده در مراحل مختلف تولید اتانول زیستی توصیف شده‌اند.
مواد و روش‌ها
در این مطالعة مروری، از موتور جستجوی انتشارات گوناگون بین‌المللی مانند الزویر[9]، اسپرینگر[10]، تیلور اند فرانسیس[11]، MDPI[12] و هینداوی[13] و مجلات مختلفی استفاده شد که در زمینة زیست فناوری، تولید سوخت زیستی، انرژی‌های پاک، اتانول زیستی و روش‌های تولید سوخت‌های پاک فعال‌اند و یافته‌های جدید در این باره را منتشر میکنند. بستر اطلاعاتی در رابطه با مطالعات انجام‌شده حول محور تولید اتانول زیستی به‌عنوان سوخت از سوبستراهای لیگنوسلولزی، روش‌های پیش‌تیمار و انواع میکروارگانیسم‌های استفاده‌شده، صورت گرفته و به جدیدترین یافته‌ها نیز اشاره شده است. در جستجوی مطالب تا حد امکان رویکرد جستجوی منطقی در پیش گرفته شده است و واژه‌های کلیدی استفاده‌شده عموماً اتانول زیستی نسل دوم، انواع روش‌های پیش‌تیمار سوبستراهای لیگنوسلولزی، تخمیر، روش‌های استخراج و خالص‌سازی بود. در جمع‌بندی و تجزیه و تحلیل نهایی اطلاعات سعی شد در هر بخش، رویکرد مقایسه‌ای بین روش‌های مختلف ذکرشده اتخاذ شود.
اتانول زیستی به‌عنوان سوخت: الکل‌های مشتق از زیست‌توده[14] به همراه دیزل‌های زیستی[15]، هیدروژن زیستی[16] و گاز سنتز[17] جزء سوخت‌های جایگزین نسل دوم به حساب می‌آیند (16, 17). اتانول، معمول‌ترین الکل مشتق از زیست‌تودة گیاهی است که به‌عنوان سوخت زیستی به کار می‌رود. این ترکیب در مقایسه با سوخت‌های فسیلی، به‌علت داشتن گروه‌های هیدروکسیل بیشتر و نداشتن گوگرد و نیتروژن در ساختار خود، تمیزتر می‌سوزد و بنابراین گزینة مناسب‌تری برای جایگزینی سوخت‌های فسیلی است (18)؛ اما باید بتوان با کاهش سرمایه‌گذاری اولیه و هزینه‌های تولید و افزایش بهره‌وری فرایندهای تولیدی، قابلیت رقابت آن را با سوخت‌های فسیلی حال حاضر افزایش داد (16, 19, 20). تبدیل ترکیبات لیگنوسلولزی به اتانول، فرایندی چندمنظوره است که می‌تواند در مصارف گوناگونی مانند جایگزینی یا بهبود محصولات نفتی (سوخت‌های پاک یا مواد افزودنی به سوخت)، تیمار پساب‌ها (زباله‌های جامد شهری یا ضایعات کشاورزی و باقی‌مانده‌های جنگلی) یا کاهش آلودگی‌ها استفاده شود. باوجود مزایای بسیار زیاد این نوع سوخت، گفتنی است واحدهای صنعتی تولید اتانول زیستی با تولید حجم بالایی از پساب، جزء صنایع آلوده‌کننده به شمار می‌روند و مشکلاتی را برای محیط زیست فراهم می‌آورند.
ترکیبات لیگنوسلولزی: ترکیبات لیگنوسلولزی پلیمری دیوارة سلولی گیاهان که حاصل فتوسنتز هستند، فراوان‌ترین ذخیرة طبیعی تجدیدپذیر و قابل دسترسی برای انسان به شمار می‌روند که با انجام تغییراتی می‌توان از این منابع با ارزش در فرایند تولید سوخت‌های زیستی بهره برد (21, 22). ساختار زیست‌توده‌های گیاهی متشکل از موادی است که با عنوان ترکیبات لیگنوسلولزی شناخته می‌شود. این زیست‌توده‌ها انواع مختلفی از گیاهان و ضایعات گیاهی را شامل می‌شوند که می‌توانند در تولید اتانول زیستی بهره‌برداری شوند. به‌طور کلی، ترکیبات لیگنوسلولزی متشکل از سلولز، همی‌سلولز و لیگنین هستند که میزان هریک از آنها در زیست‌توده‌های گیاهی مختلف، متفاوت است (23-25). علاوه بر این سه بخش ساختاری عمده، ترکیبات استخراج‌پذیر (محلول در آب یا حلال‌های آلی) و استخراج‌ناپذیر غیرسلولی (خاکستر معدنی مانند سیلیکا و نمک‌های قلیایی) نیز در زیست‌توده‌های گیاهی وجود دارد. همچنین، انواع پروتئین‌ها، پکتین[18] و نشاسته نیز در این زیست‌توده‌ها یافت می‌شوند (26-29). محتوای خاکستر در زیست‌توده‌های گیاهی چوبی کمتر از یک درصد است؛ اما مقادیر متغیری از ترکیبات استخراج‌پذیر مانند رزین[19]ها، تِرپِن[20]ها، فنول[21]ها، کوئینون[22]ها و تانین[23]ها در آنها شناسایی شده‌اند (26). ترکیبات لیگنوسلولزی از صنایع مختلفی مانند کاغذسازی، جنگلداری، کشاورزی (محصولات غذایی مانند برنج، گندم و ... و محصولات غیرغذایی مانند علف‌ها، چمن و ...) و حتی پسماندهای جامد شهری به دست می‌آیند؛ برای مثال، می‌توان به باگاس[24] (ضایعات گیاه نیشکر) اشاره کرد که به‌طور تقریبی حاوی 40 تا 45 درصد سلولز، 30 تا 35 درصد همی‌سلولز و 20 تا 30 درصد لیگنین است (17, 30). برای تولید اتانول زیستی از این ترکیبات که یکی از فرایندهای جدید تولید است، ابتدا باید قندهای موجود در این ذخایر آزاد شوند و سپس در اختیار مخمر قرار گیرند. برخلاف ساختار به ظاهر سادة ترکیبات لیگنوسلولزی، آزادسازی و تولید مؤثر قندهای مونومری از آنها آسان نیست و به تیمارهای خاصی ازجمله تیمار با آنزیم‌هایی نیازمند است که قادرند این پلیمرها را بشکنند و قند آزاد کنند (19, 31). به‌طور کلی، دانش مرتبط با ترکیبات لیگنوسلولزی، فعالیت آنزیم‌های هیدرولیزکنندة آنها، عوامل مؤثر بر تولید و عملکرد این آنزیم‌ها و میکروارگانیسم‌هایی که این آنزیم‌ها را تولید میکنند، برای افزایش بازدهی فرایند بازیافت زیست‌توده‌های گیاهی در راستای تولید سوخت‌های زیستی مانند اتانول بسیار مهم است.
سلولز: سلولز- فراوان‌ترین ذخیرة سوخت تجدیدپذیر در کرة زمین - یک هُوموپلیمر[25] خطی متشکل از یک نوع قند (گلوکز) است که با پیوندهای گلیکوزیدی بتا-4،1 بهم متصل شده‌اند. گیاهان عمده‌ترین تولیدکنندگان سلولز‌ند؛ درحالی‌که برخی جانوران و باکتری‌ها نیز قادر به تولید این پلیمر هستند (17, 32, 33). اصلی‌ترین واحد تکرارشوندة این پلیمر، سلوبیوز نام دارد که حاصل ترکیب دو واحد گلوکز است. سلولز حدود نیمی از مواد آلی در زیست‌کره را شامل می‌شود و مهم‌ترین پلی‌ساکارید موجود در زیست‌تودة گیاهی به شمار می‌رود. برخلاف دیگر پلی‌ساکاریدها، این مولکول ساختار بلورین دارد و از به هم پیوستن حدود 30 مولکول مجزای سلولز، واحدهای بزرگتری به نام فیبریل‌های ابتدایی (پروتوفیبریل[26]) ایجاد می‌شود که خود در واحدهای بزرگتری به نام میکروفیبریل[27] دسته‌بندی می‌شوند؛ درنهایت، از تجمع میکروفیبریل‌ها الیاف‌های سلولزی معمول به وجود می‌آیند. پیوندهای هیدروژنی درون و بین مولکولی این الیاف‌ها باعث سختی و نامحلول‌شدن آنها می‌شود. میکروفیبریل‌ها معمولاً در زمینهای[28] از همی‌سلولز، لیگنین، پروتئین و عناصر معدنی جای می‌گیرند که این به هم پیوستگی به شدت سلولز را در برابر هیدرولیز آنزیمی مقاوم می‌کند (31, 32, 34, 35). علاوه بر این، بلورینگی[29] ساختار سلولز عامل تعیین‌کنندة مهمی در چگونگی هیدرولیز آن به شمار می‌آید که با انجام پیش‌تیمار[30]های مناسب، معمولاً این بلورینگی کاهش می‌یابد و سوبسترا برای هیدرولیز آنزیمی آماده‌تر می‌شود؛ البته گاهی پیش‌تیمارها منجر به افزایش بلورینگی ساختار سلولز می‌شوند که هیدرولیز آنزیمی را با مشکل مواجه میکنند. همچنین، مطالعات نشان داده‌اند هیدرولیز آنزیمی سلولزهای بی‌شکل[31]، 5 تا 10 برابر سریع‌تر از سلولزهای بلوری صورت می‌گیرد (32). امروزه، پژوهش‌های زیادی در رابطه با تبدیل سلولز به گلوکز و تخمیر آن به اتانول درحال انجام است؛ زیرا این فرایند، پتانسیل اقتصادی چشمگیری دارد و با محیط زیست سازگار است (28, 31). برای تبدیل آنزیمی سلولز به قند قابل تخمیر گلوکز، از آنزیم‌های هیدرولیزکنندة سلولز (سلولازها) استفاده می‌شود.
همی‌سلولز: پس از سلولز، همیسلولزها فراوان‌ترین پلی‌ساکاریدهای ناهمگن[32] طبیعی‌اند که 25 تا 45 درصد زیست‌توده‌های گیاهی را تشکیل می‌دهند و معمول‌ترین آنها عبارت‌اند از بتاگلوکان غیرسلولزی، زایلان، زایلوگلوکان، آرابینوزایلان، مانان، گالاکتومانان، آرابینان، گالاکتان، پلی‌گالاکتومانان (28, 33, 36). مهم‌ترین ترکیب همی‌سلولزی و دومین ذخیرة انرژی تجدیدپذیر در طبیعت، زایلان نام دارد که زنجیرة اصلی آن به‌صورت هُموپلیمر و متشکل از واحدهای زایلوپیرانوز است که با پیوندهای بتا-4،1 دی-گلیکوزیدی به هم متصل شده‌اند. در بیشتر زایلان‌ها، زنجیره اصلی دارای گروه‌های جانبی مانند استیل-آرابینوفورانوزیل، گلوکورونوزیل یا متیل‌گلوکورونوزیل نیز هست (17, 23, 37)؛ البته زایلان خطی و بدون گروه‌های جانبی در غلاف بذر گوآر[33]، علف اسپراتو[34] و ساقه‌های تنباکو شناسایی شده است. ساختار همی‌سلولز، واحدهای زنجیره اصلی، میزان شاخه‌های جانبی و نوع آنها به شدت بین گونه‌های گیاهی مختلف، متغیر است؛ برای مثال، زایلوگلوکان‌ها بیشتر در دیوارة سلولی اولیة گیاهان دولپه‌ای[35] دیده می‌شوند؛ درحالی‌که گلوکورونوآرابینوزایلان‌ها در هر دو دیوارة سلولی اولیه و ثانویة گیاهان تک‌لپه‌ای برگ‌بیدی[36] همچون نیشکر و ذرت به وفور یافت می‌شوند. همچنین، زایلان‌های چوبی به‌صورت استیل-متیل‌گلوکورونوزایلان در سخت‌چوب‌ها (آنژیوسپرم‌های چوبی[37]) یا به‌صورت آرابینومتیل‌گلوکورونوزایلان در نرم‌چوب‌ها (ژیمنوسپرم‌ها[38]) وجود دارند و درجة پلیمریزاسیون[39] آنها در سخت‌چوب‌ها بیشتر از نرم‌چوب‌ها است. به‌طور کلی، نقش همیسلولزها در زیست‌توده‌های لیگنوسلولزی، اتصال لیگنین به الیاف‌های سلولزی است و به احتمال زیاد، این اتصال ازطریق پیوندهای کوالانسی بین گروه‌های جانبی همیسلولزها با لیگنین به وجود می‌آید (17, 36, 38).
لیگنین: لیگنین فراوان‌ترین پلیمر آروماتیک در طبیعت، بزرگ مولکولی ناهمگن با خواص فنولی است و درنتیجة پلیمریزاسیون و آبگیری از سه نوع الکل تک‌پاری[40] یا لیگنول[41]ها تولید می‌شود که از اسید پارا-سینامیک[42] مشتق می‌شوند. این الکل‌ها شامل ترانس-پارا-کوماریل الکل[43] (9 کربنه)، ترانس-پارا-کونیفِریل الکل[44] (10 کربنه) و ترانس-پارا-سیناپیل الکل[45] (11 کربنه) هستند (3, 16, 24). نسبت حلقه‌های آروماتیک در لیگنین به شدت وابسته به نوع زیست‌تودة گیاهی است. بیشتر لیگنین موجود در نرم‌چوب‌ها از کونیفِریل الکل و مقادیر کمی کوماریل الکل مشتق شده است. لیگنینِ سخت‌چوب‌ها نیز از مقادیر نسبتاً مساوی کونیفِریل الکل و سیناپیل الکل و مقدار کمی کوماریل الکل تشکیل شده است و در گیاهان علفی علاوه بر لینگول‌های فوق، پارا-هیدروکسی سینامیک اسیدهایی[46] همچون اسید پارا-کوماریک[47]، اسید فِرولیک[48] و اسیدهای سیانپیک[49] نیز درون لیگنین ادغام شده‌اند. به‌طور کلی، محتوای سلولزی انواع مختلف ترکیبات چوبی مشابه است؛ اما محتوای لیگنین در نرم‌چوب معمولاً بیشتر از سخت‌چوب‌ها است (16, 26, 37). لیگنین موجود در زیست‌توده‌های لیگنوسلولزی به‌علت ساختار سه‌بعدی که دارد همانند یک مانع فیزیکی در برابر حملة آنزیم‌های سلولازی و همی‌سلولازی عمل می‌کند و عملکرد این آنزیم‌ها را مختل می‌کند؛ درواقع نقش حفاظتی را در ساختار زیست‌توده‌های لیگنوسلولزی بر عهده دارد (39). اجزای لیگنین به‌دلیل اثر رقیق‌کننده بر فرایندهای هیدرولیز و تخمیر اهمیت پیدا میکنند. گروه‌های فنولی ایجادشده از تجزیة لیگنین، آنزیم‌های سلولازی را تا حد زیادی، غیرفعال و ازاین‌رو هیدرولیز آنزیمی را مختل میکنند. اصلاح لیگنین ازطریق مهندسی ژنتیک، تشکیل لیگنین را به میزان چشمگیری کاهش می‌دهد و بازدهی اتانول را بهبود می‌بخشد؛ اما این امر می‌تواند مشکل‌ساز باشد؛ زیرا اجزای لیگنین به‌عنوان اصلی‌ترین سیستم دفاعی گیاه در برابر عوامل بیماری‌زا و حشرات عمل میکنند و اصلاح ژنتیکی آنها می‌تواند حفاظت طبیعی گیاهان را مختل کند. حفظ لیگنین علاوه بر صرفه‌جویی در مصرف انرژی فرایند، با توجه به اینکه پس از بازیابی می‌توان آن را در واحد ترکیبی حرارت و نیرو[50] استفاده کرد، یک منبع بالقوة انرژی پایدار برای این فرایند است. در مجموع، مواد اولیة زیست‌توده با محتوای لیگنین بالا به آسانی به‌عنوان مادة اولیه برای تخمیر قابل استفاده نیست (40).
پیش‌تیمار ترکیبات لیگنوسلولزی: سوبستراهای لیگنوسلولزی به‌دلیل داشتن سه بخش اصلی سلولزی، همی‌سلولزی و لیگنینی، تخلخل کمی دارند و بنابراین نسبت به هیدرولیز آنزیمی مقاوم‌اند؛ درنتیجه، برای تولید اتانول زیستی از اینگونه سوبستراهای نامحلول، معمولاً این ترکیبات باید تحت‌تأثیر فرایندها و موادی قرار گیرند که کاسته‌شدن مقاومت آنها، افزایش دسترسی آنزیم‌ها به سوبسترا، ایجاد قندهای قابل تخمیر بیشتر و افزایش بازدهی هیدرولیز آنزیمی و تخمیر قندی را سبب شود (3, 41-44). اگر پیش‌تیماری روی ترکیبات لیگنوسلولزی انجام نشود، میزان بازدهی هیدرولیز آنزیمی با آنزیم قارچی کمتر از 20 درصد خواهد شد (7). به‌طور کلی، ایدئال‌ترین پیش‌تیمارها بر پایة حذف همی‌سلولز یا لیگنین، افزایش تخلخل و کاهش بلورینگی سلولز استوار است تا سطح تماس کافی برای حملة آنزیم سلولاز ایجاد شود. همچنین، در یک پیش‌تیمار ایدئال ترکیبات مهارکنندة فرایند تخمیر تا حد امکان نباید آزاد شوند؛ شرایط عملیاتی باید ارزان، راحت و کارآمد باشد و ضایعات جامد نیز تولید نشوند (3, 39, 44-46)؛ البته توجه به این نکته نیز ضروری است که در بیشتر این روش‌ها شرایط سختی مانند استفاده از ترکیبات خورنده، دما یا فشار بالا اعمال می‌شود و ممکن است به ایجاد ترکیبات مهارکننده در شیرابة لیگنوسلولزی منجر شود که مجموعة این عوامل اثرات منفی در اقتصاد فرایند تولید اتانول زیستی بر جای می‌گذارد (47-49).
انواع روش‌های پیش‌تیمار شامل انواع فیزیکی، شیمیایی، فیزیکوشیمیایی، زیستی یا ترکیبی از آنها هستند که در جدول 1 به تفکیک آورده شده‌اند (50). با وجود این، هیچ‌‌یک از این پیش‌تیمارها آنقدر توسعه نیافته‌اند که بتوانند از نقطه‌نظر اقتصادی یا تکنیکی در فرایندهای تولیدی با مقیاس بزرگ به راحتی استفاده شوند؛ حتی در برخی موارد یکی از این روش‌ها برای افزایش کارایی روش دیگر به کار می‌رود (51, 52). از بین روش‌های موجود، استخراج بازی و اسید کربنیک بهترین کارایی را دارند؛ اگرچه روش‌های انفجار بخار و هیدرولیز اسیدی رقیق معمول‌تر هستند. به‌طور میانگین حدود 33 درصد از هزینة کل فرایند تولید اتانول زیستی از ترکیبات لیگنوسلولزی به این مرحله تعلق دارد (40) و درنهایت، کارآمدی این فرایند در بازده سوخت زیستی تولیدی تأثیرگذار است (50).
جدول 1- انواع روش‌های پیش‌تیمار ترکیبات لیگنوسلولزی
|
نوع پیش‌تیمار |
روش‌های به‌کاررفته |
کاربرد |
معایب |
منابع |
|
فیزیکی |
- میلینگ[51](آسیاب‌کردن[52]/خردکردن با تیغة چرخان[53]) - همگن‌سازی فشار قوی[54] - تابش پرتو الکترون[55] - فشرده‌سازی داغ[56] - فوتوکاتالیز - آذرکافت (پیرولیز) - امواج فراصوت و مایکروویو - میدان الکتریکی ضربان‌دار - پرتودهی با پرتوی گاما - استفاده از آب داغ مایع در فشار بالا |
- کاهش درجة بلورینگی و درجة پلیمریزاسیون سلولز - هیدرولیز جزئی همیسلولزها و دِپلیمریزاسیون لیگنین - افزایش سطح دسترسی برای آنزیم‌های هیدرولیزکننده با افزایش سطح مقطع و اندازة سوراخ‌ها در ترکیبات لیگنوسلولزی |
- مصرف بالای انرژی - کارآمدی پایین |
(41, 49-57) |
|
فیزیکوشیمیایی |
- استفاده از بخار اشباع با فشار بالا در زمان کم - اکسیداسیون مرطوب - انبساط الیافی با آمونیاک - تراوش بازیافتی آمونیاک - خیساندن در آمونیاک فاز آبی - انفجار با دی‌اکسیدکربن یا دی‌اکسیدگوگرد |
- جداکردن همی‌سلولز و لیگنین - ایجاد تغییراتی در ساختار لیگنین - دهیدرولیز بخش همی‌سلولزی |
تولید ترکیبات مهارکنندة فرایند هیدرولیز و تخمیر |
(40, 50, 58) |
|
شیمیایی |
- هیدرولیز اسیدی (رقیق و غلیظ) - هیدرولیز بازی - ازون کافت - استفاده از گازهای دی‌اکسیدکلر یا دی‌اکسیدنیتروژن - استفاده از عوامل متورم کننده، استفاده از پراکسید هیدروژن (آب اکسیژنه) - استفاده از مایعات یونی - لیگنین‌زدایی اکسیداتیو یا بر پایة استخراج با حلال‌هایی مانند اتانول، بِنزن، اتیلن گلایکول یا بوتانول و استفاده از حلال‌های آلی فسفاته یا حلال‌های سلولز مانند کادوکسِن |
- لیگنین‌زدایی - هیدرولیز نسبتاً کامل همیسلولزها - کاهش بلورینگی سلولز و درجة پلیمریزاسیون آن |
- هزینة بالای عملیات - ایجاد آلاینده‌های زیست‌محیطی و بازیافت دشوار آنها - ایجاد رسوبات تیره‌رنگ هومیک یا تانن مانند در شیرابه پیش‌تیمارشده - خورندگی در تجهیزات - تولید ترکیبات مهارکنندة فرایند هیدرولیز و تخمیر |
(3, 47, 51, 54, 59, 60) |
|
زیستی |
استفاده از انواع سویه‌های قارچی (فانروکیت کریزوسپوریوم، تریکودرما ریسئی، تریکودرما ویریده، آسپرژیلوس نایجر و ...) و باکتریایی (گونه‌های کلستریدیوم، سلولوموناس، باسیلوس، ترمومونوسپرا، استرپتومایسس و ...) - استفاده از آنزیم‌های هیدرولیزکنندة سویه‌ها (مثل پکتیناز، لیگنین پراکسیداز، زایلانازها، مانانازها و ...) |
- ایجاد شکلی از سلولز به‌وسیلة تخریب ساختار بلوری آن - شکست یا حذف بخش لیگنینی - به حداقل رساندن از دست رفت قند |
زمان انکوباسیون طولانی |
(44, 50) |
هیدرولیز آنزیمی: در فرایند تولید اتانول زیستی از زیست‌توده‌های لیگنوسلولزی، مرحلة هیدرولیز آنزیمی از دهه 1980 میلادی توجه خاصی را به خود معطوف کرده است و هنوز هم به‌عنوان یک تنگنای مهم فنی-اقتصادی در این فرایند مطرح است که مطالعه و پژوهش‌های بیشتری را در این زمینه طلب می‌کند. به بیانی ساده، پس از هیدرولیز همیسلولزها و لیگنین‌زدایی از ترکیبات لیگنوسلولزی، الیاف‌های سلولزی به راحتی در معرض سلولازها قرار می‌گیرند و قند گلوکز برای تخمیر و تولید اتانول آزاد می‌شود. به‌دلیل اختصاصیت عملکرد آنزیم‌های هیدرولیزکننده در تولید محصولات خاص و بازده بالای آنها، با توسعه و بهبود این مرحله می‌توان تنوع و در دسترس‌پذیری منابع لیگنوسلولزی را برای تولید اتانول زیستی مقرون‌به‌صرفه افزایش داد (59, 61-63).
مرحلة هیدرولیز و به‌کارگیری آنزیم‌های هیدرولیزکنندة مناسب یکی از مراحلی است که می‌تواند بهره‌وری تولید اتانول زیستی را بهبود بخشد. کارایی هیدرولیز آنزیمی تأثیرگرفته از عوامل بسیاری است که می‌توان به نوع سوبسترا و غلظت آن، نوع پیش‌تیمار انجام‌شده، محتوای لیگنین و همی‌سلولز، تخلخل زیست‌توده، تبلور الیاف سلولزی، دما، pH، چگونگی همزنی، افزودن ترکیبات خاص مانند مواد فعال سطحی[57] برای تغییر سطوح مولکول سلولز و نوع و فعالیت آنزیم هیدرولیزکننده اشاره کرد (33, 51, 54, 64). به‌طور کلی، تعیین میزان دوز بهینة آنزیم کار دشواری است؛ زیرا بهای آنزیم‌های تجزیه‌کنندة ترکیبات لیگنوسلولزی همیشه ثابت نیستند و تغییر میکنند. نوع ترکیب لیگنوسلولزی استفاده‌شده نیز در تعیین این دوز مؤثر است؛ به‌طوری‌که دوز کمتری از آنزیم برای چوب‌های نرم و دوز بیشتری برای چوب‌های سخت به کار می‌رود. همچنین، غلظت مواد جامد نامحلول در آبِ به‌وجودآمده طی روش قندسازی و تخمیر همزمان[58] در تعیین این دوز تأثیر دارد (39, 65). در زمان حاضر، از آنزیم‌های هیدرولیزکنندة ترکیبات لیگنوسلولزی تجاری در مرحلة هیدرولیز استفاده می‌شود که به‌صورت کوکتل[59] آنزیمی سلولازی و همی‌سلولازی متشکل از 40 تا 50 نوع آنزیم با فعالیت‌های خاص خود هستند. همچنین، میزان و نوع آنزیم‌های اختصاصی درون کوکتل با توجه به نوع زیست‌توده تغییرپذیر است (47, 49, 66-68).
هیدرولیز ترکیبات لیگنوسلولزی با آنزیم‌ها مزایای زیادی را نسبت به پیش‌تیمارهای شیمیایی شامل می‌شود که می‌توان به اختصاصیت بالا، شرایط واکنش ملایم (pH در حدود 5/4 تا 5 و دمای 40 تا 50 درجه سانتی‌گراد)، بی‌نیازی به تجهیزات خاص، نبود مهارکننده‌های سمی مانند وانیلین و فورآلدهید و سالم‌ماندن سوبسترا طی تغییرات شیمیایی اشاره کرد (51, 54, 69, 70). محصولات هیدرولیز آنزیمی ترکیبات لیگنوسلولزی می‌توانند به سوخت‌های مایع، پروتئین تک‌یاخته[60]، حلال‌ها و دیگر ترکیبات خاصی تبدیل شوند که قابل استفاده برای میکروارگانیسم‌های تخمیرکننده‌اند. استفاده از این منابع لیگنوسلولزی به کاهش و حتی حذف ضایعات کشاورزی و پساب کمک شایانی می‌کند (71, 72). با این حال و در زمان حاضر، به‌علت زمان‌بربودن مرحلة هیدرولیز آنزیمی، پایین‌بودن فعالیت سلولازهای طبیعی، مهار کاتابولیکی آنزیم با محصولات قندی تولیدشده و بالابودن میزان آنزیم مصرفی و بهای آن (در حدود 50-25 درصد کل هزینه تولید اتانول زیستی نسل دوم)، استفاده از این روش در مقیاس‌های کلان صنعتی هنوز به قطعیت کامل نرسیده است (54, 59, 73).
تخمیر و تولید اتانول زیستی: ترکیبات لیگنوسلولزی پس از مراحل پیش‌تیمار، سمیت‌زدایی و هیدرولیز وارد مرحلة تخمیر می‌شوند تا اتانول زیستی تولید شود؛ یعنی تبدیل قندهای پنج و شش کربنه به اتانول. حداکثر بازده تئوری قندهای پنج و شش کربنه موجود در شیرابه 511/0 کیلوگرم اتانول و 489/0 کیلوگرم دی‌اکسیدکربن به‌ازای هر کیلوگرم قند است؛ ازاین‌رو، بازده کلی تئوری اتانول (در دمای 20 درجه سانتی‌گراد) به‌ترتیب 713/0 و 736/0 لیتر در کیلوگرم گلوکان (و / یا سایر ساختارهای شش کربنه) و زایلان (و / یا سایر ساختارهای پنج کربنه) می‌شود. با وجود این، توسعة این مرحله هنوز موانعی دارد که یکی از آنها فقدان میکروارگانیسم‌های مناسبی است که بتوانند به‌صورت مؤثر همه قندهای موجود در شیرابة تیمارشده را تخمیر و به اتانول تبدیل کنند (16, 36, 74).
در کل، مرحلة تولید اتانول زیستی از شیرابة تیمارشدة لیگنوسلولزی با استفاده از روش‌های قندسازی و تخمیر همزمان[61]، قندسازی جزئی همراه با تخمیر[62]، قندسازی و تخمیر نیمه‌همزمان[63]، پردازش زیستی یکی‌شده یا فرآوری زیستی تلفیقی[64]، قندسازی و تخمیر همراه با هم همزمان[65]، قندسازی و تخمیر همزمان غیر هم‌دمایی[66]و هیدرولیز و تخمیر جداگانه[67] صورت می‌گیرد که در ادامه به برخی از مهم‌ترین آنها اشاره شده است (75, 76). در هریک از این روش‌ها، نوع کشت استفاده‌شده نیز اهمیت می‌یابد. در رابطه با نوع کشت گفتنی است هر دو نوع کشت بسته[68] و پیوسته[69] برای این منظور استفاده می‌شوند؛ اما معمولاً برای تولید در مقیاس صنعتی، کشت پیوسته به‌دلایل اقتصادی همچون حجم بالاتری از بهره‌وری، صرف زمان کمتر برای تخلیه، شستشو و بارگیری دوباره، نیروی کار کمتر و احتمال آلودگی پایین‌تر مقرون‌به‌صرفه‌تر است. همچنین، کشت پیوسته در ایجاد سازگاری میکروارگانیسم‌های تخمیرکننده نسبت به مهارکننده‌هایی تأثیرگذار است که به‌واسطة پیش‌تیمار زیست‌توده تولید می‌شوند (30, 77). افزون بر کشت‌های بسته و پیوسته، سلول‌های تثبیت‌شده[70] نیز در تولید اتانول استفاده می‌شوند؛ زیرا با ایجاد تراکم سلولی بالا بهره‌وری را در راکتور افزایش می‌دهند و با حذف مرحلة شستشو در سامانه‌های پیوسته، نیاز به مراحل جداسازی یا بازیافت برای به دست آوردن تراکم سلولی بالا در راکتور زیستی از بین می‌رود و فرایندهای زیستی مؤثر‌تر با بازدهی اقتصادی بهتری انجام می‌شوند. علاوه بر تثبیت، استفاده از نانوذرات فلزی[71]، نانوفیبر‌ها[72]، نانولوله‌ها[73] و نانوصفحات[74] به‌عنوان نانوکاتالیزور و همچنین، پایین نگه داشتن غلظت اتانول تولیدی با حذف آن ازطریق استخراج حلالی به حفظ و نگهداری سلول‌ها در راکتور‌ها و درنتیجه، افزایش تولید اتانول زیستی کمک شایانی می‌کند (78-80).
روش قندسازی و تخمیر همزمان: یکی از موفق‌ترین روش‌های تولید اتانول زیستی از مواد لیگنوسلولزی، روش قندسازی و تخمیر همزمان است. در این روش هیدرولیز ترکیبات لیگنوسلولزی به‌منظور آزادسازی واحدهای قندی از بخش پلیمری همزمان با تبدیل قندهای آزادشده توسط مخمر یا دیگر میکروارگانیسم‌ها به اتانول در شرایط بی‌هوازی صورت می‌گیرد (51, 81). در این روش، بازده تولید اتانول با به حداقل رساندن اثر مهاری محصول، جذب سریع قندهای آزادشده توسط مخمر، کاهش دوز مصرفی آنزیم یا آنزیم‌های هیدرولیزکننده، کاهش مصرف آب و به طبع، کاهش انرژی مورد نیاز برای تقطیر، بی‌نیازی به راکتورهای جداگانه برای فرایندهای هیدرولیز و تخمیر و کاهش سرمایه‌گذاری اولیه افزایش می‌یابد (65, 82). سویه‌های اصلاح ژنتیکی شدة ساکارومایسس سرویزیه[75] که تخمیرکنندة زایلوز هستند، برای فرایند تخمیر همراه با هم استفاده می‌شوند و بازده اتانول 32/0 گرم به‌ازای هر گرم قند را نشان می‌دهند که این یک فرایند مناسب برای ترکیبات لیگنوسلولزی غنی از زایلوز است؛ اگرچه بازده اتانول 35 درصد کمتر از حداکثر بازده است (58). علاوه بر مخمر، قارچ‌های میانه‌پسندی[76] همچون فوزاریوم[77] و موناسکوس[78] در این روش استفاده شده‌اند (83)؛ با وجود این، متفاوت‌بودن دمای بهینه برای فرایندهای هیدرولیز (حدود 50 درجه سانتی‌گراد) و تخمیر (35 درجه سانتی‌گراد)، یکی از اصلی‌ترین معایب این روش به شمار می‌رود (2, 84, 85). گفتنی است درجه حرارت می‌تواند افزایش یابد؛ اما اگر مخمرها در معرض دمای بالاتر از دمای مطلوب خود قرار بگیرند، تغییرات ریخت‌شناسی و فیزیولوژی در آنها ایجاد و آسیب سلولی مشاهده می‌شود که باعث کاهش دوام سلول و متابولیسم مخمر می‌شود؛ همچنین دمای بالا به کاهش غلظت اتانول، عملکرد و بهره‌وری منجر می‌شود. در این زمینه، میکروارگانیسم‌های گرمادوست و تحمل‌کنندة گرما به‌عنوان تولیدکننده‌های بالقوة اتانول لیگنوسلولزی برای روش تخمیر و قندسازی همزمان شناسایی شدند (30, 86) که هنوز محدودیت‌های زیادی ازجمله توانایی کم در تحمل اتانول و نرخ تولید پایین را دارند؛ اما احتمال خطر آلودگی در این روش کمتر از روش هیدرولیز و تخمیر جداگانه است (87).
روش قندسازی و تخمیر همراه با هم همزمان: در این روش پس از انجام پیش‌تیمار، شیرابة همی‌سلولزی از بخش جامد سلولزی جدا نمی‌شود و در مرحلة بعدی هیدرولیز و تخمیر قندهای پنج و شش کربنه همزمان و همراه با هم صورت می‌گیرد که درواقع تخمیر همراه با هم در نام این روش به این مرحله اشاره دارد. در مقایسه با روش قندسازی و تخمیر همزمان این روش به دو راکتور جداگانه برای تخمیر قندهای پنج و شش کربنه و دو راکتور جداگانه برای تولید زیست‌تودة میکروبی تخمیرکنندة این قندها نیاز ندارد و همزمان می‌توان تخمیر قندهای پنج و شش کربنه را در یک راکتور و با یک نوع میکروارگانیسم تخمیری انجام داد (40, 45, 51, 88).
روش قندسازی و تخمیر همزمان غیر هم‌دمایی: در روش قندسازی و تخمیر همزمان، هیدرولیز آنزیمی در دمایی پایین‌تر از دمای بهینة واکنش انجام می‌شود که باعث کاهش فعالیت آنزیمی و افزایش دوز آنزیم مصرفی می‌شود. برای غلبه بر این مشکل، استفاده از روش قندسازی و تخمیر همزمان غیر هم‌دمایی پیشنهاد شده است. در این روش، قندسازی و تخمیر همزمان با هم در دو راکتور جداگانه و با دماهای متفاوت انجام می‌شود. ترکیبات لیگنوسلولزی درون راکتور هیدرولیز باقی می‌مانند و در دمای بهینة آنزیم هیدرولیز می‌شوند. سپس مایع خروجی از این راکتور خارج می‌شود و درون راکتور تخمیر به گردش درمی‌آید که دمای آن روی دمای بهینة رشد میکروارگانیسم تخمیری تنظیم شده است (51).
روش هیدرولیز و تخمیر جداگانه: همان‌طور که از نام این روش پیداست، هیدرولیز آنزیمی ترکیبات لیگنوسلولزی به‌منظور آزادسازی واحدهای قندی از بخش پلیمری و تبدیل قندهای آزادشده به اتانول توسط مخمر یا مخمرهای مختلف در مراحل و راکتورهای جداگانه‌ای صورت می‌گیرد (51, 88)؛ البته، تولید آنزیم‌های هیدرولیزکنندة ترکیبات لیگنوسلولزی نیز بخشی از این روش محسوب می‌شود؛ اما می‌توان آنزیم‌های مورد نیاز را به‌صورت تجاری تهیه کرد (89). اثر مهاری محصول نهایی اصلی‌ترین مشکل این روش است؛ برای مثال، سلوبیوز تولیدشده در بخش هیدرولیز به‌عنوان مهارکنندة سلولاز عمل می‌کند. همچنین این روش به زمان زیادی به‌خصوص برای بخش هیدرولیز نیازمند بوده و گران قیمت است (40, 58).
روش پردازش زیستی یکی‌شده: در تمامی روش‌های توضیح داده شده، یک نکتة مشترک وجود دارد و آن نیاز به یک واحد جداگانه برای تولید آنزیم‌های هیدرولیزکنندة ترکیبات لیگنوسلولزی یا تأمین آنها به‌صورت تجاری است. همچنین، وجود سموم آزادشده در مرحلة پیش‌تیمار ترکیبات لیگنوسلولزی و مشکلات مربوط به تخمیر همزمان قندهای پنج و شش کربنه، فرایند تولید اتانول زیستی را به چندین مرحله تقسیم کرده است؛ درنتیجه، برای کاهش هزینه‌های سرمایه‌گذاری اولیه و حین فرایند، در هم ادغام کردن برخی مراحل و ساده‌سازی آنها تا جای ممکن، روشی را به نام روش پردازش زیستی یکی‌شده به وجود آورده است (27, 88). در این روش، از یک نوع میکروارگانیسم یا یک کشت مخلوط[79] از میکروارگانیسم‌هایی استفاده می‌شود که آنزیم‌های هیدرولیزکنندة ترکیبات لیگنوسلولزی را تولید و سپس قندهای پنج و شش کربنة تولیدشده را به اتانول و دیگر ترکیبات با ارزش تبدیل میکنند (90, 91). یکی از ویژگی‌های این روش، بی‌نیازی از افزودن آنزیم‌های سلولازی و هموسلولازی خالص به‌صورت جداگانه است که مشکل استفاده از آنزیم‌های صنعتی گران قیمت را برطرف می‌کند (92). همچنین، دمای بهینة هیدرولیز و تخمیر یکسان است و به راکتور جداگانه برای هیدرولیز آنزیمی یا تخمیر نیاز نیست (22, 93). کلستریدیم ترموسلوم[80] میکروارگانیسم اصلی استفاده‌شده در این فرایند است که با تولید طبیعی سلولازها، زیست‌توده را به قندهای قابل تخمیر، تجزیه و سپس اتانول تولید می‌کند (58).
.میکروارگانیسم‌های استفاده‌شده در تولید اتانول زیستی: با توجه به مراحل مختلف تولید اتانول زیستی، بسیاری از میکروارگانیسم‌ها به‌ویژه باکتری‌ها و مخمرها می‌توانند برای تولید این سوخت زیستی استفاده شوند (94). علاوه بر مخمرها و باکتری‌ها، قارچ‌های رشته‌ای مانند موکور ایندیکوس[81]، نوروسپورا اینترمدیا[82]، رایزوپوس اورایزه[83]، پنیوفورا سینرئال[84] و ترامیتس سایئولنس[85] برای تولید اتانول بررسی شده‌اند (87, 95, 96). بعضی از این میکروارگانیسم‌ها قادر به تخمیر قندهای پنج و شش کربنه هستند و با توجه به اینکه بسیاری از این میکروارگانیسم‌ها هم توانایی تولید آنزیم‌های هیدرولیزکنندة ترکیبات لیگنوسلولزی را دارند و هم توانایی تولید اتانول، می‌توان از آنها برای پردازش زیستی یکی‌شده استفاده کرد. با وجود این، بازده کم اتانول، به‌دلیل تشکیل مقادیر چشمگیری از محصولات جانبی (برای مثال، اسید استیک)، بهره‌وری پایین و نرخ رشد کم از معایب تولید اتانول توسط قارچ‌های رشته‌ای به شمار می‌روند (87)؛ بنابراین، تلاش‌ها برای دستورزی ژنتیکی میکروارگانیسم‌هایی افزایش یافته است که قابلیت‌هایی همچون مصرف قندهای پنج کربنه، تحمل به غلظت‌های بالای اتانول و بازدهی تولید بالا را یکجا داشته باشند. در برخی از مطالعات نشان داده شده است جهش‌یافته‌هایی از جنس ژئوباسیلوس که در ژن لاکتات دهیدروژناز خود نقص دارند، اتانول بیشتری تولید میکنند. همچنین، این جنس از نقطه‌نظر مهندسی متابولیک برای تولید اتانول از ترکیبات لیگنوسلولزی حاصل از زیست‌توده‌های گیاهی، دستورزی ژنتیکی نیز شده است (2, 97). برخی از انواع میکروارگانیسم‌هایی که در این فرایند به کار می‌روند، در ادامه توضیح داده شده‌اند. انواعی از مخمرهایی که در تولید اتانول زیستی کاربرد دارند، در جدول 2 آورده شده‌اند.
جدول 2- برخی از انواع مخمرهای استفاده‌شده در فرایند تولید اتانول زیستی
|
نام علمی |
مزایا |
معایب |
منابع |
|
ساکارومایسس سرویزیه |
- تحمل طیف وسیعی از pH - بازده تولید بالا |
- حساسیت به غلظت بالای اتانول - استرس اسمزی - احتمال آلودگی کشت با باکتری‌های اسیددوست - کاهش کارایی تولید در حضور مهارکننده‌ها |
(98, 99) |
|
اسکیتزوساکارومایسس پومبه[86] |
- تحمل طیف وسیعی از pH و دما - مقاومت به سموم و نگهدارنده‌ها |
- سرعت رشد پایین - تولید مقادیر زیادی از سولفید هیدروژن طی فرایند تخمیر |
(100) |
|
کلایورومایسس مارکسیانوس[87] |
- توانایی مصرف طیف وسیعی از قندهای پنج، شش و 12 کربنه - مقاومت در برابر دمای بالا و سموم - تحمل طیف وسیعی از pH |
- بازده تولید پایین |
(101) |
|
پاکیسولن تانوفیلوس[88] |
- توانایی مصرف طیف وسیعی از قندهای پنج و شش کربنه |
- حساسیت به غلظت‌های بالای اتانول - نیازمندی به ایجاد شرایط میکروآئروفیلی دقیق - حساسیت بالا به مهارکننده‌ها - ناتوانی در تخمیر زایلوز در pHهای پایین |
(102, 103) |
|
کاندیدا شهاتائی[89] |
- توانایی مصرف قندهای پنج و شش کربنه |
- حساسیت به غلظت‌های بالای اتانول |
(103) |
|
پیچیا استیپیتیس[90] |
- بالاترین ظرفیت تخمیز زایلوز بین مخمرهای متداول |
حساسیت به غلظت‌های بالای اتانول - نیازمندی به ایجاد شرایط میکروآئروفیلی دقیق |
(104, 105) |
ساکارومایسس سرویزیه: ساکارومایسس سرویزیه معمول‌ترین مخمری است که در فرایند تولید الکل استفاده می‌شود. این مخمر می‌تواند در شرایط بهینه با سرعت بسیار بالایی فرایند گلیکولیز را انجام دهد و از گلوکز تولید اتانول کند؛ درحالی‌که قادر به مصرف قندهای پنج کربنه به‌ویژه زایلوز نیست و این مسئله بر کارایی ساکارومایسس سرویزیه دربارة تخمیر شیرابه‌های لیگنوسلولزی تأثیرگذار است که بخشی از آنها قندهای پنج کربنة حاصل از تخریب همی‌سلولزهاست (106, 107).
میزان اتانول تولیدی در شرایط بهینه از گلوکز تا 50 میلی‌مول در ساعت در هر گرم از پروتئین سلولی ساکارومایسس سرویزیه می‌رسد؛ اما این شرایط تنها برای مدت کوتاهی در کشت تخمیری بسته ایجاد می‌شود و با افزایش غلظت اتانول در محیط اطراف سلول‌ها، سرعت تولید به شدت کاهش می‌یابد (39, 108). عوامل محیطی زیادی در تعیین غلظت بحرانی اتانول نقش دارند که سبب مهار رشد مخمر و کاهش بازده فرایند تولید می‌شوند؛ ازجمله دما، pH، ترکیبات مهارکننده‌ای مانند هیدروکسی فورفورال، فورفورال، استات و ... موجود در شیرابة لیگنوسلولزی، ترکیبات محیط کشت تخمیری مانند عصارة مخمر و یون‌های کلسیم، منیزیم و آمونیوم و ترکیبات دیگری مانند بیوتین، مزو-اینوزیتول و پانتوتِنیک‌اسید که برای رشد سلول‌های مخمری ضروری‌اند. کاهش میزان ترکیبات مهارکننده به زیر حد مهارکنندگی، افزایش زیست‌تودة مخمری و استفاده از سلول‌های تثبیت‌شده در خود فرمانتور بدون وجود مواد پوشش‌دهنده از راهکار‌های مقابله با این مسئله است (109, 110). در مطالعه‌ای که ایمانی و همکاران انجام دادند، لجن فعال به‌عنوان مکمل در محیط کشت تولید اتانول زیستی توسط ساکارومایسس سرویزیه استفاده شد که نتایج نشان دادند استفاده از 10 گرم در لیتر لجن فعال به همراه گلوکز در محیط کشت این مخمر، بازده تولید اتانول زیستی را تا 90 درصد افزایش داده است (111). همچنین، در مطالعة اخیری که رباط جزی و همکاران منتشر کردند، مشخص شد شربت گلوکز و عصارة خیساندة ذرت می‌توانند جایگزین مناسبی برای محیط کشت حاوی ملاس در تولید اتانول زیستی توسط ساکارومایسس سرویزیه باشند (112). علاوه بر ترکیبات محیط کشت، سویه یا سویه‌هایی که برای تولید اتانول زیستی از مواد لیگنوسلولزی به کار برده می‌شوند، باید مسیر‌های متابولیکی متنوعی داشته باشند (برای مثال، قابلیت مصرف زایلوز)، با تغییرات pH و دما خود را تطبیق دهند، اثرات سمی الکل را تحمل کنند و توانایی تولید اتانول نزدیک به میزان بیشینة تئوری را داشته باشند (37, 113). علاوه بر این، سویه‌های نوترکیب این مخمر که پایداری ژنتیکی و بیان قابل قبولی دارند، می‌توانند در افزایش بازده تولید اتانول زیستی نقش داشته باشند (114).
قارچ های بی‌هوازی: قارچ‌های بی‌هوازی متعلق به راستة نئوکالیماستیگومایکوتا[xci] نیز گزینه مناسبی برای تولید اتانول زیستی محسوب می‌شوند؛ زیرا آنها توانایی چشمگیری در تجزیة ترکیبات لیگنوسلولزی خام دارند و قادر به تبدیل اجزای پلیمری دیوارة سلول‌های گیاهان به هیدورژن و اتانول هستند. قارچ‌های بی‌هوازی معمولاً در مجاری گوارشی پستانداران بزرگ گیاه‌خوار یافت می‌شوند. ترکیبی از روش‌های مهندسی فرایند و مهندسی ژنتیک (مولکولی) می‌تواند به انتقال موفقیت‌آمیز قارچ‌های بی‌هوازی از زیستگاه طبیعی آنها در گیاه‌خواران به بهره‌برداری مؤثر در تولید سوخت‌های زیستی صنعتی کمک کند. در استفاده از مهندسی فرایند توجه به جنبه‌های طراحی مانند ساختار مخازن تخمیر، زمان ماند، تلقیح مناسب و ورودی سوبسترای گیاهی ضروری است. مهندسی ژنتیک نیز فرصتی را برای دستورزی سلول‌های قارچی بی‌هوازی و بهره‌برداری از پتانسیل ژنتیکی آنها برای محصولات بیشتر و هیدرولیز سریع‌تر ترکیبات لیگنوسلولزی فراهم می‌کند (115).
باکتری‌های گرمادوست: استفاده از باکتری‌های گرمادوست برای تخمیر قندی و تولید اتانول زیستی مزایایی دارد که عبارت‌اند از (116-119) خواص فیزیکی مناسب محیط کشت در دماهای بالا (کاهش گرانروی، کشش سطحی و درنهایت، کاهش مصرف انرژی برای همزنی و جداسازی آسان‌تر مواد جامد از مایع)، سرعت بالای واکنش نسبت به میانه‌پسند‌ها، رشد سریع و سرعت بالا در مصرف سوبسترا، بازده تولید بالا در هر واحد سوبسترا، افزایش ارزش گرمایی متابولیکی، کاهش حلالیت اکسیژن (مناسب برای تولید اتانول با کمک باکتری‌های بی‌هوازی)، تسهیل در به دست آوردن محصول (به‌علت فشار بخار بالای ترکیبات فرار)، پایین‌بودن هزینه‌های خنک‌کردن سامانه، در دسترس‌پذیری زیستی و حلالیت بیشتر ترکیبات آلی در دماهای بالا، آلوده‌نشدن محیط کشت با میکروارگانیسم‌های میانه‌پسند و مصرف قندهای پنج کربنه و تولید آنزیم‌های سلولازی موجود در مکان (این دو ویژگی آخر می‌توانند در تعامل با یکدیگر تا 47 درصد بازده تولید اتانول از هر واحد سوبسترای چوبی را افزایش دهند). همچنین، نیازی نیست مراحل هیدرولیز آنزیمی و تخمیر جدا شوند. ترکیب این مراحل می‌تواند اثر مهاری محصول نهایی را با تولید محصولات حاصل از هیدرولیز آنزیمی کاهش دهد که درنهایت، به کاهش هزینه‌های کلی منجر می‌شود؛ اما باید توجه داشت ممکن است سلولازهای صنعتی استفاده‌شده، در شرایط احیایی محیط کشت‌های باکتری‌های گرمادوست بی‌هوازی غیرفعال شوند (3, 120). باوجود مزایای فراوان باکتری‌های گرمادوست در تولید اتانول زیستی، استفاده از باکتری‌های گرمادوست بی‌هوازی به‌ویژه کلستریدیوم‌ها برای تولید اتانول زیستی در مقیاس صنعتی مناسب نیست که مهم‌ترین آنها عبارت‌اند از تولید اسیدهای آلی مانند اسید استیک و اسید لاکتیک علاوه بر اتانول از قندهای آزادشده از ترکیبات لیگنوسلولزی، ناتوانی یا محدودیت در مصرف قندهای پنج کربنه به‌ویژه زایلوز و زایلوبیوز، پایین‌بودن بازدهی اتانول تولیدی، پایین‌بودن آستانة تحمل نسبت به اتانول تولیدشده در محیط به‌علت ایجاد سیالیت در غشای سلولی که سبب به هم خوردن عملکرد غشا می‌شود، مهار برخی آنزیم‌های گلیکولازی یا به هم خوردن تعادل پتانسیل اکسید و احیای سلول، کند رشد و سخت رشد بودن، داشتن نیازمندی‌های پیچیدة غذایی که ساخت محیط کشت را دشوار می‌کند و نبود یک سامانة ژنتیکی مناسب برای دستورزی سویه‌های گرمادوست بی‌هوازی (119, 121, 122).
زایموموناس موبیلیس[xcii]: در میان باکتری‌ها، زایموموناس موبیلیس بیشتر از دیگر باکتری‌ها مطالعه شده است که یک باکتری گرم منفی و قادر به تخمیر گلوکز، ساکارز و فروکتوز است. درمقایسه با مخمر ساکارومایسس سرویزیه، باکتری زایموموناس موبیلیس دارای بازدهی بهره‌وری ویژة اتانول بالایی است؛ زیرا زیست‌تودة کمتری را تولید و غلظت بالاتری از اتانول را تحمل می‌کند. با این حال، این باکتری قادر به استفاده از انواع محدودتری از قندهاست و تحمل کمتری به مهارکننده‌هایی مانند اسید استیک دارد. علاوه بر این، زایموموناس موبیلیس تنها در محدودة pH خنثی رشد می‌کند که ویژگی مشترک بیشتر گونه‌های باکتریایی است (87). ویژگی جالبی که این باکتری دارد مربوط به غشای پلاسمایی آن است که حاوی هوپانوئیدهاست (ترکیبات پنج حلقه‌ای مانند استرول‌های یوکاریوتی)؛ بنابراین، تحمل فوق‌العاده‌ای به اتانول (حدود 16 درصد وزنی) نشان می‌دهد. تلاش‌های متعددی برای مهندسی زایموموناس موبیلیس انجام شده است تا با مهندسی متابولیسم، جهش‌زایی یا جهش تطبیقی بر نقص ذاتی این باکتری غلبه شود و سویه‌های مقاوم به اسید استیک ایجاد شود. با این حال، هنگامی که این سویه‌های مهندسی‌شده قندهای مخلوط را در حضور مهارکننده‌ها متابولیزه میکنند، بازده و بهره‌وری بسیار پایین‌تر است و سبب ایجاد محدودیت آنها در کاربری صنعتی می‌شود (40). در برخی موارد نیز می‌توان ژن‌های کلیدی فرایند تولید اتانول زیستی را از زایموموناس موبیلیس به سویه‌های اشریشیا کلای، منتقل و سویه‌هایی با قابلیت‌های بهبودیافته ایجاد کرد (123).
استرپتومایسس فولویسیموس [xciii]CKS7: به‌طور کلی، اعضای جنس استرپتومایسس پتانسیل چشمگیری برای به‌کارگیری در تولید سوخت‌های زیستی دارند. استرپتومایسس فولویسیموس که گونه‌ای از این جنس است، انواع مختلفی از آنزیم‌های هیدرولیزکنندة خارج سلولی همچون سلولازها (کربوکسی‌متیل‌سلولاز و آوی‌سِلاز)، آمیلاز، پکتیناز و زایلاناز تولید می‌کند. این سویه قادر به رشد در پلیت حاوی سلولز، نشاسته، زایلان و پکتین آگار است و در بازة دمایی 37-25 درجه سانتی‌گراد با دمای بهینة رشد 30 درجه سانتی‌گراد، pH بین 8-6 و pH بهینة 7 رشد می‌کند. سویة CKS7 قادر به هیدرولیز هر دو شکل سلولز محلول و نامحلول سلولز است و می‌تواند روی ضایعات مختلف کشاورزی رشد کند. به نظر می‌رسد سبوس چاودار مناسب‌ترین سوبسترای زائد برای تبدیل زیستی توسط این سویه است. اگرچه بازدهی اتانول حاصل از آن متوسط است، این سویه مشابه سایر اعضای جنس استرپتومایسس گزینة امیدوارکننده‌ای برای تجزیة ضایعات لیگنوسلولزی است که می‌تواند در تولید سوخت‌های زیستی استفاده شود (124).
جمع‌بندی
آسیب‌های زیست‌محیطی سوخت‌های فسیلی جهان را به سمت یافتن منابع جدید انرژی ازجمله سوخت‌های زیستی سوق داده است. یکی از متداول‌ترین سوخت‌های زیستی اتانول است که تاکنون نسل‌های مختلفی از آن ایجاد شده است. بین این نسل‌ها، به‌طور ویژه‌ای به نسل دوم اتانول زیستی توجه شده است؛ زیرا مشکلات نسل اول ازجمله رقابت با غذای انسان را ندارد و قابلیت صنعتی‌شدن آن بیشتر از نسل سوم و چهارم است؛ درنتیجه، مطالعة دقیق فرایند تولید اتانول زیستی نسل دوم از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است که درواقع تولید اتانول از ترکیبات لیگنوسلولزی است. شناخت درست اجزای ترکیبات لیگنوسلولزی، بهینه‌سازی روش‌های پیش‌تیمار و یافتن روش هیدرولیز و تخمیر با بازده بالا ازجمله مواردی‌اند که باید به دقت بررسی شوند تا این فرایند را از لحاظ صنعتی مقرون‌به‌صرفه کنند. باوجود پژوهش‌های گسترده‌ای که برای انتخاب مناسب‌ترین میکروارگانیسم در مرحلة تخمیر انجام شده است، همچنان ساکارومایسس سرویزیه و زایموموناس موبیلیس در صدر بررسی‌ها قرار دارند. باکتری زایموموناس موبیلیس بازدهی خوبی را در تولید اتانول نشان می‌دهد؛ اما حساسیت آن به برخی مهارکننده‌ها چالش‌بر‌انگیز است. اصلی‌ترین ایراد واردشده به مخمر ساکارومایسس سرویزیه نیز عدم توانایی آن در مصرف قندهای پنج کربنه است؛ البته سویه‌های باکتریایی و قارچی دیگری نیز با توانایی تولید اتانول شناسایی شده‌اند که هریک ویژگی‌های منحصر‌به‌فرد و مفیدی دارند و می‌توان با روش‌های نوین به جایگزین‌های بهتری برای سویه‌های فعلی رسید.
[1]- International Energy Agency (IEA)
[2]- Datta
[3]- Streimikiene
[4]- Bioethanol
[5]- Nahak
[6]- Enteromorpha
[7]- Escherichia coli
[8]- Larch Dahurian
[9]- Elsevier
[10]- Springer
[11]- Taylor & Francis
[12]- Multidisciplinary Digital Publishing Institute
[13]- Hindawi
[14]- Biomass-derived alcohols
[15]- Biodiesels
[16]- Biohydrogen
[17]- Syngas
[18]- Pectin
[19]- Resin
[20]- Terpene
[21]- Phenol
[22]- Quinone
[23] Tannin
[24]- Bagasse
[25]- Homopolymer
[26]- Protofibril
[27]- Microfibril
[28]- Matrix
[29]- Crystallinity
[30]- Pretreatment
[31]- Amorphous
[32]- Heterogeneous
[33]- Guar
[34]- Esprato grass
[35]- Dicotyledonous plants
[36]- Commelinid monocots
[37]- Woody angiosperms
[38]- Gymnosperms
[39]- Polymerization
[40]- Monomer
[41]- Lingol
[42]- p-Cinnamic acid
[43]- trans-p-Coumaryl alcohol
[44]- trans-p-Coniferyl alcohol
[45]- trans-p-Sinapyl alcohol
[46]- p-Hydroxycinnamic acids
[47]- p-Coumaric acid
[48]- Ferulic acid
[49]- Sinapic acids
[50]- Combined heat and power unit (CHP)
[51]- Milling
[52]- Grinding, Hacking
[53]- Rolling
[54]- High pressure homogenization
[55]- Electron beam irradiation
[56]- Hot compression
[57]- Surfactants
[58]- Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF)
[59]- Cocktail
[60]- Single Cell Protein (SCP)
[61]- Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF)
[62]- Partial Saccharification and Co-Fermentation (PSCF)
[63]- Semi-Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSSF)
[64]- Consolidated Bioprocessing (CBP)
[65]- Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation (SSCF)
[66]- Nonisothermal Simultaneous Saccharification and Fermentation (NSSF)
[67]- Separate Hydrolysis and Fermentation (SHF)
[68]- Batch culture
[69]- Continuous culture
[70]- Immobilized cells
[71]- Metal nanoparticles
[72]- Nanofibers
[73]- Nanotubes
[74]- Nanosheets
[75]- Saccharomyces cerevisiae
[76]- Mesophile
[77]- Fusarium
[78]- Monascus
[79]- Consortium
[80]- Clostridium thermocellum
[81]- Mucor indicus
[82] Neurospora intermedia
[83]- Rhizopus oryzae
[84]- Peniophora cinereal
[85]- Trametes suaveolens
[86]- Schizosaccharomyces pombe
[87]- Kluyveromyces marxianus
[88]- Pachysolen tannophilus
[89]- Candida shehatae
[90]- Pichia stipitis
[xci]- Neocallimastigomycota
[xcii]- Zymomonas mobilis
[xciii]- Streptomyces fulvissimus CKS7
)