نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری زیست‌شناسی سلولی و مولکولی، پژوهشکدۀ زیست‌فناوری، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، تهران،
2 استادیار گروه بیوتکنولوژی پزشکی و دارویی، پژوهشکدۀ زیست‌فناوری، سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران، تهران
3 استادیار گروه ویروس‌شناسی، موسسۀ تحقیقات واکسن و سرم رازی(AREEO) ، سازمان تحقیقات کشاورزی، آموزش و ترویج، تهران
4 استاد گروه ایمنی‌شناسی، دانشکدۀ بهداشت، دانشگاۀ علوم پزشکی تهران، تهران، ایران- مرکز تحقیقات ایمونولوژی تولیدمثل، موسسۀ تحقیقاتی ابن‌سینا (ACECR)، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Cervical cancer is the leading cause of morbidity and cancer mortality in women throughout the world and persistent infection with human papillomavirus (HPV) is the main etiology for the development of this cancer. Peptide vaccines derived from E6 and E7 oncogenes are promising candidates for HPV vaccine production due to their safety, high stability, and ease of production. In the current study, expression strains such as Escherichia coli BL21 (DE3), BL21 (DE3)-AI, Rosetta, C41 (DE3), and BL21 (DE3)-pLysS were applied for poly epitopic E6 expression and the effects of temperature, induction time, and inducer concentration on the expression level of recombinant HPV16-E6 polypeptide protein were examined in the mentioned strains.
Materials and Methods: In the present study, the optimized gene of E6 recombinant protein was cloned into pET28a vector under the control of T7 promoter and the resulting plasmid was successfully transformed into Escherichia coli strains BL21 (DE3), BL21 (DE3)-AI, Rosetta, C41 (DE3), and BL21 (DE3)-pLysS. Then, the ability of these strains to express the desired recombinant protein in different conditions was compared. Two temperatures of 25 ° C and 37 ° C, IPTG concentrations between 0.1 and 1.0 mM, and different incubation times were selected to examine the expression level of recombinant E6 protein in these strains.
Results: The highest level of expression was obtained in Escherichia coli BL21 (DE3) -AI strain inducing at Optical Density (OD) of 0.9, 0.1 mM IPTG, and 16 hours induction at 25 °C.
Discussion and Conclusion: The results of this study can be used to produce E6 protein as a vaccine candidate in the treatment of HPV-related cancers.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
سرطان دهانه رحم چهارمین سرطان شایع بین زنان جهان و دومین سرطان شایع در زنان کشورهای درحال توسعه است. طبق گزارش WHO عفونت پاپیلوما ویروس انسانی (HPV) یکی از شایع‌ترین عفونت‌های منتقل جنسی است که به‌طور کلی بدون علامت است. HPV یکی از مهم‌ترین عوامل ایجادکنندة سرطان دهانه رحم محسوب می‌شود بیش از ١٠٠ نوع HPV شناسایی و طبقه شده است که از مهم‌ترین آنها می‌توان به تایپ‌های ١٦ و ١٨ اشاره کرد. در انواع پرخطر HPV،E6 و E7 به‌طور کامل چرخه سلولی را بلوکه می‌کند و سلول هیچ‌گاه مسیر تمایزی را طی نمی‌کند. سلول در مسیر تکثیر سلولی به‌طور فعال باقی می‌ماند و آپوپتوز نیز متوقف می‌شود؛ درنتیجه، ناپایداری‌های ژنومی به تجمع تغییرات ژنتیکی و بدخیم‌شدن سلول آلوده به HPV منجر می‌شود. فعالیت اصلی پروتئین E6، تحریک تخریب پروتئین P53 با واسطة یوبی‌کوئیتینه‌شدن است. در نبود E6، P53 باعث فعال‌شدن مسیر رونویسی از ژن‌های مربوط به آپوپتوز و درنتیجه، مرگ سلول آلوده قبل از تکثیر ویروس می‌شود. بازدارندگی p53 توسط E6 به کامل‌شدن چرخه عفونت ویروسی منجر می‌شود (1-3).
واکسن‌های درمانی متعددی با هدف ایجاد یا تقویت ایمنی سازگار با سلول‌های لنفوسیت T ایجاد شده‌اند که ازجمله آنها طیف وسیعی از وکتورهای ویروسی نوترکیب، پروتئین‌های نوترکیب، DNA عریان، سلول‌های دندریتیک antigen-pulsed (DC)، آنتی‌ژن‌های لکوسیتی انسانی کلاس I (HLA) و اپی‌توپ‌های پپتیدی برای درمان بیماری‌های مشتق‌شده از HPV16 آزمایش شده‌اند. از این میان، واکسن‌های پپتیدی و اپی‌توپی به‌عنوان ابزارهای مؤثری برای تقویت ایمنی سلول‌های لنفوسیت T در روش‌های پیشگیرانه و درمانی در برابر اختلالات سرطانی و عفونت‌های ویروسی استفاده می‌شوند. در کنار مزایای مختلف، واکسن‌های پپتیدی درمانی دارای ایمنی‌زایی ضعیفی‌اند و به روش‌های کمکی مانند استفاده از ساختارهای پلی اپی‌توپی یا افزودن لیپید و سایر آدجوانت‌ها برای افزایش قدرت واکسن نیاز دارند. طراحی پپتیدهای منتخب به‌صورت ساختار پلی اپی‌توپی، توانایی واکسن برای تحریک ایمنی ذاتی و افزایش پاسخ سلولی لنفوسیت‌های CD8+ T را ازطریق محافظت پپتیدها در برابر پروتئازها بهبود می‌بخشد (4-6).
برای بیان پروتئین‌های نوترکیب پلی اپی‌توپی، اشرشیاکلی به‌عنوان پرکاربردترین میزبان استفاده می‌شود که می‌تواند پروتئین هترولوگ را با موفقیت در شرایط بهینه بیان کند. اشرشیاکلی به‌علت ژنوم شناخته‌شده، سرعت بالای رشد، محیط رشد ارزان و طیف‌های گستردة وکتورها و سویه‌های بیانی هنوز هم محبوب‌ترین ارگانیسم میزبان برای تولید پروتئین‌های هترولوگ است (7). تولید پروتئین نوترکیب همیشه باعث اختلال در متابولیسم سلول میزبان می‌شود و استفاده از منابع سلولی برای تکثیر پلاسمیدها و رونویسی ژن‌های هدف، به کاهش مقدار بیوماس منجر می‌شود؛ به‌ویژه تکثیر پلاسمید با قابلیت تکثیر بالا می‌تواند منجر به اختلال متابولیکی در سلول میزبان، بازده پایین محصول یا حتی مرگ سلولی شود. به همین دلیل برای دستیابی به بهره‌وری بالا، باید تعادل خوبی بین رشد بیوماس و تولید محصول وجود داشته باشد؛ بنابراین، بسیاری از پارامترهای مختلف باید بررسی و بهینه شوند که علاوه بر وکتور بیانی و سویه‌های مختلف، شامل دمای کشت، شرایط القایی و ... است. یکی از پرکاربردترین سیستم‌های بیانی در اشرشیاکلی، سیستم T7 است که در کنترل اپرون lac است و در وکتورهای pET و pRhot وجود دارد و بیان پروتئین هدف می‌تواند توسط لاکتوز یا β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) القا شود. چنین سیستم‌های بیان توسط القاگر، امکان جداسازی دقیق و قابل تنظیم مراحل رشد و تولید را با تغییر غلظت القاکننده و زمان القا فراهم می‌کنند (8).
در این مطالعه بیان پروتئین پلی اپی‌توپی E6 در چند سویه مختلف اشرشیاکلی و تحت پارامترهای محیطی مختلف ازجمله دمای کشت، غلظت القاکننده، مدت زمان انکوباسیون قبل و بعد از القا بررسی شد.
مواد و روش‌ها.
سویه‌های باکتریایی و پلاسمید: اشرشیاکلی DH5α به‌عنوان میزبان همسانه‌سازی برای تولید و حفظ وکتور بیانی استفاده می‌شود. پنج سویه بیانی مختلف از اشرشیاکلی، BL21 (DE3)، BL21 (DE3)-pLysS، BL21(DE3)-AI، Rosetta و C41(DE3) تهیه شده و طبق پروتکل‌های استاندارد ترانسفورم شده‌اند. وکتور pET-28a به‌عنوان وکتور بیانی انتخاب شد. ژن کدکنندة پروتئین نوترکیب E6 (rpE6) توسط شرکت Generay (چین) ساخته شد؛ به صورتی که محل برش برای آنزیم‌های محدودگر XhoI و NcoI (Themo Fisher,USA) برای دو انتهای ژن پیش‌بینی شده بود.
ساخت وکتور بیانی: برای ساخت وکتور بیانی pET-28a حاوی ژن rpE6، وکتور pET-28a و ژن rpE6 به‌صورت جداگانه توسط NcoI و XhoI هضم دوگانه آنزیمی شدند. باندهای هضم‌شده توسط کیت استخراج از ژل (یکتاتجهیز، ایران) تخلیص شدند. سپس با استفاده از آنزیم T4 DNA لیگاز، الحاق ژن rpE6 درون وکتور pET-28a انجام شد تا وکتور بیانی مدنظر ایجاد شود. پلاسمید pET28a-rpE6برای تکثیر و نگهداری به داخل اشرشیاکلی DH5αترانسفورم شد و کلونی‌های رشدکرده در محیط LB آگار حاوی 50 µg/ml کانامیسین توسط Colony PCR و توالی‌یابی بررسی شدند. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) با استفاده از مسترمیکس (یکتاتجهیز، ایران) و پرایمرهای عمومی پیش‌رو و معکوس پروموتور T7 انجام شد. شرایط PCRشامل دناتوراسیون اولیه در 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه، 30 سیکل شامل هر سیکل 30 ثانیه در 94 درجه سانتی‌گراد، 40 ثانیه در 50 درجه سانتی‌گراد و 1 دقیقه در 72 درجه بود. سپس مرحله نهایی 10 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد قرار گرفت. محصول PCRبه همراه لدر1kb DNA روی ژل آگارز 1 درصد ران شدند. همچنین توالی‌یابی با استفاده از پرایمرهای عمومی پیش‌رو و معکوس پروموتور T7 توسط شرکت Bioneer (Korea) صورت گرفت (9).
بیان پروتئین نوترکیب E6 در سویه‌های مختلف اشرشیاکلی: پلاسمید pET28a-rpE6 به داخل سویه‌های میزبان (BL21 (DE3)، BL21 (DE3)-pLysS، BL21(DE3)-AI، Rosetta، C41(DE3)) ترانسفورم شد که به روش شیمیایی مستعد شده بودند. تک کلونی‌های هر سویه برای کشت شبانه در 5 سی سی محیط Terrific Broth (TB) تلقیح شد و در دمای مناسب و دور rpm 180 انکوبه شد. 200 میکرولیتر از کشت شبانه هر سویه در 20 میلی‌لیتر TB تازه و حاوی کانامایسین تلقیح شد و تا رسیدن به OD600 (Optical Density) مدنظر، انکوبه و سپس با IPTG القا شد. در فواصل دلخواه مقداری از محتوای هر ارلن برداشته و ازنظر میزان OD600 و میزان بیان پروتئین rpE6 بررسی شد.
به‌منظور تعیین میزان باکتری (OD) از دستگاه اسپتکتوفتومتری و برای بررسی میزان بیان پروتئین، تکنیک SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) استفاده شد (10).
بهینه‌سازی پارامترهای مؤثر در بیان: برای بهینه‌سازی دما، سلول‌ها به نسبت 1 به 100 در محیط کشت TB، تلقیح و در 37 درجه سانتی‌گراد با دور rpm 180 انکوبه شدند تا زمانی که کدورت به 9/0 OD600: رسید. سپس نمونه‌ها به انکوباتورهای با دمای 20 و 25 درجه سانتی‌گراد منتقل شدند. پس از انکوباسیون به مدت 30 دقیقه که نمونه به دمای مدنظر رسید، IPTG اضافه شد و القای بیان به مدت 16 ساعت ادامه یافت. برای بهینه‌سازی غلظت IPTG، IPTG با غلظت نهایی 1 و 1/0 میلی‌مولار اضافه شد و بیان به مدت 16 ساعت ادامه یافت و نمونه‌گیری در فواصل منظم زمانی انجام شد (11).
.ارزیابی میزان پروتئین پلی اپی‌توپ E6 تولیدشده .توسط الکتروفورز در ژل پلی آکریل آمید (SDS-PAGE): به‌منظور تجزیه و تحلیل تولید پروتئین مدنظر، باکتری حاصل از هر کشت با سانتریفیوژ در 6000 دور در دقیقه و به مدت 7 دقیقه رسوب داده و جداسازی شد. رسوب باکتری در بافر لیز (Tris-HCl, 50 mM؛ EDTA, 5 mM؛ pH=8.5)، معلق و سونیکاسیون انجام شد. سونیکاسیون به روش 20 ثانیه پالس با فواصل 10 ثانیه‌ای استراحت و به تعداد 15 سیکل و روی یخ انجام شد. محلول رویی توسط سانتریفوژ با دور g 20000 به مدت 15 دقیقه و دمای 4 درجه از بقایای سلولی جداسازی شد.
در این تحقیق ژل متراکم‌کننده (stacking or spacer gel) به‌صورت 4 درصد و ژل جداکننده (Resolving or separating gel) با توجه به وزن مولکولی پروتئین‌ها به‌صورت 5/12 درصد تهیه شدند. ژل‌ها با رنگ Coomassie Blue R-250 به مدت یک ساعت، رنگ‌آمیزی و با محلول رنگ‌بر طی 16 ساعت رنگ‌بری شدند و در ادامه برای تأیید وسترن بلاکینگ صورت گرفت (12).
نتایج.
ساخت وکتور بیانی: پروتئین نوترکیب E6 از چندین پپتید ایمونوژنیک ایجاد شده است که توسط لینکر به هم متصل شده‌اند. برای انتهای C ترمینال آن توالی شش‌تایی از His-tag طراحی شد. توالی اسید نوکلئیک به‌صورت بهینه برای بیان در سیستم پروکاریوتی اشرشیاکلی طراحی و سنتز شد و در وکتور pGH از شرکت تحویل گرفته شد. توالی rpE6 با آنزیم‌های NcoI و XhoI از pGH خارج و در ناحیة برش‌شده توسط دو آنزیم فوق در پلاسمید pET28a کلون شد؛ بنابراین، در کنترل پروموتور T7 قابل القا با IPTG قرار گرفت. پلاسمید نوترکیب pET28a-rpE6 از داخل اشرشیاکلی DH5α، استخراج و توالی سازه با استفاده از توالی‌یابی و colony PCR تأیید شد (شکل 1).
شکل 1- الف) الکتروفورز ژل محصول PCR، سایز ژن پروتئین نوترکیب E6 حدودا 830 جفت‌باز است. ب) نتیجة توالی‌یابی ژن پروتئین نوترکیب
.بیان pET28a-rpE6 درسویه اشرشیاکلی BL21 (DE3): اشرشیاکلی BL21 (DE3) یکی از پرکاربردترین سیستم‌های پروکاریوتی به‌عنوان میزبان بیانی است که به‌دلیل فقدان دو پروتئاز OmpT و Lon در این سیستم بیانی می‌تواند گزینه مناسبی برای بیان پروتئین‌های نوترکیب باشد. با تجاری‌سازی سویه‌های مختلف هنوز یکی از سویه‌های پرکاربرد و معتبر برای بیان پروتئین‌های هترولوگ محسوب می‌شود (13)؛ بنابراین، در ابتدا پلاسمید pET28a-rpE6 به داخل این سویه، ترانسفورم و بیان در آن بررسی شد. هنگامی که با کشت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد، دانسیته سلولی در OD600 به 5/0 رسید، IPTG به محیط اضافه شد تا غلظت نهایی آن به 1 میلی‌مولار برسد؛ پس از 16 ساعت هیچ بیانی مشاهده نشد. با کاهش دما تا 22 درجه سانتی‌گراد نیز بیانی مشاهده نشد (داده‌ها آورده نشده است). با توجه به اینکه احتمال سمی‌بودن rpE6 برای سویه BL21(DE3) وجود داشت، طبق دستورالعمل‌های موجود (14)، علاوه بر دماهای پایین، غلظت پایین IPTG، OD600 بالاتر و سویه‌های دیگر نیز بررسی شدند.
در ابتدا با OD600 حدود 9/0 و 1/0 میلی‌مولار IPTG، میزان بیان در سه دمای 20، 25 و 37 درجه سانتی‌گراد بررسی شد و بیان با وزن مولکولی 30 کیلودالتون در 25 و 20 درجه سانتی‌گراد مشاهده و با وسترن بلات تأیید شد (شکل 2)؛ با این تفاوت که مقدار بیان در 25 درجه سانتی‌گراد بیشتر از 20 درجه سانتی‌گراد بود. نتایج حاصل از سونیکاسیون نشان دادند تمام پروتئین مدنظر در بخش نامحلول وجود دارد و کاهش دمای بیان از 25 به 20 درجه سانتی‌گراد فقط باعث کاهش میزان بیان شده است و و اثری بر حلالیت rp-E6 ندارد (شکل 2). رسوب به‌دست‌آمده از بیان در دمای 25 درجه سانتی‌گراد، 1/0 میلی‌مولار IPTG و OD600 حدود 9/0، بعد از 2، 4، 6، 8 و 16 ساعت جمع‌آوری شد و همان‌طور که در شکل مشاهده می‌شود، بیشترین میزان بیان مربوط به 16 ساعت است (شکل 3).
شکل 2- الف) وسترن بلات E6. 1: مارکر؛ 2: کنترل مثبت 45 کیلودالتونی؛ 3: E6 . ب) تأثیر دمای مختلف بر سطح بیانrpE6 در سویه BL21(DE3). ستون 1: مارکر؛ ستون 2:BL21/pET28- E6 بدون القای IPTG؛ ستون 3: القای بیان در دمای 37 درجه سانتی‌گراد؛ ستون 4: القای بیان در دمای 20 درجه سانتی‌گراد؛ ستون 5: القای بیان در دمای 25 درجه سانتی‌گراد. (غلظت القاکنندة IPTG در تمامی دماها 1/0 میلی‌مولار بود). بیشترین میزان بیان در دمای 25 درجه سانتی‌گراد مشاهده شد.
شکل 3- تأثیر زمان انکوباسیون بر بیان پروتئین نوترکیب E6. ستون 1: BL21(DE3)-rpE6 بدون القا با IPTG. ستون 2: یک ساعت پس از القا با IPTG، ستون 3: دو ساعت پس از القا؛ ستون 4: چهار ساعت پس از القا؛ ستون 5: 16 ساعت پس از القا. بیشترین میزان بیان 16 ساعت پس از القا مشاهده شد.
بیان pET28a-rpE6 درسویه اشرشیاکلی BL21 (DE3)-pLysS: به‌علت احتمال سمی‌بودن rp-E6، نظر بر این شد که علاوه بر تغییر پارامترهای محیطی مختلف، سویه‌های مناسب برای تولید پروتئین‌های سمی نیز بررسی شوند. یکی از سویه‌ها (DE3)-pLysS BL21 است که امکان بیان پروتئین با راندمان بالا برای هر ژنی را فراهم می‌کند که در کنترل پروموتر T7 بوده است. BL21 (DE3) pLysS حاوی لیزوژن λ-DE3 در کروموزوم خود است و RNA پلیمراز T7 را در کنترل پروموتر lac UV5 رمزگذاری می‌کند. این سویه همچنین حاوی یک پلاسمید، pLysS است که ژن لیزوزیم T7 را کد می‌کند. لیزوزیم T7، بازدارندة فعالیت RNA پلیمراز T7 است؛ بنابراین، بیان پایه ژن‌های هدف در کنترل پروموتر T7 را کاهش می‌دهد (15, 16). میزان بیان rpE6 در دو شرایط 1 میلی‌مولار IPTG و دمای 37 درجه سانتی‌گراد و همچنین 1/0 میلی‌مولار IPTG و دمای 25 درجه سانتی‌گراد در زمان‌های جمع‌آوری مختلف بررسی شد (OD600 در هر دو حالت حدوداً 9/0 بود) و هیچ بیانی مشاهده نشد (نتایج نشان داده نشده‌اند).
بیان pET28a-rpE6 در اشرشیاکلی BL21(DE3)-AI: اشرشیاکلی BL21(DE3)-AI یک نوع سویه تجاری است که سیستم بیان پروتئین مبتنی بر RNA پلیمراز فاژ T7 دارد. ترکیبی از تنظیمات دقیق و بازدهی بالا باعث شده است که به‌طور گسترده‌ای برای بیان با مقادیر بالای پروتئین نوترکیب و سمی استفاده شود. در این سویه T7 RNA پلیمراز (T7-RNAP) کروموزومی در کنترل pBAD رمزگذاری می‌شود که پروموتر pBAD با آرابینوز، القا و به شدت کنترل می‌شود و تنها سویه‌ای است که بیان پایه به شدت کنترل می‌شود و بازده تولید بالایی دارد و برای بیان بالای پروتئین‌های سمی عالی است (17, 18).
میزان بیان rpE6 در دو شرایط 1 میلی‌مولار IPTG و دمای 37 درجه سانتی‌گراد و همچنین 1/0 میلی‌مولار IPTG و دمای 25 درجه سانتی‌گراد در زمان‌های جمع‌آوری مختلف بررسی شد (OD600 در هر دو حالت حدوداً 9/0 بود). در دمای 37 درجه سانتی‌گراد و 1 میلی‌مولار IPTG در هیچ زمانی پس از القا بیانی مشاهده نشد؛ اما در دمای 25 درجه سانتی‌گراد و 1/0 میلی‌مولار IPTG، بیشترین بیان، 16 ساعت پس از القا مشاهده شد (شکل 4).
شکل 4- بررسی بیان در سویه‌های مختلف اشرشیاکلی. ستون 1: مارکر پروتئینی؛ ستون 2، 4، 6 و 8: نمونه‌های قبل از القا با IPTG، ستون 3، 5، 7 و 9: نمونه‌های بعد از القا با 1/0 میلی‌مولار IPTG در دمای 25 درجه سانتی‌گراد، 9/0OD600=. فقط در سویه BL21-AI بیان بعد از 16 ساعت مشاهده شد.
بیان pET28a-rpE6 در Rosetta: سویه‌های Rosetta مشتقات BL21 lacZY هستند که برای افزایش بیان پروتئین‌های یوکاریوتی طراحی شده‌اند که حاوی کدون‌هایی‌اند که به ندرت در اشرشیاکلی استفاده می‌شوند. این سویه‌ها tRNAهای کدون‌های AUA، AGG، AGA، CUA، CCC و GGA را روی یک پلاسمید حاوی ژن مقاومت کلرامفنیکول تأمین می‌کنند. ژن‌های tRNA در کنترل پروتومورهای اصلی خود باکتری‌اند (19, 20).
میزان بیان rpE6 در دو شرایط 1 میلی‌مولار IPTG و دمای 37 درجه سانتی‌گراد و همچنین 1/0 میلی‌مولار IPTG و دمای 25 درجه سانتی‌گراد در زمان‌های جمع‌آوری مختلف بررسی شد (OD600 در هر دو حالت حدوداً 9/0 بود) و هیچ بیانی مشاهده نشد (شکل 4).
بیان pET28a-rpE6 در C41(DE3): سویه‌های جهش‌یافته C41 (DE3) توسط Miroux و Walkerطراحی شدند. این سویه‌های جهش‌یافته E. coli BL21 (DE3) می‌توانند از مرگ سلولی و بی‌ثباتی پلاسمیدهای مرتبط با بیان پروتئین‌های نوترکیب سمی جلوگیری کنند. این سویه‌ها همچنین در بیان پروتئین‌های سمی از همه گروه‌های مختلف موجودات ازجمله یوباکتریا، مخمرها، گیاهان، ویروس‌ها و پستانداران مؤثرند. میزان بیان rpE6 در دو شرایط 1 میلی‌مولار IPTG و دمای 37 درجه سانتی‌گراد و همچنین 1/0 میلی‌مولار IPTG و دمای 25 درجه سانتی‌گراد در زمان‌های جمع‌آوری مختلف بررسی شد (OD600 در هر دو حالت حدوداً 9/0 بود) و هیچ بیانی مشاهده نشد (شکل4) (21, 22).
.مقایسة میزان رشد سویه‌های مختلف دارای پلاسمید نوترکیب pET28a-rpE6: یکی از روش‌های بررسی سمی‌بودن پروتئین برای سلول میزبان، بررسی نمودار رشد باکتری قبل از القا و مقایسة آن با نمودار رشد باکتری بدون وکتور نوترکیب است. اثر بیان rpE6 حتی به میزان کم (حتی قبل از القا با IPTG) در رشد سویه‌های مختلف اشرشیاکلی بررسی شد. میزان رشد توسط اسپکتوفتومتری و سنجش OD600 اندازه‌گیری شد. همان‌طور که در شکل مشاهده می‌شود، میزان رشد سویه‌های مختلف (به استثنای BL21(DE3)-AI) در 8 ساعت اولیه بعد القا سرعت کمی داشته است یا متوقف می‌شود؛ اما بعد از آن، رشد صعودی یکنواخت تا 22 ساعت بعد از القا مشاهده می‌شود. در سویه BL21(DE3)-AI تقریباً در تمام ساعات بعد از القا، رشد صعودی بوده است؛ با اینکه میزان رشد در ساعات اولیه شیب کمتری دارد (شکل 5) (7).
شکل 5- مقایسة میزان رشد سویه‌های مختلف دارای پلاسمید نوترکیب pET28-rpE6 بدون القا به مدت 24 ساعت
مقایسة میزان بیان rpE6 در سویه‌های مختلف: در این آزمایش، سویه‌های اشرشیاکلی BL21(DE3)، BL21(DE3)-AI، BL21(DE3)-pLysS، C41(DE3) و Rosetta به‌طور همزمان با 1 میلی‌مولار IPTG در دمای 37 درجه سانتی‌گراد القا شدند و بیان به مدت 16 ساعت ادامه یافت. پس از سونیکاسیون، رسوب از محلول رویی، جدا و مقدار مساوی پروتئین کل در SDS-PAGE بارگذاری شد. هیچ بیانی در هیچ‌کدام از سویه‌ها مشاهده نشد (نتایج نشان داده نشده‌اند). سپس هر پنج سویة ذکرشده به‌طور همزمان با 1/0 میلی‌مولار IPTG در دمای 25 درجه سانتی‌گراد القا شد و بیان به مدت 16 ساعت ادامه یافت. پس از سونیکاسیون، رسوب از محلول رویی، جدا و مقدار مساوی پروتئین کل در SDS-PAGE بارگذاری شد؛ فقط بیان سویه‌های BL21(DE3) و BL21(DE3)-AI مشاهده شد (شکل 6). در هر دو سویه بیشترین مقدار پروتئین نوترکیب تولیدی به‌صورت رسوب دیده شد و میزان بیان به‌صورت محلول ناچیز بود. میزان پروتئین تولیدی به‌صورت کمی با استفاده از نرم‌افزار ImageJ تعیین شد. درصد باند پروتئین نوترکیب به کل پروتئین‌ها در بخش نامحلول در هر دو سویه حدوداً 30 درصد بود.
شکل 6- بررسی بیان پروتئین نوترکیب E6 در دو سوش BL21(DD3) و Bl21-AI. الف) بیان پروتئین rpE6 در BL21(DE3) 1: پروتئین توتال 16 ساعت پس از القا؛ 2: محلول رویی پس از سونیکاسیون؛ 3: رسوب پس از سونیکاسیون. ب) بیان پروتئین rpE6 در BL21 1: پروتئین توتال 16 ساعت پس از القا؛ 2: محلول رویی پس از سونیکاسیون؛ 3: رسوب پس از سونیکاسیون
بحث و نتیجه‌گیری
اشرشیاکلی یکی از ارگانیسم‌های انتخابی برای تولید پروتئین‌های نوترکیب است. استفاده از آن به‌عنوان کارخانه تولید پروتئین کاملاً تثبیت شده و به محبوب‌ترین بستر بیان تبدیل شده است. به همین دلیل، ابزارها و پروتکل‌های مولکولی زیادی همچون فهرست گسترده‌ای از پلاسمیدهای بیانی، سویه‌های مهندسی‌شده و استراتژی‌های کشت متعددی برای تولید سطح بالای پروتئین‌های هترولوگ در دسترس‌اند (23). یکی از مشکلات پیش رو برای تولید پروتئین‌های نوترکیب، سمی‌بودن آنها برای میزبان پروکاریوتی است. مشکل سمیت پروتئین ممکن است زمانی ایجاد شود که پروتئین نوترکیب عملکرد غیرضروری و مضر در سلول میزبان داشته باشد. این عملکرد با تکثیر و هموستازی طبیعی میکروارگانیسم تداخل دارد و نتیجه آن سرعت رشد کندتر، بیوماس پایین سلولی و مرگ است. بدین منظور میزان رشد سویه‌ها قبل از القا، در دو حالت 1) با وکتور حاوی ژن پروتئین نوترکیب و 2) بدون وکتور بررسی و مقایسه می‌شود. اگر سرعت رشد سویه نوترکیب در مقایسه با سویه بدون وکتورکندتر باشد، دو علت این فنوتیپ را توضیح می‌دهد: سمیت ژن و بیان پایه mRNA / پروتئین سمی. برای بیان پروتئین سمی می‌توان از چندین روش استفاده کرد: i) وکتور بیانی با تعداد کپی کم، ii) سویه‌های مختلف بیان و iii) کاهش سرعت تولید (دمای پایین‌تر، غلظت IPTG کمتر، نقطه OD600 بالا و غیره) (24).
به‌عنوان میزبان برای بیان، اشرشیاکلی شامل سویه‌های متعدد است؛ بنابراین، انتخاب مناسب میزبان‌های بیان می‌تواند به افزایش کارایی بیان پروتئین منجر شود؛ هرچند چنین میزبان‌هایی می‌توانند مزایا و معایب خاص خود را داشته باشند (جدول 1). BL21 (DE3) از سویه‌های E. coli B است که فاقد ژن‌های Lon protease (سیتوپلاسم) و OmpT پروتئاز (خارج از غشا) است. BL21 (DE3) دارای لیزوژن λDE3 است که حاوی ژن T7 RNA پلیمراز در کنترل پروموتر LacUV5 است و برای بیان پروتئین‌هایی با پروموتور T7 در بالادست ژن‌های خود به کار می‌رود. با اینکه در این سویه بیان نشتی قبل از القا مشاهده می‌شود، برای رفع این مشکل می‌توان از 1 درصد گلوکز در محیط استفاده کرد؛ با این حال، هنوز به‌عنوان یکی از مهم‌ترین سویه‌ها برای بیان پروتئین نوترکیب به شمار می‌رود (25).
جدول 1- خصوصیات سویه‌های اشرشیاکلی مختلف استفاده‌شده در بیان پروتئین نوترکیب E6
|
سویه باکتریایی |
ویژگی‌ها |
مزایا |
شرایط رشد |
|
BL21(DE3) |
- دارای لیزوژن DE3 بیان‌کنندةT7 RNA پلیمراز - فاقد پروتئازهای lon و ompT - القاشونده توسط IPTG |
مناسب برای بیان ژن‌های غیرسمی |
کنترل شدیدی بر بیان وجود ندارد؛ بنابراین، افزودن 1 درصد گلوکز به محیط رشد باید در نظر گرفته شود. |
|
BL21(D3)-pLysS |
- دارای لیزوژن DE3 که بیان‌کنندة T7 RNA پلیمراز است. - دارای لیزوزیم T7 برای تجزیه آنزیم T7 پلیمراز قبل از القا |
- جلوگیری از بیان نشتی (Leaky expression) - مناسب برای بیان پروتئین‌های سمی |
آنتی‌بیوتیک کلرامفنیکل (34µgr/ml) |
|
B21(DE3)-AI |
- دارای نسخه کروموزومی از ژنT7 RNA پلیمراز در کنترل پروموتر araBAD - القاشونده توسط آرابینوز |
- جلوگیری از بیان نشتی (Leaky expression) - مناسب برای بیان پروتئین‌های سمی |
آنتی‌بیوتیک تتراسایکلین (12.5ug/ml) |
|
Rosetta |
- مشتقاتBL21 lacZY - دارای نسخه‌های اضافی از ژن‌های کدکنندة tRNA برای کدون‌های کمیاب AUA ، AGG، AGA، CUA، CCC ، GGA |
مناسب برای بیان پروتئین‌های هترولوگ |
آنتی‌بیوتیک کلرامفنیکل (34µgr/ml) |
|
C41(DE3) |
- سویه‌های جهش‌یافته BL21 (DE3) - جلوگیری از مرگ سلولی مرتبط با بیان پروتئین‌های نوترکیب سمی |
مناسب برای بیان پروتئین‌های سمی یا غشایی از تمام کلاس‌های مختلف موجودات |
- |
در این مطالعه سویه Bl21(DE3) برای بیان پروتئین نوترکیب rpE6 استفاده شد. بیان قابل ملاحظه‌ای از فرم نامحلول پروتئین در دمای 25 درجه سانتی‌گراد، 1 میلی‌مولار IPTG و 9/0OD= به دست آمد. همچنین در این شرایط (25 درجه سانتی‌گراد، 1 میلی‌مولار IPTG و 9/0OD=)، در سویه BL21(DE3)-AI نیز بیان چشمگیری در بخش نامحلول وجود دارد. انتخاب این سویه از آنجایی صورت گرفت که برای تولید بالای پروتئین‌های با بیان کم و سمی (برای مثال پروتئین‌هایی غنی از پیوندهای دی سولفیدی) به کار می‌رود. در این سویه برای کاهش اثرات سمی بیان بیش از حد پروتئین نوترکیب از سیستم کنترل دوگانه استفاده می‌شود؛ به صورتی که در آن تولید T7 RNAP توسط پروموتر آرابینوز (ParaBAD) با دقت کنترل می‌شود؛ در حالی که ژن هدف توسط پروموتر (PT7lac) کنترل می‌شود (15).
علاوه بر دو سویه فوق، سه سویه دیگر نیز در این تحقیق بررسی شدند (با توجه به ویژگی‌های پروتئین نوترکیب مدنظر و سویه‌ها). سویه Rosetta با توجه به داشتن tRNAهای نایاب برای بیان پروتئین‌های یوکاریوتی، سویه Bl21(DE3)-pLysS با داشتن پروتومور با تنظیم دقیق‌تری از بیان پروتئین نوترکیب و سویه C41(DE3) با افزایش پایداری پلاسمیدها و کاهش قابلیت تکثیر آنها انتخاب شدند که هیچ‌کدام بیان مناسبی نداشتند. گفتنی است بیان پروتئین rpE6 با روش وسترن بلات بررسی شد که در سه سویه فوق بیانی مشاهده نشد (اطلاعات آورده نشده است).
تأثیر عوامل محیطی همچون دمای مناسب برای القای بیان، غلظت عامل القاگر، OD600و ... می‌توانند بر بیان پروتئین مؤثر باشند؛ به‌خصوص شرایط سیتوپلاسمی مطلوب‌تری را برای بیان محلول پروتئین‌های دارای پل دی سولفید و یا سمی فراهم می‌کنند.
مدت زمان و دمایی که القا در آن صورت می‌گیرد، دو عامل مهم در بیان یا حلالیت‌اند. از این نظر، کاهش دمای پس از القا می‌تواند سرعت سنتز پروتئین را کاهش دهد و درنتیجه از تشکیل اجسام نامحلول[i] جلوگیری کند. این روش برای برخی از پروتئین‌های پیچیده مؤثر است؛ بنابراین، متداول‌ترین دماهای استفاده‌شده برای القای پروتئین‌های نامحلول 18، 24 و 30 درجه سانتی‌گراد است. در دماهای بالا می‌توان رشد سلولی را افزایش داد؛ اما برای بیان پروتئین مضر است؛ زیرا سرعت رشد بیشتر می‌تواند احتمال از بین رفتن پلاسمید را افزایش دهد که در تولید پروتئین‌های نوترکیب در محیط کشت‌های پیوسته[ii] درخور توجه است. به‌طور کلی، واکنش‌هایی که باعث تشکیل اجسام نامحلول می‌شوند در دماهای بالاتر ایجاد می‌شوند؛ زیرا واکنش‌های آبگریز به شدت به دما بستگی دارند. علاوه بر این، سطوح پایین تقسیم سلولی، رونویسی و ترجمه و همچنین کاهش تجمع پروتئین در اثر کندشدن فرایندهای سلولی در دماهای پایین ایجاد می‌شوند. در این راستا، دمای پایین، تخریب پروتئین‌های حساس به پروتئولیز را کاهش می‌دهد؛ زیرا بیشتر پروتئازها در دماهای پایین فعالیت کمتری دارند؛ بنابراین، با کاهش دما (یا کاهش غلظت IPTG) و افزایش مدت زمان القا، حلالیت پروتئین‌ها افزایش می‌یابد. با وجود این، ترکیب بهینه مدت القا و دمای پس از القا هنوز با آزمایش و خطا به دست می‌آید (7, 23, 26). در این پژوهش، حتی در کمترین دمای آزمایش‌شده (20 درجه سانتی‌گراد)، هیچ باند محلولی مشاهده نشد و پروتئین نوترکیب کامل به‌صورت رسوب انباشته شد؛ اما کاهش دما از 37 درجه سانتی‌گراد به 25 درجه سانتی‌گراد باعث مشاهده بیان در ژل شد. در دمای 32 و 28 درجه سانتی‌گراد نیز مشابه 37 درجه سانتی‌گراد بیانی مشاهده نشد و میزان بیان کل در 20 درجه سانتی‌گراد نسبت به 25 درجه سانتی‌گراد کمتر بود.
یکی دیگر از استراتژی‌های شناخته‌شده برای کاهش رسوب و افزایش بیان در طول تولید پروتئین نوترکیب، بهینه‌سازی غلظت القاگر است. در غلظت‌های بالای القاکننده، بیان پروتئین به‌طور کامل القا می‌شود و با توجه به ظرفیت محدود محیط سلولی برای فولد صحیح، میزان رسوب پروتئین‌های نوترکیب افزایش می‌یابد. غلظت‌های کم القاکننده می‌تواند به القای ناکافی بیان پروتئین و درنتیجه بازده کمتر منجر شود. غلظت بالای القاگر علاوه بر داشتن هزینه‌های بالا می‌تواند سلول‌ها را از بین ببرد یا باعث بیان پروتئین به‌صورت اجسام نامحلول شود؛ بنابراین، تنظیم غلظت القاکننده اهمیت زیادی دارد. در چندین مطالعه نشان داده شده است نمونه‌هایی با غلظت IPTG بین 0 تا 1 میلی‌مولار نمی‌توانند اثرات سمی بر رشد E. coli داشته باشند. علاوه بر این، استفاده از غلظت کمتر القاگر (برای مثال، 05/0 میلی‌مولار برای IPTG) به بیان پروتئین به شکل محلول کمک می‌کند و استفاده از غلظت بیشتر القاکننده می‌تواند حلالیت پروتئین را کاهش دهد؛ درنهایت، توجه به این نکته ضروری است که برای تعیین غلظت مناسب القاگر باید به هر سه عامل وکتور، میزبان و پروتئین توجه شود. در اینجا از دو غلظت مختلف القاکننده استفاده شده است؛ اما کاهش غلظت IPTG به 1/0 میلی‌مولار باعث افزایش حلالیت نشد؛ اما میزان بیان پروتئین تام را نسبت به غلظت 1 میلی‌مولار IPTG افزایش داد (7, 23, 27).
پارامتر سوم میزان رشد باکتری قبل از القا یا به عبارتی OD600 در زمان القا است. القا در فاز لگاریتمی (ابتدا، میانه و انتها) یا فاز رشد می‌تواند بر بیان پروتئین نوترکیب مؤثر باشد. نتایج ما نشان دادند القای بهینه در مرحله نمایی انتهایی (9/0OD=) سطح بالایی از پروتئین نوترکیب با تراکم سلولی بالا را تولید می‌کند؛ جایی که بیشترین تعداد سلول ایجاد شده است. این نتیجه با مطالعات قبلی مطابقت دارد؛ به‌طوری‌که گزارش شده است میزان القای پروتئین نوترکیب تا مرحله انتهایی رشد لگاریتمی افزایش و در مرحله رشد ثابت کاهش می‌یابد (27).
در این مطالعه پروتئین نوترکیب E6 از دو سویه BL21(DE3) و BL21-AI به‌صورت رسوب به دست آمد؛ اما بیان پروتئین به‌صورت اجسام نامحلول مزایایی همچون تخلیص راحت‌تر و میزان تولید بالاتر دارد و از آنجایی که این آنتی‌ژن پلی اپی‌توپی تولیدشده کاندید واکسن درمانی است، خلوص نهایی و میزان تولید، پارامترهای کلیدی‌اند؛ بنابراین، پس از خالص‌سازی اجسام نامحلول تولیدشده، آنها به روش‌های مرسوم محلول می‌شوند و برای ارزیابی به‌عنوان واکسن درمانی استفاده خواهند شد.
سپاسگزاری.
این پروژه توسط مرکز تحقیقات کنترل سرطان طرح شماره (CCF-97087) و همچنین سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران (IROST) طرح 1012197002 حمایت مالی شده است.
[i]- Inclusion bodies
[ii]- Continuous cultures
)