نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسنده
استادیار گروه زیست‌شناسی، دانشکدۀ علوم، دانشگاه اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسنده [English]
Introduction: Tyrosol (2-(4-Hydroxyphenyl) ethanol) is one of the natural phenolic compounds in olive which has antioxidant and anticancer effects. During the olive oil mill process, a lot of the phenolic compounds are released into the water which can contaminate the environment.However, these can be converted into useful ingredients and valuable dietary supplements. In the present study, tyrosol was converted to hydroxytyrosol by spore displayed tyrosinase and the anticancer effect of hydroxyl tyrosol was studied on MCF-7 breast cancer cells.
Materials and Methods: Spore suspension of the recombinant Bacillus subtilis DB104 (pSDJH-cotE-tyr), constructed in our previous research by genetic engineering methods and surface display technique, was prepared in sporulation medium. The spores were used in the bioconversion of tyrosol to hydroxytyrosol and the reaction was assayed by high-performance liquid chromatography. The anticancer effect of hydroxytyrosol on the MCF-7 breast cancer cell line was studied by a flow-cytometer.
Results: The results of the study revealed that 1mM of tyrosol was converted to 1mM of hydroxytyrosol after 60 min. The anticancer effect of hydroxytyrosol on MCF-7 was determined more than 80% after 48 h incubation.
Discussion and conclusion: According to the obtained results, spore displayed tyrosinase as an active enzyme is able to produce useful compounds with anti-cancer properties from olive oil derivatives. The anti-cancer effects of hydroxytyrosol produced by biotransformation of tyrosol on MCF-7 breast cancer cells are confirmed by previous studies.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
تکنیک نمایش سطحی[1] برای تولید بیوکاتالیست‌ها به‌خصوص با استفاده از اسپور باکتری‌ها تکنیکی جدید و منحصربه‌فرد است. برخی باکتری‌ها ازجمله باسیلوس‌ها در شرایط نامساعد محیطی به فرم اسپور تبدیل می‌شوند. اسپورزایی باکتریایی فرایندی برای محافظت از ماده ژنتیکی است که در پوشش سخت و خشک قرار گرفته است و برای سال‌ها در این مرحله می‌تواند باقی بماند (1 و 2). اسپور از چند لایه پروتئین پوششی تشکیل شده است که اسپور را از آسیب‌های محیطی حفظ می‌کند و پایداری آن را در اثر تغییرات pH، درجه حرارت بالا و خشکی و اشعه‌های UV و گاما افزایش می‌دهد (3 و4). بیان آنزیم‌ها در سطح اسپور با استفاده از تکنیک نمایش در سطح، نوعی تثبیت ژنتیکی آنزیم محسوب می‌شود. در این حالت علاوه بر حفظ پایداری ساختار و ویژگی‌های آنزیم، با توجه به اینکه اسپورها ویژگی‌های مقاومت منحصر‌به‌فردی دارند و می‌توانند در شرایط حاد دمایی، خشکی، مواد شیمیایی مهلک و حلال‌ها زنده باقی بمانند و تولید آنها آسان است، امکان استفادة مداوم این آنزیم تثبیت‌شده به‌ویژه در صنعت فراهم می‌شود (5). تیروزیناز[2] یک مونواکسیژناز[3] حاوی دو یون مس است که با شش اسیدآمینه هیستیدین احاطه شده و در طیف وسیعی از ارگانیسم‌های یوکاریوتی و پروکاریوتی دیده شده است (6). این آنزیم براساس نوع و فرم اتم‌های مس به سه فرم مت (CuII-CuII)، داکسی (CuI-CuI) و اکسی (CuII-O2-CuII) در سلول وجود دارد که فرم مت غالب است (7). از قابلیت‌های آنزیم تیروزیناز تولید ترکیبات آنتی‌اکسیدان با هیدروکسیله‌کردن حلقة فنلی مواد است (8)؛ بنابراین، از این آنزیم در تولید ترکیبات فراسودمند از ضایعات یا پسماندهای گیاهان می‌توان استفاده کرد که غنی از ترکیبات فنلی‌اند. با توجه به کاربردهای گستردة تیروزیناز و اهمیت آن در صنایع به‌ویژه صنعت داروسازی مطالعات گسترده‌ای روی این آنزیم و روش‌های افزایش پایداری و مقاومت آن صورت گرفته است. در تحقیقی که به‌منظور افزایش پایداری و قابلیت استفادة مجدد آنزیم انجام شده است، آنزیم تیروزیناز باسیلوس مگاتریوم[4] روی سطح اسپور باکتری باسیلوس سابتیلیس[5]، بیان و پایداری آنزیم تثبیت‌شده در سطح اسپور اثبات شد و نتایج نشان دادند آنزیم بدون کاهش فعالیت بارها می‌تواند استفاده شود (5).
در طب سنتی از زیتون و روغن آن به‌عنوان داروی ملین، تب‌بر، نیروبخش، مؤثر در درمان عفونت‌های مجاری ادراری و برطرف‌کنندة سردرد یاد شده است (9). اسیدهای چرب روغن زیتون شامل مریستیک‌اسید، پالمتیک‌اسید، استئاریک‌اسید، اولئیک‌اسید و لینولئیک‌اسید و مواد غیرصابونی آن شامل هیدروکربن‌ها، ترکیبات فنولی و توکوفرول‌هاست (10). همچنین روغن زیتون حاوی ویتامین‌های E و A و بتاکاروتن است (11). از سایر ترکیبات این روغن می‌توان به تیروزول، هیدروکسی‌تیروزول، اریترودیول و الئانولیک‌اسید اشاره کرد (12). در مراحل فراوری زیتون و تولید روغن زیتون با مصرف آب زیاد در کارخانه بخش عمده‌ای از این ترکیبات به پساب کارخانة روغن زیتون‌سازی وارد و باعث افزایش بار فنلی پساب می‌شوند که به دنبال آن آلودگی زیست‌محیطی را در پی خواهد داشت. روش‌های فیزیکی یا شیمیایی مختلفی برای حذف یا بازیابی این ترکیبات مطالعه و استفاده شده‌اند (13). از ویژگی‌های ارزشمند این ترکیبات می‌توان به اثرات ضدسرطانی، جلوگیری از بیماری‌های قلبی عروقی، حذف رادیکال‌های آزاد، حفاظت در برابر تخریب اکسیداتیو ماده ژنتیکی، جلوگیری از تجمع پلاکت‌ها و ... اشاره کرد (14). با توجه به قابلیت‌های آنزیم تیروزیناز در ایجاد گروه هیدروکسیل روی حلقه فنلی، تیروزیناز می‌تواند ترکیباتی متنوع با ویژگی آنتی‌اکسیدانی بیشتر تولید کند. تیروزول یکی از ترکیبات موجود در روغن زیتون است که اثرات ضدسرطانی دارد. این ترکیب با تیروزیناز به هیدروکسی تیروزول تبدیل می‌شود (8). مطالعات نشان داده‌اند اثرات ضدسرطانی هیدروکسی تیروزول به‌علت داشتن ویژگی‌هایی ازجمله آنتی‌اکسیدان‌بودن و جلوگیری از تکثیر و افزایش آپوپتوز در بسیاری از لاین‌های سلول‌های سرطانی چندین برابر تیروزول است. اثرات ضدسرطانی این ترکیب بر سلول‌های توموری ریه، کلون، پانکراس و پروستات تاکنون گزارش شده است (15).
هدف از این تحقیق استفاده از تیروزیناز تثبیت‌شده در سطح اسپور و تبدیل زیستی تیروزول حاصل از زیتون به هیدروکسی تیروزول و بررسی اثر ضدسرطانی ترکیب حاصل بر سلول‌های MCF-7سرطان سینه است. با توجه به اینکه تیروزول در پساب روغن زیتون‌سازی به وفور وجود دارد، این مطالعه قابلیت‌های تیروزیناز تثبیت‌شده در سطح اسپور را برای تبدیل زیستی این ترکیب به یک مادة فراسودمند با خاصیت ضدسرطانی بررسی می‌کند.
مواد و روش‌ها
فعا‌ل‌سازی سویة نوترکیب و تولید اسپور: سویة مهندسی ژنتیک شده Bacillus subtilis DB104 (pSDJH-cotE-tyr) حاصل از پژوهش‌های قبلی به‌عنوان سویة نوترکیب بیان‌کنندة آنزیم تیروزیناز استفاده شد (5). ابتدا سویة مدنظر در محیط کشت [6]MSR حاوی 5/2 درصد عصارة مخمر، 5/1 درصد باکتوتریپتون[7]، 1 درصد گلوکز و 3/0 درصد K2HPO4 تلقیح شد و در گرمخانة شیکردار در 37 درجه و rpm 200 به مدت 24 ساعت قرار گرفت. برای تولید اسپور، سویه در محیط کشت [8]DSM حاوی 8/0 درصد وزن به حجم نوترینت براث، 01/0 میلی‌مولار کلرید منگنز، 1/0 درصد کلرید پتاسیم، 01/0 میلی‌مولار سولفات آهن، 1 میلی‌مولار نیترات کلسیم و 025/0 درصد سولفات منیزیم در 100 میلی‌لیتر آب مقطر با 7pH تلقیح و در گرمخانة شیکردار برای 24 ساعت در 37 درجه سانتی‌گراد در rpm 200 هوادهی شد. برای جمع‌آوری اسپورها، محیط کشت در rpm 13000 به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد (16).
شرایط واکنش تبدیل زیستی: 108*4 اسپور همراه با 10 میکرولیتر از سولفات مس 1 میلی‌مولار برای تقویت فعالیت آنزیم و میزان 924 میکرولیتر از بافر اسید بوریک 500 میلی‌مولار با 9 pH در حمام آب 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه انکوبه شد. پس از انکوباسیون، 50 میکرولیتر از اسید آسکوربیک 5 میلی‌مولار و 10 میکرولیتر از تیروزول 1 میلی‌مولار به مخلوط واکنش، اضافه و در مدت زمان‌های مختلف 0، 15، 30 و 60 دقیقه در حمام آب گرم 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند (17). پس از گذشت زمان انکوباسیون هرکدام از نمونه‌ها، مخلوط واکنش با استفاده از 50 میکرولیتر اسید هیدروکلریک 1 مولار متوقف شد و نمونه‌ها با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا HPLC (Thermo Scientific Hypersil GOLD C18) بررسی شدند.
بررسی اثرات ضدسرطانی هیدروکسی تیروزول تولیدشده در کشت سلول MCF-7: رده سلولی MCF-7 از بانک سلول گروه زیست‌شناسی دانشگاه اصفهان تهیه شد. سلول‌ها در 4 میلی‌لیتر محیط کشت DMEM غنی‌شده با 10 درصد FBS و 1 درصد آنتی‌بیوتیک پنی‌سیلین - استرپتومایسین در فلاسک cm2 25 کشت داده و در گرمخانه با رطوبت 95 درصد و CO2 5 درصد در 37 درجه سانتی‌گراد انکوبه شدند. پس از تریپسینه‌کردن و تهیه سوسپانسیون سلولی، تعداد 105 × 2 سلول در هر چاهک از پلیت 6 خانه به مدت 24 ساعت گرمخانه‌گذاری شدند. سپس محیط کشت خارج شد و سلول‌ها با غلظت 1 میلی‌مولار هیدروکسی تیروزول به مدت 24 و 48 ساعت تیمار شدند. مایع رویی حاوی سلول‌های مرده در فالکون ریخته شد و سلول‌ها تریپسینه شدند. پس از جداسازی، سلول‌ها با PBS، 2 مرتبه شست‌وشو داده شدند و درنهایت، 100 میکرولیتر رنگ PI با غلظت μM/ml 5 برای رنگ‌کردن سلول‌ها اضافه شد. سلول‌ها با استفاده از دستگاه فلوسایتومتری (Becton Dickinson FACSCalibur) همراه با نرم‌افزار CellQuest بررسی شدند (18).
نتایج
.تبدیل زیستی تیروزول به هیدروکسی تیروزول با استفاده از آنزیم تیروزیناز بیان‌شده در سطح اسپور: همان‌طور که اشاره شد، برای بررسی روند واکنش آنزیمی و تبدیل تیروزول به هیدروکسی تیروزول با استفاده از آنزیم تیروزیناز تثبیت‌شده در سطح اسپور باسیلوس سابتلیس از کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا استفاده شد. شکل 1 نمودار حاصل از گروماتوگرافی مایع با کارایی بالا است. همان‌طور که در شکل نشان داده شده است 1 میلی‌مولار از تیروزول توسط آنزیم تیروزیناز بیان‌شده در سطح اسپور طی 60 دقیقه به هیدروکسی تیروزول تبدیل شده است. زمان نگهداری[9] برای تیروزول 12 و 16 دقیقه و برای هیدروکسی تیروزول 5 و 11 دقیقه است. براساس واکنش حاصل آنزیم تیروزیناز با مکانیسم ′3 هیدروکسیلاسیون به تولید هیدروکسی تیروزول از تیروزول منجر شد.
شکل 1- دیاگرام کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا از واکنش تبدیل زیستی تیروزول به هیدروکسی تیروزول با استفاده از تیروزیناز بیان‌شده در سطح اسپور در 60 دقیقه
اثر هیدروکسی تیروزول بر زنده‌مانی سلول‌های سرطان سینه MCF-7: اثر کشندگی 1 میلی‌مولار هیدروکسی تیروزول به‌دست‌آمده در اثر تبدیل زیستی تیروزول با استفاده از آنزیم تیروزیناز تثبیت‌شده در سطح سلول پس از 24 و 48 ساعت براساس آنالیز فلوسایتومتری در شکل 2 نشان داده شده است. مطابق شکل 2، ناحیة M1 تجمع سلول‌های زنده را نمایش می‌دهد که با PI رنگ نشد‌ه‌اند و ناحیة M2 نشان‌دهندة تجمع سلول‌های مرده است. براساس نتایج حاصل، پس از 24 ساعت حدود 70 درصد و پس از 48 ساعت حدود 80 درصد سلول‌ها در اثر تیمار با هیدروکسی تیروزول از بین رفته‌اند. این نتایج اثر ضدسرطانی هیدروکسی تیروزول روی سلول‌های سرطانی MCF-7 را اثبات می‌کند.
شکل 2- نمودار هیستوگرام فلوسایتومتری از سلول‌های MCF-7 تیمارشده با هیدروکسی تیروزول
بحث و نتیجه‌گیری
تبدیل زیستی ترکیبات طبیعی به ترکیبات فراسودمند توسط آنزیم تیروزیناز تاکنون در چندین مطالعه بررسی شده است و نتایج نشان داده‌اند این آنزیم به‌طور مؤثری با انجام هیدروکسیلاسیون منجر به تولید ترکیبات فعال زیستی می‌شود. پژوهش پیشین در استفاده از تیروزیناز تثبیت‌شده در سطح اسپور برای تبدیل زیستی ترکیبات حاصل از سویا و در تبدیل زیستی دیدزین (′4 و 7 دی هیدروکسی ایزوفلاون)[x] به 3'-ODI[xi] نشان داد 1 میلی‌مولار از دیدزین توسط این آنزیم به مدت 60 دقیقه به 1 میلی‌مولار 3'-ODI تبدیل شده است (19). در مطالعة حسینی و طیبی در سال 2019، از تیروزیناز تثبیت‌شده در سطح اسپور برای تبدیل زیستی جنیستئین[xii] سویا به اروبول[xiii] استفاده شد. اثر ضدسرطانی اروبول حاصل بر سلول‌های سرطانی MCF-7 نشان‌دهندة افزایش چشمگیر در خاصیت ضدسرطانی اروبول نسبت به جنیستئین بوده است (20). در مطالعة حاضر از آنزیم تیروزیناز تثبیت‌شده در سطح اسپور باکتری به‌عنوان آنزیمی پایدار و فعال برای تبدیل زیستی تیروزول به هیدروکسی تیروزول استفاده شد. نتایج نشان دادند 1 میلی‌مولار از تیروزول پس از 60 دقیقه توسط این آنزیم به 1 میلی‌مولار هیدروکسی تیروزول تبدیل می‌شود. نتایج حاصل، اهمیت استفاده از تیروزیناز تثبیت‌شده در سطح اسپور در تبدیل زیستی ترکیبات طبیعی و تولید ترکیبات فراسودمند را نشان می‌دهند.
همچنین با توجه به مقاومت اسپور، تثبیت ژنتیکی آنزیم در سطح اسپور و براساس نتایج حاصل از پژوهش‌های انجام‌شده، این آنزیم قابلیت پایداری و استفادة مجدد دارد (5). تثبیت ژنتیکی تیروزیناز در سطح اسپور سبب حفظ فعالیت آنزیم طی نگهداری طولانی مدت در دمای محیط می‌شود و علاوه بر آن، اسپورهای نوترکیب حاوی آنزیم به‌طور چشمگیری قابلیت استفادة مکرر با حفظ فعالیت داشتند (5 و 20).
نقش هیدروکسی تیروزول به‌عنوان یک ترکیب شیمیایی ضدسرطان، در سلول‌های کارسینومای انسانی در بسیاری از مطالعات آزمایشگاهی به اثبات رسیده است (21-23). محققان نشان داده‌اند اثرات ضدسرطانی هیدروکسی تیروزول به‌علت داشتن ویژگی‌هایی ازجمله آنتی‌اکسیدان‌بودن و جلوگیری از تکثیر و افزایش آپوپتوز در بسیاری از لاین‌های سلول‌های سرطانی چندین برابر تیروزول است. اثرات ضدسرطانی این ترکیب بر سلول‌های توموری ریه، کلون، پانکراس و پروستات تاکنون گزارش شده‌اند (24و25). مطالعات در خصوص اثرات هیدروکسی تیروزول بر سلول‌های سرطان کبد و کلون نشان‌دهندة اثر این ترکیب در مهار فاکتورهای القاکنندة تومور، ممانعت از سنتز DNA، توقف چرخة سلولی و سرکوب مسیرهای AKT ([xiv]NF-κB) است (26و27)؛ بنابراین، به‌طور گسترده در مطالعات، هیدروکسی تیروزول را ترکیب ضدسرطان با قابلیت کاهش قابل ملاحظة زنده‌مانی سلول سرطانی توصیف می‌کنند و از آن به‌عنوان فاکتور پیشگیری‌کننده یا درمانی نام برده‌اند. در مطالعة حاضر نیز اثرات ضدسرطانی هیدروکسی تیروزول بیش از 80 درصد در سلول‌های سرطانی MCF-7 پس از 48 ساعت مشاهده شدند.
همان‌طور که اشاره شد، در اثر مراحل استخراج روغن زیتون از زیتون، بخش زیادی از ترکیبات روغن زیتون وارد پساب می‌شوند. بخش درخور توجهی از این ترکیبات فنلی در فرایند تولید روغن از زیتون خارج و به آب استفاده‌شده در فرایند و درنهایت به پساب کارخانه وارد می‌شوند. در این حالت با افزایش بار فنلی پساب، آلودگی زیست‌محیطی در پی خواهند داشت و همچنین باعث کاهش ارزش آنتی‌اکسیدان‌های موجود در روغن زیتون می‌شوند. در ایران نیز برای تصفیة پساب فنلی حاصل از مراحل استخراج روغن از زیتون، از روش‌های شیمیایی، آنزیم‌های پراکسیدازی یا قارچ‌ها برای تجزیة ترکیبات فنلی استفاده شده است (28)؛ اما قابلیت تبدیل این ترکیبات به مواد آنتی‌اکسیدانی فراسودمند تاکنون بررسی نشده است. برای بازیابی آنتی‌اکسیدان‌های فراسودمند در پساب حاصل و تولید آنتی‌اکسیدان‌های جدید از ترکیبات فنلی موجود، تیروزیناز تثبیت‌شده در سطح اسپور به‌عنوان یک منبع آنزیمی پایدار حائز اهمیت است. با توجه به تثبیت این آنزیم به‌صورت ژنتیکی و بیان آن در سطح اسپور و اینکه اسپور باسیلوس بسیار مقاوم به تغییرات pH، دما، خشکی، اشعه و ... است، آنزیم تثبیت‌شده در سطح اسپور نیز پایدار بوده است و قابلیت استفادة مکرر دارد (5). گفتنی است باسیلوس سابتیلیس یک باکتری پروبیوتیک و کاملاً امن است؛ بنابراین، این روش نسبت به روش‌های شیمیایی کاملاً سازگار با محیط زیست است.
براساس نتایج حاصل، از تیروزیناز تثبیت‌شده در سطح اسپور به‌عنوان آنزیمی فعال برای تولید هیدروکسی تیروزول از تیروزول استفاده می‌شود. همچنین این آنزیم قابلیت حذف آلاینده‌های فنلی ناشی از فعالیت کارخانه‌های روغن زیتون‌سازی را دارد و برای تهیه مواد فراسودمند با خاصیت ضدسرطانی استفاده می‌شود؛ البته در این خصوص به مطالعات گسترده‌تر نیاز است.
[1]- Surface display technique
[2]- Tyrosinase
[3]- Monooxygenase
[4] Bacillus megaterium
[5]- Bacillus subtilis
[6]- Medium super rich
[7]- Bacto tryptone
[8]- Difco Sporulation Medium
[9]- Retention time
[x]- Daidzein (4', 7-dihydroxyisoflavone)
[xi]- 7, 3', 4'trihydroxyisoflavone (3'-ODI)
[xii]- Genistein
[xiii]- Orobol
[xiv]- nuclear factor-kappa B
)