نوع مقاله : پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم و فناوری‌های نوین، واحد علوم دارویی، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2 استادیار گروه زیست‌شناسی سلولی-مولکولی، دانشکدۀ زیست‌شناسی،دانشگاه دامغان، دامغان، ایران

3 استاد بخش زیست‌فناوری میکروبی، دانشکدۀ زیست‌ شناسی، پردیس علوم، دانشگاه تهران، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: آنزیم‌های اکسیدکنندة تیروزین یا تیروزینازها کاربردهای متنوعی در حوزه‌های درمانی، غذایی و محیطی دارند. با توجه به اهمیت اکتینوباکترها به‌عنوان یکی از مهم‌ترین باکتری‌های نویدبخش مولد ترکیبات زیست‌فعال و آنزیم‌های دارای کاربردهای زیست‌فناورانه، مطالعة حاضر با هدف غربالگری و شناسایی جدایه‌های مولد آنزیم تیروزیناز از نمونه‌های خاک‌های کویر مرنجاب، غار هامپوئیل و جزیرة هرمز انجام شد.
مواد و روش‏‏ها: تعداد 10 نمونه خاک از کویر مرنجاب و 10 نمونه خاک از مناطق مختلف جزیرة هرمز، جمع‌آوری و پس از کشت در محیط ISP2 آگار، جدایه‌های اکتینوباکتر جداسازی و خالص‌سازی شدند. این جدایه‌ها و نیز جدایه‌های تهیه‌شده در پژوهش پیشین از غار هامپوئیل با کشت روی محیط تیروزین آگار و تیروزین براث غربالگری شدند. در ادامه فعالیت تیروزینازی جدایه‌های منتخب به‌صورت کمی ارزیابی شد؛ درنهایت، این جدایه‌ها با تعیین ترادف و آنالیز ژن 16S rRNA شناسایی شدند.
نتایج: از میان 89 جدایة اکتینوباکتریایی غربالگری‌شده، کلنی‌های 17 جدایه در محیط کشت تیروزین آگار هالة شفاف و رنگیزة قهوه‌ای - سیاه داشتند. این جدایه‌ها در غربالگری ثانوی به‌صورت کیفی ارزیابی شدند. نتایج غربالگری ثانوی تأیید کرد 11 جدایه مولد آنزیم تیروزیناز هستند. همچنین، نتایج سنجش کمی نشان دادند سویه‌های UTMC 3165 و UTMC 3233 به‌ترتیب با میزان فعالیت آنزیمی 33 و 35 واحد در میلی‌لیتر بیشترین فعالیت آنزیمی را دارند. این دو جدایه ازنظر ترادف ژن 16S rRNA به‌ترتیب 67/99 و 88/99 درصد شباهت به سویه‌های Streptomyces tendae و Streptomyces thermocarboxydus داشته‌اند.
بحث و نتیجه‏گیری: نتایج این پژوهش نشان دادند خاک‌های ایران دارای اکتینوباکترهای توانمند در زمینة تولید آنزیم تیروزیناز هستند. این جدایه‌ها به جنس Streptomyces متعلق‌اند که از غار هامپوئیل جدا شده بودند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Screening and Molecular Identification of Tyrosinase-producing Actinobacteria from Soils of the Maranjab Desert, the Hampoeil Cave, and the Hormoz Island

نویسندگان [English]

  • Zeinab Shahrokh 1
  • Fatemeh Salimi 2
  • Javad Hamedi 3

1 Department of Microbiology, Faculty of Advanced Sciences and Technologies, Pharmaceutical Sciences Branch, Islamic Azad University, Tehran

2 Cellular and Molecular Group, School of Biology, Damghan University, Damghan, Iran

3 Department of Microbial Biotechnology, School of Biology, College of Science, University of Tehran. Tehran, Iran

چکیده [English]

Introduction: Tyrosine oxidizing enzymes or tyrosinases have various applications in medicine, nutritional, and environmental disciplines. By considering actinobacteria’s impacts as one of the most promising bacteria in producing bioactive compounds and valuable enzymes with medical, industrial, and environmental applications, the current study was performed to screen and identify tyrosinase-producing isolates soil samples of the Maranjab Desert, the Hampoeil cave, and the Hormoz Island.
Materials and Methods: In this research, the soil samples collected from the Maranjab Desert (10 samples) and Hormuz Island (10 samples) were cultured in ISP2 agar, and the actinobacterial colonies were isolated. The isolates and the previously-isolated strains from the Hampoeil cave were qualitatively screened by culturing on tyrosine agar medium. The result of primary screening was confirmed by culturing in tyrosine broth. Then, the tyrosinase activity of the selected isolates was quantitatively evaluated. Finally, these isolates were identified by sequencing and analyzing the 16S rRNA gene.
Results: Among the 89 screened actinobacteria, 17 colonies showed clear zone and brown-black pigmentation around their colonies on tyrosine agar and were subjected to secondary qualitative screening. The results of secondary screening confirmed that 11 isolates produced tyrosinase. Also, the quantitative test results revealed that the strains designated UTMC 3165 and UTMC 3233 had the most enzyme activity, as 33 and 35 unit/ml, respectively. In the molecular identification, the isolates showed 99.67% and 99.88% similarity to Streptomyces tendae and Streptomyces thermocarboxydus, respectively. 
Discussion and Conclusion: The results of the present study showed that the soils in Iran possess promising actinobacteria with the ability to produce tyrosinase enzymes. These strains were the members of the Streptomyces genus.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Actinobacteria
  • Streptomyces
  • tyrosinases
  • Hormoz Island
  • Hampoeil Cave
  • primary screening
  • secondary screening
  • Molecular identification
  • Maranjab Desert

مقدمه

تیروزیناز (1،14،18،1EC ) یک آنزیم اکسیداز محدودکنندة سرعت تولید ملانین است. تیروزیناز در واکنش‌های سنتز ملانین ازجمله کاتالیز اورتوهیدروکسیلاسیون منوفنل (تیروزین) به اورتو-دی‌فنل (با فعالیت منوفنولاز) و به دنبال آن اکسیدشدن اورتو-دی‌فنل (دو الکترون) به مشتقات اورتو-کوینون و درنهایت هیدروکسیلاسیون دی‌هیدروکسی فنیل‌آلانین و تولید کوینون (پیش‌ساز ملانین) مشارکت مستقیم دارد (1). ملانین یک رنگدانة پلی‌فنلی تیره‌رنگ است که توسط برخی قارچ‌ها، گیاهان، جانوران و چندین گونة باکتریایی سنتز می‌شود. تیروزیناز، دو یون مس در جایگاه فعال خود دارد و از کلاس اکسیدوردوکتازها و زیرگروه اکسیژنازها محسوب می‌شود. فعالیت مونوفنل هیدروکسیلاز و دی‌فنل اکسیداز کاربرد گسترده‌ای در صنایع بیوتکنولوژیک دارد. تیروزیناز برای سمیت‌زدایی پساب‌های دارای فنل و خاک‌های آلوده، در ساخت زیست‌حسگر برای پایش فنل، در صنایع دارویی برای تولید اورتو-دی‌فنل‌ها (برای مثال دی‌هیدروکسی فنیل‌آلانین و دوپامین برای درمان بیماری پارکینسون) و در صنایع دارویی و آرایشی کاربرد دارند. ملانین در حفاظت علیه پرتوهای فرابنفش، ایکس و گاما نقش داشته است و نیز به‌عنوان تبادل‌گر کاتیونی، حامل دارو، آنتی‌اکسیدان و عوامل ضدویروسی یا ایمونوژن‌ها کاربرد دارد (1).

با توجه به کاربرد زیاد آنزیم تیروزیناز در صنایع مختلف، باید منابع به‌کاررفته برای تولید این آنزیم برای محیط زیست، گیاهان و جانوران بی‌ضرر باشند و نیز بازده مناسبی داشته باشند. منابع گیاهی ازجمله میوه‌ها و سبزیجات مختلف به‌منظور بررسی تیروزیناز مطالعه شدند و این آنزیم از انگور، سیب (2) و دانة آفتابگردان (3) استخراج شده است. همچنین، قارچ‌های مختلف برای جداسازی تیروزیناز مطالعه شده‌اند که از میان آنها می‌توان به Agaricus bisporus (4)، Neurospora crassa (5)، Amanita muscaria، Lentinula edodes (6)، Aspergillus oryzae (7)، Portabella mushrooms، Pycnoporus sanguineus (8) و Lentinula boryana (9) اشاره کرد.

راهکار نویدبخش دیگر، غربالگری منابع میکربی با هدف یافتن سویه‌های مولد آنزیم تیروزیناز است. تیروزیناز‌های باکتریایی معمولاً خارج سلولی‌اند. این آنزیم در گونه‌هایی مانند Rhizobium sp.، Symbiobacterium thermophilum، Pseudomonas maltophilia، Sinorhizobium meliloti، Marinomonas mediterranea، Thermomicrobium roseum، Bacillus thuringiensis، Pseudomonas putida (10،11)، Streptomyces castaneoglobisporus، Ralstonia solanacearum، و Verrucomicrobium spinosum یافت شده است (12). اکتینوباکترها یکی از گروه‌های باکتریایی مهم و مولد آنزیم‌های متنوع‌اند (13،14). این باکتری‌های گرم مثبت با مقدار GC بالا در DNA، در اکوسیستم‌های آبی و خاکی به فراوانی حضور دارند. برخی اکتینوباکترها بی‌هوازی و بسیاری هوازی و برخی از آنها مولد اسپور هستند. بسیاری از گونه‌های اکتینوباکترها دارای میسلیوم‌اند و چرخة زندگی پیچیده‌ای با اشکال مورفولوژیک متنوع دارند. گونة Streptomyces، به تنهایی تقریباً 5 درصد از حدود 16000 گونة باکتری‌های شناخته‌شده را تشکیل می دهد (15). این باکتری‌ها همچنین متابولیسم ثانویة گسترده‌ای دارند و حدود دو سوم از آنتی‌بیوتیک‌هایی که به‌صورت بالینی استفاده می‌شوند و بسیاری از داروهای ضدسرطان (16)، آنتی‌اکسیدان (17)، ضدکلسیفیکاسیون عروقی (18)، ضدانعقاد خون (19)، ضددیابت (20) و ترکیبات ضدقارچی را تولید می‌کنند؛ درنتیجه، این باکتری‌ها در زیست‌فناوری، پزشکی و کشاورزی اهمیت فراوانی دارند. اکتینوباکتر‌ها همچنین آنزیم‌های ارزشمندی همانند لیپازها (21)، پروتئازها (22) و آمیلازها (23) را تولید می‌کنند. با توجه به کاربردهای درخور توجه آنزیم تیروزیناز در صنایع مختلف و توانایی بالای اکتینوباکترها در ارائه ترکیبات زیست‌فعال با کاربردهای درمانی و آنزیم‌های متنوع با کاربردهای درمانی و صنعتی، پژوهش حاضر با هدف غربالگری و شناسایی مولکولی اکتینوباکترهای مولد آنزیم تیروزیناز از نمونه‌های خاکی جمع‌آوری‌شده از کویر مرنجاب (یک محیط گرم و خشک) و جزیرة هرمز (یک محیط گرم و مرطوب) انجام شده است. این دو اکوسیستم دارای خاک‌های شور بوده و ازنظر وجود اکتینوباکترهای مولد تیروزیناز مطالعه نشده‌اند. در این پژوهش همچنین جدایه‌های حاصل از پژوهش پیشین (24) غربالگری شدند که از غار هامپوئیل (یک محیط الیگوتروف) در مراغه جدا شده بودند. 

مواد و روش

جداسازی و نگهداری باکتری‌ها: تعداد 10 نمونه خاک از کویر مرنجاب و 10 نمونه خاک از مناطق مختلف جزیرة هرمز از عمق 20 سانتی‌متری جمع‌آوری و در ظروف استریل و در کوتاه‌ترین زمان ممکن به آزمایشگاه منتقل شدند. در هنگام نمونه‌برداری توجه شد تا نقاط نمونه‌برداری ازنظر ظاهری و ویژگی‌های اکولوژیک با یکدیگر متفاوت باشند؛ برای مثال، از خاک‌های بدون پوشش گیاهی، دارای پوشش گیاهی، نمک سود، خشک، مرطوب و نظایر آن نمونه‌برداری شد. همة نمونه‌ها در دمای اتاق در تاریکی خشک و الک شده و تا زمان کشت در دمای 4 درجة سانتی‌گراد نگهداری شده‌اند. سپس یک گرم از هر نمونه خاک در سرم فیزیولوژی، حل و رقت‌های متوالی اعشاری از آنها تهیه شد. در مرحلة بعد 100 میکرولیتر از رقت‌های 1-10 و 2-10 در محیط کشت ویژه جداسازی اکتینوباکترها (ISP2 agar) (دارای ترکیبات زیر (g/l) عصارة مالت 10، عصارة مخمر 4، گلوکز 4، کلسیم کربنات 2 و آگار 18) کشت داده شد. پلیت‌های تلقیح‌شده 14 روز در دمای 28 درجة سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. پس از خالص‌سازی، جدایه‌های حاصل در کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران، ثبت و در محیط نگهداری دارای ISP2 و گلیسرول (30 درصد) در دمای 76- درجة سانتی‌گراد نگهداری شدند.

غربالگری کیفی اولیة جدایه‌های مولد آنزیم تیروزیناز در محیط کشت تیروزین آگار: هریک از جدایه‌ها و نیز جدایه‌های به‌دست‌آمده در پژوهش پیشین که از غار هامپوئیل جدا شد بودند (24)، روی محیط ISP2 agar کشت داده شده و به مدت 10-7 روز در دمای 28 درجة سانتی‌گراد گرماگذاری شده‌اند. به‌منظور غربالگری اولیه و یافتن جدایه‌های مولد آنزیم تیروزیناز یا غربالگری کیفی، جدایه‌ها روی محیط کشت تیروزین آگار (دارای 5/0 درصد پپتون، 3/0 درصد عصارة گوشت، 5/0 درصد L-تیروزین و 2 درصد آگار با 3/7 pH) به‌صورت خطی کشت داده شدند. پلیت‌های تلقیح‌شدة تیروزین آگار به مدت 2 تا 3 روز در دمای 30 درجة سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. در پایان گرماگذاری، پلیت‌ها برای هاله‌های شفاف در اطراف کلنی بررسی شدند. نتایج تفسیرشده به‌صورت «-» برای نبود هالة شفاف و «+» برای مشاهدة هالة شفاف گزارش شدند (27-25). همچنین، ظهور کلنی‌هایی با رنگدانة قهوه‌ای که به‌تدریج (به‌دلیل تشکیل ملانین) سیاه‌رنگ می‌شوند، مولدین تیروزیناز در نظر گرفته شدند.

غربالگری کیفی ثانوی تولید آنزیم تیروزیناز: برای غربالگری کیفی ثانوی، جدایه‌ها در محیط کشت تیروزین براث (با ترکیبات مشابه تیروزین آگار ولی بدون آگار) دارای چند قطره کلروفرم کشت داده شدند. لوله‌های تلقیح‌شده در شیکر - انکوباتور با دمای 28 درجة سانتی‌گراد و سرعت 180 دور در دقیقه به مدت 3-2 روز گرماگذاری شدند (25). ظهور رنگ قرمز تیره، نشانة تولید تیروزیناز و یک نمونه‌ محیط کشت تلقیح‌نشده، شاهد در نظر گرفته شد.

.غربالگری کمی تولید آنزیم تیروزیناز جدایه‌های منتخب: برای بررسی کمی تولید آنزیم تیروزیناز از محیط کشت [1]SS (دارای نشاستة محلول ”25 گرم“، گلوکز ”10 گرم“، عصارة مخمر ”2 گرم“، کلسیم کربنات ”3 گرم“ و محلول نمک‌های کمیاب ”1 میلی‌لیتر“ ](فروسولفات، مس سولفات، روی سولفات و منیزیم کلراید) غنی‌شده با 1/0 درصد تیروزین و مس سولفات ”10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر“[) استفاده شد (28). به این منظور یک لوپ پر از جدایة مدنظر در 100 میلی‌لیتر محیط تولید آنزیم، تلقیح و در دمای 28 درجة سانتی‌گراد به مدت 7 روز در شیکر با سرعت 180 دور در دقیقه گرماگذاری شد. میزان تیروزیناز تولیدشده در محیط به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد. به این منظور به 1/0 میلی‌لیتر از مایع رویی محیط کشت تولید تیروزیناز، یک میلی‌لیتر بافر فسفات (5/0مولار با 5/6pH )، یک میلی‌لیتر محلول تیروزین (001/0 مولار) و 9/0 میلی‌لیتر آب، اضافه و مخلوط واکنش با یک لولة موئین برای 5-4 دقیقه هوادهی (اکسیژن‌رسانی) شد (اکسیژن برای عملکرد تیروزیناز ضروری است). درنهایت، جذب آن با استفاده از اسپکتروفوتومتر در طول موج 280 نانومتر اندازه‌گیری شد. محاسبة فعالیت آنزیم با استفاده از فرمول زیر انجام شد (28):

Units of enzyme/ml

شناسایی سویه‌های منتخب: مطالعة مورفولوژی کلنی و مورفولوژی میکروسکوپی جدایه‌ها، نخستین روش شناسایی جدایه‌ها بوده است. در این موارد ظهور کلنی‌های خشک و چسبیده به محیط که به آسانی با لوپ از سطح محیط کشت جدا نمی‌شوند و وجود میسلیوم در بیشتر جدایه‌های اکتینوباکتر، به‌ویژه گونه‌های جنس Streptomyces از سایر جدایه‌ها در نظر گرفته شد.

تعیین نوع دی‌آمینوپیملیک اسید: ابتدا به میزان کافی از رشد متراکم کشت خالص اکتینوباکتر‌ها در محیط  ISP2مایع تهیه شد. سپس بیوماس با استفاده از سانتریفیوژکردن مایع کشت در g 3000 به مدت 20 دقیقه تهیه شد. رسوب حاصل با آب مقطر شستشو و دوباره سانتریفیوژ شد. رسوب به‌دست‌آمده روی یک سطح آلومینیومی، ریخته و در آون در دمای 50 درجة سانتی‌گراد خشک شد. مقدار 20 میلی‌گرم از وزن خشک سلولی به‌دست‌آمده با‌ هاون، کوبیده و در داخل لوله‌های درپیچ‌دار با درب تفلونی تمیز ریخته شد. سپس 5/1 میلی‌لیتر HCl (6 نرمال) به لوله‌ها اضافه شد و پس از بستن درب لوله‌ها در دمای 100 درجة سانتی‌گراد به مدت 18 ساعت قرار داده شدند. پس از سردشدن لوله‌ها، محتوی لوله از کاغذ صافی واتمن شماره 1 عبور داده شد و بخش صاف‌شده در یک ویال شیشه‌ای تمیز ریخته و در آون در دمای 40 درجة سانتی‌گراد خشک شد. برای حذف کامل بخش اسیدی یک میلی‌لیتر آب مقطر به ویال‌ها افزوده شد و تا خشک‌شدن کامل دوباره درون آون با دمای 40 درجة سانتی‌گراد قرار داده شدند. این عمل برای 2 تا 3 بار تکرار شد. باقی‌مانده به‌دست‌آمده در 30 میکرولیتر آب مقطر حل شد. سپس 3-1 میکرولیتر از نمونة همگن‌شده با کمک لولة موئین روی کاغذTLC  قرار داده شد. کاغذ در تانک حاوی آب مقطر - HCl – پیریدین - متانول با نسبت حجمی (80:26:4:10) قرار داده شد. بعد از اتمام تفکیک، کاغذ از تانک خارج و در معرض هوا خشک شد. برای مشاهدة لکه‌ها، کاغذ خشک‌شده با محلول 1/0 درصد نین‌هیدرین در استون اسپری و پس از خشک‌شدن به مدت دو دقیقه در آون با دمای 100 درجة سانتی‌گراد قرار داده شد. مولکول‌های DAP به‌دلیل قطبیت زیاد، Rf پایین‌تری نسبت به اسیدآمینه‌های دیگر نشان می‌دهند. اسیدآمینه‌های اخیر به رنگ بنفش و ارغوانی نمایان می‌شوند و جلوتر از لکه‌های DAP حرکت می‌کنند. پس از اعمال حرارت، لکه‌های DAP به رنگ سبز مایل به خاکستری نمایان شدند. ایزومر فرم LL دارای Rf کمتری نسبت به ایزومر مزو است (28). به‌عنوان شاهد از یک نمونة دارای ایزومر مزو (Micromonospora sp. UTMC 2067) استفاده شد.

شناسایی مولکولی سویه‌ها: به‌منظور استخراج DNA، جدایه‌های مدنظر در فلاسک‌های ارلن‌مایر 100 میلی‌لیتر حاوی 10 میلی‌لیتر محیط BHI براث با 2/7 pH، تلقیح و در دمای 28 درجة سانتی‌گراد با دور 200 دور در دقیقه به مدت 7-5 روز گرماگذاری شدند. پس از اطمینان از نداشتن آلودگی محیط با استفاده از رنگ‌آمیزی گرم، محیط حاوی میسلیوم رشدیافته در شرایط سترون با دور g 13000 به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد و درنهایت رسوب به‌دست‌آمده با آب مقطر شسته و رسوب نهایی برای استخراج DNA استفاده شد. میکروتیوب‌ها تا زمان استفاده در دمای 20- درجة سانتی‌گراد نگهداری شدند. مراحل استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA (شرکت پویا ژن آزما) طبق روش کار شرکت سازنده انجام شد. به‌منظور بررسی کیفیت استخراج DNA، الکتروفورز با ژل آگارز 8/0 درصد به مدت 30 دقیقه انجام شد؛ درنهایت، باندها در در دستگاه ژل داک، زیر نور فرابنفش مشاهده شدند. برای تکثیر ژن 16S rRNA جدایه‌ها از پرایمرهای عمومی F9 و 1541R استفاده شد. توالی پرایمرهای استفاده‌شده در این پژوهش و دمای ذوب مربوط به آنها به‌ترتیب زیر است (29):

9F:5′ -AAG AGT TTG ATC ATG GCT CAG-3′ (Tm:60)

1541R:5′ -AGG AGG TGA TCC ACC CGC A-3′ (Tm:60)

بررسی محصول PCR، با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز 8/0 درصد صورت گرفت. واکنش PCR طبق روش استاندارد انجام گرفت. واسرشت‌شدن اولیه در دمای 96 درجة سانتی‌گراد و مدت زمان 5 دقیقه بود تا دو رشته از هم باز شوند. 30 چرخة تکثیر شامل 30 ثانیه در دمای 96 درجة سانتی‌گراد، 30 ثانیه در دمای 50 درجة سانتی‌گراد و 1 دقیقه و 20 ثانیه در دمای 72 درجة سانتی‌گراد انجام شد. پس از این مراحل به مدت 5 دقیقه در دمای 72 درجة سانتی‌گراد به‌منظور تکمیل نهایی سنتز و همانندسازی نهایی DNA نگه داشته شد. سپس برای تخلیص به شرکت توپاز ژن (کرج، ایران) و سپس ازطریق این شرکت برای تعیین توالی به شرکت میکروسینس (بالگاش، سوئیس) ارسال شد. برای بررسی نتیجة توالی‌ها، توالی‌های ژن 16S rRNA، با استفاده از نرم‌افزار بیوادیت[2]، مرتب و سپس با نرم‌افزار کروماس[3] بررسی شدند؛ درنهایت، توالی به‌دست‌آمده در سایت Ez-taxon هم‌ترازی شد. درخت فیلوژنی سویه‌های برتر با استفاده از نرم‌افزار مگا 5 با روش بیشترین احتمال ممکن رسم شد.

نتایج

ویژگی‌های مورفولوژی جدایه‌های اکتینوباکتریایی: در این پژوهش از 20 نمونه خاک جمع‌آوری‌شده، 31 جدایة اکتینوباکتریایی به دست آمد. در جدول 1 ویژگی‌های این جدایه‌ها و نیز جدایه‌های غار هامپوئیل ارائه شده که از کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران گرفته شده‌اند و شامل رنگ و شکل کلنی‌ها و توانایی یا عدم توانایی آنها در تشکیل اسپورند.

جدول 1- ویژگی‌های ریخت‌شناسی جدایه‌های اکتینوباکتریایی، ردیف‌های 1 تا 18 از جزیرة هرمز، 19 تا 31 از کویر مرنجاب جدا شده‌اند. ردیف‌های 32 تا 89 طی پژوهش پیشین از غار هامپوئیل به دست آمده‌اند.

ردیف

شماره سویه

ویژگی‌های کلنی (رنگ و شکل)

تشکیل اسپور و رنگ آن

1

3818

نارنجی با رنگیزه لعابی

بدون اسپور

2

3819

سفید - کرم، چروکیده و برجسته

اسپوردار

3

3820

نارنجی - کرم

بدون اسپور

4

3821

نارنجی

بدون اسپور

5

3822

نارنجی مشکی

بدون اسپور

6

3823

زرد با قوام کره‌ای

بدون اسپور

7

3824

سفید - کره‌ای

بدون اسپور

8

3825

نارنجی مشکی

بدون اسپور

9

3826

نارنجی صورتی

بدون اسپور

10

3827

زرد چروکیده برآمده

اسپوردار

11

3828

نارنجی با رنگدانة مشکی

بدون اسپور

12

3829

نارنجی

بدون اسپور

13

3830

سفید - کرم

بدون اسپور

14

3831

قهوه‌ای با رنگیزة محلول قهوه‌ای

دارای اسپور قهوه‌ای

15

3832

قهوه‌ای مشکلی ریز

بدون اسپور

16

3833

کرم زرد بزرگ پیگمان محلول زرد

دارای اسپور سفید

17

3834

کرم رنگ

اسپوردار

18

3835

نارنجی قهوه‌ای

بدون اسپور

19

3837

قهوه‌ای با رنگیزة بادمجانی محلول‌های نارنجی - ریز

بدون اسپور

20

3838

خاکستری برجسته و چروکیده

دارای اسپور خاکستری

21

3841

قهوه‌ای تیره

دارای اسپور خاکستری

22

3842

مشکی لعابی

بدون اسپور

23

3843

نارنجی مشکی

بدون اسپور

24

3844

صورتی

اسپور سفید - صورتی

25

3845

کرم – قهوه‌ای

اسپور سفید

26

3846

نارنجی قهوه‌ای

بدون اسپور

27

3847

خاکستری

اسپور سفید

28

3848

کرم صورتی

اسپور سفید

29

3849

کرم زرد با رنگیزة محلول زرد

بدون اسپور

30

3850

زرد با قوام کره‌ای

بدون اسپور

31

3851

سفید چروکیده

اسپور سفید

32

3161

کلنی‌های قهوه‌ای رنگ - کوچک

فاقد اسپور

33

3162

کلنی‌های سفید نارنجی - ریز

فاقد اسپور

34

3163

کلنی‌های زرد - کره ای شکل - ریز

فاقد اسپور

35

3164

کلنی‌های سفید نارنجی

اسپوردار

36

3165

کلنی‌های قهوه‌ای رنگ

اسپور سفید (گچی)

37

3166

کلنی‌های زرد – کره‌ای و موکوئیدی

فاقد اسپور

38

3168

کلنی‌های نارنجی صورتی با تولید رنگدانة مشکی ریز

فاقد اسپور

39

3169

کلنی‌های زرد رنگ – کره‌ای شکل - ریز

فاقد اسپور

40

3170

کلنی‌های نارنجی صورتی - رنگدانة مشکی ریز

فاقد اسپور

41

3171

کلنی‌های نارنجی - ریز

فاقد اسپور

42

3172

کلنی‌های نارنجی صورتی - ریز با رنگدانة مشکی

فاقد اسپور

43

3173

کلنی زرد رنگ کره‌ای - ریز

فاقد اسپور

44

3174

کلنی‌های زرد رنگ - کره‌ای شکل - ریز

فاقد اسپور

45

3175

کلنی‌های نارنجی صورتی - با تولید رنگدانة مشکی - ریز

فاقد اسپور

46

3176

کلنی نارنجی رنگ - ریز

فاقد اسپور

47

3177

کلنی‌های زرد رنگ - کره‌ای شکل و ریز

فاقد اسپور

48

3178

کلنی‌های سفید با حاشیة صاف و ریز

فاقد اسپور

49

3179

کلنی‌های نارنجی

فاقد اسپور

50

3180

کلنی‌های نارنجی - ریز

فاقد اسپور

51

3181

کلنی‌های قهوه‌ای رنگ کوچک با رنگدانة مشکی

فاقد اسپور

52

3182

کلنی‌های سفید قهوه‌ای با رنگدانه مشکی - ریز

فاقد اسپور

53

3183

کلنی سفید رنگ – کوچک - با مرکز سوراخ

فاقد اسپور

54

3185

کلنی‌های سفید رنگ - ریز

اسپور سفید (گچی)

55

3186

کلنی‌های قهوه‌ای با رنگدانة مشکی ریز

فاقد اسپور

56

3187

کلنی‌های نارنجی صورتی با رنگدانة مشکی ریز

فاقد اسپور

57

3188

کلنی‌های سفید رنگ با مرکز سوراخ

اسپور دار

58

3189

کلنی زرد رنگ – کره‌ای شکل - ریز

فاقد اسپور

59

3190

کلنی‌های قهوه‌ای رنگ - حاشیه چروکیده

اسپور سفید (گچی)

60

3225

قهوه‌ای - متوسط رو به کوچک - حاشیه صاف

اسپور سفید - خاکستری

61

3226

قهوه‌ای پررنگ – متوسط - صاف و کمی چروکیده

اسپور سفید (گچی)

62

3227

قهوه‌ای پررنگ – متوسط - صاف

اسپور خاکستری پر رنگ

63

3228

کرم روشن - کوچک - حاشیة صاف

اسپور سفید

64

3229

قهوه‌ای پررنگ – کوچک - حاشیة صاف

اسپور سفید - خاکستری پررنگ

65

3230

قهوه‌ای – کوچک - حاشیة صاف

اسپور سفید با حاشیه خاکستری

66

3231

قهوه‌ای – متوسط - حاشیة صاف

اسپورخاکستری

67

3232

کرم قهوه‌ای – کوچک - حاشیة چروکیده

فاقد اسپور

68

3233

کلنی قهوه‌ای پررنگ - حاشیة چروکیده و صاف

اسپور سفید و خاکستری

69

3234

قهوه‌ای پررنگ - کوچک - هم چروکیده هم صاف

اسپور سفید (گچی)

70

3235

قهوه‌ای – بزرگ - حاشیة چروکیده

اسپور سفید - خاکستری پررنگ

71

3236

قهوه‌ای پررنگ – متوسط - حاشیة چروکیده

اسپور خاکستری

72

3237

کرم روشن – کوچک - حاشیة صاف

فاقد اسپور

73

3238

کرم – بزرگ - حاشیة چروکیده

اسپور سفید - خاکستری

74

3239

قهوه‌ای پررنگ - کوچک وتعدادی بزرگ - مرکز فرورفته

اسپور کمی سفید و خاکستری

75

3240

قهوه‌ای و کرم - کوچک - حاشیة چروکیده

فاقد اسپور

76

3241

کرم روشن – کوچک – صاف

اسپور سفید - خاکستری

77

3242

کلنی کرم قهوه‌ای - متوسط - حاشیة صاف

اسپور سفید

78

3243

قهوه‌ای پررنگ – بزرگ - حاشیة چروکیده

اسپور سفید (گچی)

79

3244

کرم و قهوه‌ای – متوسط - حاشیة صاف

اسپور سفید (گچی)

80

3245

کلنی کرم و قهوه‌ای - متوسط - حاشیة صاف

اسپور سفید و خاکستری

81

3246

کرم روشن - بسیار کوچک - بدون حاشیه

اسپور سفید (گچی)

82

3247

کرم و قهوه‌ای - بزرگ - حاشیة چروکیده

اسپور سفید - خاکستری

83

3248

قهوه‌ای رو به مشکی – کوچک - حاشیة صاف

اسپور خاکستری پررنگ

84

3250

کرم با حاشیة قهوه‌ای – کوچک - حاشیة چروکیده

اسپور خاکستری

85

3251

کرم و قهوه‌ای – کوچک - حاشیة صاف و چروکیده

اسپور سفید - خاکستری

86

3252

قهوه‌ای پررنگ – متوسط - حاشیة صاف

اسپور خاکستری

87

3253

کرم و قهوه‌ای – کوچک - صاف و کمی چروکیده

اسپور سفید (گچی)

88

3254

کرم – کوچک - حاشیة صاف

اسپور سفید (گچی)

89

3255

کرم روشن - بسیار کوچک - حاشیة صاف

اسپور سفید (گچی)

 

غربالگری کیفی اولیة جدایه‌های مولد آنزیم تیروزیناز با کشت بر محیط تیروزین آگار: نتایج مربوط به آزمون غربالگری کیفی اولیة جدایه‌های اکتینوباکتریایی برای تولید آنزیم تیروزیناز در محیط کشت تیروزین آگار در جدول-2 ارائه شده‌اند. با توجه به نتایج، از بین 89 جدایة غربال‌شده، 17 جدایه ازنظر تشکیل آنزیم تیروزیناز و هالة شفاف جواب مثبت داده و به‌عنوان سویه‌های منتخب برای مراحل بعدی پژوهش برگزیده شده‌اند. وجود کلنی‌های دارای رنگدانه‌های قهوه‌ای - سیاه به‌عنوان سویه‌های اکتینوباکتر مولد آنزیم تیروزیناز در نظر گرفته شد (شکل 1، جدول 2).

شکل 1- غربالگری کیفی اولیة جدایه‌های مولد آنزیم تیروزیناز روی محیط کشت تیروزین آگار. ظهور هالة شفاف و رنگ قهوه‌ای - سیاه در اطراف کلنی‌ها به‌عنوان نشانة تولید تیروزیناز در نظر گرفته شده است. شدت هالة شفاف و رنگ قهوه‌ای در اطراف کلنی‌ها با + نشان داده شده است.

جدول 2- فعالیت تیروزینازی در جدایه‌های اکتینوباکتریایی

شماره سویه

آنزیم تیروزیناز

هالة شفاف

3164

+

+++

3165

+++

+

3190

+

+

3225

+

+

3226

+

+

3227

++

-

3229

+++

+

3230

++

+

3231

+

-

3233

+

-

3234

+

++

3235

++

++

3238

++

+

3239

+

+

3243

+

-

3247

+++

+

3248

++

+

غربالگری کیفی ثانوی جدایه‌های مولد آنزیم تیروزیناز در محیط تیروزین براث: غربالگری کیفی ثانوی در محیط تیروزین براث نشان داد از 17 جدایة منتخب در غربالگری کیفی اولیه، فعالیت تیروزینازی در 11 جدایه با تولید رنگ صورتی تا قرمز تأیید شد (جدول 3). درنهایت، با مقایسة نتایج به‌دست‌آمده از آزمون‌های کیفی اولیه و ثانوی که به‌ترتیب در محیط‌های تیروزین آگار و تیروزین براث انجام گرفته است، 4 جدایة 3233، 3229، 3247 و 3165 که در هر دو آزمون نتایج بهتری داشتند، به‌عنوان جدایه‌های منتخب برای آزمون‌های بعدی به کار گرفته شدند. براساس نتایج به‌دست‌آمده وجود هر دو ویژگی هالة شفاف و قهوه‌ای رنگ در اطراف کلنی‌ها برای انتخاب جدایه به‌منظور بررسی‌های فراتر ضروری است؛ با وجود این، در غربالگری اولیه احتمال خطا وجود دارد که لزوم استفاده از چندین غربالگری را گوشزد می‌کند.

جدول 3- فعالیت آنزیم تیروزیناز

شماره سویه

آنزیم تیروزیناز

شاهد

-

3233

++++

3235

++++

3247

+++

3225

+++

3238

+++

3165

+++

3229

+++

3190

+++

3230

+++

3243

+++

3239

++

3231

-

3164

-

3226

-

3234

-

3227

-

3248

-

 

بررسی کمی تولید آنزیم تیروزیناز: نتایج بررسی فعالیت آنزیمی جدایه‌های برتر به‌صورت کمی با کشت این جدایه‌ها در محیط SS در جدول 4 ارائه شده‌اند. براساس نتایج به‌دست‌آمده سویه‌های 3165 و 3233 بیشترین فعالیت آنزیمی را داشته‌اند (جدول 4).

 

جدول 4- میزان فعالیت آنزیم تیروزیناز در جدایه‌های منتخب

سویه

میزان فعالیت آنزیم (Unit/ml)

3229

13

3233

33

3247

24

3165

35

 

شناسایی جدایه‌های منتخب: همه جدایه‌های مطالعه‌شده دارای مورفولوژی تیپیک اعضای جنس Streptomyces، یعنی کلنی‌های خشک، چسبیده به محیط بودند که به آسانی با لوپ از سطح محیط کشت جدا نمی‌شدند؛ در ضمن، در مطالعة میکروسکوپی همه جدایه‌ها فرم گرم مثبت را نشان دادند و دارای میسلیوم بودند (شکل 3).

شکل 3- مورفولوژی ماکروسکوپی و میکروسکوپی (بزرگنمایی×1000) جدایه‌های اکتینوباکتر منتخب دارای فعالیت تیروزینازی

نتایج تعیین نوع ایزومر دی‌آمینوپایملیک اسید در دیوارة سلولی جدایه‌های مطالعه‌شده در شکل 4 نشان داده شده‌اند. همان‌گونه که مشاهده می‌شود در همه جدایه‌ها ایزومر LL مشاهده شده است.

شکل 4- نتایج آنالیز TLC نوع ایزومر دی‌آمینوپایملیک اسید (DAP) در جدایه‌های منتخب. ایزومر مزو در نمونة شاهد (Micromonospora sp. UTMC2067) با دایره مشخص شده است.

نتیجة استخراج ژنوم جدایه‌های اکتینوباکترهای منتخب و همچنین محصول PCR (ژن 16S rRNA) در ژل آگارز به‌ترتیب در شکل 5 الف و ب نشان داده شده است. محصول PCR موردنیاز اندازه‌ای حدود 1500 جفت‌باز داشته است. در جدول 5 و شکل 6 نیز نتیجة آنالیز فیلوژنی جدایه‌های منتخب ارائه شده است. همه این جدایه‌ها به جنس Streptomyces متعلق بوده‌اند.

 

شکل 5- باندهای معرف ژنوم اکتینوباکترهای منتخب در استخراج ژنوم (الف) و باند معرف ژن 16S rRNA تکثیرشده در PCR

 

جدول 5- نتیجة انطباق توالی ژن 16S rRNA در میان جدایه‌های منتخب

شماره سویه

نزدیک‌ترین سویة شناسایی‌شده با بیشترین تشابه

میزان شباهت

3165

Streptomyces tendae

67/99 درصد

3229

Streptomyces pseudogriseolus

100 درصد

3233

Streptomyces thermocarboxydus

88/99 درصد

3247

Streptomyces heliomycini

76/99 درصد

 

شکل 6- آنالیز تکاملی سویه‌های مولد آنزیم تیروزیناز با روش بیشترین احتمال ممکن. هم‌ردیفی یا تطبیق تمامی توالی‌های ژن 16S rRNA با نرم‌افزار Clustal W انجام شد. درخت فیلوژنی با استفاده از نرم‌افزار MEGA5 رسم شد.

بحث

تیروزینازهای میکربی کاربردهای گسترده‌ای در صنایع مختلف دارند. از زیست‌حسگرهای تیروزینازی قارچی و باکتریایی برای تعیین مقدار ترکیبات فنلی آب میوه، چای و مربا استفاده شده است (30،31). تیروزینازها می‌توانند روی انواع گسترده‌ای از ترکیبات مختلف فنلی شامل انواع منو، دی و پلی‌فنل‌ها عمل کنند. این ویژگی تیروزیناز برای تولید ارتو – دی‌فنل‌ها اهمیت دارد که در سنتز داروها و آنتی‌اکسیدان‌ها استفاده می‌شود. نخستین محصول واکنش تیروزیناز با تیروزین، دی‌هیدروکسی فنیل‌آلانین یا L-دوپا بوده است و ارزش اقتصادی بالایی دارد؛ زیرا داروی اصلی درمان بیماری پارکینسون است (32). کاربرد پزشکی تیروزیناز شامل تولید ملانین‌ها به‌عنوان ترکیبات ضدباکتری طبیعی برای درمان زخم، ازجمله استفادة موضعی از پیش‌مادة ملانین و تیروزیناز به‌صورت کرم یا پماد است (32).

همچنین تیروزیناز در سم‌زدایی پساب با حذف ترکیبات فنلی و رنگ‌زدایی کاربرد زیادی دارد؛ برای مثال، تیروزیناز به‌دست‌آمده از Streptomyces antibioticus روی آلاینده‌های صنعتی مانند 3 و 4-کلروفنل (33) و 3 و 4-فلوروفنل‌ها تأثیر داشته است. تیروزینازهای باکتریایی را می‌توان در رنگ‌زدایی پساب به کار برد؛ برای مثال، Trichosporon aciyoshidainum و Trichosporon beigelii NCIM-3326 در تجزیة مولکول‌های رنگی کاربرد دارند که معمولاً در صنعت نساجی استفاده می‌شوند (34، 35).

این آنزیم همچنین می‌تواند با ایجاد پیوند عرضی، ساختار مواد غذایی را تغییر دهد. تیروزینازهای به‌دست‌آمده از گونه‌های میکربی مختلف به‌عنوان عامل ایجادکنندة پیوند عرضی در انواع مختلفی از پروتئین شیر، گوشت و غلات مطالعه شده‌اند (36).

دال‌فرد[iv] و همکاران در سال 2006 با غربالگری‌های مختلف یک جدایه متعلق به جنس Bacillus مولد ملانین را از خاک‌های همدان جدا کردند. این جدایه توانایی تولید انواع پلی‌فنل اکسیدازها ازجمله کرزولازها، کاتکولازها و لاکازها را دارد. محققان فعالیت تیروزینازی این سویه را با استفاده از L-تیروزین و L-دوپا به‌عنوان سوبسترا مطالعه کردند. pH و دمای بهینة به‌دست‌آمده برای همه انواع پلی‌فنل اکسیدازها، به‌ترتیب 5/5 و 55 درجة سانتی‌گراد بود. فعالیت تیروزین هیدروکسیلازی تیروزیناز این سویه با تأخیر انجام می‌شود که با افزودن مقادیر کمی از L-دوپا و سدیم دودسیل سولفات می‌توان آن را رفع کرد. علاوه بر این، نتایج نشان دادند تیروزیناز و لاکاز با افزودن سدیم دودسیل سولفات با اتیلن دی‌آمین تترا استیک‌اسید[v] یک مولار مهار می‌شود. محققان مقاومت سلول‌های ملانین‌دار را برای پرتو فرابنفش A، C و هیدروژن پراکسید سنجش کردند. نتایج نشان دادند ملانین این سویه را در برابر پرتوهای فرابنفش و عوامل اکسیدان محافظت می‌کند (37).

سابهاش[vi] و همکاران در سال 2016 هفت نمونه خاکی را از منطقة شیرالا در هند جمع‌آوری کردند. از این نمونه‌های خاک، 70 جدایة اکتینوباکتریایی در محیط گلیسرول آسپارژین آگار تکمیل‌شده با سیکلوهگزیمید به دست آمد. از 70 جدایة اکتینوباکتریایی 85/82 درصد، 10 درصد، 85/2 درصد، 85/2 درصد به‌ترتیب متعلق به جنس‌های Streptomyces، Streptoverticillum، Nocardia و Micromonospora و بقیه جدایه‌ها متعلق به جنس Actinomadura بودند. غربالگری اولیة 70 جدایه برای تولید تیروزیناز انجام شد و 19 مولد تیروزیناز شناخته شد(25).

آریکان[vii] و والی‌پور[viii] در سال 2015 یک سویة Bacillus sp. مولد تیروزیناز را از یک نمونه خاک جداسازی کردند. مطالعات ریخت‌شناسی، بیوشیمیایی و مولکولی نشان دادند این سویه 99 درصد به Bacillus megaterium DSM319 شباهت دارد. تولید تیروزیناز این سویه به روش پاسخ سطح با فاکتورهای دمای رشد 36 درجة سانتی‌گراد، حضور نمک 4/3 درصد و مس سولفات 4/148 میکرومولار بهینه‌سازی شد. در شرایط بهینه بازده تولید آنزیم 522/0 واحد بود. وزن مولکولی این آنزیم با آنالیز SDS-PAGE، 34 کیلودالتون برآورد شده است (26).

دولاشکی[ix] و همکاران ویژگی‌های آنزیم تیروزیناز تولیدشده توسط Streptomyces albus  را مشخص کردند. آنزیم خام نخست با سانتریفیوژ و در ادامه با رسوب آمونیوم سولفات و اولترافیلتراسیون خالص‌سازی شد. برای حذف ملانین از رزین Servacell DEAE 52  استفاده شد. وزن مولکولی آنزیم به روش اسپکتروسکوپی جرمی در حدود 30096 دالتون برآورد شد. با استفاده از دی فنل-L- دوپا (mM 8/7Km=، mM-1s-1  157=Kcat/Km) و مونوفنل L-تیروزین (mM 5/0Km=، mM-1s-1  23=Kcat/Km) به‌عنوان سوبسترا، پارامترهای کینتیکی برای هر دو سوبسترا مشخص شد (38).

ابو-دوبارا[x] و همکاران با هدف جداسازی و غربالگری آنزیم تیروزیناز تولیدشده با اکتینوباکترها، 5 نمونه خاک از مناطق مصر و لیبی جمع‌آوری کردند. تعداد 36 جدایة اکتینوباکتریایی با استفاده از محیط کشت نشاسته - نیترات آگار جداسازی شدند. در غربالگری اولیه با محیط تیروزین آگار، 8 جدایة رنگدانة سیاه - قهوه‌ای مولد ملانین به دست آمد. از میان این جدایه‌ها در غربالگری ثانویه در محیط تیروزین براث، 3 جدایة Streptomyces malachitorectus،Streptomyces iakyrus  و Streptomyces echinatus با تولید 4/8، 8/4 و 2/1 واحد بر میلی‌لیتر بیشترین فعالیت تیروزینازی را نشان دادند (39).

موتالاکشمی[xi] و همکاران سویه‌های Bacillus sp.  و Acinetobacter sp. را به‌عنوان منابع بالقوة تیروزیناز باکتریایی معرفی کردند (40). طبق مطالعات پیشین Streptomyces albus، Streptomyces nigrifaciens و Streptomyces michiganensis فعالیت تیروزینازی بسیار قوی داشته‌اند (41،42).

بیشتر اکتینوباکترها (به‌ویژه Streptomyces) ارگانیسم‌های ساپروفیت و ساکن در خاک‌اند که بیشتر دوره‌های زندگی خود را به‌عنوان اسپورهای نیمه‌فعال به‌خصوص در شرایط نامطلوب از لحاظ مواد مغذی صرف می‌کنند (43). این باکتری‌ها در خاک، به‌ویژه در خاک‌های قلیایی و غنی از مواد آلی، بیشتر از سایر محیط‌ها حضور دارند. اکتینوباکترها انواع ملانین‌ها را تولید می‌کنند که با توجه به نوع سویه، محیط استفاده‌شده و سن کشت، ممکن است قرمز، زرد، نارنجی، صورتی، قهوه‌ای، قهوه‌ای روشن، قهوه‌ای متمایل به سبز، آبی یا سیاه باشند (44). ملانین‌ها برای رشد و توسعة ارگانیسم ضروری نیستند؛ اما برای بهبود بقا و رقابت باکتری نقش حیاتی دارند.

در این پژوهش از بین 20 نمونه خاک مطالعه‌شده، 31 جدایة اکتینوباکتریایی به دست آمد و درنهایت با غربالگری کمی و کیفی این جدایه‌ها و نیز 58 جدایة حاصل از پژوهش پیشین (24)، چهار جدایة 3165، 3229، 3233 و 3247 بیشترین فعالیت آنزیمی را داشتند. نزدیک‌ترین گونه‌های شناخته‌شده به این جدایه‌ها براساس توالی ژن S rRNA16 به‌ترتیب Streptomyces tendae، Streptomyces lusitanus، Streptomyces thermocarboxydus و Streptomyces heliomycini تعیین شدند. همه این جدایه‌ها از غار هامپوئیل جدا شده بودند. با توجه به حجم کم نمونه به دشواری می‌توان این نکته را به محل جداسازی جدایه‌ها نسبت داد؛ اگرچه نسبت جدایه‌های متعلق به جنس Streptomyces به نسبت دیگر جدایه‌ها از غار هامپوئیل در مقایسه با دو محیط دیگر یعنی جزیرة هرمز و کویر مرنجاب بیشتر بوده است.

روی[xii] و همکاران در سال 2014، فعالیت تیروزینازی بیست جدایه حاصل از نمونه رسوبات دریایی ساحل مارینا در هندوستان را با استفاده از محیط Skim milk agar غربالگری کردند. نتایج به‌دست‌آمده نشان دادند از 20 نمونة جمع‌آوری‌شده، دو جدایة 4-Lk و 20-Lk هیدرولیز تیروزین را نشان داده‌اند و براساس نتایج غربالگری ثانویه، 4-Lk برای تجزیه و تحلیل بیشتر انتخاب شد. براساس شناسایی مولکولی، سویة 4-Lk بیشترین شباهت را به Streptomyces espinosus دارد. همچنین، آنزیم تیروزیناز ترکیبات فنلی را از محلول‌های آبی در عرض چند ساعت حذف کرده است و نشان می‌دهد عصارة کشت تولیدشده توسط Streptomyces espinosus سویة 4-Lk با فعالیت آنزیمی 6 واحد در میلی‌لیتر به‌طور چشمگیری کارآیی حذف فنل و ترکیبات فنلی از پساب‌های آلوده را دارد (24).

همان‌گونه که مشاهده می‌شود میزان فعالیت تیروزینازی در سویه‌های Streptomyces tendae، Streptomyces thermocarboxydus، Streptomyces heliomycini و Streptomyces pseudogriseolus حاصل از این پژوهش به‌ترتیب 83/5، 5/5، 4 و 17/2 برابر بیش از سویة Streptomyces espinosus Lk-4  جداشده از منابع دریایی هند بوده است؛ براساس این، می‌توان چهار جدایة Streptomyces برتر حاصل از این پژوهش را به‌عنوان سویه‌های نویدبخش برای پژوهش‌های بعدی به‌منظور تولید تیروزیناز استفاده کرد. همچنین، این سویه‌ها می‌توانند ازنظر توان تجزیة آلاینده‌های فنلی مطالعه شوند.

با توجه به کاربردهای متعدد آنزیم تیروزیناز در صنایع مرتبط با بیوتکنولوژی و لزوم استفاده از روش‌های دوستدار با محیط زیست و مقرون‌به‌صرفه در صنایع مختلف و با در نظر گرفتن تنوع زیستی درخور توجه کشور، نتیجة پژوهش کنونی نشان می‌دهد اکتینوباکترها منابع میکربی نویدبخشی برای تولید انواع آنزیم‌های تیروزیناز هستند.

سپاسگزاری

از همکاری خانم‌ها لیلا پرویزی و فهیمه محمدنیا کارشناسان کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران برای نگهداری سویه‌های باکتریایی سپاسگزاریم.

[1]- Salmonella shigella

[2]- BioEdit

[3]- Chromas

[iv]- Dalfard

[v]- EDTA

[vi]- Subhash

[vii]- Arikan

[viii]- Valipour

[ix]- Dolashki

[x]- Abou-Dobara

[xi]- Muthulakshmi

[xii]- Roy

  • (1) Cheng M, Chen Z. Screening of tyrosinase inhibitors by capillary electrophoresis with immobilized enzyme microreactor and molecular docking. Electrophoresis. 2017; 38 (3-4): 486-93.

(2)          Janovitz-Klapp A, Richard F, Nicolas J. Polyphenoloxidase from apple, partial purification and some properties. Phytochemistry. 1989; 28 (11): 2903-7.

(3)          Raymond J, Rakariyatham N, Azanza J. Purification and some properties of polyphenoloxidase from sunflower seeds. Phytochemistry. 1993; 34 (4): 927-31.

(4)          Strothkamp K, Jolley R, Mason H. Quaternary structure of mushroom tyrosinase. Biochem Biophys Res Commun. 1976; 70 (2): 519-24.

(5)          Lerch K. Neurospora tyrosinase: structural, spectroscopic and catalytic properties. Mol Cell Biochem. 1983; 52 (2): 38-125

(6)          Kanda K, Sato T, Ishii S, Enei H, Ejiri S-i. Purification and properties of tyrosinase isozymes from the gill of Lentinus edodes fruiting body. Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 1996; 60 (8): 1273-8.

(7)          Nakamura M, Nakajima T, Yasunori O, Yamauchi S, Lee BR, Ichishima E. Identification of copper ligands in Aspergillus oryzae tyrosinase by site-directed mutagenesis. Biochem J. 2000; 350 (2): 537-45.

(8)          Halaouli S, Asther M, Kruus K, Guo L, Hamdi M, Sigoillot JC, et al. Characterization of a new tyrosinase from Pycnoporus species with high potential for food technological applications. J Appl Microbiol. 2005; 98 (2): 332-43.

(9)          de Faria RO, Rotuno Moure V, Balmant W, Lopes de Almeida Amazonas MA, Krieger N, Mitchell DA. The tyrosinase produced by Lentinula boryana (Berk. & Mont.) Pegler suffers substrate inhibition by L-DOPA. Food Technol Biotechnol. 2007; 45 (3): 334-40.

(10)       Liu Z, Liu Y, Yang H, Yang Y, Shen G, Yu R. A phenol biosensor based on immobilizing tyrosinase to modified core-shell magnetic nanoparticles supported at a carbon paste electrode. Analytica Chimica Acta. 2005; 533 (1): 3-9.

(11)       McMahon AM, Doyle EM, Brooks S, O’Connor KE. Biochemical characterisation of the coexisting tyrosinase and laccase in the soil bacterium Pseudomonas putida F6. Enzyme Microb Technol. 2007; 40 (5): 1435-41.

(12)       Matoba Y, Kumagai T, Yamamoto A, Yoshitsu H, Sugiyama M. Crystallographic evidence that the dinuclear copper center of tyrosinase is flexible during catalysis. J Biol Chem . 2006; 281 (13): 8981-90.

(13)       Zaidi KU, Ali AS, Ali SA, Naaz I. Microbial tyrosinases: promising enzymes for pharmaceutical, food bioprocessing, and environmental industry. Biochem Res Int. 2014; 1-16.

(14)       della-Cioppa G, Garger Jr SJ, Sverlow GG, Turpen TH, Grill LK, Chedekal MR. Melanin production by Streptomyces. Google Patents; 1998.

(15)       Hopwood DA. Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers: Oxford University Press; 2007.

(16)       Azman A-S, Othman I, Fang C-M, Chan K-G, Goh B-H, Lee L-H. Antibacterial, anticancer and neuroprotective activities of rare Actinobacteria from mangrove forest soils. Indian J Microbiol. 2017;57 (2): 177-87.

(17)       Mohammadipanah F, Momenilandi M. Potential of rare actinomycetes in the production of metabolites against multiple oxidant agents. Pharm Biol. 2018;56 (1): 51-9.

(18)       Salimi F, Hamedi J, Motevaseli E, Mohammadipanah F. Isolation and screening of rare Actinobacteria, a new insight for finding natural products with antivascular calcification activity. J Appl Microbiol. 2018; 124 (1): 254-66.

(19)       Salimi F, Hamedi J, Motevaseli E, Mohammadipanah F. Coexistence of anticoagulant and anti-vascular calcification activities in Kribbella sp. UTMC 267 metabolites. Iran J Pharm Sci: IJPR. 2019; 18 (1): 459.

(20)       Salimi F, Jafari‐Nodooshan S, Zohourian N, Kolivand S, Hamedi J. Simultaneous anti‐diabetic and anti‐vascular calcification activity of Nocardia sp. UTMC 751. Lett Appl Microbiol. 2018; 66 (2): 110-7.

(21)       Imanparast S, Hamedi J, Faramarzi MA. Enzymatic esterification of acylglycerols rich in omega-3 from flaxseed oil by an immobilized solvent-tolerant lipase from Actinomadura sediminis UTMC 2870 isolated from oil-contaminated soil. Food Chem. 2018; 245: 934-42.

(22)       Mohammadipanah F, Ghelichkhani F, Khajeh K, Hamedi J. Alkaline Protease from Nocardiopsis arvandica UTMC 1492 Isolated from Saline Soil with the Ability to Produce Bioactive Protein Hydrolysate. Ind Biotechnol. 2018; 14 (1): 54-60.

(23)       Singh R, Kumar V, Kapoor V. Partial purification and characterization of a heat stable α-amylase from a thermophilic actinobacteria, Streptomyces sp. MSC702. Enzyme Res. 2014; 2014.

(24)       Hamedi J, Kafshnouchi M, Ranjbaran M. A Study on actinobacterial diversity of Hampoeil cave and screening of their biological activities. Saudi J Biol Sci. 2019; 26 (7): 1587-95.

(25)       Subhash GS, Karad D, Kulkarni S. Screening of Tyrosinase Producing Soil Actinomycetes from Shirala Region of Maharashtra, India. Int J Curr Microbiol App Sci. 2016; 5 (3): 345-53.

(26)       Valipour E, Arikan B. Increased production of tyrosinase from Bacillus megaterium strain M36 by the response surface method. Arch Biol Sci. 2016; 68 (3): 659-668.

(27)       Roy S, Das I, Munjal M, Karthik L, Kumar G, Kumar S, et al. Isolation and characterization of tyrosinase produced by marine actinobacteria and its application in the removal of phenol from aqueous environment. Front Biol. 2014; 9 (4): 3 306-316.

(28)       Raval KM, Vaswani PS, Majumder D. Biotransformation of a single amino-acid L-Tyrosine into a bioactive molecule L-DOPA. Int J Sci Res. 2012; 2: 2250-3153.

(29)       Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. 1987; 4 (4): 406-25.

(30)       Girelli AM, Giuliani T, Mattei E, Papaleo D. Determination of an antioxidant capacity index by immobilized tyrosinase bioreactor. J Agric Food Chem. 2009; 57 (12): 517.86-8.

(31)       Abhijith K, Kumar PS, Kumar M, Thakur M. Immobilised tyrosinase-based biosensor for the detection of tea polyphenols. Anal Bioanal. 2007; 389 (7-8): 2227-34.

(32)       Dalet F-GE, Guadalupe T-FJ, del Carmen C-HM, Humberto G-AC, Antonio S-UM. Insights into the structural biology of G-protein coupled receptors impacts drug design for central nervous system neurodegenerative processes. Neural Regen Res. 2013; 8 (24): 2290.

(33)       Marino SM, Fogal S, Bisaglia M, Moro S, Scartabelli G, De Gioia L, et al. Investigation of Streptomyces antibioticus tyrosinase reactivity toward chlorophenols. Arch Biochem Biophys. 2011; 505 (1): 67-74.

(34)       Pajot HF, Fariña JI, de Figueroa LIC. Evidence on manganese peroxidase and tyrosinase expression during decolorization of textile industry dyes by Trichosporon akiyoshidainum. Int Biodeterior Biodegradation. 2011; 65 (8): 1199-207.

(35)       Saratale R, Saratale G, Chang J-S, Govindwar S. Decolorization and biodegradation of textile dye Navy blue HER by Trichosporon beigelii NCIM-3326. J Hazard Mater. 2009; 166 (2-3): 1421-8.

(36)       Horne DS. Casein structure, self-assembly and gelation. Curr Opin Colloid Interface Sci. 2002; 7(5-6): 456-61.

(37)       Dalfard AB, Khajeh K, Soudi MR, Naderi-Manesh H, Ranjbar B, Sajedi RH. Isolation and biochemical characterization of laccase and tyrosinase activities in a novel melanogenic soil bacterium. Enzyme Microb Technol. 2006; 39 (7): 1409-16.

(38)       Dolashki A, Gushterova A, Voelter W, Tchorbanov B. Identification and characterization of tyrosinase from Streptomyces albus by mass spectrometry. Biotechnol Biotechnol Equip. 2009; 23(sup1): 946-50.

(39)       Abou-Dobara M, El-Sayed A, El-Fallal A, Sauf M. Survey for Tyrosinase production by Streptomyces species. Journal of Egyptian Academic Society for Environmental Development D, Environ Stud. 2019; 20 (1): 79-90.

(40)       Muthulakshmi T, Sivakumar U, Nadella RK, Murugadas V, Prasad M, Greeshma S. Study on Melanized Shrimp Reveals Bacillus sp and Acinetobacter sp as Potential Sources for Bacterial Tyrosinase. Int J Curr Microbiol App Sci. 2019; 8 (12): 1430-8.

(41)       Nambudiri A, Bhat J, Rao PS. Conversion of p-coumarate into caffeate by Streptomyces nigrifaciens. Purification and properties of the hydroxylating enzyme. Biochem J. 1972; 130 (2): 425-33.

(42)       Philipp S, Held T, Kutzner HJ. Purification and characterization of the tyrosinase of Streptomyces michiganensis DSM 40015. J Basic Microbiol. 1991; 31(4): 293-300.

(43)       Mayfield C, Williams S, Ruddick S, Hatfield H. Studies on the ecology of actinomycetes in soil IV. Observations on the form and growth of streptomycetes in soil. Soil Biol Biochem. 1972; 4 (1): 79-91.

(44)       Lechevalier H, Lechevalier MP, editors. Classification des actinomycètes aérobies basée sur leur morphologie et leur composition chimique. Annales DE L Institut Pasteur; 1965; 108(5), 662.