نوع مقاله : پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشدگروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد فلاورجان، اصفهان، ایران

2 استادیار گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد فلاورجان، اصفهان، ایران

10.22108/bjm.2021.124951.1322

چکیده

مقدمه: آلودگی محیط زیست با فلزات سنگین با پیشرفت صنعت رو به افزایش است. هدف این پژوهش، جداسازی و شناساییمولکولی باکتری‌های مقاوم به کروم از پساب‌های آلودهو بررسی زیست پالایی کروم توسط آنها بود.
مواد و روش‏‏ها: به‌منظور جداسازی باکتری‌های مقاوم به کروم، نمونه‌گیری از پساب کارگاه دباغی و کارخانة چرم‌سازی انجام شد. سپس دما، pH، BOD،COD و میزان فلزات سنگین در نمونه‌ها تعیین شدند. جداسازی باکتری‌های مقاوم به کروم به روش رقت در آگار انجام و میزان رشد باکتری‌ها در غلظت‌های 1 تا 128میلی‌مولار کروم بررسی شد. شناسایی مولکولی باکتری‌های مقاوم با روش کلنی - واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز انجام و جذب زیستی باکتری‌ها در شرایط آزمایشگاهی با جدایه‌هایی ارزیابی شد که بیشترین مقاومت را نسبت به کروم نشان دادند.
نتایج: میزان دما، pH، BOD،COD اندازه‌گیری‌شده در پساب کارخانة چرم‌سازی به‌ترتیب برابر 07/28 درجه سانتی‌گراد، 10/7، 100 و 330 میلی‌گرم بر لیتر و در پساب کارگاه دباغی به‌ترتیب برابر 03/26 درجه سانتی‌گراد، 84/6، 110 و 480 میلی‌گرم بر لیتر به دست آمد. براساس نتایج، سه سویة مقاوم به کروم جداسازی و شناسایی مولکولی شدند که شامل جنس‌های Bacillus subtilis H1Baclillus sp. H1D از پساب کارخانة چرم‌سازی و Bacillus cereus H2Cاز پساب کارگاه دباغی بودند. بین آنها B. subtilis H1Fبالاترین میزان مقاومت به کروم با حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) برابر با mM 64 را نشان داد و بیشترین توان جذب کروم این سویه ppm 5/68 بود.
بحث و نتیجه‏گیری: با توجه به اینکه باکتری B. subtilis H1Fبالاترین مقاومت و جذب کروم را در مقایسه با دو باکتری دیگر دارد، کاندید مناسبی برای حذف زیستی کروم از پساب‌های آلوده است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Isolation, Molecular Identification, and Bioremediation Activity of Chromium-Resistant Bacteria Collected from Waste Waters in Leather Tanning Plants of Khuzestan, Iran

نویسندگان [English]

  • Hoda Yektamanesh 1
  • Monir Doudi 2
  • Zarrindokht Emami 2

1 Department of Microbiology, Faculty of Biological Sciences, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran

2 Department of Microbiology, Faculty of Biological Sciences, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran

چکیده [English]

Introduction: Environmental pollution with heavy metals is increasing with the development of the industry. The aim of the present study was to examine the isolation and molecular identification of chromium-resistant bacteria from contaminated wastewaters to investigate the bioremediation of chromium by them.
Materials and Methods: Chromium-resistant bacteria were isolated from tannery and leather factory effluents. The temperature, pH, BOD, COD, and the amount of heavy metals in each sample were determined. Bacterial isolation was performed by the agar dilution method in the presence of different concentrations of chromium from 1 to 128 mmolL-1. Then, the MIC and MBC for the selected strains were determined. The molecular identification of the resistant strains was done by colony PCR. The biological removal of chromium was evaluated by the selected strains under in vitro conditions.
Results: The results of the study showed that the temperature, pH, BOD, and COD in the leather factory effluent were 28.7 ° C, 7.10, 100, and 330 mgL-1 and in the tannery effluent were 26.03 ° C, 6.84, 110, and 480 mgL-1, respectively. In this study, Bacillus subtilis H1F and Bacillus sp. H1D were isolated from leather wastewaters and Bacillus cereus H2C was the selected strain from tannery effluents. Among them, B. subtilis H1F showed the highest chromium resistance with an MIC value of 64 mM. Chromium removal of this strain was 68.5 ppm and it had the highest capacity among the three selected isolates.
Discussion and conclusion: Considering that B.subtilis H1F had the highest resistance and adsorption of chromium compared to other two bacteria, it is a suitable candidate for the biological removal of chromium from polluted effluents.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bioremediation
  • Chromium-resistant bacteria
  • Industrial wastewater

مقدمه

آلودگی محیط زیست با فلزات سنگین سمی در سراسر جهان همراه با پیشرفت صنایع گوناگون روزبه‌روز گسترش می‌یابد. براساس گزارشات منتشرشده از سازمان جهانی بهداشت مس، کروم، کادمیوم و نیکل مهم‌ترین فلزات سنگینی‌اند که به آلودگی محیط زیست منجر می‌شوند (1). فلزات سنگین در غلظت پایین برای رشد گیاهان نیازند؛ اما در غلظت بالا به‌عنوان یکی از مهم‌ترین گروه‌های آلایندة محیط زیست محسوب می‌شوند. بیشتر فلزات سنگین ازلحاظ زیستی فعال‌اند و قادر به ایجاد واکنش در سطح مولکولی، سلولی و اکوسیستم‌اند (2).

کروم یکی از فلزات سنگین است که به میزان زیادی در خاک و آب وجود دارد که به سختی دچار خوردگی می‌شود و در برابر زنگ‌زدگی و سیاه‌شدن مقاوم است. معمولی‌ترین حالت‌های اکسایش کروم یون‌های دو، سه و شش ظرفیتی آن است که یون سه ظرفیتی پایدارترین آنها و حالت‌های چهار و پنج ظرفیتی آن کم و بیش کمیاب است. کروم ازطریق منابع انسانی مانند کارخانه‌های آبکاری، دباغ‌خانه‌های چرم، پردازش فلز، آبکاری کروم، تهیه آلیاژ، پالایش نفت و تولید قطعات خودرو وارد آب‌های محیطی می‌شود (3). منابع دیگر انتشار کروم شامل احتراق نفت و زغال سنگ، جوشکاری فولاد ضدزنگ، تولید فولاد، کارخانة سیمان، صنایع رنگ و برج‌های خنک‌کننده‌اند که از کروم شش ظرفیتی به‌عنوان مهارکنندة رنگ برای بخش‌های مختلف غوطه‌ور استفاده می‌کنند. مواجه شغلی با ترکیبات کروم شش ظرفیتی می‌تواند بسیار حاد و خطرناک باشد (4). همچنین، آبشویه، کروم را وارد خاک و آب‌های زیرزمینی می‌کند؛ با این حال در محیط‌های آبی، کروم عمدتاً در دو حالت اکسیداسیون مانند کروم سه و شش ظرفیتی وجود دارد که کروم شش ظرفیتی سرطان‌زا است و آلایندة بالقوه برای خاک و آب‌های سطحی و زیرزمینی محسوب می‌شود (2). یک افزایش جزئی در سطح کروم شش ظرفیتی به‌دلیل سمیت بالای آن، جهش‌زایی (5) و سرطان‌زایی (6) موجب بروز مشکلات زیست‌محیطی و سلامت می‌شود. چندین روش فیزیکوشیمیایی برای حذف فلزات سنگینی مانند کروم از محیط وجود دارد؛ با این حال، این روش‌ها به‌دلیل هزینه‌های عملیاتی بالا و تولید ضایعات جامد غیرعملی‌اند. تحقیقات انجام‌شده در سال‌های اخیر نشان می‌دهند زیست‌پالایی با استفاده از میکروارگانیسم‌های مقاوم به فلزات سمی روشی کارآمد برای حذف این قبیل از آلودگی‌ها است (7). میکروارگانیسم‌ها مکانیسم‌های گوناگونی را برای سازگاری و پاسخ به فلزات سنگین به کار می‌گیرند که به تشکیل کمپلکس و ساخت پروتئین‌های اتصالی نظیر متالونین‌ها می‌توان اشاره کرد. میکروارگانیسم‌هایی که توانایی جذب فلزات را در غلظت بالا دارند، گزینة مناسبی برای زیست‌پالایی‌اند (8).

براساس نتایج ارائه‌شده از تحقیقات پیشین، کاهش میکروبی کروم شش ظرفیتی دارای اهمیت عملی است؛ زیرا استراتژی‌های حذف زیستی سنجش فلزات سنگین از دستاوردهای تکنولوژی سبز است که مقرون‌به‌صرفه و سازگار با محیط زیست است (9)؛ ازاین‌رو هدف از مطالعة‌ حاضر جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های مقاوم به فلز سنگین کروم از چند پساب‌ صنعتی در استان خوزستان و سپس یافتن بهترین جدایة باکتریایی برای حذف این فلز در شرایط آزمایشگاهی بود.

مواد و روش‌ها

نمونه‌برداری:در پژوهش حاضر، نمونه‌برداری از پساب یک کارخانة چرم‌سازی (پساب 1) و یک کارگاه دباغی (پساب 2) در استان خوزستان با استفاده از ظروف شیشه‌ای استریل انجام شد. کلیه ظروف حاوی نمونه‌های جمع‌آوری‌‌شده روی یخ به آزمایشگاه انتقال داده شدند. سپس دما، pH، نیاز بیوشیمیایی به اکسیژن ([1]BOD)، نیاز شیمیایی به اکسیژن (COD[2])و غلظت فلز کروم (برحسب یک در میلیون در لیتر، ppm) با استفاده از دماسنج جیوه‌ای، پی‌اچ متر (Metrohm 827, Swiss)، BOD سنج، COD سنج و دستگاه جذب اتمی (Nikon,Japan) ICP اندازه‌گیری شد و نمونه‌ها در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند (10). به‌منظور اندازه‌گیری کروم موجود در نمونه‌ها، ابتدا 100 میلی‌لیتر از هر پساب به‌صورت جداگانه به بالن ژوژه 200 میلی‌لیتری انتقال داده شد، مقدار 5 میلی‌لیتر اسید نیتریک غلیظ به آن اضافه و روی حمام بخار قرار داده شد تا به آرامی تبخیر شود و به حجم 20 میلی‌لیتر برسد. سپس محلول فوق با استفاده از آب مقطر به حجم 200 میلی‌لیتر رسانده شد. در پایان، با استفاده از دستگاه جذب اتمی، غلظت کروم موجود در نمونه‌ها قرائت شد (11).

جداسازی و غنی‌سازی باکتری‌های مقاوم به فلز کروم:برای جداسازی باکتری‌های مقاوم به کروم از روش تهیه رقت در آگار استفاده شد. بدین منظور ابتدا محیط کشت PHGII آگار حاوی 4 گرم پپتون، 1 گرم عصارة مخمر، 2 گرم گلوکز و 15 گرم آگار در یک لیتر آب مقطر تهیه و استریل شد. پس از رسیدن دمای محیط کشت به 55 درجه سانتی‌گراد، محلول حاوی فلز کروم تهیه‌شده از نمک نیترات کروم با غلظت 8 میلی‌مولار به آن افزوده شد و پس از اختلاط کامل، pH آن روی 7 تنظیم و درون پلیت‌های استریل توزین شد (10). در مرحلة بعد، 1-5/0 میلی‌لیتر از رقت‌های 1-10 تا 6-10 تهیه‌شده از نمونه‌های پساب روی محیط‌های کشت PHGII آگار حاوی کروم، تلقیح و با استفاده از میلة شیشه‌ای سرکج استریل در سطح پلیت‌ها پخش شد. سپس کلیه پلیت‌ها به مدت 3 تا 5 روز در دمای 30 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. در این مرحله یک پلیت به‌عنوان کنترل منفی و پلیت دیگر به‌عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد. پس از اتمام دورة انکوباسیون، کلنی‌هایی با مورفولوژی متفاوت برای فرایند غنی‌سازی انتخاب شدند (11). به‌منظور غنی‌سازی، کلنی‌های انتخاب‌شده درون محیط کشت نوترینت‌براث حاوی کروم با غلظت اولیه کشت داده و در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به مدت 24 ساعت گرما‌گذاری شدند. سپس با استفاده از کشت خطی روی محیط PHGII آگار با غلظت نمک اولیه خالص‌سازی شدند. درنهایت، رنگ‌آمیزی گرم برای کلنی‌های خالص‌شده انجام شد (11).

شناسایی بیوشیمیایی باکتری‌های جداشده: شناسایی 8 سویة جداسازی‌شده مطابق راهنمای سیستماتیک برگی و طبقه‌بندی باسیلوس‌ها براساس شکل، رنگ‌آمیزی گرم، تشکیل اسپور، تحرک، تست کاتالاز، لسیتیناز، سیترات، احیای نیترات، هیدرولیز ژلاتین، تخمیر قندهای گلوکز، گزیلوز و آرابینوز، ایندول، تولید H2S و اکسیداز انجام شد (12).

.تعیین حداقل غلظت ممانعت‌کننده از رشد ([3]MIC) و حداقل غلظت کشندة ([4]MBC) فلز کروم روی باکتری‌ها: به‌منظور تعیین MIC کروم روی باکتری‌های مقاوم جداسازی‌شده از روش انتشار در آگار استفاده شد. برای این هدف پلیت‌های حاوی محیط کشت PHG II آگار با غلظت‌های مختلف فلز (1، 2، 4، 8، 16، 32، 64 و 128 میلی‌مولار) و غلظت‌های بین آنها تهیه شدند؛ به‌طوری‌که هر پلیت حاوی یک غلظت معین از فلز بود. سپس کلنی‌های مقاوم به‌صورت شعاعی بر سطح پلیت کشت داده و درنهایت پلیت‌ها به مدت 2 روز در 30 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند. پس از طی مدت زمان لازم پلیت‌ها بررسی شدند و براساس حداقل غلظتی از فلز که از رشد باکتری ممانعت کرده بود، MIC و یک غلظت بعد از آن MBC تعیین شد (13).

.بررسی میزان جذب کروم توسط باکتری‌های مقاوم جداشده در شرایط آزمایشگاهی:میزان جذب این فلز توسط باکتری‌هایی با بیشترین MIC سنجش شد. ابتدا باکتری‌های مدنظر در محیط کشت مولرهینتون براث در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و دور  rpm200 تا زمان رسیدن به کدورت استاندارد نیم مک‌فارلند (cfu/ml 106× 5/1 (رشد داده شدند. سپس 10 میکرولیتر از کشت هر باکتری به پلیت نوترینت آگار (Scharlu, Spain) به‌عنوان شاهد و 10 میکرولیتر به پلیت حاوی بالاترین غلظتی از کروم منتقل شد که باکتری مورد آزمایش در آن رشد کرده بود و پلیت‌ها در دمای 30 درجه سانتی‌گراد تا زمان تشکیل کلنی انکوبه شدند. سپس چند کلنی از هر باکتری به محیط کشت مولرهینتون براث (Merck, Germany) بدون فلز، منتقل و در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و دور rpm200 تا زمان رسیدن به کدورت استاندارد نیم مک‌فارلند انکوبه شد. در مرحلة بعد، نمک نیترات کروم در غلظت 5/2 میلی‌مولار به کشت هر باکتری اضافه شد. پس از اضافه‌کردن محلول آرسنیک، در زمان‌های مختلف (0، 60، 120، 240 و 480 دقیقه) مقدار 1 میلی‌لیتر از این کشت به مدت 8 دقیقه در دور  rpm10000 سانتریفیوژ شد. سپس رسوب باکتری جداسازی و پس از شستشو با سرم فیزیولوژی و سانتریفیوژ مجدد برای محاسبه وزن بیومس باکتری نگه داشته شد. در مرحلة بعد، باکتری‌های رسوب‌کرده در دمای 60 درجه سانتی‌گراد به مدت 6 ساعت در فور خشک شدند و وزن خشک به‌عنوان بیومس باکتری در نظر گرفته شد (15 و 14). همچنین، مقدار کروم ذخیره‌شده در بیومس باکتری با دستگاه جذب ICP سنجش شد (16) و با استفاده از نرم‌افزار اکسل[5]، نمودارهای مربوط به نمونه‌های باکتری، رسم و نتایج به‌دست‌آمده مقایسه و تحلیل شدند.

شناسایی مولکولی سویه‌های باکتریایی مقاوم به کروم: شناسایی مولکولی باکتری‌های منتخب در مراحل قبلی آزمایش به‌منظور تعیین جنس و گونة آنها با استفاده از تکنیک کلنی - واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (PCR) و تعیین توالی ژن 16S rDNA انجام شد. برای این منظور از پرایمرهای عمومی ارائه‌شده در جدول 1 متعلق به شرکت فرمنتاز استفاده شد.

 

 

جدول 1- توالی پرایمرهای عمومی انتخاب‌شده در این مطالعه (17)

توالی

نام پرایمر

طول پرایمر

5'- AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3'

OF BUN

19 نوکلئوتید

5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

OR BUN

19 نوکلئوتید

 

 

مخلوط واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز حاوی 25/1 میکرولیتر از هر پرایمر (Mµ 10)، 5/0 میکرولیتر  dNTP(mM 10)، 75/0 میکرولیتر ‌کلرید منیزیم (mM 50)، 5/2 میکرولیتر بافر PCR (x 10)، 5/2 میکرولیتر آنزیم Taq DNA Polymerase u/µl) 5) و 5/19 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه، تهیه و یک کلنی از باکتری به آن اضافه شد. سپس سیکل‌های حرارتی واکنش به‌صورت دمای دناتوراسیون 95 درجه‌ سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه، 35 سیکل شامل دناتوراسیون در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه، اتصال در دمای 52 درجه سانتی‌گراد به مدت 45 ثانیه و طویل‌سازی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت90 ثانیه تکثیر نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 8 دقیقه انجام شدند. محصول تولیدشده پس از الکتروفورز ژل آگارز 5/1 درصد و خالص‌سازی، تعیین توالی شد. سپس توالی ‌به‌دست‌آمده با استفاده از الگوریتم بلاست با توالی‌های ثبت‌شده در پایگاه اطلاعاتی ژنوم ژن بانک مقایسه شد و رابطة فیلوژنیک سویه‌های جداسازی‌شده، بررسی و درخت فیلوژنی سویه‌های مدنظر با استفاده از توالی‌های حاصل از جست‌وجو در پایگاه اطلاعاتی NCBI با نرم‌افزار مگا[6] نسخة 6 ترسیم شد (14).

نتایج.

خصوصیات فیزیکوشیمیایی و زیستی پساب‌ها: در پژوهش حاضر فاکتورهای فیزیکوشیمیایی و زیستی و نیز غلظت فلزات سنگین پساب‌های مورد مطالعه بررسی شدند. نتایج به‌دست‌آمده به‌ترتیب در جدول 2 و اشکال 1 و 2 ارائه شده‌اند.

باکتری‌های مقاوم به کروم جداسازی‌شده: به‌منظور جداسازی، غنی‌سازی و غربال‌گری باکتری‌های مقاوم به فلز کروم از محیط کشت PHG II آگار حاوی نمک نیترات کروم استفاده شد. براساس نتایج به‌دست‌آمده 8 سویة‌ باکتریایی H1A،H1B ، H1D، H1F،H1G, ، H1J، H1K و H1O از پساب کارخانة چرم‌سازی و 3 سویة باکتریایی H2A، H2B و H2C از پساب کارگاه دباغی جداسازی و خالص‌سازی شدند. در ادامه، آزمون‌های بیوشیمیایی برای سه جدایة H1F، H2C و H1D انجام شدند که ازنظر مورفولوژی و ویژگی‌های میکروسکوپی تفاوت بیشتری با سایر سویه‌های جداسازی‌شده داشتند و سه جدایة نام‌برده به‌عنوان سویه‌های منتخب برای ادامة آزمایش‌ها انتخاب شدند. نتایج حاصل از بررسی خصوصیات میکروسکوپی و ماکروسکوپی، در جدول 3 و نتایج مربوط به آزمون‌های بیوشیمیایی این سه جدایه در جدول 4 ارائه شده‌اند.

 

 

جدول 2- میزان فلزات و شبه‌فلزات موجود در پساب‌های مطالعه‌شده

فلز

Mg (ppm)

Ca (ppm)

Bi (ppm)

Be (ppm)

Ba (ppm)

B (ppm)

As (ppm)

Al (ppm)

Ag (ppm)

پساب 1

58

59

<005/0

<001/0

02/0

13/0

<005/0

<005/0

<01/0

پساب 2

77

38

<005/0

<001/0

01/0

12/0

<005/0

<005/0

<01/0

فلز

Mn (ppm)

(ppm) Li

K (ppm)

Hg (ppm)

Fe (ppm)

Cu (ppm)

Cr (ppm)

Co (ppm)

Cd (ppm)

پساب 1

<008/0

007/0

95/2

<001/0

01/0

<005/0

<5/0

<005/0

<001/0

پساب 2

<005/0

012/0

39/3

<001/0

01/0

<005/0

<5/0

<005/0

<001/0

فلز

Sc (ppm)

Sb (ppm)

Pb (ppm)

P (ppm)

Ni (ppm)

Na (ppm)

Mo (ppm)

 

 

پساب 1

<005/0

<005/0

005/0>

<1/0

<5/0

141

<005/0

 

 

پساب 2

<005/0

<005/0

<005/0

<1/0

<5/0

155

<005/0

 

 

 

 

 

شکل 1- مقایسة پساب‌های مطالعه‌شده ازنظر  BODو COD. (1) پساب کارخانة چرم‌سازی، (2) پساب کارگاه دباغی

 

شکل 2- مقایسة پساب‌های مطالعه‌شده ازنظر pH و دما. (1) پساب کارخانة چرم‌سازی، (2) پساب کارگاه دباغی

 

 

جدول 3- نتایج مربوط به صفات ماکروسکوپی و میکروسکوپی باکتری‌های مقاوم به کروم جداسازی‌شده از پساب‌ها

کد جدایه

خصوصیات ماکروسکوپی

خصوصیات میکروسکوپی

H1D

رنگ کلنی: سفید، اندازه: کوچک، مقطع طولی: محدب، شکل کلنی: گرد، حالت: لزج

باسیل نسبتاً بلند، گرم مثبت با آرایش زنجیره‌ای کوتاه

H1F

رنگ کلنی: سفید، اندازه: بزرگ، مقطع طولی: محدب، حالت: لزج، شکل کلنی: گرد

باسیل کوتاه، گرم مثبت با آرایش منفرد

H2C

رنگ کلنی: سفید، مقطع طولی: محدب، اندازه: کوچک، حالت: نرم، شکل کلنی: گرد

باسیل کوتاه، گرم مثبت شبیه موی مجعد

 

جدول 4- نتایج مربوط به شناسایی جدایه‌ها به کمک تست‌های بیوشیمیایی

کد جدایه

سیترات

گزیلوز

احیای نیترات و کاتالاز

ژلاتیناز

حرکت

آرابینوز

SH2

H1D

-

-

+

+ نسبتا کند

-

-

-

H1F

+

+

+

+ خیلی کند

+

+

-

H2C

+

-

+

+ خیلی سریع

+

-

-

 

 

.میزان مقاومت جدایه‌های میکروبی منتخب در برابر فلز کروم: حداقل غلظت ممانعت‌کننده (MIC) و حداقل غلظت کشندة (MBC) نیترات کروم روی باکتری‌ها با روش ماکرودایلوشن براث اندازه‌گیری شدند. مقادیر MIC و MBC برای جدایة H1F به‌ترتیب برابر با 64 و 70 میلی‌مولار، برای جدایة H2C به‌ترتیب 50 و 60 میلی‌مولار و برای جدایة H1D به‌ترتیب برابر با 7 و 5/7 میلی‌مولار به دست آمد. براساس نتایج به‌دست‌آمده، از بین سویه‌های باکتریایی مقاوم به کروم بررسی‌شده، سویة H1F بیشترین میزان مقاومت به کروم را نشان داد.

شناسایی مولکولی سویه‌های باکتریایی منتخب: محصول PCR قطعایی به اندازة 1500 جفت‌باز را روی ژل آگارز نشان داد (شکل 3). پس از تعیین توالی قطعه ژن 16S rDNA و بررسی توالی‌های به‌دست‌آمده در مقایسه با توالی‌های ثبت‌شده در بانک جهانی اطلاعات ژنوم (NCBI) با استفاده از نرم‌افزار بلاست[7] و نرم‌افزار مگا نسخة 6 مشخص شد سویه‌های H1F، H1D و H2D به‌ترتیب دارای 98% شباهت با توالی باکتری‌های B. subtilis BY45، Bacillus sp. ANIOT10 و B. cereus LB17 بودند. درخت فیلوژنی این سه سویه در شکل 4 ارائه شده است.

جذب زیستی کروم به‌وسیلة سویه‌های منتخب:به‌منظور ارزیابی میزان فلز کروم جذب‌شده توسط سه سویة‌ باکتریایی منتخب، از تکنیک جذب اتمی (ICP) استفاده شد. میزان جذب فلز کروم توسط سویه‌های H1F، H2C و H1D و میزان زیست‌تودة آنها در زمان‌های مختلف بررسی شد. نتایج مربوط به میزان جذب کروم توسط زیست‌توده‌ها در جدول 5 ارائه شده‌اند. براساس نتایج به‌دست‌آمده سویة H1F بیشترین میزان جذب کروم را در زمان 480 دقیقه در غلظت ppm 5/68 کروم و میزان 1/13 میلی‌گرم زیست‌تودة سلولی داشته است.

 

 

شکل 3- الکتروفورز محصولات کلنی PCR جدایه‌های مقاوم به فلز سنگین کروم در ژل آگارز 1%. ستون :M مربوط به نشانگر مولکولی (bp 100) و ستون 1 تا 3 به‌ترتیب مربوط به جدایه‌های , ,  است. ستون 4: محصول PCR یک Bacillus sp. (کنترل مثبت) و ستون N: کنترل منفی است.

 


 

شکل 4- درخت فیلوژنی مربوط به جدایه‌های H2C، H1F و H1D به‌ترتیب متعلق به باسیلوس سرئوس (98% تشابه)، باسیلوس سوبتی‌لیس (98% تشابه) و باسیلوس sp (98% تشابه)، با استفاده از نرم‌افزار مگا نسخة 6 ترسیم شده است.

جدول 5- میزان جذب (ppm)، زیست‌توده (mg) و تعداد کلنی باکتریهای مطالعه‌شده

نام باکتری

B. subtilis H1F

Bacillus sp. H1D

B. cereus H2C

زمان (دقیقه)

0

60

120

240

480

0

60

120

240

480

0

60

120

240

480

میزان جذب (ppm)

55/4

40/18

45/24

1/57

50/68

85/3

21/4

24/4

10/5

5/55

80/19

12/21

24/4

30/21

09/22

میزان زیست‌توده (mg/)

9/4

9/6

9/7

7/9

1/13

2/1

9/2

8/3

6/6

9/8

3/4

8/4

8/3

3/5

7/4

تعداد کلنی cfu/ml

101

80

56

28

19

92

52

48

24

19

73

52

48

60

26

 


بحث و نتیجه‌گیری

تحقیقات انجام‌شده در سال‌های اخیر نشان داده‌اند زیست‌پالایی با استفاده از میکروارگانیسم‌های مقاوم به فلزات سمی روشی کارآمد برای حذف این قبیل از آلودگی‌ها هستند (18). یکی از روش‌های یافتن سویه‌های میکروبی با ارزش صنعتی، جستجو در زیستگاه‌های طبیعی آنها مانند پساب‌های صنعتی است. در بسیاری از موارد، فعالیت بیوکاتالیست‌های میکروبی بومی بیشتر از سویه‌های تهیه‌‌شده از کلکسیون بوده است. هرچه محیط‌های جستجو وسیع‌تر باشد، امکان دستیابی به سویه‌های طبیعی بیشتر خواهد بود (19)؛ ازاین‌رو در پژوهش حاضر جداسازی سویه‌های باکتریایی مقاوم به کروم از پساب یک کارگاه دباغی با pH اسیدی در دمای 03/26 و یک کارخانة چرم‌سازی با pH خنثی در دمای 07/28 به دست آمد. براساس نتایج به‌دست‌آمده 3 سویة باکتریایی از پساب کارگاه دباغی و 8 سویة باکتریایی از پساب کارخانة چرم‌سازی رشد داده و جداسازی شدند که علت آن را می‌توان به شرایط خنثی تا کمی اسیدی محیط‌های مذکور مرتبط دانست. براساس گزارشات ارائه‌شده، رشد میکروارگانیسم‌های مقاوم به فلزات سنگین در شرایط خنثی بیشتر از اسیدی بوده است. ذوالفقاریو همکاران[viii] (2012) در تحقیقی مشابه، باکتری‌های مقاوم به کروم را از پساب‌های صنایع مختلف در استان قم جداسازی کردند. براساس نتایج آنها رشد سویه‌های باکتریایی مقاوم در دمای 34 درجه سانتی‌گراد و در pH خنثی بیشتر بوده است (20) که با نتایج تحقیق حاضر هم‌خوانی داشت. از دیگر فاکتورهای مؤثر در جداسازی و رشد سویه‌های میکروبی مقاوم به فلزات سنگین می‌توان به‌ BOD و COD پساب‌ها اشاره کرد. میزان استاندارد COD برای پساب‌های صنعتی mg/L 120 و حداکثر آن mg/L 400 گزارش شده است (21). وقتی BOD به mg/L 5 برسد در خلوص آب تردید ایجاد می‌شود و وقتی از mg/L 20 تجاوز کند، هشداردهنده در نظر گرفته می‌شود. طبق استانداردهای ارائه‌شده برای پساب‌های صنعتی، استاندارد BOD برابر با mg/L 20 و حداکثر آن با توجه به نوع صنعت و شرایط فیزیکوشیمیایی برابر mg/L 100 است. با توجه به طبقه‌بندی فاضلاب‌ها ازلحاظ درجة آلودگی، میزان BOD برای پساب‌هایی با آلودگی بسیار شدید برابر mg/L 600 گزارش شده است (22). با توجه به نتایج به‌دست‌آمده در این تحقیق، COD پساب کارخانة چرم‌سازی با COD استاندارد محیط زیست برای پساب‌های صنعتی مطابقت دارد؛ در صورتی که در مورد پساب کارگاه دباغی بالاتر از استانداردهای گزارش‌شده است. ازاین‌رو BOD و COD پساب کارگاه دباغی نسبت به کارخانة چرم‌سازی افزایش چشمگیری داشته است؛ درنتیجه، رشد باکتری‌های مقاوم به کروم در این پساب کمتر بوده است. در مطالعة کریشنا و همکاران[ix] (2012) درصد باکتری‌های مقاوم به مس و کروم با میزان BOD و COD از رابطة مثبتی برخوردار بوده است؛ به‌طوری‌که با افزایش میزان BOD و COD درصد باکتری‌های مقاوم افزایش یافته‌اند (19). نتایج پژوهش حاضر با مطالعة‌ طهمورث‌پور و همکاران در قسمت درصد باکتری‌های مقاوم به کروم با میزان COD مغایرت نشان داد که دلیل آن را می‌توان به تفاوت در پساب‌ها و ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی مختلف آنها نسبت داد (22). به‌منظور افزایش بازده کاربرد میکروارگانیسم‌ها و باکتری‌ها برای حذف فلزات سنگین از محیط‌های طبیعی، تعیین حداقل غلظت ممانعت‌کننده از رشد بسیار مؤثر است و امکان مدیریت بهتر و کارایی بیشتری را برای کاهش و حذف آلاینده‌هایی همچون فلزات سنگین فراهم می‌کند (23). حداقل غلظت ممانعت‌کننده از رشد برای سویه‌های منتخب جداشده در پژوهش حاضر، طیف متفاوتی از 5/7 تا 60 میلی‌مولار گزارش شده است. براساس این نتایج‌ از بین سویه‌های مقاوم به کروم جداشده از پساب کارخانة چرم‌سازی، H1F بیشترین مقاومت را با mM 65MIC =  و  mM70 MBC = و بعد از آن، جدایة H1D بیشترین مقاومت را با mM 0/7MIC =  و  mM5/7 MBC = نشان داد. بین سویه‌های پساب کارگاه دباغی، جدایة H2C بیشترین مقاومت را با mM 50MIC =  و Mm60 MBC = نشان داد. زانگ و همکاران[x] در سال 2015 جدایة‌ پسودوموناس پوتیدا [xi]را از دریا جداسازی کردند و رشد باکتری‌ها را در غلظت 280 میکرومولار کروم گزارش دادند. در این پژوهش اشاره شده است که این مقاومت احتمالاً می‌تواند به‌دلیل مقاومت بالای دیوارة سلولی باکتری‌های گرم منفی به‌دلیل داشتن لیپید فراوان در لایه‌های مختلف لیپوپلی‌ساکارید، فسفولیپید و لیپوپروتئین باشد. این محقق و همکارانش این جدایه را انتخاب مناسبی برای پالایش زیستی کروم از دریاها و دریاچه‌ها معرفی کردند (24). ویتی و همکاران[xii] در سال 2015 در پژوهش خود کورینه باکتریوم اس پی[xiii]را از چندین پساب صنعتی جداسازی کردند و بیشترین مقاومت به فلز کروم در آن را mM 35 MIC = گزارش دادند (25). این در حالی است که در پژوهش حاضر، بیشترین مقاوت به فلز کروم mM 65MIC =  به دست آمد. متفاوت‌بودن این درصد مقاومت در دو پژوهش فوق‌الذکر می‌تواند تا حدودی مربوط به تفاوت در شرایط فیزیکوشیمیایی دو پژوهش با یکدیگر و تفاوت جنس و گونة باکتری‌های مقاوم به فلز کروم در دو مطالعه باشد. مطابق گزارش نییتو[xiv]در سال 1985، باکتری‌هایی که توانایی رشد در غلظت 1 میلی‌مولار فلزات را در چندین پساب صنعتی داشته باشند، جزء باکتری‌های مقاوم به آن فلز محسوب می‌شوند. نتایج این محقق نشان دادند جدایه‌های باسیلوس اس پی[xv]S29 و استافیلوکوکوس اس پی[xvi]به کروم مقاوم بوده‌اند و در حضور کروم به خوبی رشد می‌کردند (26). نتایج این محقق با یافته‌های پژوهش حاضر در معرفی باکتری مقاوم به کروم در چندین پساب صنعتی تا حدودی مطابقت داشت. دلیل این هم‌خوانی را می‌توان به عوامل متعددی نظیر ساختارهای یکسان پساب‌های بررسی‌شده ازنظر موقعیت‌های فیزیکوشیمیایی، موقعیت‌های یکسان باکتری‌های جداسازی‌شده و همچنین عوامل محیطی نزدیک به هم نسبت داد. براساس نتایج به‌دست‌آمده در مطالعة حاضر، بیشترین میزان جذب کروم در هر سه جدایةH1F ، H1D و  H2Cبه‌ترتیب برابر 5/68، 5/55 و 09/22 ppm برآورد شد که نشان‌دهندة کاهش میزان جذب فلز کروم و نتایج زیست‌توده در سه جدایه در برابر فلز کروم است. بین باکتری‌های مقاوم به فلز کروم باکتری باسیلوس سوبتی‌لیس[xvii] H1F بیشترین میزان مقاومت به کروم را از خود نشان داد و برای بررسی جذب فلز مذکور در شرایط آزمایشگاهی مطالعه شد. با توجه به نتایج به‌دست‌آمده مشاهده شد میزان جذب کروم در این سویه در دقایق ابتدایی سریع‌تر بوده است؛ اما در زمان‌های 60 تا 120 دقیقه این روند با سرعت بسیار کمتری دنبال شده است. سپس در فاصلة زمانی 120 تا 240 دقیقه روند جذب با شیب تندتری ادامه یافته و بعد از آن، در زمان 480 دقیقه تقریباً به تعادل رسیده است؛ به‌طوری‌که در فاصلة زمانی 240 تا 480 دقیقه افزایش ناچیزی در میزان جذب مشاهده شده است. همچنین، میزان زیست‌تودة این باکتری در دقایق ابتدایی آزمایش، افزایش سریع‌تری نسبت به زمان 240 تا 480 دقیقه نشان داده است و می‌توان چنین استنباط کرد که رشد باکتری در حضور فلز کروم کاهش یافته است. اسپاتل و همکاران[xviii] (2010) جدایه‌ای به نام پسودوموناس فراگی[xix] را از پسماندهای کارخانه‌های نساجی جداسازی کردند. بیشترین میزان کروم جذب‌شده از محیط حاوی 2 میلی‌مولار کروم در این باکتری برابر 59/0 میلی‌گرم از فلز کروم به‌ازای هر گرم از وزن باکتری بود. یکی از دلایل میزان جذب کم در این باکتری در این تحقیق می‌توانست مربوط به تعداد مکان‌های کم برای اتصال فلز به سطح باکتری باشد و درنتیجه، پس از اشباع و پرشدن آن مکان‌ها باکتری مدنظر قادر به جذب بیشتری از فلز کروم نبوده باشد (27). نتایج این پژوهش با یافته‌های پژوهش حاضر مغایرت نشان دادند دلیل این تفاوت را می‌توان تا حدودی به نوع باکتری و تنوع زیستی میکروارگانیسم‌ها و متفاوت‌بودن نوع پساب بررسی‌شده با صفات متفاوت فیزیکی و شیمیایی مربوط دانست. جعفری صالح و همکاران[xx] در سال 2018 با بررسی باکتری‌های مقاوم به کروم از رودخانة سلطان‌آباد شیراز نشان دادند چندینگونه از باکتری سودوموناس قادر به مقاومت بسیار بالایی در برابر فلز کروم بودند و به‌عنوان گزینة مناسب برای انجام آزمایشات جذب فلز کروم از محیط زیست در این پژوهش استفاده شدند. میزان فلز کروم استفاده‌شده در این تحقیق حدود 30 میلی‌مولار بود. میزان سرعت جذب در 20 دقیقة نخست بیشترین مقدار و بسیار سریع بود. پس از مدت زمان 40 دقیقه از ابتدای آزمایش، روند جذب به حالت تعادل رسید و هرچه میزان غلظت محلول کروم افزایش یافته، مدت زمان رسیدن به حالت تعادل کوتاه‌تر شده بود (28). نتایج حاصل از این مطالعه با نتایج این پژوهش در قسمت جذب بالای کروم و نیز در مقاومت بالای باکتری‌ها در برابر این فلز مطابقت داشت؛ اما جنس و گونة باکتری‌های جداسازی و شناسایی مولکولی شده متفاوت بودند.

شناسایی جدایه‌های منتخب در این پژوهش ابتدا با استفاده از آزمون‌های بیوشیمیایی و سپس آنالیز مولکولی ژن rDNAS16 صورت گرفت. براساس نتایج به‌دست‌آمده سویة H1F دارای همولوژی 98% با باسیلوس سوبتی‌لیس وH1D و دارای 98% همولوژی با جنس باسیلوس اس اپی و سویة H2C دارای همولوژی 98% با باسیلوس سرئوس بودند. هر سه باکتری‌ بررسی‌شده در این پژوهش باسیل گرم مثبت بودند. این سه جدایه، اسپورهای بیضوی شکل در موقعیت مرکزی یا نزدیک مرکزی بدون تورم داشته‌اند و دارای آرایش‌های متفاوت منفرد، زنجیره‌ای و آرایشی از زنجیره‌های درهم شبیه موی مجعد بودند. این گروه از باکتری‌ها به‌دلیل داشتن اسپور در برابر بسیاری از مواد ضدباکتریایی، حرارت، خشکی، یخ‌زدگی، سموم شیمیایی، فلزات سنگین و دیگر فاکتورهای مضر محیطی مقاومت نشان می‌دهند (29). ویتی و همکاران در پژوهش خود، شش جنس از باکتری‌های گرم منفی و سه جنس از باکتری‌های گرم مثبت ساکن خاک را شناسایی کردند که قادر به مقاومت بالایی در برابر فلز کروم و انواعی از آنتی‌بیوتیک‌های رایج بودند. در این پژوهش اشاره شده بود باکتری‌های گرم منفی به‌دلیل داشتن غشای خارجی و بار منفی سطحی LPS در مقایسه با باکتری‌های گرم مثبت با وجود کروی‌بودن و داشتن پپتیدوگلیکان چندین لایه در دیوارة سلولی و حتی حضور تیکوئیک‌اسید در دیوارة سلولی مقاومت کمتری در برابر فلز کروم نشان دادند (25). در پژوهش حاضر نیز تمامی جنس‌های شناسایی‌شدة مقاوم به فلز کروم متعلق به جنس‌های متفاوت باسیلوس‌ها بودند که مقاومت بیشتری را در برابر فلز سنگین کروم نشان دادند. از دیدگاه ریخت‌شناسی بیشتر باکتری‌های جداسازی‌شدة مقاوم به کروم از دو پساب بررسی‌شده در این پژوهش، باکتری‌های میله‌ای شکل و گرم مثبت بودند که مانند پژوهش ویتی و همکاران در سال 2015 به‌دلیل گرم مثبت بودن و بالابودن نسبت سطح به حجم در باکتری‌های میله‌ای نسبت به کروی از مقاومت بیشتری برخوردارند. درنهایت با توجه به اینکه باکتری باسیلوس سوبتی‌لیس (H1F) بیشترین مقاومت و بیشترین میزان جذب کروم را در مقایسه با دو باکتری دیگر از خود نشان داده است، این باکتری می‌تواند کاندید مناسبی برای حذف زیستی کروم پس از ارزیابی سایر ژن‌های مقاومت در برابر آنتی‌بیوتیک‌ها، حشره‌کش‌ها و سموم دفع آفات نباتی از پساب‌های آلوده باشد.

 

سپاسگزاری

این مقاله براساس نتایج به‌دست‌آمده از پایان‌نامة کارشناسی ارشد رشتة میکروبیولوژی با کد 17230554962001 دانشکدة علوم زیستی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان تدوین شد. نویسندگان این مقاله از مسئولان محترم دانشکدة علوم زیستی و آزمایشگاه تحقیقاتی این دانشگاه به‌منظور حمایت‌های اجرایی کمال تشکر و امتنان را دارند.



[1]- Biochemical oxygen demand

[2]- Chemical oxygen demand

[3]- Minimum inhibitory concentration

[4]- Minimum bactericidal concentration

[5]- Excel

[6] -Mega

[7]- BLAST

[viii]- Zolfaghari et al

[ix]- Krishna et al

[x]- Zhang et al

[xi]- Pseudomonas putida

[xii]- Viti et al

[xiii]- Corynebacterium sp.

[xiv]- Nieto

[xv]- Bacillus sp.S29

[xvi]- Staphylococcus sp.

[xvii]- B. subtilis

[xviii]- Spatel et al

[xix]- Pseudomonas fragi.

[xx]- Jafari Saleh et al.

(1) Ganguli A, Tripathi AK. Bioremediation of toxic chromium electroplating effluent by chromate reducing Pseudomonas aeruginosa A2 in two bioreactors. Applied Microbiology and Biotechnology. 2009; 58: 416-417.
(2) Srivastava S, Thakur IS. Evaluation of bioremediation and detoxification potentiality of Aspergillus niger for removal of hexavalent chromium in soil Microcosm. Soil Biology and Biochemistry. 2016; 38 (7): 1904-11.
 
(3) Kinamari M, Chirayu D, Drishna P. Chromate reduction by Vogocuccus sp. isolated from Cr (VI) contaminated industrial effluent. Electronic Journal of Biology. 2010; 6: 6-12.
(4) Viamajala S, Peyton BM, Sani RK, Apel WA, Peterson JN. Toxic effects of chromium (vi) on anaerobic and aerobic growth of Shewanella oneidensis MR. Biotechnology Progress. 2014; 20: 87-95.
(5) Nishioka H. Mutagenic activities of metal compounds in bacteria. Mutation Research. 2015; 3: 185-189.
(6) Venitt S, Levy LS. Mutagenicity of chromates in bacteria and its relevance to chromate carcinogenis. Nature. 2016; 250: 493-495.
(7) Ramteke PW. Biosorption of nickel (ii) by Pseudomonas stutzeri. Journal of Environmental Biology. 2000; 21: 219-231.
(8) Ghane M. Isolation and identification of chromium-resistant bacteria in order to clean contaminated wastewater. Iran Journal of Environmental Geology. 2012; 6 (19): 31-39
(9) Kinamari M., Chirayu D., Drishna P. Chromate reduction by Vogocuccus sp. isolated from Cr (VI) contaminated industrial effluent. Electronic Journal of Biology. 2010; 6: 6-12.
(10)           Apha, American public Health Association: Standard methods for the examination for water and wastewater. 20th ed. Washington: AWWA, WPCF; 1998.
(11)           Salehi M, Akhtari M, Akhavan Sepahi A. Evaluation of resistance to heavy metals of zinc sulfate and cadmium sulphate in Escherichia coli strain isolated from surface waters of Tehran city using seial dilution method in pipe. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal. 2017; 20 (7): 85-89
(12)           Ghandehari F, Ghiasian M. Atlas of medical bacteriology and diagnostic tables of bacteria. 2nd ed. Isfahan: Kankash Publications; 112 pages; 2007.
(13)           Tsai PJ, Tsai TH, Ho SC. In vitro inhibitory effects of rosemary extracts on growth and glucosyltransferase activity of Streptococcus sobrinus. Food Chemistry. 2007; 105 (1): 311-6.
(14)           Sajadian M, Doudi M, Shirmardi M. Isolation and molecular identification of lead (pb) resistant bacteria from oil-contaminated soils area c-branch masjedsoleyman. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal. 2018; 30 (8): 71-78.
(15)           Cappuccino JG, Sherman N. 1996. Microbiology, A Laboratory Manual. 4th Ed. California: The Benjamin-Cumming Publishing Company, Menlopark, 186 p.
(16)           Anyanwu CU, Nwachukwu ON. Heavy metal resistance in bacteria isolated from contaminated and uncontaminated soils. International Journal of Research in Chemistry and Environment 2011; 1: 171-173
(17)           Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. Journal Bacteriolgy. 1991; 173 (2): 697–703. 
(18)           Kepahi M, Sachdeva A. Bioremediation options for heavy metal pollution. Journal of Health and Pollution. 2019; 9(24): 1-20.
(19)           Kinamari M, Chirayu D, Drishna P. Chromate reduction by Vogocuccus sp. isolated from Cr (VI) contaminated industrial effluent. Electronic Journal of Biology. 2010; 6: 6-12.
(20)           Zolfaghari M, Soleymani Darjagh M, Masodikhah M, Motlagh M, Heydarpoor A. Prevalence and antimicrobial resistance of chromium-bearing microorganisms in industrial wastewaters of Qom. Medical Science of Qom University. 2012; 6: 15- 23.
(21)           Krishna MP, Varghese R, Babu AV, Mohamedhatha AA. Bioaccumulation of Cr and Cu by Pseudomonas sp. Isolated from Metal Polluted Industrial Region. Environmental Research Engineering and Management. 2012; 3 (61): 58-64.
(22)            Tahmors Pour A, Kasra Kermanshahi R. Determination of adaptation to heavy metals in bacteria resistant to industrial effluents. Water and Wastewater Journal. 2005: 61: 53-59.
(23)           Meybodi SM, Khorasani H. Bioremediation of chromium by Pseudomonas strain isolated from oil contaminated soils of Khuzestan. Journal of Microbiological Biology. 2014: 4 (14): 101-110.
(24)           Zhang K, Li F. Isolation and characterization of a chromium-resistant bacterium Serratia sp. Cr-10 from a chromate-contaminated site. Applied Microbiology and Biotechnology. 2015; 90 (3): 1163-9.
(25)           Viti C. Response of Microbial communities to different doses of chromate in soil Microorganism. Applied Soil Ecology. 2015; 34: 125-139.
(26)           Nieto JJ, Fernandes-Castillo R, Marquez MC, Ventoza A, Quesada E, Ruiz- Berraquero F. Survey of metal tolerance in moderately halophilic eubacteria.Applied and Environmental Microbiology. 1989; 55: 2385-2390.
(27)           Spatel J, Cpatel P, Kalia K. Isolation and characterization of nickel uptak by nickel resistant bacterial isolate .Biomedical and Environmental Sciences. 2010; 19: 297-301.
(28)           Jafari Saleh A, Shahnani A, Bagherizadeh A, Arzani Birgani P, Shirali M, Abdoli Sanjani M. Isolation and Chromium-Strong Bacteria from Soltan Abad River Shiraz. Hozan Journal Scientific Environment. 2018; 3 (2): 20-1.
(29)           Jensen GB, Hansen BM, Eilenberg J, Mahillon J. The hidden life styles of Bacillus cereus and relatives. Environmental Microbiology. 2003; 5 (8): 631-640.