بررسی اثر ضدمیکروبی ترکیب پردة آمونیوتیک، Arnebia euchroma، روغن کنجد و موم زنبورعسل بر باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی در زخم‌های سوختگی درجه دو

مقدمه

ایجاد مقاومت دارویی عارضه‌ای تهدیدکننده در استفادة گسترده از آنتی‌بیوتیک‌ها در سراسر جهان است؛ به‌طوری‌که افزایش سویه‌ها‌ی مختلف باکتریایی مقاوم به آنتی‌بیوتیک‌ها‌، به یکی از نگرانی‌ها‌ی اصلی سازمان بهداشت جهانی تبدیل شده است (1). کشف خواص ضدمیکروبی مواد طبیعی و ترکیبات گیاهی در سال‌های اخیر، پژوهشگران را به‌سمت یافتن راهکاری برای جایگزین‌کردن آنها به‌جای آنتی‌بیوتیک‌ها سوق داده است (2).

یکی از بافت‌های طبیعی مطرح در این زمینه، پردة آمنیون است. پردة آمنیون مانند غشایی پایه عمل می‌کند و در کنار نقش‌های متعدد در رشد و تکامل جنین، با به کار بردن چندین سازوکار، باعث بهبود ضایعات اپیتلیومی می‌شود. از ویژگی‌های پردة آمنیوتیک می‌توان به مواردی ازقبیل غنی‌بودن از فاکتور‌های رشد و سایتوکین‌هایی که منجر به اپیتلیال‌سازی می‌شود، خواص ضدمیکروبی و ویروسی، کاهش عفونت و درد در موضع زخم و خاصیت ضدالتهاب برای ممانعت از تشکیل اسکار به‌دنبال ترمیم زخم اشاره کرد. این پرده مهاجرت، چسبندگی و تمایز یاخته‌های اپیتلیومی را تحریک و آپوپتوز این سلول‌ها را مهار می‌کند. در بیشتر نقاط جهان گیاهان دارویی، درمان‌های پذیرفته‌شده برای بسیاری از بیماری‌ها ازجمله بیماری‌های عفونی محسوب می‌شوند (3).

برخی از گیاهان دارویی افزایش‌دهندة سرعت پروسة درمانی زخم بوده‌اند و برخی دیگر به‌علت داشتن خاصیت آنتی‌میکروبی تأثیر چشمگیری در درمان زخم دارند (4). یکی ازگیاهان سنتی استفاده‌شده در درمان زخم سوختگی، گیاه Arnebia euchroma، ابوخلسا یا هواچوبه است. مطالعات نشان داده‌اند ریشة گونه‌‌های متعلق به خانوادة گیاه گل گاوزبان ازجمله گیاه ابوخلسا، غنی از شیکونین^[1] و نفتاکینون^[2] است (5). این مواد و مشتقات آلکانین^[3] آنها دارای طیف وسیعی از توانایی‌های زیستی ازجمله ترمیم زخم (6) و ضدالتهابی (7) هستند.

گیاه کنجد که برای نخستین‌بار در آفریقا کشت داده شد، مقادیر زیادی لیگنان با فعالیت آنتی‌اکسیدانی دارد؛ همچنین، کلروسسامون که از ریشة این گیاه گرفته می‌شود، فعالیت ضدقارچی نشان داده است (8). مطالعات اخیر نشان‌دهندة فعالیت ضدمیکروبی روغن کنجد علیه باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی ازجمله سالمونلا تایفی و استرپتوکوکوس موتانس بوده‌اند (9).

در سالیان اخیر، فعالیت ضدمیکروبی محصولات موم زنبورعسل شایان توجه قرار گرفته است. مطالعات نشان‌دهندة تأثیر ضدباکتریایی موم خام زنبور علیه چندین سویة باکتریایی و کاندیدا البیکنس بود (10).

با توجه به اینکه هزینة درمان زخم سوختگی بالاست و درمان‌های معمول آن، عوارض جانبی بسیاری برای بیماران دارد، رویکرد فعلی محققان طب سنتی استفاده از مواد و مخلوط‌های طبیعی کم‌هزینه و بدون عوارض جانبی برای بیماران مبتلا به سوختگی است (11, 12). هدف از انجام مطالعة حاضر، ارزیابی تأثیر ضماد تولیدشده از ترکیب عصاره پردة آمنیوتیک، عصارة گیاه ابوالخسا، روغن کنجد و موم زنبورعسل، بر حذف عفونت‌های باکتریایی در زخم‌های سوختگی و تسریع فرایند التیام زخم بوده است.

مواد و روش‌ها

تهیة استوک گیاهی و ارزیابی بار میکروبی آن: پس از خالص و پاکسازی گیاه A.euchroma به‌صورت دستی با الک مخصوص و شستشوی کامل با آب جوشیده و سردشده تا دمای 27-25 درجه سانتی‌گراد، گیاه در دمای محیط در شرایط بدون نور خشک شد. سپس خشک‌شدة گیاه با آسیاب مخصوص، پودر و با روغن کنجد در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 73 ساعت بدون نور در تانک مخصوص مخلوط شد. پس از عبور مخلوط از صافی مخصوص، با موم زنبورعسل در دمای 45-40 درجه سانتی‌گراد به مدت 8 ساعت مخلوط شد. این ترکیب نیمه‌جامد در مقدار معینی حلال حل شد. براساس میزان حلالیت کمترین غلظت حل‌شده 1 به 10، برآورد و غلظت محلول استوک برابر با یک دهم تعیین شد. مقدار 100 میکرولیتر از محلول استوک در محیط‌های بلاد آگار و همچنین در مک کانکی کشت داده و به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد انکوباسیون انجام شد تا ازنظر آلودگی باکتریایی بررسی شود. بعد از 48 ساعت کشت‌ها بررسی شدند؛ هر دو پلیت عاری از رشد بودند و استریل‌بودن محلول استوک تأیید شد.

تهیة پردة آمنیوتیک: به‌منظور جلوگیری از انتقال آلودگی زایمان، جمع‌آوری بافت آمنیون از موارد سزارین‌شده انجام شد. انتخاب مورد با نظارت پزشک متخصص و با معاینة دقیق و رد سوابق رفتارهای پرخطر جنسی، استفاده از مواد تزریقی، خالکوبی، تزریق خون و بدخیمی انتخاب شد. پس از شرح روند انجام کار برای شخص مشارکت‌کننده، فرم رضایت‌نامة کتبی در اختیار او قرار گرفت. همچنین، نمونة خون بیمار برای ارزیابی سرولوژی گرفته شد. پس از 6 ماه، دوباره آزمایش‌های سرولوژی برای بیمار صورت گرفت تا از عدم هرگونه بیماری و عفونت اطمینان حاصل شود. سوپرناتانت این پرده برای بررسی‌‌های MIC طبق مطالعات پیشین آماده شد (13, 14). به‌طور خلاصه، بافت‌ها با فسفات بافر سالین (PBS) سه بار شسته شدند تا هرگونه لختة خون شسته شود. سپس بافت‌ها به تکه‌های ریزی، تقسیم و با نیتروژن مایع منجد شدند. پس از آن، با استفاده از هاون بافت‌ها به تکه‌های ریزی پودر شدند. تکه‌های غشا با نسبت 1:1 با فسفات بافر سالین، میکس و به مدت یک ساعت روی یخ هموژنیزه شدند. سوپرناتانت‌ها با فیلتر 22/0 میکرومتری استریل شدند. این ترکیب برای مصارف بعدی در دمای منفی 80 درجه سانتی‌گراد ذخیره شد.

تهیة ضماد و استعمال آن روی زخم سوختگی ایجادشده: پودر گیاه Arnebia euchroma با روغن کنجد، موم زنبورعسل و بافت آمنیوتیک مخلوط شد. اثر ضدمیکروبی ترکیب گیاهی Arnebia euchroma به روش دیسک دیفیوژن و آگار دیفیوژن، بررسی و حداقل غلظت مهاری رشد (^[4]MIC) ترکیب گیاهی Arnebia euchroma با روش براث میکرودایلوشن تعیین شد. به‌منظور آماده‌سازی مدل موشی سوختگی، از روش سوختگی سکه‌ای روی موش مدل سوری Mus musculus استفاده شد. در این روش پس از برداشتن موی حیوان، ازطریق تماس میله‌ای با سطح مقطع برابر با مساحت یک سکة 50 ریالی (heated brass bar (10×10×100 mm))، به مدت 45 ثانیه با پوست برهنه‌شدة حیوان، سوختگی درجه دوم ایجاد شد. ترکیب تولیدشده در مراحل قبل به‌صورت کرم موضعی در محل زخم سوختگی به مدت 8 روز، به قرار هر دو روز یک بار به میزان 5 گرم استفاده شد. همچنین به‌منظور تسکین درد، شربت مسکن استامینوفن به موش‌ها خورانده شد. بعد از گذشت 8 روز یک سانتی‌متر مربع از پوست حیوان به همراه ترشحات پوستی، جداسازی و پس از هموژنیزاسیون، در محیط‌های بلاد آگار و مک کانکی کشت شد. تعداد باکتری‌های گرم منفی E.coli، سودوموناس ائروژینوزا و اسینتوباکتر بومانی^[5] و باکتری گرم مثبت استافیلوکوک اوئوس با 200 میکرولیتر از کشت باکتری در رقت‌های ^4-10، ^5-10، ^6-10، ^7-10 و ^8-10 شمارش شدند. برای هریک از باکتری‌های مذکور یک موش در گروه مورد و یک موش در گروه شاهد بررسی شد.

نتایج

در شکل 1 ایجاد سوختگی درجه دوم در موش‌های بررسی‌شده، تصویر زخم پس از استفاده از عصارة گیاه ابوالخسا در موش مورد و نیز تصویر زخم در موش شاهد نشان داده شده‌اند. همان‌طور که مشاهده می‌شود، التیام زخم در موش تحت تیمار با ضماد تولیدشده، کمتر از موش شاهد است.

همچنین، تعداد باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی شمارش‌شده در رقت‌های مختلف نمونه‌برداری از محل زخم موش‌های مورد و شاهد، در جدول 1 ارائه شده است. با توجه به جدول، تعداد باکتری‌های سودوموناس ائروژینوزا، استافیلوکوک اورئوس و اسینتوباکتر بومانی در رقت‌های ^4-10 و ^5-10 به قدری در نمونة برداشت‌‌شده و محیط کشت آن زیاد است که قابلیت شمارش ندارد. تعداد باکتری E.coli در رقت‌های ^4-10 و ^5-10 در گروه شاهد شمارش‌ناپذیر بود و در گروه مورد که تیمارِ ضماد شده بودند، کمتر و شمارش‌پذیر بوده است. در غلظت‌های ^6-10، ^7-10 و ^8-10 نیز تعداد باکتری‌های E.coli در نمونه‌های تحت تیمار بسیار کمتر از نمونه‌های شاهد شمارش شده است. در غلظت‌های مذکور، تعداد باکتری‌های سودوموناس ائروژینوزا، استافیلوکوک اورئوس و اسینتوباکتر بومانی نیز در گروه تحت تیمار کمتر از گروه شاهد بوده است.

شکل 1- تصاویر موش‌ها پس از انجام سوختگی و استعمال سوسپانسیون باکتریایی (الف)، پس از برداشتن پوست و نمونة زخم در موش کنترل (ب) و مورد (ج)

در شکل 2 نمودار میله‌ای شمار باکتری‌ها نشان داده شده است. همان‌طور که مشاهده می‌شود، تعداد باکتری‌های شمارش‌پذیر در گروه شاهد بیشتر از گروه تحت تیمار است. در مجموع، این یافته‌ها بیان می‌کنند ضماد تولیدشده از ترکیب عصارة پردة آمنیون، عصارة گیاه ابوالخسا، موم زنبورعسل و روغن کنجد، قادر به کاهش عفونت باکتری‌های سودوموناس ائروژینوزا، استافیلوکوک اورئوس و اسینتوباکتر بومانی و به میزان چشمگیرتر عفونت E.coli است.

جدول 1- شمارش تعداد سلول‌های پاتوژن در موش‌های مورد و شاهد در درمان با عصارة گیاه Arnebia euchroma

شکل 2- شمار سلول‌های باکتریایی در موش‌های آلوده‌شده با اشرشیاکلی (A)، سودوموناس ائروژینوزا (B)، استافیلوکوکوس اورئوس (C)، اسینتوباکتر بومانی (D). در هر مورد، شمارش تعداد سلول‌های پاتوژن در موش‌هایی که درمان دارویی با عصارة پردة آمنیون و عصارة گیاه Arnebia euchroma را دریافت کرده یا دریافت نکرده‌اند، به‌ترتیب به‌عنوان موش‌های مورد و شاهد نشان داده شده است.

بحث و نتیجه‌گیری

با توجه به اهمیت درمان زخم‌های سوختگی و مهار عفونت‌های مرتبط با آن، شناسایی داروهایی ضروری به نظر می‌رسد که در التیام زخم مؤثرند و بدون ایجاد مقاومت دارویی و با کمترین عوارض قادر به کنترل عفونت‌اند (15). در این بین، داروهایی که اساس ساختاری آنها شیمیایی نیست و از طبیعت استخراج شده‌اند، علاوه بر مقرون‌به‌صرفه بودن، خطرات احتمالی و عوارض جانبی کمتری نیز دارند (16). طبق نظر براون^[vi] و همکارانش، مداخله‌ای ارزشمند است که زمان التیام زخم را حتی به تعداد 2 روز کاهش دهد؛ زیرا بستری طولانی‌مدت بیماران سوختگی، به افزایش عفونت، جای زخم و هزینه منجر می‌شود (17). در مطالعة حاضر سعی شد خواص ضدمیکروبی ضماد تهیه‌شده از ترکیب مواد طبیعی مانند روغن کنجد، موم زنبورعسل، پردة آمنیون و عصارة گیاه Arnebia euchroma در التیام زخم‌های درجه دوم سوختگی بررسی شود. اثرات پردة آمنیون و عصارة گیاه ابوالخسا در درمان زخم‌های سوختگی در مطالعات گذشته به اثبات رسیده‌اند؛ اما در مطالعة حاضر برای نخستین‌بار ترکیب این چهار مادة طبیعی در کاهش عفونت زخم‌های سوختگی بررسی شده است. نتایج مطالعه نشان می‌دهند تعداد میکروب‌های تکثیریافته، پس از مالیدن 200 میکرولیتر از غلظت‌های مختلف باکتری‌های E.coli، استافیلوکوک اورئوس، سودوموناس ائروژینوزا و اسینتوباکتر بومانی، در موش‌هایی کاهش یافته است که ضماد مذکور را دریافت کرده‌اند؛ به‌طوری‌که میزان تکثیر باکتری E.coli در موش‌های دریافت‌کنندة ضماد مذکور کاهش چشمگیری یافت. کاهش تعداد باکتری‌های سودوموناس ائروژینوزا، استافیلوکوک اورئوس و اسینتوباکتر بومانی نیز مشاهده‌پذیر بوده است؛ این نتیجه با مطالعات سایر محققان کشور همخوانی دارد.

پردة آمنیوتیک تأثیر زیادی در انواع متفاوتی از درمان‌ها ازجمله درمان زخم‌ها نشان داده است. در مطالعة لئوفلبین^[vii] و همکارانش، پتانسیل ترمیم‌کنندگی زخم در کارآزمایی‌های آزمایشگاهی و بالینی به اثبات رسیده است (18). در مطالعات دیگر نیز تأثیر بافت پردة آمنیون در جلوگیری از عفونت زخم‌های دیابتی و ترمیم ناحیة زخم، به‌علت داشتن سایتوکاین‌ها، عوامل رشد و سلول‌های بنیادی به اثبات رسیده است (19). تأثیر ترمیمی این بافت در زخم‌های سوختگی نیز طی مطالعات متعدد به اثبات رسیده است (20, 21). همچنین، مطالعات زیادی دربارة اثبات ویژگی‌های ضدمیکروبی و ویژگی‌های احتمالی ضدویروسی پرده‌های جنینی انجام شده است که نشان می‌دهند پرده‌های جنینی به‌دلیل داشتن موادی مانند بتا دفنسین‌های انسانی، الافین و مهارکنندة پروتئازی لوکوسیت ترشحی در لایة اپی‌تلیالی خود، ویژگی‌های ضدمیکروبی دارند. وجود سیستاتین E، آنالوگ مهارکنندة سیستئین پروتئاز، اثرات ضدویروسی احتمالی به این غشا می‌بخشد (22). این بافت با مهار تولید گیرنده‌های TGFᵦ در سطح فیبروبلاست‌ها، تشکیل اسکار و بافت فیبروزه توسط TGFᵦ را مهار می‌کند (23, 24).

سابقة استفاده از گیاهان دارویی برای تهیة داروهای مختلف، به بیش از چندین هزار سال می‌رسد. در مطالعات متعدد، اثر گیاهان دارویی در درمان انواع بیماری‌ها بررسی شده است (3)؛ ازجمله این موارد گیاهانی‌اند که با استخراج روغن یا عصاره در درمان زخم‌ها و کنترل عفونت‌های مرتبط با زخم استفاده می‌شوند (4).

در مطالعات متعدد در کشور ایران، تأثیر عصارة گیاه ابوالخسا بر زخم‌های سوختگی حاصل از لیزر (25)، زخم‌های سوختگی موش (16, 26)، زخم‌های درجه دوم و سوم (27) و نیز تأثیر آن بر تکثیر فیبروبلاست‌ها، رگ‌زایی و تولید کلاژن در آسیب‌های پوستی بررسی شده است (28). در بررسی انجام‌شده در ایتالیا مشخص شد افزودن محلول اتانول و استون به مخلوط 7 گیاه از شاخة گیاه گل گاوزبان باعث افزایش خاصیت میکروب‌کشی این مخلوط می‌شود (16). در بررسی دیگری در اردن، مشخص شد این گیاهان در کاهش ایجاد مقاوت نسبت به آنتی‌بیوتیک‌ها مؤثرند (29). نصیری و همکارانش در سال 2016 در مطالعه‌ای روی بیماران مبتلا به سوختگی، نشان دادند استفاده از پماد گیاه Arnebia euchroma، باعث التیام زودتر زخم‌های سوختگی درجه دو و کاهش التهاب و عفونت زخم‌ها می‌شود، همچنین شدت درد و سوزش در بیماران دریافت‌کنندة این پماد کاهش یافته است (15). گفتنی است در این مطالعه عوارض جانبی این پماد در برابر داروی شیمیایی سولفادیازین نقره کمتر گزارش شده است (26, 30). محققان مختلف خواص زیاد ترکیبات فعال ریشة A.euchroma را در مطالعات متعدد تأیید کرده‌اند. مشتقات نافتوکوئینون^[viii] مانند آلکانین^[ix]، آلکانان^[x]، شیکونین‌ها^[xi] و آرنبین-2^[xii]، از ترکیبات فراوان در ریشه‌های Arnebia هستند. مطالعات قبلی نشان داده‌اند A.euchroma سرشار از نافتوکوئینون‌ها، هیدروکسیناپتوکوئینون^[xiii]، اسیدهای فنولیک و آلکالوئیدها است (29, 31). مشتقات نافتوکوئینون استخراج‌شده از A.euchroma، دارای خواص ضدالتهابی و ضدعفونی‌کنندگی زخم‌اند (32). شیکونین به‌عنوان یک مشتق 1و4-نافتوکوئینون، در برابر استافیلوکوکوس اورئوس و انتروکوک^[xiv] مقاوم به متی‌سیلین فعالیت دارد (6). این ترکیب سال‌هاست در طب سنتی برای درمان زخم‌ها و بیماری‌های پوستی و ضدعفونی‌کردن آنها استفاده می‌شود (25).

در مطالعة چوبکار و همکارانش، از موم زنبورعسل به‌منظور درمان زخم‌های پوستی در آبزیان استفاده شد. در این مطالعه غلظت‌های مختلف موم زنبورعسل بر میزان ترمیم زخم و نیز پاسخ ایمنی ارزیابی شد. نتایج نشان دادند در مقایسه با گروه شاهد، استفاده از موم زنبورعسل در غلظت 2 درصد تأثیر معنی‌داری در روند ترمیم زخم پوستی و تحریک سیستم ایمنی در ماهی کپور پرورشی داشت (33). در مطالعات متعدد دیگری اثر موم زنبورعسل بر زخم آبزیان (34) و نیز لیشمانیوز پوستی در مدل حیوانی ارزیابی شده‌اند (35, 36). نتایج تمامی این مطالعات اثر نویدبخش موم زنبورعسل در التیام انواع زخم را نشان داده و در تناسب با یافته‌های مطالعة حاضر است.

در مطالعات متعدد، تأثیر روغن کنجد بر زخم‌های سوختگی ارزیابی شده است. یافته‌های این پژوهش‌ها نشان‌دهندة اثرگذاری این روغن به‌صورت مستقل یا در ترکیب با سایر مواد طبیعی روی زخم‌های سوختگی بوده است (37-39). یافته‌های این مطالعات با یافته‌های پژوهش حاضر همخوانی و انطباق دارند.

در مجموع، اظهارنظر قطعی در رابطه با استفاده از ضماد تولیدشده از عصارة پردة آمنیوتیک، عصارة گیاه ابوالخسا، موم زنبورعسل و روغن کنجد، در درمان زخم‌های سوختگی نیاز به مطالعات وسیع‌تر و تأییدکننده دارد؛ اما به نظر می‌رسد پتانسیل‌های این ضماد در درمان زخم ازجمله زخم‌های سوختگی و کاهش عفونت زخم‌ها، نویدبخش و مژده‌دهندة ایجاد درمانی با عوارض جانبی کم، ارزان و ساده است.

[1]- Shikonin

[2]- Naphthoquinone

[3]- Alkanin

^[4]- Minimal inhibitory concentrations

[5]- Acinetobacter baumannii

[vi]- Brown

[vii]- Loeffelbein

[viii]- Naphthoquinone

[ix]- Alkannin

[x]- alkannan

[xi]- shikonins

[xii]- arnebin-2

[xiii]- hydroxynaphthoquinone

[xiv]- Enterococcus