نوع مقاله : پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری گروه بیماری‌شناسی گیاهی، دانشکدۀ کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه زابل، ایران

2 دانشیار گروه بیماری‌شناسی گیاهی، دانشکدۀ کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه زابل، ایران

3 استادیار گروه تولیدات گیاهی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه گنبد کاووس، ایران

10.22108/bjm.2020.124212.1315

چکیده

مقدمه: قارچ‌های مختلف اندوفیت در بافت‌های گیاهی وجود دارند که منابع ارزشمندی برای رشد گیاهان هستند. این اندوفیت‌ها یک منبع بیولوژیکی غنی را برای کشف محصولات طبیعی جدید تشکیل می‌دهند. همچنین، قارچ‌های اندوفیت به‌عنوان منابع مفید متابولیت‌های ثانویة فعال زیستی ازجمله آنتی‌بیوتیک‌ها، آنتی‌اکسیدان‌ها و ترکیبات ضدسرطان شناخته شده‌اند. این مطالعه به‌منظور ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی و خواص فیتوشیمیایی عصارة اتیل‌استات قارچ‌های اندوفیت از گیاه فندق انجام شد.
مواد و روش‏‏ها: ابتدا قارچ‌های اندوفیت با استفاده از تکنیک‌های استاندارد استریلیزاسیون سطحی از گیاه فندقجداسازی شدند. عصارة اتیل‌استات قارچ‌ها برای حضور ترکیبات فیتوشیمیایی کیفی و فعالیت آنتی‌اکسیدانی غربال شدند. برای این منظور، از مهار رادیکال آزاد DPPH برای ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی استفاده شد.
نتایج: در مجموع، 791 ایزوله متعلق به 24 گونه از بافت ساقه، برگ و ریشه جدا شد. شناسایی قارچ‌های اندوفیت با استفاده از هر دو ویژگی مورفولوژیکی و تجزیه و تحلیل توالی ITS انجام شد. همه توالی‌ها در بانک داده‌های ژنی NCBI ثبت شدند. تجزیه و تحلیل کیفی ترکیبات فیتوشیمیایی، نتایج مثبت برای فلاونوئید، آلکالوئید، تانن، فنول، استروئید، ترپنوئید، دی‌ترپن، فلاونن، کوئینون و کومارین در بیشتر قارچ‌ها نشان دادند. گونه‌هایParaphaeosphaeria sporulosa ، Cladosporium herbarum، Alternaria alternata، Nothophoma quercina ، Fusarium equiseti، Pleosporales sp.، Neocucurbitaria unguis، Penicillium citrinum،Fusarium sp.، Fusarium fujikuroi، Epicoccum nigrum، Gnomoniopsis idaeicola، Cladosporium sphaerospermum، Bjerkandera adusta، Angustimassarina sp.،Exophiala sp. و Talaromyces amestolkiae بالاترین فعالیت آنتی‌اکسیدانی از 50 تا 97 درصد نشان دادند.
بحث و نتیجه‏گیری: روش مهار رادیکال آزاد DPPH یک مدل آزمایشگاهی مناسب است که به‌طور گسترده برای ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی در مدت زمان کوتاه استفاده می‌شود. نتایج این مطالعه نشان می‌دهند متابولیت‌های تولیدشده توسط قارچ‌های اندوفیت جداشده از گیاه فندقرا می‌توان به‌عنوان منبع بالقوة آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی به کار برد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Study of Antioxidant Activity and Phytochemical analysis of Endophytic Fungi Extracts from Hazel (Corylus avellana L.) plant

نویسندگان [English]

  • Arezoo Kashanian 1
  • Naser Panjekeh 2
  • Fakhtak Taliei 3

1 Departement of Plant Pathology, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Zabol University, Iran

2 Departement of Plant Pathology, Faculty of Agriculture and Natural Resources, Zabol University, Iran

3 Departement of Plant Production, Faculty of Agricultere and Natural resources, Gonbad Kavous University, Iran

چکیده [English]

Diverse endophytic fungi exist within plant tissues that are valuable resources for plant growth promotion. These endophytes constitute a rich bio-resource to discover new natural products. Also, endophytic fungi have been recognized as useful sources of bioactive secondary metabolites including antibiotic, antioxidant and anticancer. This study to evaluate antioxidant activity and the phytochemical properties ethyl acetate extract of endophytic fungi from Corylus avellana L. plant.
First, endophytic fungi were isolated from C. avellana plant using standard surface sterilization techniques. Ethyl acetate extracts of fungi were screened for the presence of characteristics of qualitative phytochemicals compounds and antioxidant activity. For this purpose, DPPH free radical scavenging was used to evaluate the antioxidant activity. The presence of phytochemical compounds, flavonoids, alkaloids, tannin, phenol, steroid, terpenoid, diterpene, flavanones, quinone and cumarin was also assayed qualitatively.
In total, 791 isolates belonging to 24 species were isolated from the stem, leaf and root tissues. . All sequences were deposited in NCBI's GenBank Database. The qualitative analysis of phytochemical compounds showed positive results for flavonoids, alkaloids, tannin, phenols, steroids, terpenoids, diterpenes, flavanones, quinones and coumarins in most of the fungus. Species Paraphaeosphaeria sporulosa, Cladosporium herbarum, Alternaria alternate, Nothophoma quercina, Fusarium equiseti, Pleosporales sp., Neocucurbitaria unguis, Penicillium citrinum, Fusarium sp., Fusarium fujikuroi, Epicoccum nigrum, Gnomoniopsis idaeicola, Cladosporium sphaerospermum, Bjerkandera adusta, Angustimassarina sp., Exophiala sp., Talaromyces amestolkiae showed the highest antioxidant activity ranging from 50% to 97%.
Hazelnut plants have different fungal endophytes with several antioxidant activities. Phenoles and flavonoids were positive in all fungal extracts and are the most important phytochemical compounds in this study. Extracts with more phenoles and flavonoid contents produced more antioxidant activity. The results of this study represent that metabolites produced by endophytic fungi isolated from C. avellana plant may serve as a potential source of natural antioxidants.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Antioxidant
  • Endophytic Fungi
  • DPPH
  • Phytochemicals

مقدمه

رادیکال‌های آزاد، گونه‌های اکسیژن و نیتروژن واکنش‌پذیرند که با فرایندهای مختلف فیزیولوژیکی در بدن ایجاد می‌شوند. تولید کنترل‌نشدة رادیکال‌های آزاد منجر به حمله به لیپیدهای غشایی، پروتئین‌ها، آنزیم‌ها و DNA، استرس اکسیداتیو و درنهایت مرگ سلولی می‌شود (1). این گونه‌های اکسیژن واکنش‌پذیر ([1]ROS)، مسئول بسیاری از بیماری‌های تخریب‌کنندة انسانی مانند دیابت، سرطان، اختلالات عصبی، بیماری‌های آلزایمر، پارکینسون، التهابی و پیری است (2). در بدن انسان سیستم‌های مختلف آنزیمی برای اصلاح رادیکال آزاد وجود دارند؛ اما ریزمغذی‌ها مانند ویتامین E، بتاکاروتن و ویتامین C آنتی‌اکسیدان‌های اصلی‌اند. این مواد باید در رژیم غذایی تأمین شوند؛ زیرا بدن این مواد مغذی را نمی‌تواند تولید کند (3).

آنتی‌اکسیدان یک مولکول پایدار است که یک الکترون را به یک رادیکال آزاد درحال اکسایش اهدا می‌کند و واکنش زنجیره‌ای را قبل از آسیب‌دیدن مولکول‌های حیاتی خاتمه می‌دهد. خاصیت مهار رادیکال آزاد آنتی‌اکسیدان‌ها باعث تأخیر یا مهار آسیب‌های سلولی می‌شود (4). مواد مشتق‌شده از گیاهان به‌تازگی به‌دلیل کاربردهای چندمنظوره بسیار مورد توجه قرار گرفته است. انواع زیادی از گیاهان برای منبع جدید آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی مطالعه شده‌اند؛ به‌ویژه ترکیبات فنولی و فلاونوئید به‌دست‌آمده از گیاهان که به‌عنوان آنتی‌اکسیدان قوی و محافظ رادیکال آزاد شناخته شده‌اند (5).

فندق[2] متعلق به خانوادة بتولاسه[3] و جنس کوریلوس[4] است. این گیاه یکی از محصولات مهم آجیل جهان به‌ شمار می‌رود و بومی مناطق اروپایی و غربی قارة آسیا و شامل 25 گونه است (6). فندق در گذشته برای جنبه‌های تغذیه‌ای کشت می‌شد؛ اما اکنون به‌دلیل محتوای فیتوشیمیایی خود، شایان توجه قرار گرفته است (7). ثابت شده است فندق منبع غنی بسیاری از ترکیبات آلی به‌ویژه ترکیبات فنولی است (8). همچنین، فعالیت آنتی‌اکسیدانی و ترکیبات فنولی هستة مغز فندق و برخی از فرآورده‌های جانبی آن نیز بررسی شده‌اند (9).

طبق تحقیقات انجام‌شده، علاوه بر گیاهان، برخی از میکروارگانیسم‌ها نظیر قارچ‌ها و باکتری‌های اندوفیت نیز تولیدکنندة متابولیت‌های ثانویه‌اند؛ ازجمله آنتی‌اکسیدان‌ها و ترکیبات فیتوشیمیایی نظیر آلکالوئیدها، بنزوپرانون‌ها، بنزوکینون‌ها، فلاونوئیدها، گلیکوزیدها، استروئیدها، ساپونین‌ها، تانن‌ها و ترپنوئیدها، فنول، ترکیبات فنولی، فنیل پروپانوئیدها، تترالون‌ها، زانتان‌ها و سایر ترکیبات (10). قارچ‌های اندوفیت میکروب‌هایی‌اند که در بافت‌های زندة گیاهی زندگی می‌کنند؛ بدون اینکه صدمه‌ای جدی به میزبان خود وارد کنند (11). اندوفیت‌ها میکروارگانیسم‌های بسیار متنوعی‌اند و قادرند ترکیبات شیمیایی تولیدشده توسط گیاه میزبان را سنتز کنند. اندوفیت‌ها طیف وسیعی از مکانیسم‌ها را برای تسهیل رشد گیاهان به کار می‌برند؛ برای مثال، برخی از اندوفیت‌ها هورمون‌های گیاهی تولید می‌کنند، بنابراین بر رشد گیاه و تحمل آن در برابر تنش‌های زیستی و غیرزیستی تأثیر می‌گذارند (12). همچنین، میکروارگانیسم‌های اندوفیت، آنتی‌اکسیدان‌های گیاهان میزبان را به‌ویژه در شرایط تنش‌های غیرزیستی افزایش می‌دهند (13).

مطالعات متعددی روی پتانسیل‌های زیست‌محیطی و فعالیت‌های بیولوژیکی اندوفیت‌ها مانند اثرات ضدویروسی، ضدسرطان، ضددیابتی و ضدمیکروبی انجام شده‌اند (14)؛ اما گزارش‌های منتشرشده دربارة ظرفیت آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت بسیار اندک است. مطالعة حاضر با هدف جداسازی اندوفیت‌های مختلف از گیاه فندق و بررسی خواص آنتی‌اکسیدانی و ترکیبات فیتوشیمیایی مختلف در آنها انجام شد.

 

مواد و روش‌ها

.نمونه‌برداری و جداسازی قارچ‌های اندوفیت: نمونه‌های گیاهی فندق از گیاهان تازه و سالم از سه بافت برگ، ساقه و ریشه از شش استان (گلستان، مازندران، گیلان، اردبیل، زنجان و قزوین) با شرایط آب‌وهوایی متفاوت جمع‌آوری شدند. نمونه‌ها در پاکت‌های کاغذی سربسته به آزمایشگاه، منتقل و در دمای 4 درجة سانتی‌گراد تا تجزیه و تحلیل بیشتر نگهداری شدند. به‌منظور جداسازی اندوفیت‌ها از بافت‌های گیاهی، ضدعفونی سطحی به روش تان و همکاران[5] انجام شد (15). نمونه‌ها به‌طور کامل شسته شدند تا بقایا و آلودگی‌های سطحی حذف شوند. نمونه‌های گیاهی ابتدا در اتانول 70 درصد به مدت یک دقیقه، هیپوکلریت سدیم 3 درصد به مدت 2 تا 8 دقیقه (با توجه به نوع بافت) و اتانول 70 درصد به مدت یک دقیقه ضدعفونی سطحی شدند؛ درنهایت، چندین‌بار با آب مقطر سترون شستشو داده و روی کاغذ صافی سترون در زیر هود لامینار خشک شدند. نمونه‌های استریل‌شده به قطعات 5/0 تا 1 سانتی‌متری تقسیم شدند و به محیط غذایی سیب‌زمینی دکستروز آگار (PDA، مرک[6] آلمان) به همراه 50 میلی‌گرم در لیتر تتراسایکلین به‌منظورجلوگیری از رشد باکتری، منتقل و به مدت 2 تا 4 هفته در انکوباتور با دمای 2± 25 درجة سانتی‌گراد در شرایط تاریکی نگهداری شدند. قارچ‌های اندوفیت رشدکرده به تشتک‌های پتری جدید منتقل شدند و خالص‌سازی جدایه‌ها به روش نوک هیف انجام شد (16).

بررسیمولکولیجدایه‌ها: جدایه‌های قارچی در محیط کشت سیب‌زمینی دکستروز براث (PDB مرک آلمان) کشت داده شدند و پس از رشد قارچ‌ها و تشکیل توده‌های میسلیومی، استخراج DNA به روش ژانگ و همکاران[7] انجام شد (17). کمیت و کیفیت DNA استخراج‌شده با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز تعیین شد. برای شناسایی مولکولی از آغازگرهای عمومی ITS5-5.8SrRNA-ITS4 استفاده شد (جدول 1) (18). واکنش زنجیره پلیمراز با استفاده از دستگاه ترموسایکلر مدل Bio-Rad انجام شد. چرخة حرارتی برای تکثیر این نواحی ژنی شامل واسرشت‌سازی اولیه 94 درجة سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه در 40 سیکل، 94 درجه به مدت 30 ثانیه، 58 درجه به مدت 20 ثانیه، 72 درجه به مدت 40 ثانیه و سپس گسترش نهایی در دمای 72 درجة سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه انجام شد. محصول پی‌سی‌آر ([8]PCR) در ژل آگارز یک درصد تحت جریان الکتروفورز قرار گرفت و سپس برای شناسایی به روش توالی سنگر به مرکز ژنوم بالگاچ سوئیس[9] ارسال شد. توالی‌های حاصل ازطریق بلاست در سایت [10]NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) تجزیه و تحلیل شدند.

تهیه عصارة قارچی: به‌منظور تهیه عصارة قارچی ابتدا جدایه‌ها روی محیط کشت PDA کشت داده و به مدت یک هفته در دمای 25 درجة سانتی‌گراد نگهداری شدند. سپس از حاشیة پرگنه‌های درحال رشد جدایه‌ها، دیسک‌هایی در اندازة 5/0 × 5/0 سانتی‌متر تهیه شدند و به محیط کشت PDB، منتقل و به مدت 10 روز در دمای اتاق روی شیکر با سرعت 120 دور در دقیقه قرار داده شدند. به این ترتیب، 100 میلی‌لیتر حلال اتیل‌استات به کشت‌های مایع و توده‌های میسلیومی اضافه شد و به مدت 24 ساعت در دمای اتاق روی شیکر قرار داده و با دستگاه تبخیرکنندة چرخان در درجه حرارت 50 درجة سانتی‌گراد در شرایط خلأ تغلیظ شدند.

 

 

جدول 1- توالی آغازگرهای استفاده‌شده برای شناسایی جدایه‌های اندوفیت

منبع

توالی

جهت

نام آغازگر

18

5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

Forward

ITS4

18

5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'

Reverse

ITS5

 


بررسی فعالیت آنتی‌اکسیدانی به روش دیفنیلپیکریل هیدرازی[11] (DPPH): بررسی فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌ها با استفاده از رادیکال‌های پایدار DPPH به روش برند - ویلیامز و همکاران[12] (19) انجام گرفت. 1/0 میلی‌لیتر عصارة متانولی 5-10 × 6 مولار به 9/3 میلی‌لیتر محلول DPPH، اضافه و به مدت 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شد. سپس میزان جذب محلول در طول موج 515 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (Biochrom Libra S22) خوانده شد. درنهایت، میزان فعالیت مهار رادیکال ([13]RSA) DPPH توسط عصاره با فرمول زیر محاسبه شد:

 

در این رابطه، =Asمیزان جذب نمونه، =Ac میزان جذب شاهد و =RSA فعالیت مهارکنندگی رادیکال آزاد است.

تعیین مقدار فنول کل و فلاونوئید: محتوای فنول کل عصارة اتیل‌استات قارچ‌های اندوفیت با استفاده از روش مبتنی بر معرف فولین - سیوکالتیو[14] اندازه‌گیری شد (20). عصارة هر قارچ در متانول (1 میلی‌گرم در میلی‌لیتر) حل و 500 میکرولیتر از محلول (50 درصد) واکنشگر فولین –سیوکالتیو و سپس 5/1 میلی‌لیتر سدیم‌کربنات 20 درصد اضافه شد. مخلوط حاصل با افزودن آب مقطر در حجم نهایی 5 میلی‌لیتر، ساخته و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شد. سپس جذب نمونه‌ها در طول موج 760 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر فرابنفش مرئی (Biochrom Libra S22) قرائت شد. مقادیر فنول کل عصاره‌ها با استفاده از منحنی استاندارد براساس میلی‌گرم گالیک‌اسید در گرم عصاره اندازه‌گیری شدند (21).

به‌منظور سنجش میزان محتوای فلاونوئید هر عصاره از روش رنگ‌سنجی کلرید آلومینیوم استفاده شد (22). 250 میکرولیتر از هر عصاره به‌طور جداگانه با 25/1 میلی‌لیتر آب مقطر و 75 میکرولیتر سدیم‌نیتریت 5 درصد ترکیب شد. سپس بعد از 5 دقیقه 150 میکرولیتر محلول کلرید آلومینیوم 10 درصد اضافه شد؛ درنهایت بعد از 6 دقیقه، 500 میکرولیتر سدیم‌هیدروکسید و 275 میکرولیتر آب مقطر، اضافه و به مدت 30 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. شدت رنگ صورتی مخلوط حاصل در طول موج 510 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر فرابنفش مرئی قرائت شد. محتویات فلاونوئید براساس منحنی کالیبراسیون کوئرستین، محاسبه و نتایج به‌صورت میلی‌گرم معادل کوئرستین در گرم عصاره بیان شدند.

 

.غربالگری فیتوشیمیایی کیفی عصاره‌های قارچی: به‌منظور بررسی متابولیت‌های ثانویة موجود در عصاره‌های قارچی، تست‌های مختلفی با روش‌های استاندارد انجام شدند که به شرح زیرند:

به‌منظور اثبات وجود فلاونوئید، 2 میلی‌لیتر از عصارة قارچی با 2 میلی‌لیتر محلول سدیم‌هیدروکسید رقیق ترکیب شد. تغییر رنگ از زرد به بی‌رنگ نشان‌دهندة وجود فلاونوئید است (23). برای سنجش وجود آلکالوئیدها، 1 میلی‌لیتر از عصاره‌های قارچی با چند قطره لوگول ترکیب شد؛ رنگ قرمز مایل به قهوه‌ای نشان‌دهندة وجود آلکالوئیدها است (24). وجود تانن، با اضافه‌کردن کلرید آهن (III) 1 درصد به‌صورت قطره‌قطره به 5 میلی‌‌لیتر از عصارة قارچی اثبات شد؛ به‌طوری‌که رنگ سیاه مایل به آبی نشان‌دهندة تانن است (25). برای تست وجود ترکیبات فنولی، 2 میلی‌لیتر از عصارة قارچی با 2 میلی‌لیتر از محلول کلرید آهن (III) 5 درصد ترکیب شد؛ رنگ سبز تیره نشان‌دهندة وجود ترکیبات فنولی است (26). وجود استروئیدها با ترکیب 2 میلی‌لیتر از عصارة قارچی با 2 میلی‌لیتر کلروفرم و سپس افزودن اسید سولفوریک به‌صورت قطره‌قطره تأیید شد؛ به‌طوری‌که رنگ سبز نشان‌دهندة وجود استروئید در نمونه‌ها است (26). به‌منظور اثبات وجود ترپنوییدها، 200 ماکرولیتر از عصارة قارچی با 1 میلی‌لیتر کلروفورم و 1 میلی‌لیتر اسید سولفوریک ترکیب شد؛ رنگ خاکستری مایل به صورتی نشان‌دهندة وجود ترپنوئید در نمونه‌ها است (24). ظهور رنگ نارنجی و قرمز تیره بر اثر ترکیب 1 میلی‌لیتر عصارة قارچی با 1 میلی‌لیتر اسید سولفوریک غلیظ، نشان‌دهندة وجود کوئینون و فلاونن در نمونه‌ها است (25). وجود دی‌ترپن‌ها با ترکیب 2 میلی‌لیتر از عصارة قارچی با 5-4 قطره محلول کوپر استات مس اثبات شد؛ به‌طوری‌که رنگ سبز زمردی نشان‌دهندة وجود دی‌ترپن‌ها است (27). همچنین، 1 میلی‌لیتر از عصارة قارچی با 1 میلی‌لیتر از سدیم‌هیدروکسید 5 درصد ترکیب شد؛ رنگ زرد نشان‌دهندة وجود کومارین در نمونه‌ها است (25).

 

نتایج

شناسایی قارچ‌های اندوفیت: در مطالعة حاضر، در مجموع 791 قارچ اندوفیت از بافت‌های برگ، ساقه و ریشة گیاه فندق از شش منطقة جغرافیایی (استان‌های گلستان، مازندران، گیلان، زنجان، اردبیل و قزوین) جداسازی شد که از رویشگاه‌های اصلی فندق در ایران‌اند. جدایه‌ها براساس خصوصیات مورفولوژیکی و شناسایی مولکولی به 24 گونه طبقه‌بندی شدند که از این میان، 23 گونه متعلق به شاخة آسکومایکوتا[15] و یک گونه متعلق به شاخة بازیدیومایکوتا[16] بود. توالی قارچ‌های شناسایی‌شده با اخذ شماره دستیابی در بانک ژن ذخیره شدند (جدول 2).

.سنجش فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصاره‌های قارچی:این مطالعه همچنین با هدف به دست آوردن جدایه‌هایی با فعالیت آنتی‌اکسیدانی از گیاه فندق انجام شد. فعالیت آنتی‌اکسیدانی عصارة اتیل‌استاتی گونه‌های قارچی مورد مطالعه به روش DPPH انداز‌گیری و با نمونة استاندارد (اسید آسکوربیک با فعالیت آنتی‌اکسیدانی 98 درصد) مقایسه شد. در این روش تغییر رنگ رادیکال آزاد DPPH از ارغوانی به زرد نشان‌دهندة قدرت مهار رادیکال‌های آزاد با آنتی‌اکسیدان‌های مربوطه است.

نتایچ نشان دادند اختلاف میان فعالیت به دام‌اندازی رادیکال DPPH در عصارة حاصل از قارچ‌های مختلف و نمونة شاهد در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار بود (01/0>P) (جدول3). گونة sporulosa P. که بیشترین فعالیت آنتی‌کسیدانی را نشان داد با نمونة شاهد در یک گروه قرار گرفت (شکل 1). سایر گونه‌ها نظیر C. herbarum، A. alternata، N. quercina، F. equiseti، Pleosporales sp.، N. unguis، P. citrinum، Fusarium sp.، F. fujikuroi، E. nigrum، G. idaeicola، C. sphaerospermum، B. adusta، Angustimassarina sp.، Exophiala sp. و T. amestolkiae به‌ترتیب با مقادیر بالای 50 درصد، بیشترین فعالیت مهار رادیکال‌های DPPH را نشان دادند؛ درحالی‌که P. chrysogenum دارای کمترین فعالیت آنتی‌اکسیدانی بود (شکل 1).

 

 

جدول 2- نام قارچ‌های اندوفیت جداشده از گیاه فندق به همراه کد ثبت‌شده در بانک ژن (NCBI)

شماره جدایه‌ها

نام قارچ

اندام‌های گیاهی

کد دستیابی در بانک ژن

GOLB4

Epicoccum nigrum

برگ

(MN963671)

GOLB6

Nothophoma quercina

برگ

(MN963672)

GOLS20

Neocucurbitaria unguis

ساقه

(MN963673)

GOLR5

Alternaria alternata

ریشه

(MN963674)

GOLR6

Paraphaeosphaeria sporulosa

ریشه

(MN963675)

MZB3

Purpureocillium lilacinum

برگ

(MN963676)

MZB12

Fusarium sp.

برگ

(MN963694)

MZR1

Fusarium proliferatum

ریشه

(MN963677)

GIB1

Diaporthe sp.

برگ

(MN963678)

GIS2

Cladosporium tenuissimum

ساقه

(MN963679)

GIS3

Pyrenochaetopsis sp.

ساقه

(MN963680)

GIR2

Exophiala sp.

ریشه

(MN963681)

ZNB7

Fusarium fujikuroi

برگ

(MN963682)

ZNB8

Fusarium equiseti

برگ

(MN963683)

ZNS2

Bjerkandera adusta

ساقه

(MN963684)

ZNR4

Penicillium chrysogenum

ریشه

(MN963685)

ARB5

Angustimassarina sp.

برگ

(MN963689)

ARB6

Gnomoniopsis idaeicola

برگ

(MN963686)

ARB21

Cercospora sp.

برگ

(MN963687)

ARS4

Pleosporales sp.

ساقه

(MN963690)

ARR2

Cladosporium sphaerospermum

ریشه

(MN963688)

QZS1

Cladosporium herbarum

ساقه

(MN963691)

QZR4

Penicillium citrinum

ریشه

(MN963692)

QZR10

Talaromyces amestolkiae

ریشه

(MN963693)

         

 

 

شکل 1- مقایسة میانگین میزان مهار رادیکال آزاد DPPH توسط عصاره‌های قارچ‌های اندوفیت جداشده از گیاه فندق. حروف مختلف بیان‌کنندة وجود اختلاف معنی‌دار در سطح احتمال 1 درصد است.

 

جدول 3- تجزیه واریانس تأثیر گونة قارچی بر درصد مهار رادیکال آزاد DPPH

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات درصد مهار رادیکال آزاد DPPH

گونة قارچی

24

** 14/40872

خطا

50

843/37

ضریب تغییرات

28/1

مقایسة میانگین در سطح احتمال یک درصد انجام شده است (9021/1 =LSD)

 


سنجش میزان فنول کل و فلاونوئید عصاره‌های قارچی: محتوای فنول کل با روش فولین - سیوکالتیو براساس معادلة خط منحنى استاندارد گالیک‌اسید (y = 8.992x + 0.0087, R² = 0.9986) محاسبه شد. نتایج نشان دادند محتوای فنول کل اندازه‌گیری‌شده در عصاره‌های قارچی مختلف، تفاوت معنی‌داری در سطح احتمال یک درصد نشان داد (01/0P <) (جدول 4). طیف گسترده‌ای از غلظت‌های فنول کل در عصاره‌های قارچی از اتیل‌استات وجود دارد (جدول 5). بیشترین غلظت ترکیبات فنولی‌ در عصارة sporulosa P. و C. herbarum مشاهده شد؛ درحالی‌که P. chrysogenum و .Diaporthe sp حاوی کمترین غلظت بودند (جدول 5). محتوای فلاونوئید عصاره‌ها نیز با معادلة خط استاندارد کوئرستین به‌صورت y = 0.1773x + 0.162, R2=0.97 محاسبه شد. نتایج نشان دادند محتوای فلاونوئید اندازه‌گیری‌شده در عصاره‌های قارچی مختلف در سطح احتمال یک درصد معنی‌دار بود (01/0P <) (جدول4). sporulosa P. و C. herbarum به‌ترتیب با محتوای فلاونوئیدی 038/0±84/9 و 034/0±76/8 دارای بالاترین غلظت بودند؛ درحالی‌که Diaporthe sp و P. chrysogenum به‌ترتیب با مقادیر 025/0±08/0 و 023/0±03/0 کمترین غلظت از فلاونوئید را داشتند (جدول 5).

 

 

جدول 4- تجزیه واریانس میزان فنول کل و فلاونوئید در عصاره‌های قارچ‌های اندوفیت مختلف جداشده از گیاه فندق

منابع تغییرات

درجه آزادی

میانگین مربعات میزان فنول

میانگین مربعات میزان فلاونویید

گونة قارچی

23

** 159/9

** 870/0

خطا

48

0103/0

000054/0

ضریب تغییرات

47/0

82/0

 

جدول 5- میانگین محتوای فنول کل و فلاونوئید عصارة قارچ‌های اندوفیت جداشده از گیاه فندق

نام قارچ

فنول کل (میلی‌گرم گالیک‌اسید در گرم عصاره)

فلاونوئید (میلی‌گرم معادل کوئرستین در گرم عصاره)

Paraphaeosphaeria sporulosa

a  01/0±86/14

a038/0±84/9

Cladosporium herbarum

b037/0±66/14

b034/0±76/8

Alternaria alternata

c  054/0±86/12

c023/0±68/7

Nothophoma quercina

d  084/0±29/12

c023/0±62/7

Fusarium equiseti

e  019/0±87/10

d034/0±48/7

Pleosporales sp.

f026/0±91/8

e  025/0±55/6

Neocucurbitaria unguis

g067/0±94/7

f023/0±97/5

Penicillium citrinum

h024/0±17/8

g03/0±76/5

Fusarium sp.

i067/0±74/8

h049/0±61/5

Fusarium fujikuroi

j021/0±70/7

h056/0±51/4

Epicoccum nigrum

k011/0±82/5

i034/0±05/5

Gnomoniopsis idaeicola

l037/0±66/5

j028/0±63/4

Cladosporium sphaerospermum

l  066/0±63/5

k028/0±51/4

Bjerkandera adusta

m012/0±42/5

k034/0±52/5

Angustimassarina sp.

m024/0±12/5

l13/0±87/2

Exophiala sp.

n022/0±42/5

m028/0±08/2

Talaromyces amestolkiae

n014/0±07/5

n031/0±99/1

Cladosporium tenuissimum

o017/0±68/4

o029/0±87/0

Cercospora sp.

p02/0±30/4

o038/0±62/0

Purpureocillium lilacinum

q013/0±17/4

p023/0±64/0

Fusarium proliferatum

r  014/0±88/3

p032/0±81/0

Pyrenochaetopsis sp.

s013/0±96/1

q031/0±24/0

Diaporthe sp.

t017/0±78/1

r025/0±08/0

Penicillium chrysogenum

u01/0±68/0

r023/0±03/0

مقایسة میانگین در سطح احتمال یک درصد انجام شده است. عدد LSD برای فنول کل و فلاونوئید به‌ترتیب از 322/0 و 0161/0 است.

 

 

 

غربالگری فیتوشیمیایی عصاره‌های قارچی

 

جدول 6- بررسی‌های فیتوشیمیایی عصارة قارچ‌های اندوفیت جداشده از گیاه فندق

عصارة قارچی

فلاونوئید

آلکالوئید

تانن

فنول

استروئید

ترپنوئید

کوئینون و فلاونن

دی‌ترپن

کومارین

GOLB4

+

-

-

+

-

+

+

+

+

GOLB6

+

-

-

+

+

+

+

+

+

GOLS20

+

-

-

+

+

-

-

+

+

GOLR5

+

-

-

+

-

-

+

+

+

GOLR6

+

-

-

+

+

+

-

+

+

MZB3

+

-

-

+

+

-

-

+

+

MZB12

+

-

-

+

+

+

+

+

+

MZR1

+

-

-

+

-

+

-

+

+

GIB1

+

-

-

+

-

-

-

+

+

GIS2

+

-

-

+

-

-

-

+

+

GIS3

+

-

-

+

-

-

-

+

+

GIR2

+

-

-

+

+

_

+

+

+

ZNB7

+

-

-

+

+

+

+

+

+

ZNB8

+

-

-

+

+

+

+

+

+

ZNS2

+

-

-

+

-

+

+

+

+

ZNR4

+

-

-

+

-

-

-

+

+

ARB5

+

-

-

+

-

-

-

+

+

ARB6

+

-

-

+

+

+

+

+

+

ARB21

+

-

-

+

-

-

-

+

+

ARS4

+

-

-

+

+

+

+

+

+

ARR2

+

-

-

+

-

-

+

+

+

QZS1

+

-

-

+

-

-

+

+

+

QZR4

+

-

-

+

-

-

+

+

+

QZR10

+

-

-

+

-

-

+

+

+

 

 

بررسی آزمون‌های فیتوشیمیایی نشان داد ترکیبات فلاونوئید، دی‌ترپن و کومارین در همه عصاره‌های قارچی حضور داشتند؛ درحالی‌که ترکیبات آلکالوئید، فنول و تانن در هیچ‌کدام از عصاره‌های قارچی یافت نشدند. همچنین ترکیبات استروئید، ترپنوئید، کوئینون و فلاونن در برخی از قارچ‌ها نتایج مثبت نشان دادند. ترکیبات فلاونوئید، استروئید، ترپنوئید، کوئینون و فلاونن، دی‌ترپن و کومارین در گونه‌های N. quercina، F. equiseti، Pleosporales sp.، Fusarium sp.، F. fujikuroi و G. idaeicola به‌طور مشترک مشاهده شدند (جدول 6). این گونه‌ها در مهار رادیکال‌های آزاد DPPH نیز فعالیت آنتی‌اکسیدانی بالای 70 درصد نشان دادند (شکل 1). گونه‌های Diaporthe sp.، C. tenuissimum، P. chrysogenum، Angustimassarina sp.، .Cercospora sp و Pyrenochaetopsis sp. فاقد ترکیبات استروئید، ترپنوئید، کوئینون و فلاونن بودند. نتایج این بررسی به‌طور کامل در جدول 6 ارائه شده‌اند.

 

بحث

قارچ‌های اندوفیت به‌طور گسترده از گیاهان مختلف گزارش شده‌اند که به‌عنوان منابع متابولیت‌های ثانویة فعال زیستی شناخته می‌شوند (28). اندوفیت‌ها تمایل بیشتری به استفاده از مخزن ترکیبات فعال زیستی طبیعی دارند که توسط میزبان آنها تولید می‌شود (29). تحقیقات انجام‌شده روی غربالگری فیتوشیمیایی فندق، وجود ترکیبات فنولی، فلاونوئیدی و غیره را نشان داد (30). گونه‌های قارچی اندوفیت اکنون به‌عنوان منابع جدید هیجان‌انگیز برای به دست آوردن ترکیبات فعال زیستی جدید در نظر گرفته شده و از چندین میزبان گزارش شده‌اند (31). وجود ترکیبات فیتوشیمیایی در اندوفیت‌ها منبع بالقوه‌ای برای استفادة دارویی و صنعتی و همچنین منبع بالقوة پیش‌سازها در تولید داروهای مصنوعی است (32)؛ ازاین‌رو غربالگری عصاره‌های اندوفیت به‌منظور تعیین پتانسیل آنها برای تجزیه و تحلیل بیشتر و بررسی فعالیت زیستی آنها حائز اهمیت است.

در این مطالعه، 24 جدایه اندوفیت از گیاه فندق جداسازی و شناسایی شد. همچنین، میزان توانایی به دام‌اندازی رادیکال‌های آزاد DPPH و غربالگری ترکیبات فیتوشیمیایی موجود در آنها بررسی شدند. در مطالعة حاضر از عصارة اتیل‌استات حاصل از قارچ‌های اندوفیت برای ارزیابی‌های بالا استفاده شد. عصاره‌گیری با اتیل‌استات، کارآمدترین روش برای جداسازی متابولیت‌های ثانویة قارچی است. اتیل‌استات، به‌عنوان یک حلال عصاره‌گیری، به‌طور انتخابی ترکیبات فنولی با وزن مولکولی کم و پلی‌فنول‌هایی با وزن مولکولی بالا را استخراج می‌کند (33).

به‌منظور تعیین خواص آنتی‌اکسیدانی عصاره‌های قارچی، از روش سنجش مهار رادیکال آزاد DPPH استفاده شد. این روش بین روش‌های مختلف آنتی‌اکسیدانی، بسیار اساسی و پرکاربرد و یک مدل آزمایشگاهی مناسب در نظر گرفته شده است. این روش دقیق‌ترین روش غربالگری محسوب می‌شود که به‌طور گسترده برای ارزیابی فعالیت آنتی‌اکسیدانی در مدت زمان کوتاه استفاده می‌شود (34). این ترکیب با شکستن زنجیره رادیکال آزاد ازطریق اهدای یک اتم هیدروژن فعالیت آنتی‌اکسیدانی را نشان می‌دهد (35). DPPH در اثر کاهش ترکیبات آنتی‌اکسیدانی، ناپدید و به مولکول‌های تشخیصی پایدار تبدیل می‌شود؛ درنتیجه، تغییر رنگ از بنفش به زرد می‌تواند نشان‌دهندة توانایی هیدروژن‌دهی در عصاره‌ها باشد (35).

در این مطالعه، تمام عصاره‌های قارچی توانایی گسترده‌ای در مهار رادیکال‌های آزاد DPPH داشتند. در این میان، گونة sporulosa P. با فعالیت مهاری 97 درصد در برابر DPPH به‌عنوان گونة برتر انتخاب شد که میزان خاصیت آنتی‌اکسیدانی آن تقریباً برابر با اسید آسکوربیک نشان داده شده است. این گونه برای نخستین‌بار در سال 2013 به‌عنوان اندوفیت از ریشة گیاه Festuca sp. جداسازی شد (36)؛ اما تاکنون مطالعاتی دربارة فعالیت آنتی‌اکسیدانی آن انجام نشده است. سایر گونه‌ها نظیر C. herbarum، A.alternata، N. quercina، F. equiseti، Pleosporales sp.، N. unguis، P. citrinum،Fusarium sp.، F. fujikuroi، E. nigrum، G. idaeicola، C. sphaerospermum، B. adusta، Angustimassarina sp.،Exophiala sp.، T. amestolkiae به‌ترتیب فعالیت آنتی‌اکسیدانی خوبی را از 50 درصد تا 97 درصد نشان دادند. از میان گونه‌های بالا به استثنای گونه‌های A. alternata، Fusarium spP. citrinum و Exophiala sp. که در مطالعات دیگر نیز خواص آنتی‌اکسیدانی آنها بررسی شده است (37، 38، 39 و40)، سایر گونه‌ها برای نخستین‌بار در این مطالعه ازلحاظ خواص آنتی‌اکسیدانی ارزیابی شدند.

در این مطالعه بررسی کیفی ترکیبات فیتوشیمیایی عصاره‌های اتیل‌استات اندوفیت‌های قارچی، وجود فلاونوئید، استروئید، ترپنوئید، فنول، دی‌ترپن، فلاونن، کوئینون و کومارین را در بیشتر قارچ‌‌ها تأیید می‌کند. تحقیقات نشان داده است عصاره‌های اندوفیت، ترکیبات فیتوشیمیایی فعال و خواص آنتی‌اکسیدانی قوی دارند؛ این فعالیت‌ها ممکن است به‌دلیل وجود ترکیبات فنولیک مانند فلاونوئیدها، فنول‌ها و ترپنوئیدها باشد (22). فلاونوئیدها، فنول‌ها و ترپن‌ها اصلی‌ترین ترکیبات شیمیایی‌اند که باعث کاهش پراکسیداسیون لیپیدها می‌شوند؛ ازاین‌رو به‌عنوان آنتی‌اکسیدان‌های اولیه و ثانویه عمل می‌کنند (41). همچنین به‌دلیل گروه‌های هیدروکسیل موجود در ترکیبات فنول، آنها می‌توانند به‌طور مستقیم به فعالیت آنتی‌اکسیدانی کمک کنند و نقش مهمی در اصلاح رادیکال‌های آزاد داشته باشند (41).

فلاونوئیدها نیز زیرگروه بزرگی از متابولیت‌های ثانویه‌اند، نقش مهمی در مقاومت گیاه دارند و به‌طور گسترده بین گیاهان و پروکاریوت‌ها توزیع می‌شوند (42). فلاونوئیدها از گیاهان در برابر تنش‌های مختلف زیستی و غیر‌زیستی محافظت می‌کنند و شامل طیف متنوعی از عملکردهای بیولوژیکی‌اند و نقش مهمی در تعامل گیاه و محیط آنها دارند (43). یکی از مهم‌ترین ویژگی‌های ترکیبات فنولیک فعالیت آنتی‌اکسیدانی است که ارتباط نزدیکی با ساختار شیمیایی آنها دارد. همچنین، ترکیبات فنولیک با فعالیت‌های ضدسرطان، ضدباکتریایی، ضدویروسی یا ضدالتهابی گزارش شده‌اند (44). اندوفیت‌های قارچی یک منبع غنی از متابولیت‌های ثانویة جدید ازجمله ترکیبات آنتی‌بیوتیک، آنتی‌اکسیدان و سرکوب‌کنندة سیستم ایمنی‌اند (44).

فنول‌ها و فلاونوئیدها مهم‌ترین ترکیبات فیتوشیمیایی اندوفیت‌ها در این مطالعه بودند و در همه عصاره‌های قارچی نتایج مثبت نشان دادند و مطابق با نظرات فردوس و عالم هستند (25). مطالعات قبلی بیان می‌کنند بین محتوای فنول کل، فلاونوئید و پتانسیل آنتی‌اکسیدانی هر نمونه، رابطة خطی و مستقیم وجود دارد (45). در مطالعة بالا، عصاره‌هایی که محتوای فنولی و فلاونوئیدی زیادی دارند، فعالیت آنتی‌اکسیدانی خوبی را نشان دادند؛ درنتیجه، با افزایش فعالیت آنتی‌اکسیدانی، میزان فنول کل و فلاونوئید نیز افزایش می‌یابد.

در این مطالعه، ترکیبات فیتوشیمیایی دیگر نظیر دی‌ترپن‌ها و کومارین‌ها نیز نتایج مثبتی را در همه عصاره‌های قارچی نشان دادند. این ترکیبات نقش مهمی در گیاه دارند و از مهم‌ترین متابولیت‌های گیاهی به شمار می‌روند. دی‌ترپن‌ها از ژرانیل ژرانیل پیروفسفات[xvii] (GGPP) مشتق شده‌اند (46). گیاهان و قارچ‌ها این ترکیب را ازطریق مسیر بیوسنتز ردوکتاز HMG-CoA سنتز می‌کنند (47). دی‌ترپن‌ها پایه‌ای برای ترکیبات مهم بیولوژیکی مانند رتینول، رتینال و فیتول‌اند که به‌عنوان عوامل ضدمیکروبی و ضدالتهابی و همچنین ترکیبات جدید آنتی‌بیوتیکی شناخته شده‌اند (47). کومارین‌ها تقریباً در هر خانوادة گیاهی یافت می‌شوند. آنها در بیوشیمی و فیزیولوژی گیاه و همچنین به‌عنوان آنتی‌اکسیدان‌ها، مهارکننده‌های آنزیمی و پیش‌سازهای مادة سمی نقش مهمی دارند. کومارین‌ها به‌عنوان ترکیبات دفاعی نیز نقش مهمی در سیستم دفاعی گیاهان در برابر آفات و بیماری‌ها دارند (48). ازاین‌رو اکنون پذیرفته شده است اندوفیت‌ها یک مخزن مهم از ساختارهای شیمیایی منحصربه‌فرد را نشان می‌دهند که ازطریق تکامل اصلاح شده‌اند و اعتقاد بر این است که در حفاظت و ارتباط گیاهان میزبان دخیل‌اند (49).

 

نتیجه‌گیری

پیشنهاد شده است افزایش تولید آنتی‌اکسیدان توسط اندوفیت‌های جداشده از گیاهان ممکن است نتیجة تولید انواع اکسیژن فعال توسط گیاهان یا اندوفیت‌ها باشد (50). یافته‌های ما مطابق با نتایجی است که نقش اندوفیت‌ها را در تقویت فعالیت آنتی‌اکسیدانی گیاه برجسته می‌کند. مطالعة حاضر نشان داد قارچ‌های اندوفیت ممکن است به‌عنوان منبع بالقوة آنتی‌اکسیدان‌های طبیعی استفاده شوند. عصارة قارچ‌های اندوفیت به‌دلیل وجود ترکیبات طبیعی فعال زیستی، فعالیت آنتی‌اکسیدانی خوبی را به نمایش گذاشته‌اند. همچنین، عصاره‌های خام برای شناسایی ترکیبات فعال، در معرض فرایند خالص‌سازی قرار می‌گیرند که ممکن است منبع بهتری برای توسعة داروهای جدید باشند. این ترکیبات طبیعی فعال، کاربردی بالقوه به‌عنوان آنتی‌اکسیدان‌ها در بسیاری از محصولات دارویی دارند. این نخستین گزارش دربارة فعالیت آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت جداشده از گیاه فندق است. در ایران مطالعات چندانی روی فعالیت آنتی‌اکسیدانی قارچ‌های اندوفیت و خواص فیتوشیمیایی آنها انجام نشده است؛ بنابراین، مطالعة حاضر مقدمه‌ای برای تحقیقات جامع‌تر دربارة ترکیبات فعال زیستی تولیدشده توسط این اندوفیت‌ها ارائه می‌دهد.

 

سپاسگزاری

سپاس از زحمات آقای مهندس سید اصغر حسینی از دانشگاه کشاورزی گنبد کاووس که ما را در انجام پژوهش حاضر یاری کردند.



[1]- Reactive Oxygen Species

[2]- Corylus avellana L.

[3]- Betulaceae

[4]- Corylus

[5]- Tan et al

[6]- Merck

[7]- Zhang et al

[8]- Polymerase chain reaction

[9]- Microsynth AG genome center (Balgach, Swiss)

[10]- National centre biotechnology information

[11]- Diphenyl-1-picrylhydrazyl

[12]- Brand-Williams

[13]- Radical scavenging activity

[14]- Folin-Ciocalteu

[15]- Ascomycota

[16]- Basidiomycota

[xvii]- Geranylgeranyl pyrophosphate

(1) Gülçin I. Comparison of in vitro antioxidant and antiradical activities of L-tyrosine and L-Dopa. Amino acids. 2007; 32 (3): 431-8.
(2) Aruoma OI. Free radical, oxidative stress, and antioxidants in human health and disease. Journal of the American Oil Chemists Society. 1998; 75 (2): 199–212.
(3) Ramassamy C. Emerging role of polyphenolic compounds in the treatment of neurodegenerative diseases: a review of their intracellular targets. European Journal Pharmacology. 2006; 545(1): 51-64.
(4) Halliwell B. How to characterize an antioxidant: an update. Biochemical Society Symposium. 1995; 61: 73-101.
(5) Silva BA, Ferreres F, Malva JO, Dias AC. Phytochemical and antioxidant characterization of Hypericum perforatum alcoholic extracts. Food Chemistry. 2005; 90 (1–2): 157-67.
 
(6) Mehlenbacher SA. Geographic distribution of incompatibility alleles in cultivars and selections of European hazelnut. Journal of the American Society for Horticultural Science. 2014; 139 (2): 191-212.
(7) Gallego A, Malik S, Yousefzadi M, Makhzoum A, Tremouillaux-Guiller J, Bonfill M. Taxol from Corylus avellana: paving the way for a new source of this anti-cancer drug. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 2017; 129: 1-16.
(8) Shahidi F, Alasalvar C, Liyana-Pathirana CM. Antioxidant phytochemicals in hazelnut kernel (Corylus avellana L.) and hazelnut byproducts. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2007; 55 (4): 1212-20.
(9) Alasalvar C, Karamać M, Amarowicz R, Shahidi F. Antioxidant and antiradical activities in extracts of hazelnut kernel (Corylus avellana L.) and hazelnut green leafy cover. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2006; 54 (13): 4826-32.
(10)           Alurappa R, Chowdappa S. Antimicrobial Activity and Phytochemical Analysis of Endophytic Fungal Extracts Isolated from Ethno Pharmaceutical Plant Rauwolfia tetraphylla L. Journal of Pure and Applied Microbiology. 2018; 12 (1): 317-32.
(11)           Petrini O. Fungal endophytes of tree leave. In: Andrews JH, Hirano SS, editors. Microbial ecology of leaves. 1991; p. 179-197.
(12)           Baltruschat H, Fodor J, Harrach BD, Niemczyk E, Barna B, Gullner G, et al. Salt tolerance of barley induced by the root endophyte Piriformospora indica is associated with a strong increase in antioxidants. The New Phytologist. 2008; 180: 501-10
(13)           Guo B. Cytonic acids A & B: novel tridepside inhibitors of hCMV protease from the endophytic fungus Cytonaema species. Journal of Natural Product. 2000; 63 (5): 602-4.
(14)           Tan XM, Chen XM, Wang CL, Jin XH, Cui JL, Chen J, et al. Isolation and identification of endophytic fungi in roots of nine Holcoglossum plants (Orchidaceae) collected from Yunnan, Guangxi, and Hainan provinces of China. Current microbiology. 2012; 64 (2): 140-7.
(15)           Singleton LL, Mirial JD, Rush CM. Methods for Research on Soilborne Phytopathogenic Fungi. APS Press. 1990.
(16)           Zhang J, Zhang L, Wang X, Qiu D, Sun D, Gu J, et al. Microbial transformation of 10-deacetyl-7-epitaxol and 1b-hydroxybaccatin I by fungi from the inner bark of Taxus yunnanensis. Journal of Natural Products. 1998; 61 (4): 497–500
(17)           White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: a guide to methods and applications. San Diego. Academic Press. 1990; 18 (1): 315-22.
(18)           Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. Use of a free radical method to evaluate Antioxidant activity. Lebensmittel Wissenschaft und Technologie-Food Science and Technology. 1995; 28: 25-30.
(19)           Halliwel B, Guttridge JM. Free radicals in biology and medicion. 2nd ed. London: Clarendon Press; 1989.
(20)           Yadav M, Yadav A, Yadav JP. In vitro antioxidant activity and total phenolic content of endophytic fungi isolated from Eugenia jambolana Lam. Asian Pacific journal of tropical medicine. 2014; 7: S256-61.
(21)           Govindappa M, Channabasava R, Kumar KS, Pushpalatha KC. Antioxidant Activity and Phytochemical Screening of Crude Endophytes Extracts of Tabebuia argentea Bur. & K. Sch. American Journal of Plant Sciences. 2013; 2013.
(22)           Yadav YC, Srivastava DN, Saini V, Singhal S, Seth AK, Kumar S. In-vitro antioxidant activity of methanolic extraction of Ficus Benghalensis L. latex. Pharmacologyonline. 2011; 1: 140-8.
(23)           Misra CS, Pratyush K, Sagadevan LDM, James J, Veettil AKT, Thankamani V. A comparative study on phytochemical screening and antibacterial activity of roots of Alstonia scholaris with the roots, leaves and stem bark. International Journal of Research in Phytochemistry and pharmacology. 2011; 1 (2): 77-82.
(24)           Firdouse S, Alam P. Phytochemical investigation of extract of Amorphophallus campanulatus tubers. International Journal of Phytomedicine. 2011; 3 (1): 32.
(25)           Devi NN, Prabakaran JJ, Wahab F. Phytochemical analysis and enzyme analysis of endophytic fungi from Centella asiatica. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2012; 2 (3): S1280-4.
(26)           Tiwari P, Kumar B, Kaur M, Kaur G, Kaur H. Phytochemical screening and extraction: A review. Internationale Pharmaceutica Sciencia1. 2011; 1(1): 98-106.
(27)           Schulz B, Boyle C, Draeger S, Römmert AK, Krohn K. Endophytic fungi: a source of novel biologically active secondary metabolites. Mycological Research. 2002; 106: 996-1004.
(28)           Tan RX, Zou WX. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Natural Product Reports. 2001; 18: 448-59.
(29)           Riethmüller E, Alberti Á, Tóth G, Béni S, Ortolano F, Kéry Á. Characterisation of diarylheptanoid‐and flavonoid‐type phenolics in Corylus avellana L. leaves and bark by HPLC/DAD–ESI/MS. Phytochemical Analysis. 2013; 24 (5): 493-503.
(30)           Verma VC, Gond SK, Kumar A, Mishra A, Kharwar RN, Gange AC. Endophytic actinomycetes from Azadirachta indica A. Juss.: isolation, diversity, and anti-microbial activity. Microbial ecology. 2009; 57 (4): 749-56.
(31)           Sadananda TS, Nirupama R, Chaithra K, Govindappa M, Chandrappa CP, Vinay Raghavendra B. Antimicrobial and antioxidant activities of endophytes from Tabebuia argentea and identification of anticancer agent (lapachol). The Journal of Medicinal Plants Research. 2011; 5 (16): 3643-52.
(32)           Garcia A, Rhoden SA, Bernardi-Wenzel J, Orlandelli RC, Azevedo JL, Pamphile JA. Antimicrobial Activity of Crude Extracts of Endophytic Fungi Isolated from Medicinal Plant Sapindus saponaria L. Journal of applied pharmaceutical science. 2012; 2 (10): 35.
(33)           Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C. Use of free radical method to evaluate antioxidant activity. LWT-Food Science and Technology. 1995; 28 (1): 25-30
(34)           Ravindran C, Naveenan T, Varatharajan GR, Rajasabapathy R, Meena RM. Antioxidants in mangrove plants and endophytic fungal associations. Botanica Marina. 2012; 55 (3): 269-79.
(35)           Baroncelli R, Da Lio D, Vannacci G, Sarrocco S. Genome Resources for the endophytic fungus Paraphaeosphaeria sporulosa. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2020; 33 (9): 1098-9.
(36)           Guleria S, Tiku AK, Gupta S, Singh G, Koul A, Razdan VK. Chemical composition, antioxidant activity and inhibitory effects of essential oil of Eucalyptus teretecornis grown in north-western Himalaya against Alternaria alternata. Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology. 2012; 21 (1): 44-50.
(37)           Ruma K, Sunil K, Prakash HS. Antioxidant, anti-inflammatory, antimicrobial and cytotoxic properties of fungal endophytes from Garcinia species. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 2013; 5 (3): 889-97.
(38)           Hulikere MM, Joshi CG, Nivvya T, Ananda D, Raju NG. Antiangiogenic and antioxidant activity of endophytic fungus isolated from seaweed (Sargassum wightii). Asian Journal of Biochemistry. 2016; 11 (4): 168-76.
(39)           Diao YH, Li T, Zhao ZW. Zinc accumulation characteristics of two Exophiala strains and their antioxidant response to Zn2+ stress. Journal of environmental protection. 2013; 4: 12-9.
(40)           Elmastas M, Isildak O, Turkekul I, Temur N. De- termination of Antioxidant Activity and Antioxidant Com- pounds in Wild Edible Mushrooms, Journal of Food Composition and Analysis. 2007; 20 (3): 337- 45.
(41)           Sultana B, Anwar F, Przybylski R. Antioxidant activity of phenolic components present in barks of Azadirachta indica, Terminalia arjuna, Acacia nilotica, and Eugenia jambolana Lam. trees. Food chemistry. 2007 Jan 1; 104 (3):1106-14.
(42)           Pourcel L, Routaboul JM, Cheynier V, Lepiniec L, Debeaujon I. Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions. Trends in plant science. 2007; 12 (1): 29-36.
(43)           Strobel G, Ford E, Worapong J, Harper JK, Arif AM, Grant DM, et al. Isopestacin, a unique isobenzofuranone from Pestalotiopsis microspora possessing antifungal and antioxidant properties. Phytochemistry. 2002; 60 (2): 179-83.
(44)           Fang Z, Zhang Y, Lü Y, Ma G, Chen J, Liu D, et al. Phenolic compounds and antioxidant capacities of bayberry juices. Food Chemistry. 2009; 113 (4): 884-8.
(45)           Pasdaran A, Hamedi A. Natural products as source of new antimicrobial compounds for skin infections. InThe Microbiology of Skin, Soft Tissue, Bone and Joint Infections. Academic Press. 2017; 223-53.
(46)           Eberhard Breitmaier. "Diterpenes". Terpenes: Flavors, Fragrances, Pharmaca, Pheromones. 2006; 1: 1-3. 
(47)           Kostova I. Synthetic and Natural Coumarins as Cytotoxic Agents. Current Medicinal Chemistry Journal. 2005; 5: 29- 46.
(48)           Gunatilaka AL. Natural products from plant-associated microorganisms: distribution, structural diversity, bioactivity, and implications of their occurrence. Journal of natural products. 2006; 69 (3): 509-26.
(49)           White JRJF, Torres MS. Is plant endophyte‐mediated defensive mutualism the result of oxidative stress protection?. Physiologia Plantarum. 2010; 138 (4): 440-6.