نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد رشتۀ گیاهپزشکی، بیماریشناسی گیاهی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران
2 استاد بیماریشناسی گیاهی، بخش مهندسی گیاه پزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران
3 استادیار گروه فیزیولوژی گیاهی، پژوهشکدۀ فناوری تولیدات گیاهی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، ایران
4 عضو هیات علمی بخش بیوتکنولوژی میکروبی، پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Phytophthora nicotianae is a destructive plant pathogen with a worldwide distribution that causes root, fruit, leaf, and crown rot. Phytophthora species are the main reason for various diseases in a wide range of plant species including vegetables. Symptoms include fruit, stem, crown, and root rot. They lead to plant host death and in most cases, the economic losses caused by P. nicotianae are very high due to the diversity of the host range and its damage, therefore, controlling this pathogen is a constant challenge.
Materials and methods: In order to biologically control the disease, three Streptomyces isolates including M6, M8, and M215 were selected from a large number of soil-inhabitant actinomycetes isolated from Kerman province, which showed effective anti-Oomycete activity against P. nicotianae. To better understand the inhibitory mechanism of these isolates, in vitro dual-culture assay, plant growth promotion, and pathogen control effects were investigated through the application of antagonists under laboratory and greenhouse conditions. Molecular identification of the most promising isolate was also achieved.
Results: The antagonistic activity of three isolates including M8, M6, and M215 against P. nicotianae in tomato plants (super chef variety) was evaluated. Among all, based on the statistical analysis under both laboratory and glasshouse conditions, the M8 isolate had an inhibitory effect on the crown and root rot of tomato. The comparison of the effects of antagonists on the tomato plant yield indices revealed that M8 isolate had the greatest effect on increasing the growth indices of the tomato plant (super chef cultivar) including plant height, the number of flowers, shoot, and root dry weight. The M8 isolate was identified by the sequence analysis of a small ribosomal RNA subunit (16S rRNA). Based on the results of the present study, Streptomyces venetus CMU-AB225T strain had the highest similarity (96.08%) with the M8 isolate.
Discussion and conclusion: The results showed that M8 isolate can be considered as a beneficial microorganism to produce some useful biofertilizers and bioactive materials to control tomato crown and root rot biologically. Some biocontrol agents such as T. harzianum and T. asperellum within composts can be effective in reducing the symptoms of Ph. nicotianae in pepper seedlings. The production of any product based on the S. venetus (M8) requires fulfilling further research steps such as the interaction of the bacterium with other beneficial soil microorganisms and its impact on the population of beneficial soil microbes, evaluation of the antimicrobial activity of M8 against other plant pathogenic fungi, fungal-like microorganisms and bacteria. Moreover, biosafety considerations and measures have to be investigated.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
گوجهفرنگی، با نام علمیL. Solanum lycopersicum متعلق به تیرة Solanaceae است. سالهای زیادی این گیاه بهصورت زینتی در اروپا کشت میشد. در اواخر قرن هجدهم بهعنوان گیاهی با مصرف خوراکی شناخته شد (1). گوجهفرنگی پس از سیبزمینی، بین سبزیجات ازنظر اقتصادی مقام دوم را در جهان دارد (2). قارچ Phytophthora nicotianae (Breda de Haan) بیمارگر گیاهی ویرانگر با گسترش جهانی است که سبب پوسیدگی ریشه، میوه، برگ و طوقه میشود (3) و براساس اهمیت علمی و اقتصادی در لیست 10 اوومیست بیمارگر مهم قرار گرفته است (4). این بیمارگر باعث کاهش رشد، زردشدن برگها، شانکر ساقه، کاهش عملکرد و مرگ گیاهان آسیبدیده میشود. همچنین، پوسیدگی ساقه و ریشه و درنتیجه، بروز نشانههای کمبود آب در گیاهانی مانند گوجهفرنگی، تنباکو، آووکادو، پنبه و برخی از گیاهان زینتی و درختان را سبب میشود (5). این بیمارگر روی میوة گوجهفرنگی علائم موسوم به پوسیدگی چشم آهویی ایجاد میکند که بهصورت حلقههای موجی سبز روشن و سبز تیره یا قهوهای مشاهده میشود. این علائم، نقاط آب سوختهاییاند که در نزدیکی انتهای محل گلگاه یا در محل تماس مستقیم میوهها با خاک ظاهر میشوند (6). مدیریت بیماریهای ناشی از قارچها و شبهقارچهای خاکبرد ازطریق روشهای شیمیایی و زراعی مشکل است و به هزینة زیادی نیاز دارد. همچنین، بهکارگیری سموم شیمیایی موجب بر هم خوردن تنوع میکروبی خاک میشود و اثرات مخرب زیستمحیطی به همراه دارد؛ بنابراین، در تحقیق ارائهشده، هدف نهایی ما دستیابی به کشاورزی پایدار ازطریق بهکارگیری استرپتومایسسهای آنتاگونیست جداشده از خاک بر شاخصهای رشدی گیاه گوجهفرنگی در شرایط تنش زیستی ایجادشده توسط شبهقارچ خاکبرد P. nicotianae است.
مواد و روشها
نمونهبرداری و جداسازی اکتینومیستها:نمونهبرداری از خاک منطقة ریزوسفر گیاهچۀ گوجهفرنگی و سیبزمینی از مزارع شهرستانهای جیرفت و ماهان و مزارع یونجة دانشگاه شهید باهنر کرمان انجام گرفت. برای نمونهبرداری، حدود 10 سانتیمتر از سطح رویی خاک کنار زده و مقداری خاک (100 گرم) از اطراف ریشة گوجهفرنگی، سیبزمینی و یونجه برای انجام مراحل بعدی به آزمایشگاه منتقل شد. نمونهها به مدت سه الی چهار روز در معرض هوای خشک قرار داده و پس از خشکشدن در پاکتهای کاغذی با درج تاریخ و محل جمعآوری، در دمای محیط نگهداری شدند. هنگام استفاده، 10 گرم از هر نمونه خاک به 90 میلیلیتر آب مقطر سترون اضافه شد. مخلوط حاصل با آهنربا به مدت نیم ساعت روی دستگاه همزن به خوبی مخلوط شد. سپس یک میلیلیتر از فاز رویی به 9 میلیلیتر آب مقطر سترون اضافه و سری رقت 2- 10 تا 6- 10 تهیه شد. یک میلیلیتر از هرکدام از رقتهای حاصل در کف تشتکهای پتری سترون ریخته شد و مقدار 25-20 میلیلیتر از محیطکشت Casein Glycerol Agar مذاب با دمای 45 درجة سانتیگراد به آنها اضافه و به آرامی مخلوط شد. نمونهها در دمای 28 درجة سانتیگراد انکوبه شدند. این آزمایش در سه تکرار انجام (7) و پس از گذشت10-7 روز روی محیط کشت پرگنههای اکتینومیستها و باکتریها ظاهر شدند (8).
آزمون بیماریزایی در شرایط آزمایشگاهی: بهمنظور ارزیابی بیماریزایی شبهقارچ فیتوفتورا (تهیهشده از کلکسیون واحد حفظ نباتات، سازمان جهاد کشاورزی استان کرمان) روی بذور گوجهفرنگی، ابتدا عامل بیمارگر بهصورت پلاگگذاری (قطر هر پلاگ 6 میلیمتر) روی کاغذ صافی سترون قرار گرفت و سپس روی محیط آرد ذرت آگار [1]CMA کشت داده شد. پس از گذشت 7-5 روز ریسههای اوومیست روی کاغذ صافی مشاهده شدند. بذور گوجهفرنگی سترونشده با هیپوکلریت سدیم 2 درصد روی کاغذ صافیهای آغشته به اوومیست قرارگرفتند و سپس روی محیط آب - آگار قرار داده شدند. علائم بیماری پس از 7 روز ثبت شد.
.آزمون کشت متقابل و ارزیابی فعالیت ضداوومیستی باکتریها:بهمنظور تعیین توانایی جدایههای اکتینومیست در ممانعت از رشد اوومیست بیمارگر و انتخاب جدایة برتر، ابتدا عامل بیمارگر بهصورت چمنی روی محیط CMA کشت شد. سپس یک دیسک 6 میلیمتری از کشت 10-7 روزه 70 جدایة اکتینومیست جداشده روی آن قرارداده شد. نمونة شاهد، محیط کشت فاقد باکتری در نظر گرفته شد. تشتکهای پتری به مدت 5 روز در انکوباتور و در شرایط تاریکی و دمای 28 درجة سانتیگراد نگهداری شدند. میزان فعالیت ضداوومیستی براساس قطر هاله ممانعت از رشد بیمارگر سنجیده شد.
استخراج DNA ژنومی:250 میکرولیتر از سوسپانسیون کشت 3 روزة باکتری در محیطCGA مایع به مدت 3 دقیقه در rpm 3000 یا دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی، حذف و به رسوب حاصل 400 میکرولیتر آب مقطر سترون اضافه شد. به سوسپانسیون حاصل 400 میکرولیتر بافر استخراجX 2 (50 میلیمولار Tris-HCl، 25 میلیمولار EDTA، 1 درصد SDS و µg/ml 10 پروتئیناز K) اضافه شد. نمونهها به مدت 3 ساعت در دمای 55 درجۀ سانتیگراد قرار گرفتند. سپس 400 میکرولیتر از آمونیوم استات 5/7 مولار به هر لوله، اضافه و به مدت 2 تا 3 دقیقه تکان داده شد. بعد از این مرحله، لولهها به مدت 10 دقیقه در 12500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. سپس 750 میکرولیتر از رونشین به لولة جدید منتقل شد و 750 میکرولیتر ایزوپروپانول سرد به آن، اضافه و با دست تکان داده شد. نمونهها به مدت یک شب در دمای 20- درجۀ سانتیگراد قرار گرفتند. سپس نمونهها به مدت 30 دقیقه در 12500 دور در دقیقه در دمای 4 درجۀ سانتیگراد سانتریفیوژ شدند و رسوب حاصل با 750 میکرولیتر اتانول 70 درصد دو بار شسته و در دمای 56 درجۀ سانتیگراد به مدت 30 دقیقه خشک شد. رسوب حاصل در 20 میکرولیتر آب مقطر سترون، حل و یک شب در 4 درجۀ سانتیگراد نگهداری شد. نمونهها برای نگهداری طولانیمدت به فریزر 20- درجۀ سانتیگراد منتقل شدند (9).
بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراجشده:برای تعیین کمیت DNA از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد. غلظت DNA موجود در هر نمونه برحسب نانوگرم DNA موجود در هر میکرولیتر محلول (ng/µl) توسط دستگاه گزارش شد. همچنین با استفاده از دستگاه نسبت DNA استخراجشده به پروتئین (در دو طول موج 260 و 280 نانومتر) تخمین زده شد. برای اطمینان از کیفیت DNA استخراجشده از روش الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد.
انجام واکنش PCR:شناسایی باکتری منتخب براساس آنالیز توالی زیرواحد کوچک RNA ریبوزومی (16S rRNA) و با استفاده از آغازگرهای PAF (5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAGA-3′) و PAR (5′- AAGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3′) انجام شد (10). برای انجام PCR از مخلوط Master mix آماده با نام تجاری Amplicon در حجم نهایی 20 میکرولیتر استفاده شد. واکنش PCR در دستگاه ترموسایکلر ساخت شرکت Bio-Rad با شرایط دمایی به شرح زیر انجام شد؛ 5 دقیقه واسرشتسازی اولیه در دمای 94 درجۀ سانتیگراد و در ادامه، 35 چرخه شامل واسرشتسازی در 94 درجۀ سانتیگراد به مدت 40 ثانیه، اتصال در دمای 55 درجۀ سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، بسط در 72 درجۀ سانتیگراد به مدت 90 ثانیه و درنهایت، بسط نهایی در دمای 72 درجۀ سانتیگراد به مدت 10 دقیقه.
توالییابی محصولات تکثیرشده:پس از مشاهدة قطعه تکثیرشدة مدنظر (حدود bp 1500) روی ژل آگارز و مقایسه با نشانگر اندازه DNA با نام تجاری (Gene RulerTM DNA Ladder Mix)، محصول حاصل برای توالییابی ازطریق شرکت ژن فناوران تهران به شرکت ماکروژن کره جنوبی فرستاده شد.
تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی و رسم تبارنما:توالی حاصل برای تعیین درصد شباهت اولیه با سایر توالیهای موجود در بانک دادة NCBI استفاده شد. درنهایت، برای تعیین میزان شباهت توالی ژنومی 16S rRNA جدایه با سایر باکتریها براساس میزان تشابه جفتباز از بانک دادة (EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net استفاده شد. پس از همترازی توالیها با استفاده از الگوریتم CLUSTAL W از نرمافزار MEGA5 (روش Neighbor-joining) برای رسم درخت فیلوژنی استفاده شد. بررسی بوت استراپ (Bootstrap) بهمنظور ارزیابی پایداری ضرایب همبستگی بر پایة 1000 بار نمونهگیری تصادفی انجام شد (11). از سویة شاخص باکتری Actinomadura madurae بهعنوان نمونة غیرخویشاوند استفاده شد که از جنسهای نزدیک Streptomyces است.
مطالعات گلخانهای:بهمنظور اطمینان از فعالیت آنتاگونیستی جدایههای اکتینومیست علیه شبهقارچ P. nicotianae عامل پوسیدگی طوقه و ریشه در گیاه گوجهفرنگی، آزمایش در شرایط گلخانه به شرح ذیل انجام گرفت. این آزمون در قالب فاکتوریل و در سه تکرار برای سه جدایه (M6، M8 و M215) با تیمارهای زیر انجام شد: 1- شاهد (گیاه بدون مایهزنی با شبهقارچ P. nicotianae و باکتریهای آنتاگونیست)، 2- اوومیست بیمارگر (P. nicotianae)، 3- جدایة M8، 4- جدایة M6، 5- جدایة M215، 6- اوومیست بیمارگر و جدایة M8، 7- اوومیست بیمارگر و جدایة M215 و 8- اوومیست بیمارگر و جدایة .M6
ضدعفونی سطحی بذرهای گوجهفرنگی:برای اطمینان از حذف آلودگیهای موجود روی سطح، بذرهای گوجهفرنگی به مدت 30 ثانیه در هیپوکلریت سدیم دو درصد قرار گرفتند و سپس برای حذف هیپوکلریت سدیم، بذور دو بار و هر مرتبه به مدت دو دقیقه در آب مقطر سترون شسته شدند.
تهیه اینوکولوم P. nicotianae وسوسپانسیون جدایههای فعال اکتینومیست:برای تولید اینوکولوم، ابتدا شبهقارچ فیتوفتورا روی محیط CMA بهصورت پلاگگذاری، کشت و به مدت 7 روز در دمای 28 درجۀ سانتیگراد نگهداری شد. پس از رشد فیتوفتورا روی محیط کشت، با اضافهکردن 20 میلیلیتر آب مقطر سترون به هر تشتک، فیتوفتورا از روی سطح محیط کشت خراش داده و برای انجام مراحل بعدی استفاده شد. برای تهیه سوسپانسیون جدایههای استرپتومایسس منتخب، ابتدا جدایههای فعال روی محیطCGA داخل تشتک پتری، کشت و به مدت 5 روز در دمای 28 درجۀ سانتیگراد نگهداری شدند. سپس 20 میلیلیتر آب مقطر سترون به هر تشتک پتری، اضافه و سطح پرگنهها با یک لولة L شکل سترون کاملاً خراش داده شد تا سوسپانسیونی از اسپور و میسلیوم حاصل شود. بذرهای ضدعفونیشدة گوجهفرنگی در گلدانهای حاوی مخلوط بستر (شن بادی سترون شستهشده،کوکوپیت و پیت ماس به نسبت وزنی 2:1:1) کشت شدند. مایهزنی خاک همزمان با کاشت بذر و بهصورت ساندویچی انجام شد. در گلدانهای شاهد، مخلوط بستر بدون هرگونه مایهزنی با اوومیست بیمارگر و یا باکتری آنتاگونیست ریخته شد. برای تیمار باکتری، 100 گرم از مخلوط بستر با 20 میلیلیتر سوسپانسیون باکتری مایهزنی شد. خاک مایهزنیشده بین دو لایة مخلوط بستر قرار گرفت و به خوبی مخلوط شد. در تیمار بیمارگر، 100 گرم از مخلوط بستر با 20 میلیلیتر سوسپانسیون بیمارگر مخلوط (مایهزنی) شد. خاک مایهزنیشده بین دو لایة مخلوط بستر قرار گرفت و به خوبی مخلوط شد. در تیمار مخلوط باکتری و بیمارگر، 20 میلیلیتر سوسپانسیون بیمارگر و 20 میلیلیتر سوسپانسیون باکتری با هم مخلوط و به 100 گرم مخلوط بستر اضافه شدند. خاک مایهزنیشده بین دو لایة مخلوط بستر قرار گرفت و به خوبی مخلوط شد. چهار عدد بذر گوجهفرنگی ضدعفونیشده در عمق یک سانتیمتری خاک هر گلدان کاشته شدند. برای هر تیمار چهار گلدان و هر گلدان بهعنوان یک تکرار در نظر گرفته شد. آبیاری گلدانها با آب مقطر سترون انجام شد (8). نود روز پس از کشت بذرها تعداد برگ، طول گیاه، وزن خشک اندامهای هوایی و ریشه و تعداد گل بررسی و ثبت شدند.
تجزیه و تحلیل آماری نتایج:تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از نرمافزارSAS نسخة 1/9 انجام گرفت. سطح معنیداری آزمونها برابر 05/0 در نظر گرفته شد. برای آنالیز توصیفی متغیرها، میانگین و انحراف معیار گزارش شده است. برای بررسی معنیداربودن تفاوت بین میانگینهای متغیرهای با توزیع نرمال از جدول آنالیز واریانس و برای بررسی تفاوت بین میانگین تیمارهای مختلف از آزمون دانکن استفاده شد.
نتایج
اثبات بیماریزایی عامل بیمارگر در شرایطآزمایشگاه:پس از 15 روز بذرهای آغشته به عامل بیمارگر، علائم بیماری را نشان دادند. علائم بیماری شامل کلونیزهکردن جوانهها و نکروز آنها توسط اوومیست بیمارگر بود که درنهایت، موجب مرگ گیاهچهها شد. بذرهای شاهد بهطور مناسب جوانه زدند و رشد کردند (شکل 1).
شکل 1- اثبات بیماریزایی Phytophthora nicotianae روی گیاهچة گوجهفرنگی رقم Super Chef در شرایط آزمایشگاه. الف) تشتک حاوی گیاهچههای سالم (شاهد) ب) تشتک حاوی گیاهچههای حاصل از بذرهای مایهزنیشده با قارچ بیمارگر
آزمون کشت متقابل و ارزیابی فعالیت ضداوومیستی باکتریها:تمام جدایههای باکتری خالصشده در آزمون زیستی به روش کشت متقابل ارزیابی شدند و میزان فعالیت ضداوومیستی آنها با اندازهگیری میزان هاله ممانعت از رشد بررسی شد. از بین جدایهها 15 جدایه قادر به ممانعت از رشد بیمارگر بودند؛ اما درنهایت، برای مراحل بعدی فقط سه جدایة M6، M8 و M215 انتخاب شدند که بیشترین هاله ممانعتکنندگی از رشد اوومیست بیمارگر را داشتند (شکل 2).
شناسایی مولکولی جدایة منتخب: قطعة تکثیرشده از روی ژن 16S rRNA روی ژل آگارز مشاهده شد. با استفاده از نشانگر استاندارد، طول این قطعه کمتر از 1500 جفتباز بود که با طول محاسبهشده براساس توالی ژنومی (1403 جفتباز) مطابقت داشت (شکل 3).
تجزیه و تحلیلهای فیلوژنی براساس ژن 16S rRNA:با استفاده از جفت پرایمر معرفیشده، یک قطعه به طول 1403جفتباز از روی ژن 16S rRNA تکثیر شد. توالی این قطعه با کد MT071745 در بانک اطلاعات NCBI ثبت شد. بررسی اولیه براساس بلاست این توالی، قرابت 100 درصدی جدایة M8 با دیگر اعضای جنس Streptomyces را نشان داد. براساس نتایج حاصل سویة شاخص S. venetus CMU-AB225T بالاترین شباهت (08/96 درصد) را با این جدایه داشت. درخت خویشاوندی یا تبارنما (درخت فیلوژنی) با استفاده از این توالی و توالیهای اخذشده از بانک ژن رسم شد (شکل 4).
شکل 2 - نتایج فعالیت ضداوومیستی سه جدایة اکتینومیست فعال علیه بیمارگر P. nicotianae. الف) اکتینومیست جدایة M6، ب) اکتینومیست جدایة M215 و ج)اکتینومیست جدایة M8
شکل 3- باند 1403 جفتبازی حاصل تکثیر ژن 16S rRNA روی ژل آگارز
اثبات بیماریزایی عامل بیمارگر در شرایط گلخانه: دو هفته بعد از مایهزنی خاک با شبهقارچ فیتوفتورا، بوتههای گوجهفرنگی علائم پژمردگی و پوسیدگی طوقه در مقایسه با گیاهچههای سالم شاهد بروز دادند (شکل 5). منطقة بالای طوقه شامل ساقة گیاهچهها، علائم نکروز و کلونیزهشدن توسط P. nicotianae را نشان داد و بعد از کشت از مناطق نکروزه روی محیط کشت آب آگار P. nicotianae خالصسازی و شناسایی شد.
شکل 4- درخت خویشاوندی سویة M8 S. venetus براساس توالی ژن.16S rRNA درخت با استفاده از نرمافزار MEGA 5 و روش neighbor-joining رسم شده است. Accession number هر توالی در پرانتز آورده شده است. توالی مربوط بهActinomadura madurae DSM 43067T بهعنوان outgroup استفاده شد. مقادیر Bootstrap براساس 1000 تغییر شکل مجدد محاسبه و در نقاط انشعاب نشان داده شدهاند.
شکل 5- آزمون بیماریزایی در شرایط گلخانه. الف)گیاهان گوجهفرنگی سالم و بدون علائم بیماری، ب) ساقة آلوده به اوومیست بیمارگر، ج) گیاه تیمارشده با اوومیست و دارای علائم بیماری، د) تشکیل ریسههای اوومیست در اطراف قطعات ساقة گیاه آلوده به عامل بیمارگر روی محیط آب - آگار بعد از 3 روز، ه) قطعات ساقة سالم روی محیط آب – آگار و ی) تصویر میکروسکوپی اسپورانژیومهای واجد 2 پاپیل و یک پاپیل P. nicotianae
.ارزیابی تأثیر عامل بیمارگر و جدایههای باکتری بر شاخصهای رشد گیاه در شرایط گلخانه:نتایج نشان دادند عامل بیمارگر موجب کاهش معنیدار طول گیاه شد. تیمار با باکتری نهتنها از کاهش طول گیاه آلودهشده با اوومیست جلوگیری کرد، بلکه در تیمار با جدایة M8 افزایش طول در مقایسه با کنترل آلودهنشده نیز مشاهده شد. تفاوت معنیداری بین جدایههای باکتری همراه با عامل بیمارگر وجود نداشت؛ اما تأثیر جدایة M8 بیشتر از دو جدایة دیگر بود (شکل 6).
نتایج حاصل از آزمون دانکن روی میانگین تعداد برگ یک بوته نشان دادند تعداد برگ در تیمارهای M6، M8 و M215 آلودهشده با عامل بیمارگر بهطور معنیداری بیشتر از تیمار آلودهشده و بدون باکتری است. تیمار با هریک از سه باکتری موجب افزایش تعداد برگ در مقایسه با شاهد شد و اختلاف معنیداری بین باکتریها وجود نداشت؛ اما تأثیر جدایههای M8 و M215 بر گیاه آلوده با بیمارگر بیش از جدایة M6 بود (شکل 7).
خروجی حاصل از آزمون دانکن روی میانگین تعداد گل هر بوته نشان داد عامل بیمارگر بر کاهش تعداد گل تأثیر معنیداری داشت. دو جدایة M6 و M8 در مقایسه با تیمار ph اثر منفی عامل بیمارگر را بهطور معنیداری کاهش دادند و موجب افزایش معنیدار تعداد گل شدند (شکل 8).
شکل 6- نمودار مقایسة میانگین طول گیاه برحسب سانتیمتر، 90 روز پس از کشت بذر گوجهفرنگی در شرایط گلخانه. شاهد، فاقد هرگونه میکروارگانیسم (Cnt)، تیمار حاوی مایه تلقیح اوومیست بیمارگر (ph)، M6،M8وM215 جدایههای باکتری. حروف مشابه تفاوتهای غیرمعنیدار مطابق دامنة دانکن را نشان میدهند (05/0P˂)
شکل 7- نمودار مقایسة میانگین تعداد برگ 90 روز پس از کشت بذر گوجهفرنگی در شرایط گلخانه. شاهد، فاقد هرگونه میکروارگانیسم (Cnt)، تیمار حاوی مایة تلقیح اوومیست بیمارگر (ph)، M6،M8وM215 جدایههای باکتری. حروف مشابه تفاوتهای غیرمعنیدار مطابق دامنة دانکن را نشان میدهند (05/0P˂)
شکل 8- نمودار مقایسة میانگین تعداد گل 90 روز پس از کشت بذر گوجهفرنگی در شرایط گلخانه. شاهد، فاقد هرگونه میکروارگانیسم (Cnt)، تیمار حاوی مایة تلقیح اوومیست بیمارگر (ph)، M6،M8وM215 جدایههای باکتری. حروف مشابه تفاوتهای غیرمعنیدار مطابق دامنة دانکن را نشان میدهند (05/0P˂)
عامل بیمارگر موجب کاهش وزن خشک اندام هوایی شد؛ اما این تأثیر معنیدار نبود. تنها جدایة M8 در صورت حضور و عدم حضور عامل بیمارگر موجب افزایش معنیدار وزن خشک اندام هوایی گیاه در مقایسه با شاهد و تیمار حاوی اوومیست شد (شکل 9).
تأثیر عامل بیمارگر بر وزن خشک ریشه همانند وزن خشک اندام هوایی معنیدار نبود. در این شرایط دو جدایة M6 و M8 موجب افزایش معنیدار وزن خشک ریشه در مقایسه با شاهد و عامل بیمارگر شدند. تأثیر این دو جدایه تفاوت معنیداری با یکدیگر نداشت. تأثیر جدایة M215 بر افزایش وزن خشک ریشه در مقایسه با شاهد و جدایة M8 معنیدار بود؛ اما تفاوتی با جدایة M6 نداشت (شکل 10).
شکل 9- نمودار مقایسة میانگین وزن خشک اندام هوایی 90 روز پس از کشت بذر گوجهفرنگی در شرایط گلخانه. شاهد، فاقد هرگونه میکروارگانیسم (Cnt)، تیمار حاوی مایة تلقیح اوومیست بیمارگر (ph)، M6، M8 وM215 جدایههای باکتری. حروف مشابه تفاوتهای غیرمعنیدار مطابق دامنة دانکن را نشان میدهند (05/0P˂)
شکل10- نمودار مقایسة میانگین وزن خشک ریشه 90 روز پس از کشت بذر گوجهفرنگی در شرایط گلخانه. شاهد، فاقد هرگونه میکروارگانیسم (Cnt)، تیمار حاوی مایة تلقیح اوومیست بیمارگر (ph)، M6، M8 وM215 جدایههای باکتری. حروف مشابه تفاوتهای غیرمعنیدار مطابق دامنة دانکن را نشان میدهند (05/0P˂)
مقایسة عملکرد جدایههای ارزیابیشده نشان داد جدایة M8 بیشترین تأثیر را در افزایش شاخصهای رشد گیاه گوجهفرنگی رقم Super Chef داشت و بعد از آن بهترتیب جدایههای M215وM6 قرار گرفتند (جدول 1).
جدول 1- تأثیر جدایههای M6، M8 وM215 در ارتقای شاخصهای رشد شامل ارتفاع گیاه، تعداد برگ، تعداد گل، وزن بوته و وزن ریشة گیاه گوجهفرنگی
|
جدایه |
% افزایش ارتفاع گیاه |
% افزایش تعداد برگ |
% افزایش تعداد گل |
% افزایش وزن خشک اندام هوایی |
% افزایش وزن خشک ریشه |
|
M8 |
48 |
28 |
187 |
30 |
54 |
|
M215 |
32 |
28 |
106 |
15 |
45 |
|
M6 |
24 |
28 |
9 |
7 |
47 |
بحث و نتیجهگیری
دانشمندان معتقدند بقایای سموم وکودهای شیمیایی در محصولات کشاورزی میتواند سبب بروز بیماریهای خطرناک و شیوع عوارض مختلف در انسان و موجودات زنده شود. این سموم علاوه بر اینکه جمعیت طبیعی میکروارگانیسمهای خاک را تغییر میدهند، مقداری از آنها در محصولات گیاهی باقی میمانند که به انسان منتقل میشوند؛ بنابراین، روشهای مبارزة شیمیایی باید با احتیاط و بهعنوان آخرین ابزار و راهکار در مدیریت آفات و بیماریهای گیاهی استفاده شوند. کنترل بیولوژیک، برعکس مبارزه با سموم شیمیایی، به سرعت اثر نمیکند؛ اما در موارد موفق، مبارزة بیولوژیک اثرات ماندگارتری نسبت به سموم شیمیایی دارد. طی 120 سال گذشته، حدود 2000 عامل غیرمستقیم کنترلشده در برابر آفات زیستی در 196 کشور با مشکلات زیستمحیطی چشمگیر ایجاد شده است. کنترل بیولوژیک یک مؤلفة کلیدی از رویکردهای سیستم مدیریت آفات و بیماریهای گیاهی است (12).
در این تحقیق بهمنظور غربالگری استرپتومایسسهای جدید برای بیوکنترل اوومیست P. nicotianae، چندین نمونه خاک از اطراف استان کرمان (ماهان و جیرفت) و مزرعة یونجه دانشگاه شهید باهنر کرمان جمعآوری شد و حدود 200 جدایة اکتینومیست خالص به دست آمد. بهمنظور ارزیابی فعالیت ضداوومیستی این جدایهها، آزمون زیستی به روش دیسکگذاری وکشت متقابل انجام شد و درنهایت، سه جدایه با کدهای M215، M8و M6 با داشتن حداکثر هاله ممانعت از رشد در شرایط آزمایشگاهی، برای انجام آزمایشهای بعدی انتخاب شدند. از بین این سه جدایه، M8 بیشترین اثر بازدارندگی از رشد هیفها در شرایط in vitro را داشت و بعد از آن بهترتیب جدایة M215 و M6 قرار داشتند. در مقایسه با تحقیق حاضر، لی و همکاران[ii] (22)، 239 جدایة اکتینومیست از 29 نمونه خاک جدا کردند که 48 مورد آن در برابر P. nicotianae اثرات آنتاگونیستی بروز دادند. براساس ویژگیهای مورفولوژی و فیزیولوژی - بیوشیمی، آنتاگونیستها بهعنوان استرپتومایسس (41 جدایه، 92/97 درصد) و Nocardia (یک جدایه) شناسایی شدند. سه جدایة اکتینومیست که فعالیت آنتاگونیستی بیشتری در کشت متقابل نشان دادند، برای مراحل بعدی انتخاب شدند. نتایج آنها نشان دادند متوسط درصد بازدارندگی 80/59 درصد است که بیشترین میزان بازدارندگی 69/75 درصد مربوط به جدایة A27-12 و کمترین میزان بازدارندگی 50 درصد مربوط به جدایة A30-19 بود و هر دو تفاوت معنیداری داشتند؛ درحالیکه نتایج آزمایش گلخانهای اثرات متفاوتی را نشان دادند. بیشترین تأثیر آنتاگونیستی را جدایة A30-19 79/78 درصد اعمال کرد و دو باکتری دیگر شامل A36-15 و A27-12 بهترتیب 95/67 درصد و 41/57 درصد اعمال کردند. در صورتی که در تحقیق حاضر نتایج بررسی فعالیت آنتاگونیستی جدایههای باکتری منتخب در شرایط آزمایشگاهی با شرایط گلخانهای مطابقت داشتند. همچنین در تحقیقات دیگری، سویههای استرپتومایسس در کنترل زیستی گیاهچۀ میری خیار ناشی از شبهقارچ P. capsici نتایج مشابه تحقیق حاضر از قبیل کنترل بیماری و اثرات محرک رشد اما در شرایط نامساعد محیطی بروز دادند (23).
در مطالعات گلخانهای تحقیق حاضر، شاخصهای رشدی گیاهان گوجهفرنگی بررسی و آنالیز آماری شد. نتایج بررسیهای آماری ثابت کرد ازنظر طول گیاه بین جدایههای اکتینومیست، بیشترین مربوط به جدایة M8و بعد از آن بهترتیب جدایة M215 و M6 است. با توجه به نتایج ازنظر طول گیاهان، بین تیمارهای M8 و M8 +P. nicotianae با P. nicotianaeاختلاف معنیدار وجود داشت. همچنین، بین تیمار M8 با تیمار M215+P. nicotianaeاختلاف معنیداری وجود دارد؛ درصورتی که بین تیمارهای P. nicotianae+M8، M6، P. nicotianae و P. nicotianae+M215 اختلاف معنیداری وجود ندارد. ازنظر تعداد برگچه، بین تیمارهای استرپتومایسس، بیشترین مقدار مربوط به جدایة M215و بعد از آن بهترتیب مربوط به جدایة M8 و M6 است. نتایج حاصل از آزمون دانکن روی میانگین تعداد برگچهها نشان میدهند بین تیمارهای M8، M6 و M215 و M215+P. nicotianae با تیمار P. nicotianae اختلاف معنیداری وجود دارد. علاوه بر این، بین تیمار M6 با M6+P. nicotianae اختلاف معنیدار وجود دارد. در صورتی که بین تیمارهای M6، M8، M215، M8+P. nicotianaeو M215+P. nicotianae اختلاف معنیداری وجود ندارد. خروجی آزمون دانکن روی وزن خشک ریشه نشان میدهد وزن خشک تیمارهای M8،M8+P. nicotianae ، M6 و M215 نسبت به سایر تیمارها بیشتر است و وزن خشک ریشه در جدایههای دارای اکتینومیست نسبت به جدایههای دارای اوومیست بیشتر بوده است. این نتایج نشاندهندة اثر مثبت محرک رشدی تیمارهای بالا روی افزایش وزن خشک ریشه و کاهش خسارت ناشی از اوومیست بیمارگر است. کمترین وزن ریشه مربوط به تیمار حاوی Ph. nicotianae بود. بین تیمارهایM8، M8+Ph. nicotianae و Ph. nicotianae اختلاف معنیدار وجود داشت. همچنین بین تیمارهای M6، M6+Ph. nicotianae و Ph. nicotianae اختلاف معنیدار وجود داشت. در تحقیقات دیاس و همکاران[iii] (24) و کوردووز و همکاران[iv] (25)، نقش مؤثر جدایههای استرپومایسس در تولید ترکیبات آلی فرار، سیدروفور، تنظیم آنزیمهای مؤثر در رشد گیاه و تأثیر مثبت بر شاخصهای رشدی گیاه و آنتاگونیسم میکروبی در آزمایشات متعددی تأیید شده است. برآورد کلی نتایج این تحقیق در راستای سایر تحقیقات مرتبط انجامشده توسط محققان در سطح ملی و بینالمللی نشان میدهند جدایههای استرپتومایسس، انتخاب مناسبی برای بهبود عملکرد گونههای گیاهی در شرایط تنش ناشی از شبهقارچها و قارچهای بیمارگر گیاهی خاکبرد محسوب میشوند.
)