نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری گروه میکروبیولوژی، پردیس علوم و تحقیقات فارس، دانشگاه آزاد اسلامی، فارس، ایران، 2-گروه میکروبیولوژی، واحد شیراز، دانشگاه آزاد اسلامی، شیراز، ایران
2 استادیار گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم پایه، واحد تهران شمال، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 دانشیار گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، واحد ساوه، دانشگاه آزاد اسلامی، ساوه، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Klebsiella pneumoniae is a human opportunistic pathogen. Biofilm formation is one of the important properties of this bacteria that leads to the development of multidrug-resistant phenotypes. In recent years, Nanoparticle Technology (NP) has been an important field in a wide range of studies. In this study, the effects of chemical nanoparticles on biofilm formation and antibiotic resistance of Klebsiella pneumoniae were investigated.
Materials and methods: Overall, 340 samples from patients were collected from different hospitals in Tehran. Colonies were tested to identify bacteria based on standard techniques. In each bacterium, the presence of important biofilm formation genes in Klebsiella pneumoniae was detected by Multiplex PCR and their expression levels were analyzed using the Real-time PCR method. The effect of chemical nanoparticles of iron oxide on biofilm formation and antibiotic resistance was also investigated.
Results: Sixty isolates of Klebsiella pneumoniae were identified based on standard techniques. The results showed that both types of iron oxide nanoparticles had a significant effect on inhibiting the formation of biofilm and antibiotic resistance of this bacterium (p <0.001). In addition, the combination of iron oxide nanoparticles and ciprofloxacin had significant antimicrobial effects compared to other compounds (p <0.001).
Discussion and conclusion: The formation of biofilm and the antibiotic resistance of Klebsiella pneumoniae isolates were effectively inhibited in response to iron oxide nanoparticles. The results could be useful in controlling multiple drug-resistant infections in hospitalized patients.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
کلبسیلا پنومونیه[1] یک باکتری گرم منفی، متعلق به خانوادة انتروباکتریاسه است که بهعنوان پاتوژن فرصتطلب انسانی باعث عفونتهای شدید مانند عفونت دستگاه ادراری، مننژیت، پنومونی و سپتیسمی، بهویژه در بیماران بستری میشود (1، 2). بهطور طبیعی نرخ بیماریزایی مرتبط با این باکتری کم است؛ اما توانایی تشکیل بیوفیلم و تجمع باکتریها، به بروز مقاومت آن به چندین آنتیبیوتیک منجر میشود که یک عامل مهم بیماریزا برای باکتری تلقی میشود (3). یک بیوفیلم شامل چندین باکتری است که در سطح کلنیزه میشوند و با یکدیگر و با ماتریکس خارج سلولی تماس دارند و از پروتئینها، اسیدهای نوکلئیک، کربوهیدراتها و سایر ماکرومولکولها تشکیل شده است (4). تنظیم ژنی تولید بیوفیلم بر عهدة دستهای از ژنهای مهم است. ژن mrkD پروتئین ساختاری فیمبریه را کد میکند و در شروع اتصال باکتری به کاتتر برای تشکیل بیوفیلم مهم است (1، 3، 5). ژنهای treC و sugE با تنظیم پلیساکارید کپسول که در شکلگیری بیوفیلم ضروریاند، بر تشکیل بیوفیلم اثر میگذارند (6). سلولهای باکتریایی با استفاده از مولکولهای سیگنالینگ (پیامرسان) شیمیایی که بهعنوان کروم سنسینگ شناخته میشوند، با یکدیگر ارتباط برقرار میکنند و در فنوتیپهای باکتریایی مانند تشکیل بیوفیلم اهمیت دارند. ژن LuxS یکی از ژنهای مهم در فرایند کروم سنسینگ و تشکیل بیوفیلم است (7). در سالهای اخیر، فناوری نانوذرات ([2]NP) یکی از زمینههای مهم در طیف گستردهای از مطالعات بوده است. در مطالعات میکروبیولوژیکی، نانوذرات عملکردهای جالبی در مهار میکروارگانیسمهای مختلف بیماریزا داشتهاند. یکی از خصوصیات مهم نانوذرات، نسبت سطح به حجمشان است که به آنها اجازة برقراری ارتباط با ذرات دیگر را میدهد (8، 9). به نظر میرسد ماهیت سمی و شیمیایی فلزات با این مکانیسمها تغییر یافته و به ایجاد نانوذرات با خصوصیات مختلف فیزیکی، حرارتی، شیمیایی، مغناطیسی، اپتیکال و الکتریکی منجر شده است (10، 11). نانوذرات فلزی مانند نقره و طلا از نانوذرات مهمیاند که میتوانند برای هر دو باکتری گرم مثبت و گرم منفی خواص ضدباکتری داشته باشند (12، 13). امروزه علاوه بر روشهای شیمیایی، روشهای زیستی برای تولید نانوذرات فلزی بهعنوان روشهای سبز غیرسمی توسعه یافتهاند. انواع مختلف نانوذرات فلزی با خواص ویژه توسط بسیاری از باکتریها، گیاهان و قارچها میتوانند ساخته شوند (14-16). اکسیدهای آهن نوعی از اکسیدهای فلزیاند که در سیستمهای ذخیرة انرژی، تحریک سلولها، کاتالیزورها و حاملهای دارویی مفیدند (17-19). مگنتیت (Fe3O4) یکی از نانوذرات اکسید آهن است که توسط باکتریهای مغناطیسی تولید میشود (20، 21). سویههای باسیلوس سرئوس[3] و باسیلوس سوبتیلیس[4] نیز نانوذرات مغناطیسی را در مقادیر زیاد تولید میکنند (22، 23).
مطالعة حاضر بر آن بوده است تا اثرات نانوذرات اکسید آهن را بر تشکیل بیوفیلم جدایههای کلبسیلا پنومونیه در نمونههای بالینی مختلف تعیین کند.
مواد و روشها
جداسازی و شناسایی باکتریهای کشتشده: درمجموع، 340 نمونة بالینی از بیماران در بیمارستانهای مختلف تهران جمعآوری شد. نمونههای بالینی شامل سواب زخم، ادرار، خلط و خون، با سیستم انتقالی کری - بلیر به محیط کشت منتقل شدند. شناسایی باکتریها براساس تکنیکهای استاندارد انجام شد (24، 25). رنگآمیزی گرم، آزمونهای کاتالاز، اکسیداز، حرکت، اندول و اورهآز، استفاده از سیترات، آزمایشهای بیوشیمیایی در محیط اکسیداسیون و تخمیر (محیط OF) و اکسیداسیون گلوکز در محیط کشت کریگلر آیرون آگار (کیولب، کانادا) Krigler Iron Agar (KIA) برای شناسایی کلنیهای باکتری استفاده شدند. سپس توالی 16srRNA کلنیهای جداشده بررسی شد.
آزمایش حساسیت ضدمیکروبی: جدایههای کلبسیلا پنومونیه برای حساسیت ضدمیکروبی با استفاده از روش انتشار دیسک (تکنیک کربی - بایر) بررسی شدند. برای آزمایش حساسیت از دیسکهای ضدمیکروبی (پادتن طب، ایران) شامل سیپروفلوکساسین (5 میلیگرم)، ایمیپنم (10 میکروگرم)، جنتامایسین (10 میکروگرم)، آمیکاسین (30 میکروگرم) و سفتریاکسون (30 میکروگرم) استفاده شد.
تعیین MIC نانوذرات اکسید آهن: نانوذرات اکسید آهن با اندازة 40 نانومتری بهصورت تجاری (مرک، آمریکا) تهیه شدند و تصویر SEM آنها تهیه شد (شکل 1). برای شناسایی حداقل غلظتهای مهارکننده (MICs)، روش میکروتیتر پلیت براساس روش استاندارد پیشنهادی توسط کمیتة استانداردهای آزمایشگاههای بالینی (CLSI) استفاده شد. تکنیک انتشار دیسک برای به دست آوردن بهترین غلظت نانوذره برای آزمایش MIC انجام شد و نتایج بهصورت هالة عدم رشد با استفاده از نانوذرة آمادهشده نشان داده شدند. تمام چاهکها در پلیت میکروتیتر با 100 میلیلیتر محیط کشت مولر هینتون براث استریل پر شدند. رقت سریالی نانوذره در پلیت میکروتیتر، تهیه (به چاهک اول 100 میکرولیتر از نانوذره با غلظت 2048 میکروگرم در میلیلیتر اضافه شد) و سپس 100 میکرولیتر از سوسپانسیون میکروبی با غلظت نیم مک فارلند به هر چاهک اضافه شد. پلیت میکروتیتر در دمای 37 درجة سانتیگراد به مدت 24 ساعت انکوبه شد. MIC بهعنوان حداقل غلظت نانوذرات تعریف شد که از رشد ارگانیسمها (کلبسیلا پنومونیه) در محیط کشت ممانعت میکند.
شکل 1- عکسبرداری میکروسکوپ الکترونی روبشی از نمونة نانوذرات مغناطیسی آهن Fe3O4 خریداریشده در مقیاس 100 نانومتر
تشخیص بیوفیلم: جدایههای کلبسیلا پنومونیه به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجة سانتیگراد در محیط کشت تریپتیک سوی براث (TSB) (کیولب، کانادا) رشد کردند. کلنیها برای تشکیل غلظت 5/0 مکفارلند رقیق شدند. بعد از آن، 20 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری به چاهکهای میکروپلیت 96 خانة پلیاستیرنی اضافه شد که قبلاً 180 میکرولیتر TSB داشتند و سپس به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجة سانتیگراد انکوبه شد. چاهکها با محلول بافر فسفات (PBS) سه بار شسته شدند تا سلولهای متصلنشده حذف شوند و سپس در حالت معکوس خشک و با متانول تثبیت شدند. کریستال ویوله 1/0 درصد (CV) به مدت 5 دقیقه برای رنگآمیزی پلیتها استفاده شد. بعد از آن، چاهکها یک بار دیگر شسته و خشک شدند. بهمنظور سنجش میزان رنگ متصلشده که نمایانکنندة میزان بیوفیلم بود، 200 میلیلیتر اسید استیک گلاسیال 33 درصد به هر چاهک اضافه شد. جذب نوری (OD) در محدودة 630 نانومتر با دستگاه الایزا (BioTek, USA) با 3 تکرار اندازهگیری شد. ODc بهعنوان سه انحراف معیار بیشتر از میانگین OD کنترل منفی تعیین شد. چهار گروه برای طبقهبندی نتایج در نظر گرفته شدند؛ ازجمله باکتریهای متصلنشده (OD ≤ ODc)، باکتریهای با اتصال ضعیف (ODc
بررسی ژنتیکی: DNA با استفاده از کیت (پیشگامان، ایران) و با توجه به دستورالعمل شرکت سازنده استخراج شد. ژنهای هدف با PCR چندگانه تکثیر شدند. پرایمرها با نرمافزارGene Runner طراحی شدند (جدول 1). PCR چندگانه با استفاده از مستر میکس (آمپلیکون، دانمارک) و دستگاه PCR (Bio-Rad، آمریکا) انجام شد. مخلوط واکنش شامل 5/12 میکرولیتر محلول کاری X2، 4 میکرولیتر DNA الگو، 6/1 میکرولیتر پرایمر و 1/2 میکرولیتر آب، به حجم کلی 25 میکرولیتر رسانده شد. شرایط دمایی PCR به شرح زیر تنظیم شد: 95 درجة سانتیگراد به مدت 3 دقیقه (مرحلة تقلیب اولیه)، 35 چرخه بهصورت 95 درجة سانتیگراد برای 30 ثانیه (مرحلة تقلیب)، 58 درجة سانتیگراد برای 40 ثانیه (مرحلة اتصال پرایمرها)، 72 درجة سانتیگراد برای 60 ثانیه (مرحلة طویلسازی) و سپس 72 درجة سانتیگراد به مدت 5 دقیقه (مرحلة طویلسازی نهایی). الکتروفورز روی ژل آگارز 1 درصد برای تشخیص تکثیر ژن در نمونهها، انجام و تصویر با دستگاه UV ترانسلومیناتور (آمریکا) گرفته شد.
پروتکل استخراج RNA و سنتز DNA مکمل (cDNA): برای استخراج RNA از کیت استخراج RNA سینا پیور با توجه به دستورالعمل شرکت سازنده استفاده شد. خلوص RNA استخراجشده نیز با دستگاه نانودراپ (2000c ,Thermo Fisher Scientific, USA)، ارزیابی و درنهایت، cDNA با استفاده از کیت 2-Steps RT-PCR (ویوانتیس- مالزی) طبق دستورالعملهای تولیدکننده ساخته شد.
جدول 1- توالی پرایمرهای رفت و برگشت استفادهشده در PCR و real-time PCR
|
نام پرایمر |
فوروارد (’3- ’5) |
ریورس (’3- ’5) |
طول محصول (bp) |
|
MrkD |
ACACCACCAACTATTCCCTCG |
ATGGAACCCACATCGACATTC |
229 |
|
TreC |
GTATCGTGCTGGATATGGTGC |
TCACGGTAATCGCTGATGCTG |
856 |
|
SugE |
TGGTTCCCAGCGTTATCACCA |
TCACGATACAGACAAGGCTGG |
198 |
|
LuxS |
ACTTACACCATGCACTCGCTG |
CAGTTCGTCGTTGCTGTTGATG |
90 |
|
16S rRNA |
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG |
AAGGAGGTGATCCAGCCGCA |
- |
اندازهگیری سطح بیان ژن luxS: برای تجزیه و تحلیل سطح رونویسی ژن luxS، real-time PCR با استفاده از محلول کاری X2 سایبر گرین، های راکس (امپلیکون - دانمارک) و دستگاه real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, USA) انجام شد. مخلوط واکنش حاوی 10 میکرولیتر محلول کاریX 2، 1 میکرولیتر cDNA، 2 میکرولیتر پرایمر (1 میکرولیتر از هر پرایمر) و 7 میکرولیتر آب عاری از RNase به حجم کل 20 میکرولیتر بود. شرایط real-time PCR به این صورت تنظیم شد: 95 درجة سانتیگراد به مدت 10 دقیقه (مرحلة تقلیب اولیه)، 40 چرخه 95 درجة سانتیگراد برای 20 ثانیه (مرحلة تقلیب)، 56 درجة سانتیگراد برای 30 ثانیه (مرحلة اتصال پرایمرها) و 72 درجة سانتیگراد به مدت 30 ثانیه (مرحلة طویلسازی). برای اندازهگیری سطح بیان ژن luxS، از روش CT مقایسهای استفاده شد (26). سطح رونویسی ژن 16SrRNA بهعنوان ژن خانهدار برای نرمالکردن سطوح کمی نسبی ژن luxS در نظر گرفته شد.
تجزیه و تحلیل آماری: برای تجزیه و تحلیل دادهها از نرمافزار SPSS و برای ترسیم از برنامة GraphPad Prism نسخة 7، استفاده و 05/0>p بهعنوان سطح معنادار آماری تعریف شد.
نتایج
.جداسازی کلبسیلا پنومونیه و آزمایش حساسیت ضدمیکروبی: در این پژوهش از میان 340 نمونه،60 سویه (33 سویه از زنان و 27 سویه از مردان) کلبسیلا پنومونیه از منابع مختلف بالینی جداسازی شدند. نمونهها شامل ادرار (57 درصد)، خلط (21 درصد)، زخم (13 درصد) و خون (9 درصد) بودند. باکتریهای جداشده کمترین مقاومت را به جنتامایسین (33/23 درصد) و بیشترین مقاومت را به سفتریاکسون (33/48 درصد) نشان دادند. جزئیات مقاومت در برابر تمام داروها در شکل 2 نشان داده شده است.
.بررسی حضور ژنهای مؤثر در تشکیل بیوفیلم و ارتباط آنها با مقاومت آنتیبیوتیکی: حدود 66/96 درصد جدایههای کلبسیلا پنومونیه، ژنهای mrkD و treC را دارند و بهدنبال آن 95 درصد و 90 درصد از جدایهها بهترتیب ژنهایluxS و sugE را داشتند. دادهها نشان دادند حضور ژن luxS در جدایههای کلبسیلا پنومونیه فقط با مقاومت جنتامایسین رابطة معنیداری داشت (p<0.01). همچنین، بین این ژنها و تشکیل بیوفیلم رابطة معنیداری دیده نشد. قطعات مشاهدهشده روی ژل آگارز در شکل 3 نشان داده شدهاند.
شکل 2- مقاومت آنتیبیوتیکی در کلبسیلا پنومونیه
شکل 3- قطعات PCR روی ژل آگارز. ستون 1: لدر 100 جفتبازی، ستون + کنترل مثبت (Template control)، ستون no taq control: ستون no template control، ستونهای 1 تا 4 نمونهها.
آزمایش حساسیت نانوذرات: با توجه به روش انتشار دیسک، بهترین هاله مهار کلبسیلا پنومونیه در برابر نانوذرات شیمیایی اکسید آهن (08/11 میلیمتر) با غلظت 256 میکروگرم در میلیلیتر بود (جدول 2). MIC نانوذرات شیمیایی اکسید آهن برای جدایههای کلبسیلا پنومونیه بر طبق پروتکل CLSI تفسیر شد. MIC بهدستآمده شامل 28/80 ± 29/136 برای نانوذرات شیمیایی اکسید آهن بود.
تأثیر نانوذرات بر تشکیل بیوفیلم کلبسیلا پنومونیه: باکتریها براساس توانایی تشکیل بیوفیلم توسط کلبسیلا پنومونیه به 4 دسته تقسیم شدند: قوی (67/26 درصد)، متوسط (40 درصد)، ضعیف (15 درصد) و عدم تشکیل بیوفیلم (13/18 درصد). جدایههای تشکیلدهندة بیوفیلم با نانوذرات شیمیایی اکسید آهن تحتتأثیر قرار گرفتند. تفاوتهای چشمگیری در تشکیل بیوفیلم در این جدایهها یافت شدند (جدول 3).
جدول 2- هاله عدم رشد کلبسیلا پنومونیه
|
(P) |
هاله عدم رشد (میلیمتر) انحراف معیار ± میانگین |
نمونه (ترکیب نانوذرات و سیپروفلوکساسین) |
|
** 001/0> |
46576/5 ± 3/19 55555/5 ± 6833/20 |
سیپروفلوکساسین غلظت 256 نانوذرة شیمیایی+ سیپروفلوکساسین |
|
** 001/0> |
55555/5 ± 6833/20 86135/1 ± 0893/11 |
غلظت 256 نانوذرة شیمیایی+ سیپروفلوکساسین غلظت 256 نانوذرة شیمیایی |
|
** 001/0> |
86135/1 ± 0893/11 46576/5 ± 3/19 |
غلظت 256 نانوذرة شیمیایی سیپروفلوکساسین |
غلظت برحسب میکروگرم بر میلیلیتر است.
(**) معنیدار در سطح 01/0 است.
جدول 3- درصد تشکیل بیوفیلم در حضور نانوذرة شیمیایی با غلظتهای متفاوت
|
توانایی تشکیل بیوفیلم |
بدون نانو |
g/mlµ 64 |
غلظت g/mlµ 128
|
غلظت g/mlµ 256
|
|
عدم اتصال |
% 33/18 |
% 30 |
% 65 |
% 66/86 |
|
ضعیف |
% 15 |
% 33/38 |
% 35 |
% 34/13 |
|
متوسط |
% 40 |
% 67/31 |
- |
- |
|
قوی |
% 67/26 |
- |
- |
- |
.اثر نانوذرات بر سطح بیان ژن luxS در کلبسیلا پنومونیه: برای ارزیابی سطح بیان ژن luxS، یک جدایه با مقاومت بالای آنتیبیوتیکی و تشکیل بیوفیلم قوی انتخاب شد. مشخص شد سطح بیان ژن luxS با نانوذرات اکسید آهن 77/18 درصد کاهش یافته است که ازنظر آماری معنیدار تلقی میشود (p<0.001) (شکل 4).
شکل 4- نتایج Real–Time PCR برای ژن luxS در ایزولة کلبسیلا پنومونیه تشکیلدهندة بیوفیلم در حالتهای تیمارشده (treat) و تیمارنشده (non treat) با نانوذرات اکسید آهن زیستی. ژن 16srRNA بهعنوان ژن House-keeping استفاده شده است.
بحث
کلبسیلا پنومونیه یک پاتوژن فرصتطلب انسانی است که عفونت شدید در بیماران بستریشده ایجاد میکند و تهدید جهانی در سیستم مراقبت بهداشتی در نظر گرفته میشود (1، 2). یک مطالعة قبلی نشان داده است مرگومیر ناشی از عفونت کلبسیلا پنومونیه حدود 50 درصد در بیماران آلوده است و عمدتاً بهعلت افزایش فنوتیپهای مقاومت چند دارویی بهعنوان یک مسئله مهم در سیستمهای مراقبتهای بهداشتی تلقی میشود (27).
پس از افزایش پدیدة مقاومت چند دارویی در باکتریهای مختلف، خصوصیات آنتیباکتریال نانوذرات فلزی یکی از مهمترین زمینههای مطالعات میکروبیولوژی شده است. نانوذرة اکسید آهن یکی از نانوذرات فلزی است که بهعلت تولید رادیکالهای اکسیژن، خواص آنتیبیوتیکی دارد که به شکستن رشتة DNA، دپلیمریزهشدن پلیساکارید، غیرفعالشدن آنزیمها و پراکسیداسیون لیپید منجر میشود (28).
در مطالعة حاضر، 60 جدایه کلبسیلا پنومونیه حاصل از نمونههای مختلف بالینی تجزیه و تحلیل شدند که از بیمارستانها جمعآوری شده بودند. حدود 82 درصد از جدایهها قادر به تشکیل بیوفیلم بودند. تمامی جدایهها برای حضور ژنهای مرتبط در تشکیل بیوفیلم بررسی شدند. تقریباً بیش از 90 درصد از جدایههای کلبسیلا پنومونیه این ژنها را داشتند که برای تشکیل بیوفیلم مهماند. همچنین، نانوذرات اکسید آهن سطح بیان ژن luxS را بهعنوان یک ژن مهم در تشکیل بیوفیلم کلبسیلا پنومونیه بهصورت معنیداری کاهش دادند. در مطالعة مشابهی ترابی و همکاران اثر ضدباکتریایی ترکیب نانوذرات MgO و Fe2O3 بر باکتریهای اشریشیاکلی و استافیلوکوکوس اورئوس را در محیط مایع، ارزیابی و سپس اثر آنها را همزمان در آبمیوههای هویج، انار و سیب بهصورت جداگانه به روش کلنی کانت بررسی کردند و نشان دادند اثر ترکیبی دو نانوذره باعث کاهش رشد هر دو باکتری میشود (9). اثر ترکیبی از نانوذرات اکسید آهن و اکسید منیزیم باعث تخریب غشای سلولی و سپس نشت محتویات داخل سلولی و درنهایت، مرگ سلولهای باکتریایی میشود؛ این اثر، مکانیسم اصلی ضدباکتریایی این نانوذرات است (11-10). با توجه به سایر مطالعات (9-12) به نظر میرسد فعالیت ضد بیان ژنهای دخیل در تشکیل بیوفیلم نوع دیگری از اثرات این نانوذرات در روند فعالیتهای ضدباکتریایی آنها باشد. در مطالعات دیگر کاهش اندازه و بهدنبال آن، افزایش سطح مخصوص بهعنوان عامل افزایش تعداد گروههای فعال روی سطح ذرات، مهمترین فاکتورهای مؤثر بر افزایش سمیت نانوذرات برشمرده شدهاند. در مقایسه با سایر مطالعات (9، 22، 23) میتوان نتیجه گرفت نانوذرات 40 نانومتری استفادهشده در این مطالعه از فعالیت ضدمیکروبی قوی برخوردارند.
دادههای این مطالعه نشان دادند باوجود نیاز به بررسیهای بیشتر دربارة سمیت سلولی این ذرات، نانوذرات اکسید آهن میتوانند برای کنترل عفونت در بیماران بستری، طراحی روشهای جدید درمان برای جلوگیری از عفونت و کلونیزهشدن کلبسیلا پنومونیه و همچنین مهار سویههای مقاوم به چند دارو مفید باشند.
)