نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران
2 استادیار گروه میکروبیولوژی، دانشکدۀ علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد تهران شمال، تهران، ایران
3 دانشیار گروه علوم گیاهی، دانشکدۀ علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم تحقیقات، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Clavulanic acid is the first B-Lactamase inhibitor that has been used clinically since 1981. This inhibitor is the natural product of the fermentation of Streptomyces clavuligerus and is useful for protecting B-lactams against lots of important B-lactamases such as Group A B-lactamases and Group D Cloxacillin lysis enzymes. The aim of this study was to optimize the composition of the fermentation medium in terms of the carbon source in the production of clavulanic acid.
Materials and Methods: In this experiment, the influence of different concentrations of glycerol 15 g/L, wheat bran 17 g/L, and glucose 18.1 g/L on the production of clavulanic acid was tested. After passing the levels of sporulation, seeding, and fermentation, the influence of different concentrations of glucose, wheat bran, and glycerol on pH rates, biomass, and morphology of Streptomyces clavuligerus was tested by the light microscope. The concentration of clavulanic acid produced was measured by spectrophotometry.
Results: According to the results, the highest production of clavulanic acid in all substrates was on the eighth day. The use of glycerol at a concentration of 15 g/l produced 238.3 mg/l clavulanic acid, which had the highest production rate and also reduced production costs.
Discussion and Conclusion: Due to the price, availability, and also increasing the production of glycerol and wheat bran (compared to corn oil), the production of clavulanic acid in environments containing glycerol and wheat bran is easier and more convenient.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
استرپتومایسسها، گروه بزرگی از ریزموجودات هستند که بهعلت تولید ترکیبات باارزش، توجه بسیاری را به خود جلب کردهاند. یکی از مهمترین و باارزشترین گونههای استرپتومایسس که توجه پژوهشگران بسیاری را به خود معطوف کرده، استرپتومایسس کلاولیجروس[1] است (1). ترکیبات یادشده بهشکل متابولیت ثانویۀ ریزموجودات بهطور معمول در زمان بیشینۀ رشد میکروب تولید میشوند؛ بنابراین، چون بیشترین غلظت آنتیبیوتیک در زمان مرگ ریزموجود به دست میآید، تولید آن مستلزم زمان نسبتاً طولانی (5 تا 7 روز) است. ساختار شیمیایی آنتیبیوتیکها باهم متفاوت است و این ساختار شیمیایی ویژگیهای فیزیکی، شیمیایی، میکروبی، دارویی و بالینی آنتیبیوتیک را مشخص میکند (2). آنتیبیوتیکهای بتالاکتام که در درمان بیماریهای باکتریایی به کار میروند، بیش از 50 درصد آنتیبیوتیکها و بخش عمدهای از داروهای شیمیایی را تشکیل میدهند. آنتیبیوتیکهای بتالاکتام با مهار پروتئینهای متصلشونده به پنیسیلین، در سنتز دیوارۀ سلولی باکتریایی اختلال ایجاد میکنند (3). دسترسی آسان به ساختار این ترکیب، سمیت ناچیز، کارآمدی و اثر زیاد سبب کاربرد گستردۀ آنتیبیوتیکهای بتالاکتام در پزشکی شده است. این دسته از آنتیبیوتیکها دو خانوادۀ پنیسیلینها و سفالوسپورینها را شامل میشود. شاخصۀ اصلی آنتیبیوتیکهای بتالاکتام، وجود حلقۀ چهار عضوی بتالاکتام است (4).
از دهۀ 1970 به بعد که بحث مقاومت در برابر آنتیبیوتیکهای بتالاکتام بهطور جدی مطرح شد، غربالگریهای گستردهای برای یافتن بتالاکتامهای مقاوم به بتالاکتاماز انجام و به کشف برخی از بتالاکتامها مانند کارباپنمها منجر شدند که در برابر بتالاکتامازها مقاومترند.
میکروبشناسان واژۀ تخمیر را در دو مفهوم متفاوت به کار میبرند: در مبحث متابولیسم، تخمیر به فرایند تولید انرژی گفته میشود که در آن، ترکیبات آلی بهشکل دهنده و دریافتکنندۀ الکترون عمل میکنند؛ در میکروبیولوژی صنعتی، این واژه برای تعداد زیادی از سلولها به کار میرود که در شرایط هوازی و بیهوازی و درون ظرفی به نام فرمانتور یا بیورآکتور رشد کردهاند (5).
بهطورکلی، فرایند تولید آنتیبیوتیکها شامل پنج مرحلۀ اصلی است که عبارتند از: مرحلۀ اول- حفظ و نگهداری کشت فعال؛ مرحله دوم- تهیۀ سوسپانسیون اسپوری یا درحقیقت، مایۀ تلقیح و توسعۀ آن؛ مرحلۀ سوم- مرحلۀ پیشکشت که به آن، مرحلۀ بذردهی یا Seeding نیز گفته میشود؛ مرحله چهارم- مرحلۀ تخمیر یا fermentation که اساسیترین مرحلۀ تولید آنتیبیوتیک است؛ مرحلۀ پنجم- استخراج و برداشت محصول و خالصسازی آن (این مراحل برای تولید کلاولانیکاسید نیز صدق میکنند) (5). کلاولانیکاسید مهمترین بازدارندۀ آنزیم بتالاکتاماز است که سبب مهار عملکرد بتالاکتامازهای کروموزومی و پلازمیدی تولیدشده بهوسیلۀ باکتریهای گرم مثبت و منفی میشود (6). فرمولاسیون کلاولانیکاسید نزدیک به 20 سال در درمان طیف گستردهای از عفونتهای بالینی مؤثر بوده است. آگمنتین که نام تجاری کلاولانیکاسید است، حاوی ترکیبی از آموکسیسیلین و کلاولاناتپتاسیم است و یکی از کاربردیترین آنتیبیوتیکها به شمار میآید. باتوجهبه کاربرد کلاولانیکاسید در صنعت داروسازی، تولید ارزان این ماده میتواند کمک بزرگی به اقتصاد و داروسازی ما باشد (7). تأثیر منابع کربن در تولید کلاولانیکاسید توسط استرپتومایسس کلاولیجروس، برخلاف سفامایسین C که آن نیز یکی از محصولات تولیدی این ریزموجود است، بهطور درخور توجهی بررسی نشده و اطلاعات چندانی دربارۀ تولید کلاولانیکاسید بهوسیلۀ این باکتری منتشر نشده است؛ این امر نشاندهندۀ پژوهشهای کمتر در زمینۀ تولید کلاولانیکاسید یا اهمیت کمتر این آنتیبیوتیک نیست، بلکه به احتمال زیاد، پژوهشهای انجامشده در این زمینه بهعلت اهمیت صنعتی و تجاری این ترکیب منتشر نشدهاند.
هدف اصلی پژوهش حاضر، تولید کلاولانیکاسید با استفاده از منابع کربنی مختلف و کاهش چشمگیر هزینۀ تولید با استفاده از مقادیر مناسب منابع کربن در فرمولاسیون محیطکشت تخمیر است. در حال حاضر، باوجود تمهیداتی که علیه مصرف آنتیبیوتیکها در دنیا انجام شدهاند، هنوز انواع آنتیبیوتیکها بهطور چشمگیر در ایران استفاده میشوند و سالانه هزینۀ زیادی برای تولید و خرید این محصولات پرداخت میشود؛ این امر ضرورت بومیسازی تولید آنتیبیوتیکها با هزینۀ کمتر را در کشور نشان میدهد و از سوی دیگر، انتخاب کلاولانیکاسید در پژوهش حاضر بهعلت مقاومت آنتیبیوتیکی ایجادشده از طریق این ماده و خطر بزرگی که جامعۀ بشریت را تهدید میکند، اهمیت دارد.
مواد و روشها
الف) ریزموجودات: در پژوهش حاضر از سویۀ استرپتومایسس کلاولیجروس PTCC 1705 استفاده شد و این سویۀ مولد کلاولانیکاسید از مرکز کلکسیون ریزموجودات صنعتی ایران تهیه شد. این مرکز بیش از دو هزار نمونۀ میکروبی شامل باکتری، قارچ، مخمر و مشتقات آنها را طبق استانداردهای بینالمللی نگهداری میکند؛ از سوی دیگر، مرکز کلکسیون پیوسته با جداسازی و جمعآوری نمونههای میکروبی ایران غنیتر میشود و سرمایهای را برای پژوهشهای علمی کشور فراهم میکند.
ب) محیطکشت اسپورزایی: این محیط با ترکیبات 10 گرمبرلیتر عصارۀ مالت (Merck)، 4 گرمبرلیتر عصارۀ مخمر (Quelab)، 4 گرمبرلیتر گلوکز (Merck)، 2 گرمبرلیتر کربناتکلسیم (Merck) و 12 گرمبرلیتر آگار (Merck) تهیه شد. این محیطکشت سبب رشد اسپورها میشود و رشد میسلیومی کمتری در این مرحله دیده میشود (8). پساز ساخت محیطکشت و استریلکردن آن، سویۀ ریزموجود در شرایط استریل از آمپول لیوفیلیزه به محیطکشت منتقل و بهمنظور تولید اسپور، 14 روز در دمای 28 درجۀ سانتیگراد گرماگذاری شد.
ج) مرحلۀ بذردهی: هدف از تهیۀ این محیط، وادارکردن اسپورهای باکتری به آغاز رویش میسلیوم است (8). ترکیبات بهکاررفته در محیطکشت بذردهی شامل 10 گرمبرلیتر باکتوپپتون (Himedia)، 20 گرمبرلیتر گلیسرول (Merck) و 10 گرمبرلیتر عصارۀ مالت (Merck) بود و با تهیۀ سوسپانسیون اسپوری از مرحلۀ اسپورزایی، به میزان 1 درصد حجم محیطکشت بذردهی به آن تلقیح شد و بهمدت 48 ساعت در همزنانکوباتور با دور 200 دوردردقیقه و دمای 28 درجۀ سانتیگراد قرار داده شد. پساز گذشت مدت زمان یادشده و با سنجش عدمآلودگی میکروبی، زیستتودۀ تشکیلشده، ریختشناسی باکتری و اسیدیته، بهترین فلاسک بذردهی بهعنوان مایۀ تلقیح اصلی برای مرحلۀ تخمیر استفاده شد. مناسبترین فلاسک بذردهی انتخابشده زیر میکروسکوپ نوری، بدون آلودگی، دارای میسلیومهای مشخص، 23 تا 26 درصد زیستتوده و اسیدیتۀ 9/5 تا 1/6 بود.
د) مرحلۀ تخمیر: ترکیبات محیطکشت این مرحله بیشترین اثر را در تولید آنتیبیوتیک دارند. ترکیبات استفادهشده در محیطکشت تخمیر شامل 20 گرمبرلیتر کنجالۀ سویا، 10 گرمبرلیتر نشاسته (Merck)، 23 گرمبرلیتر روغن ذرت، 2/1 گرمبرلیتر Ca3(po4)2 (Merck)، 001/0 گرمبرلیتر ZnSO4.H2O (Merck)، 001/0 گرمبرلیتر FeSO4. 7H2O (Merck) و 001/0 گرمبرلیتر Mncl2.4H2O (Merck) بود (9). ازآنجاکه تولید کلاولانیکاسید در پژوهش حاضر با استفاده از منابع کربنی مختلف انجام شد، علاوهبر مواد یادشده، گلیسرول به مقدار 15 گرمدرلیتر، گلوکز به مقدار 18/1 گرمدرلیتر و سبوس گندم به مقدار 17 گرمدرلیتر در محیط تخمیر استفاده شد و 23 گرمدرلیتر روغن ذرت برای شاهد در نظر گرفته شد. پساز تنظیم اسیدیته و استریلکردن محیط، از مایۀ تلقیح که درحقیقت محیطکشت بذردهی ساختهشده در بخش (ج) بود، به میزان 5 تا 10 درصد حجمی به محیطکشت تخمیر افزوده شد (10) و بهمدت 12 روز در همزنانکوباتور با دمای 28 درجۀ سانتیگراد و سرعت 200 دوردردقیقه قرار داده شد و طی این مدت، کلاولانیکاسید تولید شد. در روزهای 4، 6، 8، 10 و 12 و در شرایط استریل، مقدار 10 میلیلیتر نمونه از هریک از فلاسکها گرفته شد و ریختشناسی، درصد زیستتوده، اسیدیته و میزان کلاولانیکاسید تولیدشده در هر نمونه بررسی شد. تمام آزمایشها پنج بار تکرار شدند.
سنجش اسیدیته: در پایان مرحلۀ تخمیر، میزان 5 میلیلیتر از هریک از محیطهای کشت برداشته و اسیدیته بررسی شد. بهمنظور سنجش اسیدیته از دستگاه pHمتر رومیزی (مدل (GLP 22 PH ISE CRISON استفاده شد. مناسبترین اسیدیته در این مرحله، 9/5 تا 1/6 بود.
سنجش وزن تر زیستتوده (بیومس): بهمنظور اندازهگیری وزن تر زیستتوده از رابطۀ زیر استفاده شد (8):
ه) سنجش میزان کلاولانیکاسید تولیدشده: بهمنظور استخراج کلاولانیکاسید از محیطکشت، میزان 8 میلیلیتر از هر نمونه درون لولۀ فالکن 10 ریخته شد و نمونهها بهمدت 20 دقیقه با سرعت 4000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند و سپس محلول رویی به ویال دیگر منتقل شد. بهمنظور حذف پروتئینهای مداخلهکننده، اسیدیتۀ مایع تخمیر با استفاده از هیدروکلریکاسید 1/0 نرمال معادل 2/3 تنظیم شد و سپس محلول حاصل بهمدت 20 دقیقه با سرعت 4000 دوردردقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی از طریق غشای میلیپور ( فیلتر 45/0 درصد) فیلتر شد. مایع رویی برای اندازهگیری کلاولانیکاسید استفاده شد (6).
پساز فیلترشدن، 200 میکرولیتر از محلول رویی درون ارلن 100 میلیلیتری ریخته و سپس 800 میکرولیتر از محلول ایمیدازول به آن افزوده شد (11)؛ سپس چهار ارلن 100 میلیلیتری حاوی کلاولانیکاسید و ایمیدازول بهمدت 15 دقیقه در 30 درجۀ سانتیگراد روی شیکر قرار داده شدند؛ پساز 15 دقیقه، کمپلکس زردرنگ کلاولانیکاسید و ایمیدازول مشاهده شد. میزان جذب کمپلکس رنگی کلاولانیکاسید- ایمیدازول برای هریک از نمونهها با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 311 نانومتر خوانده شد (11). مقدار 1 میلیلیتر از محلول ایمیدازول (بلانک) برای تنظیم صفر دستگاه استفاده شد. غلظتهای کلاولانیکاسید در نمونههای تخمیری با استفاده از منحنی استاندارد به دست آمدند.
تجزیهوتحلیل آماری دادهها: محاسبۀ آماری مطالعۀ حاضر با نرمافزار Graph pad prisme 5 انجام شد و نتایج با تحلیل واریانس یکطرفه (One way ANOVA) بررسی شدند و 05/0P< معنادار در نظر گرفته شد؛ سپس میزان تغییرات هریک از نمونهها با نرمافزار Graph pad prisme 5 و با استفاده از روش One way ANOVA و Tukey‘s HSD post-hoc test محاسبه شد.
نتایج
نتایج پژوهش حاضر نشان دادند میزان اسیدیته، درصد زیستتودۀ تولیدشده و غلظت کلاولانیکاسید تولیدشده طی فرایند تخمیر با تغییراتی همراه است؛ بهطوریکه در روزهای چهارم، ششم و هشتم، روند صعودی و پساز آن، سیر نزولی نشان میدهد.
الف- ابتدا به بررسی درصد وزن تر، تغییرات ریختشناسی سویۀ مدنظر و میزان کلاولانیکاسید تولیدی هنگام استفاده از 23 گرمدرلیتر روغن ذرت برای شاهد در محیطکشت تخمیر پرداخته میشود.
1- بررسی تغییرات اسیدیتۀ محیطکشت تخمیر دارای روغن ذرت (گروه شاهد): در شکل 1، تغییرات مقدار اسیدیته در محیط شاهد دارای 23 گرمدرلیتر روغن ذرت طی دورۀ تخمیر دوازدهروزه مشاهده میشود؛ بهاینترتیب که مقدار اسیدیته در روز چهارم برابر 58/5 میشود و تا روز هشتم روند افزایشی دارد و در روز هشتم به بیشترین مقدار خود (3/7) میرسد؛ با ادامۀ فرایند، مقدار اسیدیته سیر نزولی مییابد تا اینکه در روز دوازدهم تخمیر به 2/6 میرسد.
شکل 1- نمودار تغییرات اسیدیته در طول دورۀ دوازدهروزۀ کشت تخمیری در گروه شاهد
2- بررسی درصد زیستتوده در محیطکشت تخمیر دارای روغن ذرت (گروه شاهد): در شکل 2، درصد تغییرات زیستتوده در محیطکشت دارای 23 گرمدرلیتر روغن ذرت از روز اول تا دوازدهم کشت مشاهده میشود. نتایج نشان میدهند درصد زیستتوده در محیطکشت از روز اول تا روز هشتم بهترتیب روز اول 1/4، روز چهارم 13/6، روز ششم 48/12 و روز هشتم 08/14 بوده و روند افزایشی داشته است؛ سپس از روز دهم تا روز دوازدهم بهترتیب روز دهم 62/12 و روز دوازدهم 60/12 بوده و روند کاهشی داشته است.
شکل 2- نمودار درصد تغییرات زیستتوده در طول دورۀ دوازدهروزۀ کشت تخمیری در گروه شاهد
3- بررسی مقدار کلاولانیکاسید تولیدشده. در محیطکشت دارای روغن ذرت (گروه شاهد): شکل 3، مقدار کلاولانیکاسید تولیدشده در بازۀ زمانی دوازده روز را در محیطکشت دارای 23 گرمدرلیتر روغن ذرت (نمونۀ شاهد) نشان میدهد. مقدار کلاولانیکاسید تولیدی از روز اول تا روز هشتم روند افزایشی داشته و به ترتیب در روز اول 50، روز چهارم 41/76 ، روز ششم 20/118 و روز هشتم 40/230 میلیگرمدرلیتر بوده و از روز هشتم به بعد، روند کاهشی داشته و در روز دهم و دوازدهم سنجش بهترتیب در روز دهم 50/212 و روز دوازدهم 20/210 میلیگرمدرلیتر بوده است.
شکل 3- نمودار مقدار تولید کلاولانیکاسید در طول دورۀ دوازدهروزۀ کشت تخمیری در گروه شاهد
4- بررسی تأثیر روغن ذرت روی. ریختشناسی باکتری استرپتومایسس کلاولیجروس: همانطور که در شکل 4، الف دیده میشود، رشد میسلیومی باکتری در روز چهارم فرایند تخمیر آغاز میشود و هیفهای کوتاه و درحال انشعاب تولید میشوند و تا روز ششم فرایند تخمیر، میسلیومها بهطور کامل رشد میکنند و دارای طول بلند و انشعابات فراوان میشوند (شکل 4، ب). در روز هشتم، رشد میسلیومها کامل میشود و تمام میسلیومها منشعب و دارای طول بلند میشوند (شکل 4، ج). روز دهم فرایند تخمیر، میسلیومها طول کمتری دارند و در برخی قسمتها قطعهقطعه میشوند و طول و انشعابات آنها کاهش مییابد (شکل 4، د) و تا روز دوازدهم، تمام میسلیومها تجزیه میشوند و تنها قطعههای مجزا و پراکندۀ میسلیومی که طول کوتاهی دارند، دیده میشوند (شکل 4، ه).
|
|
|
|
|
|
شکل 4- ریختشناسی باکتری استرپتومایسس کلاولیجروس در محیطکشت شاهد در طول تخمیر؛ الف. روز چهارم، ب. روز ششم، ج. روز هشتم، د. روز دهم، ه. روز دوازدهم
.ب) بررسی و مقایسۀ همزمان اثر تمام غلظتها روی شاخصهای تخمیر.
1- بررسی تأثیر تمام غلظتها روی اسیدیتۀ محیطکشت. تخمیر: شکل 5 نشان میدهد در تمام غلظتها، اسیدیته در ابتدای فرایند (از روز چهارم تا روز هشتم) روند افزایشی دارد و پسازآن، کاهش مییابد. در پژوهش حاضر، بیشترین مقدار اسیدیته به روغن ذرت (23 گرمدرلیتر) و پسازآن، سبوس گندم (17 گرمدرلیتر)، گلیسرول (15 گرمدرلیتر) و درنهایت، گلوکز (18/1 گرمدرلیتر) تعلق داشت. گروههای آزمون با گروه شاهد بر اساس آزمون آماری two way ANOVA مقایسه شدند. معناداربودن دادهها با نرمافزار Graph pad prisme 5 و آزمون Tukey و One way ANOVA بررسی شد و اختلاف معنادار نسبت به گروه شاهد مشاهده نشد (P<0.122).
|
|
شکل 5- نمودار تغییرات اسیدیته در تمام گروهها طی مدت 12 روز
2- بررسی اثر تمام غلظتها روی درصد وزن تر. زیستتودۀ تولیدی محیطکشت تخمیر: شکل 6، تغییرات وزن تر زیستتوده نسبت به تمام غلظتها را نشان میدهد. بیشترین میزان وزن تر زیستتوده در روز هشتم بهترتیب به روغن ذرت (23 گرمدرلیتر) به مقدار 08/14 و سپس سبوس گندم (17 گرمدرلیتر) به مقدار 54/12، گلیسرول (15 گرمدرلیتر) به مقدار 16/12 و گلوکز (18/1 گرمدرلیتر) به مقدار 03/6 مربوط بود. گروههای آزمون با گروه شاهد بر اساس آزمون آماری two way ANOVA مقایسه شدند. معناداربودن دادهها با نرمافزار Graph pad prisme 5 و آزمون Tukey و One way ANOVA بررسی و اختلاف معنادار نسبت به گروه شاهد مشاهده شد (P<0.006).
شکل 6- نمودار تغییرات زیستتوده در تمام روزها
3- بررسی اثر تمام. غلظتها بر میزان کلاولانیکاسید تولیدی محیطکشت تخمیر: باتوجهبه شکل 7، غلظتهای مختلف روغن ذرت با غلظت 23 گرمدرلیتر به میزان 43/220 میلیگرمدرلیتر، گلیسرول با غلظت 15 گرمدرلیتر به مقدار 3/218میلیگرمدرلیتر، سبوس گندم با غلظت 17 گرمدرلیتر به مقدار 26/138 میلیگرمدرلیتر و گلوکز با غلظت 18/1 گرمدرلیتر به مقدار 11/47 میلی گرمدرلیتر رسیده است. گروههای آزمون با گروه شاهد بر اساس آزمون آماری two way ANOVA مقایسه شدند. معناداربودن دادهها با نرمافزار Graph pad prisme 5 و آزمون Tukey و One way ANOVA بررسی و اختلاف معنادار نسبت به گروه شاهد مشاهده شد (P<0.001).
شکل 7- تأثیر تمام غلظتها بر تولید کلاولانیکاسید
ج) غلظت بهینه برای تولید کلاولانیکاسید: بر اساس نتایج، علاوهبر روغن ذرت در غلظت 23 گرمدرلیتر که بهشکل شاهد در محیطکشت تخمیر استفاده شد و میزان کلاولانیکاسید تولیدی آن برابر 43/220 میلیگرمبرلیتر بود، گلیسرول با غلظت 15 گرمدرلیتر که میزان تولید کلاولانیکاسید آن در روز هشتم برابر 3/238 میلیگرمبرلیتر بود، میتواند غلظت بهینه برای تولید کلاولانیکاسید باشد؛ همچنین سبوس گندم که در پژوهشهای گذشته روی غلظتهای مختلف آن برای تولید کلاولانیکاسید کار شده است، در غلظت 17 گرمدرلیتر به میزان 26/138 میلیگرمدرلیتر کلاولانیکاسید تولید کرد. میزان تولید کلاولانیکاسید در گلوکز با غلظت 18/1 برابر 6/50 میلیگرمبرلیتر و بسیار کمتر از روغن ذرت، گلیسرول و سبوس گندم بود. مطالعۀ ریختشناسی نشان داد تولید میسلیوم در غلظت 18/1 میلیگرمدرلیتر گلوکز بسیار ناچیز است و باکتری گلوکز را به میزان بسیار کم جذب کرده است (شکل 8).
شکل 8- تصویر تغییرات ریختشناسی باکتری استرپتومایسس کلاولیجروس در روز هشتم فرایند تخمیر با غلظت 18/1 میلیگرمدرلیتر گلوکز
د) طیف جذبی محیطکشت در روزهای مختلف: شکل 9 طیف جذبی محیطکشت در روزهای دوم، چهارم، ششم و هشتم را نشان میدهد که با دستگاه اسپکتروفتومتری اندازهگیری شده است.
شکل 9- نمودار طیف جذبی گلیسرول، گلوکز، سبوس گندم و شاهد
بحث و نتیجهگیری
باتوجهبه نتایج پژوهش حاضر، استفاده از مقادیر 15 گرمبرلیتر گلیسرول و 17 گرمبرلیتر سبوس سبب تولید مقادیر مختلف کلاولانیکاسید میشود و گلوکز با میزان 18/1 گرمبرلیتر میزان بسیار ناچیزی کلاولانیکاسید میکند. مونیر[ii] و همکاران در سال 2010، بهبود و افزایش تولید کلاولانیکاسید در استرپتومایسس کلاولیجروس را با استفاده از روغن گیاهی بررسی کردند و نتیجه گرفتند استفاده از روغن زیتون بهشکل تنها منبع کربن و انرژی برای کشت استرپتومایسس کلاولیجروس، راهبرد امیدوارکنندهای برای تولید کلاولانیکاسید است و استفاده از روغن ذرت بهشکل تنها منبع کربن مناسب است. نتایج مطالعۀ حاضر با انتخاب روغن ذرت برای منبع کربن در محیط تخمیر مطابقت دارند (12).
پژوهشگران بیان کردهاند گلیسرول در غلظتهای 10 تا 15 میلیگرمدرلیتر سبب افزایش تولید کلاولانیکاسید در کشتهای فلاسک لرزشی میشود و غلظت گلیسرول بیش از 15 میلیگرمدرلیتر را برای مهار بروز کلاولانیکاسید گزارش کردهاند (6 و 13). در پژوهش حاضر، گلیسرول با مقدار 15 میلیگرمدرلیتر بیشترین میزان کلاولانیکاسید را تولید کرد.
در برخی پژوهشها، اثر آرد بادامزمینی و اجزای مختلف آن بر رشد استرپتومایسس کلاولیجروس و تولید کلاولانیکاسید در محیط کمپلکس دارای آرد سویا، آرد مالت و نمکهای معدنی بررسی شده است و نتایج نشان دادهاند بهترین غلظت آرد دانۀ بادامزمینی برای رشد استرپتومایسس کلاولیجروس و تولید کلاولانیکاسید بهترتیب برابر 5 و 1 گرمبرلیتر است که بهترتیب سبب 35 و 40 درصد افزایش زیستتوده و تولید کلاولانیکاسید میشوند (6 و 14)؛ در این راستا، استفاده از سبوس گندم بهجای روغن ذرت، منبع مناسب کربن و انرژی در فرمولاسیون فرایند تخمیر است و تولید کلاولانیکاسید در محیطکشت حاوی سبوس گندم با غلظت 4/20 گرمبرلیتر افزایش مییابد. در پژوهش حاضر، سبوس گندم با غلظت 17 گرمبرلیتر استفاده شد و نتیجه با یافتههای مطالعههای پیشین مطابقت داشت و سبب افزایش تولید کلاولانیکاسید شد (6).
باتوجهبه نتایج، همزمانبودن یا نبودن رشد باکتری و تولید کلاولانیکاسید به شرایط تخمیر و بهویژه ترکیبات محیطکشت و مقدار آنها بستگی دارد؛ در صورتی که طبق الگوی کلاسیک، بیشترین میزان آنتیبیوتیک در مرحلۀ ایدیوفاز (مرحلۀ سکون) تولید میشود (8). مطابق با این نتایج، پژوهشها نشان میدهند تولید کلاولانیکاسید سبب رشد جزئی ریزموجود میشود (10)
محیطکشت حاوی روغن گل زیتون (olive pomace oil) سبب افزایش رشد استرپتومایسس کلاولیجروس و درنتیجه، افزایش تولید کلاولانیکاسید میشود (3). کاهش دما در محدودۀ 20 تا 30 درجۀ سانتیگراد سبب افزایش تولید کلاونیکاسید در کشتهای تخمیری استرپتومایسس کلاولیجروس دارای گلسیرول در فرمانتور با سرعت 250 دوردردقیقه و اسیدیتۀ 8/6 میشود (7). آمینواسیدها بهعنوان عاملی برای افزایش بازدهی رشد در شرایطی با اسیدیته و اکسیژن کنترلشده مطالعه شدهاند. ترکیب همزمان آرژنین و گلیسرول در محیطکشت سبب تولید 130 میلیگرمبرلیتر کلاولانیکاسید و حضور همزمان اورنیتین و گلیسرول سبب تولید 200 میلیگرمبرلیتر کلاولانیکاسید میشود (15). بهطورکلی، افزودن موادی مانند گلیسرول یا روغنهای گیاهی مانند روغن ذرت و روغن زیتون در مقایسه با نشاسته (16) و ثابت نگهداشتن مقدار اکسیژن و اسیدیته، بازده تولید کلاونیکاسید را افزایش میدهد. همچنین روشهای مختلف تخمیری مانند fed-batch در افزایش تولید موثر هستند (17).
در زمینۀ رشد باکتری استرپتومایسس کلاولیجروس و تغییرات وزن تر زیستتوده طی فرایند تخمیر دیده شد میسلیومهای باکتری بهشکل قطعههای کوتاه هستند؛ زیرا باکتری مدنظر در فاز تأخیری است و سلولها درحال سازگاری با شرایط محیطکشت جدید هستند. پساز اتمام فاز تأخیری، فاز جدید نمایی آغاز شد و میسلیومها با انشعابات بلند مشاهده شدند که این تغییر در فاز رشد باکتری سبب افزایش ناگهانی و شدید مقدار زیستتوده شد (8).
در بررسی ارتباط تغییرات ریختشناسی باکتری استرپتومایسس کلاولیجروس و تولید کلاولانیک اسید، ریختشناسی تعداد زیادی از اکتینومیستها با غلظتهای اسپوری زنده در مایۀ تلقیح تحتتأثیر قرار گرفت؛ بهطوریکه در غلظتهای زیاد به ایجاد شکل میسلیومها و در غلظتهای کم مایۀ تلقیح به شکل پلت منجر شد. همزدن محیط تخمیر، عامل مؤثر دیگری بود که بر تغییرات ریختشناسی باکتری تأثیر داشت؛ در این محیطکشت، همزدن نهتنها برای انتقال حرارت، انتقال جرم و مخلوطکردن محیط بهمنظور انتقال اکسیژن در فلاسک ضروری بود، تأثیراتی روی ریزموجودات داشت که ازجملۀ آنها عبارتند از: تغییر ریختشناسی ریزموجودات رشتهای، تغییر بازده رشد و تغییر سرعت تشکیل محصول. ازآنجاکه هیفها طول بلندی داشتند، نسبت به سلولهای منفرد در معرض نیروهای برشی بزرگتری قرار داشتند. برخی از اکتینومیستها، دیوارۀ سخت و محکمی داشتند و نیروهای برشی شدید را تحمل کردند؛ درحالیکه برخی دیگر به نیروهای برشی حساستر بودند. شکستهشدن هیفها میتواند آثار مفید و زیانآوری را در پی داشته باشد. رشد هیف تنها در سلولهای نوک هیف رخ میدهد. اگر هیف از ناحیهای که در رشد مؤثر است، بریده شود، سیتوپلاسم بیشتری از دست میدهد و مرگ اتفاق میافتد؛ ولی اگر هیف از ناحیهای که تأثیری در رشد ندارد، بریده شود، بدون اینکه سرعت رشد خود را از دست دهد، به دو قسمت تبدیل میشود. بریدهشدن هیفها سبب کاهش ویسکوزیتۀ مایع تخمیر میشود. هیفهای بسیار منشعب حساسیت کمتری نسبت به شکنندگی دارند و در سرعتهای زیاد همزن، شدت شکنندگی قطعههای هیف بزرگتر کم تر از قطعههای کوچکتر است (8).
انشعابات بیشتر و طویلتر هیفها در محیطکشت تخمیر (بهینه) نسبت به محیطکشت شاهد نشاندهندۀ تأثیر ترکیبات محیطکشت بر ریختشناسی سویۀ استرپتومایسس کلاولیجروس بود. این یافتهها با نتایج مطالعۀ سایر پژوهشگران مطابقت دارند (8 و 18).
یکی از راههای کاهش هزینه، جایگزینی مواد خام محیطکشت با مواد ارزان و دردسترس است. ریزموجودات در وضعیت خاص قادر به تولید متابولیتهای ثانویه هستند؛ بنابراین، نکتۀ اصلی در تولید متابولیتهای ثانویه، برنامهریزی و طراحی محیطکشت مناسب است. محدودیت منبع مغذی در محیطکشت سبب محدودیت رشد ریزموجودات و تولید محصول میشود. در پژوهش حاضر، گلیسرول در غلظت 15 گرمبرلیتر بهشکل منبع کربن توانست رشد باکتری و تولید کلاولانیکاسید را تقویت کند. در پژوهش حاضر، گلیسرول و سبوس گندم بیشترین میزان تولید کلاولانیکاسید را داشتند و گلوکز بازدهی بسیار کمی نسیت به این دو ماده داشت.
سپاسگزاری
از نویسندگان این مقاله و همچنین کارکنان آزمایشگاه میکروبشناسی رازی دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات برای همکاری صمیمانه در اجرای این پروژه سپاسگزاری میکنم.
[1]- Streptomyces clavuligerus
[ii]- Mounir
)