نوع مقاله : پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه ولیعصر (عج)، رفسنجان، ایران

2 دانشیار گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه ولیعصر (عج)، رفسنجان، ایران

3 استادیار گروه گیاه‌پزشکی، دانشکدۀ کشاورزی، دانشگاه ولیعصر (عج) ،رفسنجان، ایران

4 دانشیار گروه گیاه پزشکی، دانشکدة کشاورزی، دانشگاه ولیعصر (عج)، رفسنجان،ایران

10.22108/bjm.2020.123989.1311

چکیده

مقدمه: قارچ‌های میکوریز آربوسکولار (AMF) فراوان‌ترین عوامل ایجاد‌کنندۀ همزیستی بین قارچ و گیاه در خاک به شمار می‌آیند و ازاین‌رو، اهمیت اکولوژیکی و اقتصادی فراوانی دارند. مطالعۀ حاضر با هدف شناسایی گونه‌هایAMF همزیست با ریشۀ گیاهان مختلف بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی و مولکولی ژن بتاتوبولین در دو منطقۀ راویز و داوران شهرستان رفسنجان انجام شد.
مواد و روش‏‏ها: نمونه‌برداری از منطقۀ ریزوسفر گیاهان مختلف انجام شد. اسپورهای AMF از خاک نمونه‌ها با استفاده از روش الک مرطوب جداسازی شدند. گروه‌بندی بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی مانند رنگ اسپور، شکل، تزئینات سطح، اندازه و ساختار دیوارۀ آنها و ویژگی‌های اسپورها در آب انجام شد. استخراج DNA از تک‌اسپور انجام شد و بخشی از ژن بتاتوبولین به روش PCR آشیانه‌ای سه‌مرحله‌ای با آغازگرهای مناسب تکثیر شد. محصول PCR نمونه‌های انتخابی به روش سنگر توالی‌یابی شد. رابطۀ فیلوژنتیکی توالی‌های انتخابی پس‌از اصلاح و بازبینی با استفاده از روش حداکثر احتمال با سایر جدایه‌های انتخابی از بانک ژن ارزیابی شد.
نتایج: بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی و فیلوژنی مبتنی بر ژن بتاتوبولین، گونه‌های Funneliformis mosseae، Funneliformis coronatum، Gigaspora giganteScutellospora calosporaو Septoglomus constrictum شناسایی شدند. گونۀ F. mosseae و پس‌از‌آن، گونۀ F.coronatumگونه‌های غالب در مناطق بررسی‌شده بودند.
بحث و نتیجه‏گیری: ژن بتاتوبولین، راسته‌ها، خانواده‌ها و جنس‌های میکوریز آربوسکولار مطالعه‌شده در پژوهش حاضر را به‌خوبی از یکدیگر تفکیک کرد و تمام گونه‌های شناسایی‌شده در جایگاه تاکسونومیکی اختصاصی خود قرار گرفتند. نتایج تجزیه‌وتحلیل مولکولی تأیید‌کنندۀ نتایج شناسایی بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی بودند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Identification of Arbuscular Mycorrhizal Fungi Associated with Different Plants in Rafsanjan Based on Morphological Characteristics and ß-tubulin Gene Sequence

نویسندگان [English]

  • Parisa Aminiannasab 1
  • Ebrahim Sedaghati 2
  • Samin Hosseini 3
  • Roohallah Saberi 4

1 Plant Protection Department, Agriculture Faculty, Vali-e-Asr University, Rafsanjan, Iran

2 Plant Protection Department, Agriculture Faculty, Vali-e-Asr University, Rafsanjan, Iran

3 Plant Protection Department, Agriculture Faculty, Vali-e-Asr University, Rafsanjan, Iran

4 Plant Protection Department, Agriculture Faculty,Vali-e-Asr University, Rafsanjan, Iran

چکیده [English]

Introduction: Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF), as the most abundant mutual symbiotic association between fungi and plants in the soil, are of great ecological and economic importance. The present study aimed to identify AMF species associated with different plant roots based on morphological and molecular characteristics of ß-tubulin gene sequences of collected samples in Raviz and Daveran regions of Rafsanjan city.
Materials and methods: Samples were collected from the rhizosphere of different plants and AMF spores were isolated from the soil samples using the wet sieve method. The identification was performed based on morphological characteristics of the spores such as the color, shape, surface ornamentation, size, wall structure as well as characterization of the spores in water. The DNA of the fungi was extracted from single spores and partial sequences of ß-tubulin gene were amplified by three nestedPCR using appropriate primers. The PCR products of the selected samples were sent for Sanger sequencing. The phylogenetic relationship of the selected sequences with other available isolates in GenBank was analyzed using the Maximum likelihood method.
Results: Based on morphological characteristics and phylogenetic analysis of the partial sequence of ß-tubulin gene, the following species were detected: Funneliformis mosseae, Funneliformis coronatum, Gigaspora gigantean, Scutellospora calospora, andSeptoglomus constrictum. F. mosseae followed by F. coronatum were recognized as the dominant species in the present study.
Discussion and conclusion: The partial sequence of ß-tubulin gene was well separated from the studied orders, families, and genera of arbuscular mycorrhiza fungi. All the identified species in this study were placed in the expected taxonomic level. The results of the molecular analysis confirmed the classification of species based on morphological characterization.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Symbiosis
  • Arbuscular mycorrhizal fungi
  • Phylogeny
  • alignment
  • ß-tubulin

مقدمه

قارچ‌های میکوریز آربوسکولار (AMF) در شاخۀ گلومرومیکوتا قرار دارند و فراوان‌ترین عوامل ایجادکنندۀ همزیستی در خاک هستند؛ ازاین‌رو، اهمیت اکولوژیکی و اقتصادی فراوانی دارند (1). این دسته از قارچ‌ها به‌طور همزیست اجباری با ریشۀ گیاهان ارتباط برقرار می‌کنند و بخشی از مواد غذایی لازم برای آنها را از طریق هیف‌های خود فراهم می‌کنند؛ از سوی دیگر، این قارچ‌ها برای رشد و تکمیل چرخۀ زندگی خود به ریشه و سلول‌های گیاه میزبان وابسته‌اند (2). پژوهش‌ها نشان می‌دهند حدود ۸۰ درصد گیاهان زمینی و آوندی با این دسته از قارچ‌ها ارتباط دارند (1). کلونیزاسیون ریشه با قارچ‌های میکوریز آربوسکولار سبب افزایش مقاومت گیاه در برابر عوامل بیماری‌زا، تنش خشکی و شوری، افزایش تثبیت نیتروژن زیستی، افزایش فتوسنتز در گیاه میزبان و مهم‌تر از همه، کاهش غلظت عناصر فلزی سنگین مانند کادمیوم و آرسنیک در بافت گیاه می‌شود (3).

در سال ۱۸۴۵، برادران تلاسنه[1] نخستین شرح را برای این دسته از قارچ‌ها ارائه کردند و ساختار اسپورهای جنس Glomus و دو گونۀ آن را تنها بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی شناسایی و معرفی کردند (4). ویژگی‌های ریخت‌شناسی تا مدت‌ها برای شناسایی این دسته از قارچ‌ها استفاده می‌شدند؛ اما با‌توجه‌به ساختار بسیار سادۀ اسپور و وجود ویژگی‌های محدود برای تفکیک این دسته از قارچ‌ها، شناسایی بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی همواره با خطاها و مشکلاتی همراه بوده است (5). در سال‌های اخیر، روش‌های مولکولی به‌طور گسترده برای مطالعۀ روابط فیلوژنتیکی و تنوع ژنتیکی قارچ‌های میکوریز آربوسکولار و به‌شکل روش‌های مکمل برای شناسایی بر پایۀ ویژگی‌های ریخت‌شناسی استفاده می‌شوند. به‌منظور بررسی مولکولی، استفاده از نشانگرهای مناسب و مطمئن نقش مهمی را در شناسایی دقیق گونه ایفا می‌کند؛ به‌طوری‌که نشانگرها باید حفاظت زیادی بین تاکسون‌های بررسی‌شده داشته باشند و بتوانند آنها را به‌طور دقیق تفکیک کنند (6).

مدتی طولانی، تنها نشانگر موجود برای شناسایی و بازسازی روابط فیلوژنتیکی قارچ‌های میکوریز آربوسکولار، ژن‌های DNA ریبوزومی هسته بود؛ DNA ریبوزومی هسته شامل نواحی بسیار حفاظت‌شده و در‌عین‌حال، متغیر است و بنابراین برای شناسایی در سطح گونه تا شاخه در فیلوژنی مناسب است (7). مطالعه‌های فیلوژنتیکی تمام طول زیرواحد کوچک DNA ریبوزومی به طبقه‌بندی جدید قارچ‌های میکوریز آربوسکولار منجر شدند و این قارچ‌ها به‌شکل گروه مونوفیلتیک از قارچ‌های Zygomycota جدا و در شاخۀ Glomeromycota قرار گرفتند (8)؛ با گذشت زمان و استفاده از توالی بخش‌‌های بیشتری از DNA ریبوزومی به‌ویژه زیرواحد کوچک DNA ریبوزومی (SSU) و نواحی بین‌ژنی (ITS) و به میزان کمتر، زیرواحد بزرگ DNA ریبوزومی (LSU) و استفاده از ویژگی‌های ریخت‌شناسی در قارچ‌های میکوریز آربوسکولار، تغییرات زیادی در زمینۀ تاکسونومی آنها ایجاد شده است؛ اما مشکل این ژن‌ها در قارچ‌های میکوریز آربوسکولار این است که نواحی متغیری که برای شناسایی گونه بسیار مفید هستند، تغییراتی را درون یک موجود نشان می‌دهند (7 و 9). در یک تک‌اسپور از قارچ‌های میکوریز آربوسکولار ممکن است توالی‌های متعددی از DNA ریبوزومی هسته با تفاوت‌های اندک وجود داشته باشند که شناسایی و تشخیص گونه‌های نزدیک به هم را دشوار می‌کنند (10). به‌منظور حل مشکل یادشده، تعیین توالی هم‌زمان چندین بخش از DNA ریبوزومی و در کنار آنها سایر نواحی ژنی مدنظر قرار گرفته است؛ به این منظور، ژن‌های پروتئینی متعددی از قارچ‌های میکوریز آربوسکولار مانند فاکتورهای elongation 1-α، H ATPase، BIP، اکتین و بتاتوبولین بررسی شده‌اند (10). در سال 2004، کرادی[2] و همکاران بر اساس فیلوژنی مبتنی بر ژن بتاتوبولین، رابطۀ خواهری دو خانوادۀ Acaulosporaceae و Gigasporaceae را اثبات کردند (11). در سال 2009، امسیسکا[3] و مورتون[4] کارایی ژن بتاتوبولین در حل روابط تکاملی شاخۀ گلومرومایکوتا را مطالعه کردند. نتایج این پژوهش نشان دادند ژن بتاتوبولین به اندازۀ ژن‌های 18S rDNA و 28S rDNA توانایی حل روابط فیلوژنتیکی قارچ‌های میکوریز را در سطح خانواده و گونه دارد.

در سال‌های اخیر، پژوهش‌های متعددی بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی (12-16) و مولکولی (17-21) برای جداسازی و شناسایی قارچ‌های میکوریز آربوسکولار بومی خاک‌های ایران در ریزوسفر گیاهان مختلف انجام شده‌اند. در تمام پژوهش‌های مولکولی یادشده از نواحی مختلف DNA ریبوزومی برای تفکیک این قارچ‌ها استفاده شده است. بر اساس دانش ما، در هیچ‌کدام از پژوهش‌های مولکولی انجام‌شده در ایران، ژن بتاتوبولین برای رده‌بندی و بررسی فیلوژنی قارچ‌های میکوریز آربوسکولار استفاده نشده است.

در پژوهش حاضر، گونه‌هایAMF همزیست با ریشۀ گیاهان مختلف در دو منطقۀ راویز و داوران شهرستان رفسنجان که تنوع گیاهی بیشتری نسبت به سایر مناطق شهرستان دارند، بررسی شدند و به‌منظور شناسایی قارچ‌ها از روش‌های ریخت‌شناسی و مولکولی مبتنی بر توالی ناحیۀ بتاتوبولین استفاده شد.

 

مواد و روش‌ها

نمونه‌برداری: نمونه‌برداری در تابستان سال‌های 1394و 1395 در دو منطقۀ داوران و راویز شهرستان رفسنجان انجام شد. نمونه‌برداری به‌طور تصادفی و از نقاط مختلف باغ‌ها، مزارع و مراتع دو منطقۀ یادشده و از عمق 5 تا 30 سانتی‌متری ناحیۀ ریزوسفر گیاهان انجام شد. به‌منظور تهیۀ هر نمونۀ مرکب، 5 نمونۀ خاک از نقاط مختلف مزرعه یا باغ جمع‌آوری و باهم مخلوط شدند و درنهایت، 9 نمونۀ مرکب خاک (یک کیلوگرمی) همراه با ریشه‌های نازک تهیه و پس‌از ثبت مشخصات به آزمایشگاه منتقل شدند. نمونه‌ها ‌به‌مدت دو هفته در برابر جریان هوا خشک و پس‌از این مدت تا زمان جداسازی اسپور، در دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شدند (22) (جدول 1).

استقرار کشت تلۀ گلدانی: گیاه ذرت (Zea mayes) به‌عنوان گیاه تله برای اسپورزایی و افزایش جمعیت اسپورهای سالم استفاده شد. در هر گلدان، 10 عدد بذر در محیط پایۀ خاک، ماسه و پرلیت با نسبت 1:1:1 و 200 گرم از هر نمونه خاک جمع‌آوری‌شده کشت شد. گلدان‌ها به‌مدت پنج ماه در گلخانه با دمای 25 تا 30 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شدند و پس‌از پنج ماه، تنش خشکی با قطع آبیاری گلدان‌ها اِعمال شد تا گونه‌های میکوریز وارد دورۀ اسپورزایی شوند. زمانی که گلدان‌ها کاملاًٌ خشک شدند، اندام‌های هوایی گیاهان از سطح خاک بریده شدند و خاک گلدان‌ها همراه با ریشه‌های گیاهان جمع‌آوری و در دمای کم نگهداری شد (23).

 

جدول 1- ویژگی‌های جغرافیایی محل جمع‌آوری گیاهان مطالعه‌شده

شماره

گیاه میزبان

منطقۀ جمع‌آوری

ارتفاع

طول جغرافیایی

عرض جغرافیایی

1

پیاز

راویز

7869

345601

3360634

2

آفتابگردان

راویز

7650

347388

3360775

3

مرغ

راویز

7570

347536

3360185

4

بادام

راویز

7786

346264

3360719

5

ذرت

داوران

6222

422471

3383025

6

یونجه

داوران

6049

41185

3382734

7

هلو

داوران

6151

422057

3382766

8

زردآلو

داوران

6213

422452

3382943

9

تاغ

داوران

6069

420834

3383329

 


جداسازی و بررسی ریخت‌شناسی قارچ‌های جداسازی‌شده: پس‌از نمونه‌برداری و به‌منظور اثبات رابطۀ همزیستی قارچ‌های میکوریز آربوسکولار با ریشۀ گیاهان مختلف، رنگ‌آمیزی ریشه‌ها به روش فیلیپس[5] و هیمن[6] (24) انجام شد؛ سپس اسپورهای AMF بر اساس روش سری الک مرطوب از خاک‌های نمونه‌برداری‌شده جداسازی شدند (25). اسپورهای جدا‌شده بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی مانند اندازه، رنگ، شکل، تزئینات سطح و هیف اتصال (26 و 27) زیر استریومیکروسکوپ (Nikon SMZ 1000) گروه‌بندی شدند. مخلوط حجمی پلی‌وینیل‌لاکتوگلیسرول[7] و معرف ملزر با نسبت 1:1 برای بررسی ویژگی‌های ریخت‌شناسی و مورفومتریک اسپورها استفاده شد (28). ریخت‌شناسی گونه‌های AMF با میکروسکوپ نوری کالیبره‌شده (Nikon-ECLIPSE-80i) و ویژگی‌هایی مانند شکل، رنگ، اندازه و ساختار دیوارۀ اسپور، شیوۀ اتصال هیف به اسپور و باز یا بسته بودن روزنۀ هیف در محل اتصال به اسپور و شیوۀ انسداد در صورت بسته‌بودن بررسی شدند. شناسایی اسپورها با مراجعه به تارنماهای اینترنتی معتبر http://www.invam.wvu.edu و http://www.zor.zut.edu.pl و مقاله‌های کلیدی (29) انجام شد.

استخراج DNA اسپور قارچ‌ها و تکثیر DNA: پیش از استخراج DNA، هر اسپور به‌مدت30 ثانیه در معرض امواج مافوق صوت با شدت 37 هرتز قرار گرفت؛ سپس اسپورهای تیمارشده سه مرتبه با آب دو بار تقطیر استریل شسته شدند.یک اسپور از هر گروه اسپوری در 20 میکرولیتر محلول شامل 10 میکرولیتر بافر 5X GoTaq PCR و 10 میکرولیتر آب مقطر استریل خرد شد و سپس به‌مدت 15 دقیقه در دمای 60 تا 65 درجۀ سانتی‌گراد قرار داده شد؛ پس‌از 10 دقیقه سانتریفیوژ با سرعت 13000 دوربردقیقه، فاز رویی به‌عنوان DNA الگو در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز استفاده شد (30). به‌منظور تکثیر بخشی از ژن ß-tubulin از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آشیانه‌ای سه‌مرحله‌ای استفاده شد؛ به‌این‌ترتیب که مرحلۀ اول با جفت آغازگر C2F و FBtub4R، مرحلۀ دوم با جفت آغازگر GiH4R و IB36F و سومین مرحله با جفت آغازگر Fsp و GiH3R انجام شد. آغازگرهای یادشده می‌توانند قطعه‌ای با اندازۀ 861 تا 1014 جفت باز را تکثیر کنند (31). واکنش تکثیری در حجم 25 میکرولیتر شامل 5/5 میکرولیتر آب مقطر دیونیزه، 5/12 میکرولیتر بافر Amplicon Taq DNA polymerase2x، 1 میکرولیتر آغازگر رفت 10 میکرومولار، 1 میکرولیتر آغازگر برگشت 10 میکرومولار و 5 میکرولیتر DNA استخراج‌شده با شرایط زیر انجام شد: مرحلۀ اول به‌مدت 2 دقیقه در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد به‌منظور واسرشت‌کردن اولیۀ DNA و سپس 30 چرخه شامل 30 ثانیه در 94 درجۀ سانتی‌گراد، 30 ثانیه در 52 درجۀ سانتی‌گراد و 1 دقیقه در 72 درجۀ سانتی‌گراد و درنهایت، 7 دقیقه در 72 درجۀ سانتی‌گراد برای گسترش نهایی. در مرحلۀ دوم، 5 میکرولیتر از محصول PCR اول و در مرحلۀ سوم، 5 میکرولیتر از محصول PCR دوم برای DNA الگو استفاده شد. حجم واکنش تکثیری، تعداد چرخه‌ها و مراحل PCR دوم و سوم مشابه PCR اول بود. پس‌از انجام PCR و به‌منظور بررسی درستی تکثیر DNA، 5 میکرولیتر از محصول روی ژل آگارز 5/1 درصد با بافر TBE[8] الکتروفورز شد.

تعیین توالی نواحی تکثیرشده و بررسی فیلوژنتیکی بر اساس توالی ژن بتاتوبولین: قطعه‌های تکثیرشده از 9 نمونه قارچ انتخابی برای توالی‌یابی به شرکت XCELRIS کشور هند ارسال شدند و ژن بتاتوبولین به‌طور دوطرفه و به روش سنگر[9] توالی‌یابی شد. فایل توالی‌های رفت و برگشت ارسالی از شکل AB1 به شکل FASTQ تبدیل و سپس با برنامۀ Seqtk، نواحی ابتدایی و انتهایی که کیفیت کمی داشتند با حالت پیش‌فرض تصحیح و با نرم‌افزار MAFFT v.7 با تنظیمات پیش‌فرض (32) هم‌ردیف‌سازی شدند و توالی توافقی[10] به‌عنوان توالی نهایی استفاده شد.

به‌منظور بررسی روابط فیلوژنتیکی توالی قارچ‌های بررسی‌شده با سایر توالی‌های موجود در بانک ژن، ابتدا توالی‌های بتاتوبولینی که شباهت زیادی با توالی‌های پژوهش حاضر داشتند با استفاده از برنامۀ BLASTN از بانک ژن برداشت شدند. هم‌ردیف‌سازی چندگانه بر اساس توالی نوکلئوتیدی ژن‌های مختلف بررسی‌شده با نرم‌افزار MAFFT v.7 با تنظیمات پیش‌فرض انجام شد (32). فایل‌های هم‌ردیف‌سازی‌شده به‌طور دستی با برنامۀ Mesquite v.3.04 بازبینی شدند (33). به‌منظور رسم درخت فیلوژنی از روش حداکثر احتمال[11] با برنامۀ IQtree v.1.6 استفاده شد (34)؛ این برنامه به‌طور خودکار بهترین و مناسب‌ترین مدل را برای رسم درخت فیلوژنی انتخاب می‌کند. به‌منظور بررسی اعتبار درخت‌های فیلوژنتیکی رسم‌شده از آزمون اعتبار‌سنجی UFBoot[12] با ۱۰۰۰ تکرار استفاده شد و درنهایت، درخت رسم‌شده با برنامۀ Figtree به تصویر کشیده شد.

 

نتایج

در پژوهش حاضر، نمونه‌برداری به‌طور تصادفی از دو منطقۀ داوران و راویز شهرستان رفسنجان و از ریزوسفر 9 گیاه باغی، زراعی و مرتعی که فراوانی بیشتری داشتند، انجام شد (جدول 2). گیاه ذرت (Zea mayes) به‌عنوان گیاه تله برای اسپورزایی و افزایش جمعیت اسپورهای سالم استفاده شد و پس‌از پنج ماه، ریشه‌ها رنگ‌آمیزی و وجود اندام‌های قارچی میکوریز آربوسکولار درون ریشه‌ها بررسی شد (شکل 1). اسپورهای سالم و زنده در هر نمونۀ خاک بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی گروه‌بندی و شناسایی شدند و مشخص شد به پنج گونۀ مختلف تعلق دارند و همچنین گونۀ غالب در هر نمونۀ خاک مشخص شد (شکل 2 و جدول 3).

 

شکل 1- اندام‌های قارچی میکوریز آربوسکولار درون ریشه‌های رنگ‌آمیزی‌شدۀ گیاه ذرت (Hy: هیف، :Ve وزیکول)

 

جدول 2- گونه‌های غالب قارچ‌های میکوریز آربوسکولار شناسایی‌شدۀ همزیست با گیاهان بررسی‌شده

گیاه میزبان

منطقۀ جمع‌آوری

درصد فراوانی اسپور

گونۀ غالب شناسایی‌شده

نام جدایه

شمارۀ توالی در بانک ژن

پیاز

راویز

88/73

Funneliformis coronatum

VRU1

MT892857

آفتابگردان

راویز

62/90

Funneliformis mosseae

VRU9

MT892856

مرغ

راویز

82/78

Funneliformis mosseae

VRU10

MT892854

بادام

راویز

77/27

Septoglomus constrictum

VRU13

MT892860

ذرت

داوران

91/36

Funneliformis coronatum

VRU17

MT892859

یونجه

داوران

84/43

Funneliformis coronatum

VRU2

MT892858

هلو

داوران

57/20

Gigaspora gigantea

VRU15

MT892853

زردآلو

داوران

03/22

Scutellospora calospora

VRU21

MT892852

تاغ

داوران

69/43

Funneliformis mosseae

VRU22

MT892855

 


بررسی مولکولی:به‌منظور تأیید نتایج بررسی‌های ریخت‌شناسی و بررسی کارایی ژن بتاتوبولین در شناسایی این گونه‌ها، بخشی از انتهای '3 ژن بتاتوبولین تکثیر شد؛ به دنبال تکثیر این ژن با استفاده از آغازگرهای C2F و FBtub4R در مرحلۀ اول، آغازگرهای GiH4R و IB36F در مرحلۀ دوم و آغازگرهای Fsp و GiH3R در مرحلۀ سوم واکنش PCR آشیانه‌ای سه‌مرحله‌ای، قطعه‌ای به طول حدود 860 تا 1000 جفت باز تکثیر شد (شکل 3).

پس‌از توالی‌یابی و ویرایش توالی‌ها، روابط فیلوژنتیکی توالی‌های حاصل که نتیجۀ تکثیر بخشی از انتهای'3 ژن بتاتوبولین از تک‌اسپور جدایه‌های حاضر در این پژوهش بودند، با ۴۶ جدایۀ انتخابی از بانک ژن بررسی شدند. بر اساس نتایج، ماتریکس هم‌ردیف‌سازی‌شده ۵۶ توالی و ۱۲۳۷ کاراکتر داشت؛ بین کاراکترهای بررسی‌شده، ۵۵۴ کاراکتر parsimony-informative، ۱۴۸ کاراکتر parsimony- non-informative و ۵۳۵ کاراکتر ثابت بودند. بهترین مدل انتخاب‌شده با برنامۀ IQtree بر اساس BIC (Bayesian Information Criterion)، مدل TPM2+F+I+G4 بود. یک توالی بتاتوبولین مربوط به Paraglomus brasilianum (FJ174314) به‌عنوان ریشۀ درخت انتخاب شد.

 

 

شکل 2- ویژگی‌های میکروسکوپی گونه‌های قارچ‌های میکوریز آربوسکولار شناسایی‌شده در ریزوسفر گیاهان مطالعه‌شده؛ الف، ب، پ. Septoglomus constrictum، ت، ث، ج. Scutellospora calospora، چ، ح، خ.Funneliformis coronatum، د، ذ، ر. Funneliformis mosseae، ز، ژ، س. Gigaspora gigantea. لایه‌های دیوارۀ اسپور: L1. لایۀ اول،L2. لایۀ دوم،L3. لایۀ سوم،L4. لایۀ چهارم، SE. دیوارۀ عرضی

 

 

همان‌طور که در شکل ۴، الف و ب مشاهده می‌شود، قارچ‌ها به تفکیک جنس و گونه به‌خوبی از یکدیگر متمایز شده‌اند و تمام توالی‌های بررسی‌شده در ۹ جنس در درخت شکل ۴، الف قرار گرفته‌اند. هرکدام از جنس‌های موجود، یک گروه مونوفیلتیک تشکیل داده‌ است و درجۀ اعتبار همه گروه‌ها بین 98 تا 100 درصد است که اعتبار گروه‌های تشکیل‌شده را نشان می‌دهد. گونه‌های تاکسون‌های بررسی‌شده در شکل ۴، ب به‌وضوح و با درجۀ اعتبار زیاد از یکدیگر متمایز شده‌اند. همان‌طور که در درخت شکل ۴، ب مشخص شده است، ۹ گونۀ جداسازی‌شده در پژوهش حاضر به چهار جنس تعلق دارند. جدایۀ VRU1 جداشده از نمونۀ خاک ریزوسفر گیاه پیاز در راویز، جدایۀ VRU2 جداشده از نمونۀ خاک ریزوسفر گیاه یونجه در داوران و جدایۀ VRU17 جداشده از نمونۀ خاک ریزوسفر گیاه ذرت در داوران به‌عنوان گونۀ Funneliformis coronatum با درجۀ اعتبار 99 درصد همراه با توالی‌های مرجع در یک کلاد مجزا قرار گرفته‌اند؛ این سه توالی به‌ترتیب 03/99 درصد، 32/99درصد و 28/99درصد مشابه توالی نوکلئوتیدی Funneliformis coronatumهستند.

 

جدول 3- ویژگی‌های ریخت‌شناسی گونه‌های قارچ میکوریز آربوسکولار شناسایی‌شده

ویژگی‌های ریخت‌شناسی

نام جدایه، میزبان و منطقۀ جمع‌آ‌وری

گونۀ شناسایی‌شده

اسپورها نیمه‌کروی تا کروی، به رنگ زرد تیره و نارنجی تیرۀ مایل به قهوه‌ای و قطر 150 تا 235 میکرومتر، دیوارۀ اسپور (SW) دولایه، لایۀ اول (L1) شفاف و به ضخامت 7/1 تا 5/2 میکرومتر و لایۀ دوم (L2) ورقه‌ای و به ضخامت 8/3 تا 5/4 میکرومتر، هیف اتصال (SH) در محل اتصال قیفی‌شکل و عرض آن در محل اتصال 35 تا 44 میکرومتر

پیاز/راویز

VRU1

Funneliformis coronatum

اسپور منفرد و یا اکثراً گروهی و در خوشۀ اسپور، اسپورهای بالغ زرد تا زرد لیمویی، اسپورهای جوان شفاف یا بی‌رنگ، نیمه‌کروی تا کروی و به قطر 110 تا 200 میکرومتر، دیوارۀ اسپور(SW) سه‌لایه، لایۀ اول (L1) شفاف، ناپایدار و موسیلاژی و به ضخامت 1 تا 2 میکرومتر، لایۀ دوم (L2) به ضخامت 8/1 تا 2 میکرومتر، لایۀ سوم (L3) ورقه‌ای به رنگ قهوه‌ای و به ضخامت 6/2 تا 4 میکرومتر، هیف متصل به اسپور (SH) در محل اتصال قیفی‌شکل و به‌شکل راست تا خمیده به اسپور متصل می‌شود، قطر هیف در محل اتصال به اسپور 2/18 تا 1/24 میکرومتر

آفتابگردان/راویز

VRU9

Funneliformis mosseae

اسپورها نیمه‌کروی تا کروی، به رنگ زرد مایل به سبز و قطر 303 تا 320 میکرومتر، دیوارۀ اسپور سه‌لایه، لایۀ اول به رنگ قهوه‌ای تیره و ضخامت 9/2 تا 06/3 میکرومتر، لایۀ دوم ورقه‌ای، روشن‌تر و به ضخامت 2/8 تا 8/10 میکرومتر، لایۀ سوم به رنگ قهوه‌ای تیره و ضخامت 2/3 تا 1/4 میکرومتر

هلو/داوران

VRU15

Gigaspora gigantea

اسپورها منفرد، به رنگ زرد با ته‌رنگ مایل به سبز، نیمه‌کروی تا کروی و بیضوی به قطر 8/208 تا 220 میکرومتر، دیوارۀ اسپور (SW) متشکل از دو لایه، لایۀ اول (L1) صاف و شفاف و به ضخامت 1 تا 2/1 میکرومتر، لایۀ دوم (L2) ورقه‌ای و به ضخامت 9/1 تا 1/3 میکرومتر، دیوارۀ تندشی اول شامل دو لایه (GW1)، لایۀ اول معمولاً متصل به لایۀ دوم و به ضخامت 9/0 تا 5/1و لایۀ دوم به ضخامت 1 تا 2/1 میکرومتر، متصل به دیوارۀ اسپور، دیوارۀ تندشی دوم (GW2) دولایه، لایۀ اول روشن، انعطاف‌پذیر و 8/0 تا 8/1میکرومتر، لایۀ دوم شفاف و به ضخامت 1 تا 1/2 میکرومتر، غلاف جوانه‌زنی بیضوی یا نامنظم، به رنگ زرد کم‌‌رنگ، طول آن تقریباً 5/1 برابر عرض آن، این ناحیه شکننده است و به‌آسانی قطعه‌قطعه می‌شود.

زردآلو/داوران

VRU21

Scutellospora calospora

اسپور به رنگ قرمز مایل به قهوه‌ای تیره، نیمه‌کروی تا کروی و به قطر 152 تا 198 میکرومتر، دیوارۀ اسپور (SW) با ضخامت متفاوت در بخش‌های مختلف و دولایه، لایۀ اول (L1) شفاف و ناپایدار و به ضخامت 2 تا 4 میکرومتر، لایۀ دوم (L2) ورقه‌ای، قرمز مایل به قهوه‌ای و به ضخامت 8/6 تا 6/10 میکرومتر، هیف متصل به اسپور (SH) زرد مایل به قهوه‌ای‌رنگ و معمولاً در محل اتصال به اسپور به حالت باریک‌شده، گاهی هیف به‌شکل قیفی یا استوانه‌ای به اسپور متصل، روزنه (P) نازک است و با افزایش سن ضخیم می‌شود و با یکی از لایه‌های داخلی لایۀ دوم بسته می‌شود.

بادام/راویز

VRU13

Septoglomus constrictum

 

750 bp

 

1000 bp

 

شکل 3- نیم‌‌رخ الکتروفورزی محصول PCR آشیانه‌ای ناحیۀ بتاتوبولین؛ 1 تا 9 به‌ترتیب اسپورهای VRU1، VRU2، VRU9، VRU10، VRU13، VRU15، VRU17، VRU21 و VRU22 و M: نشانگر مولکولی DNA 1kb

 

 

الف

ب

شکل 4- الف. درخت فیلوژنی گونه‌های قارچ‌های میکوریز آربوسکولار جداسازی و شناسایی‌شده بر اساس بخشی از ژن بتاتوبولین؛ این درخت با نرم‌افزار IQtree v.1.6 و روش Maximum Likelihood از طریق آزمون اعتبار‌سنجی Ultrafast bootstrap) UFBoot) با 1000 تکرار تحلیل و رسم شده است. گونۀ (FJ174314)Paraglomus brasilianum  به‌عنوان out group استفاده شده است. گونه‌های تعیین‌توالی‌شده با رنگ قرمز مشخص شده‌اند، ب. تقسیم‌بندی جنس‌های مختلف بررسی‌شده در درخت فیلوژنی رسم‌شده با روش ML. گروه‌های شامل نمونه‌های توالی‌یابی‌شده با رنگ نارنجی مشخص شده‌اند.

 

جدایۀ VRU10 جداشده از نمونۀ خاک ریزوسفر علف هرز مرغ در راویز، جدایۀ VRU22 جداشده از نمونۀ خاک ریزوسفر درختچۀ تاغ در داوران و جدایۀ VRU9 جداشده از نمونۀ خاک ریزوسفر گیاه آفتابگردان در راویز با درجۀ اعتبار ۱۰۰ درصد همراه با توالی‌های Funneliformis mosseae در یک کلاد مجزا قرار گرفته‌اند؛ این سه توالی به‌ترتیب 62/95 درصد، 91/95 درصد و 48/96 درصد مشابه توالی نوکلئوتیدی Funneliformis mosseaeهستند. نتایج جستجوی BLASTN توالی بتاتوبولین جدایۀ VRU13 جداشده از نمونۀ خاک ریزوسفر بادام در راویز نشان داد توالی نوکلئوتیدی این جدایه دارای14/94 درصد شباهت با گونۀ Septoglomus constrictumاست و همراه با تنها توالی موجود از این گونه با درجۀ اعتبار ۱۰۰ درصد قرار می‌گیرد. نتایج جستجوی BLASTN توالی بتاتوبولین جدایۀ VRU15 جداشده از نمونۀ خاک ریزوسفر هلو در داوران نشان داد این توالی با گونۀ Gigaspora giganteaدارای19/98 درصد شباهت نوکلئوتیدی است و همراه با سایر توالی‌های G. gigantea در کلادی با درجۀ اعتبار ۱۰۰ درصد قرار می‌گیرد. نتایج جستجوی BLASTN توالی بتاتوبولین جدایۀ VRU21 جداشده از نمونۀ خاک ریزوسفر زردآلو در داوران نشان داد این توالی با گونۀ Scutellospora calosporaدارای57/97 درصد شباهت نوکلئوتیدی است و همراه با تنها توالی موجود مربوط به این گونه در یک گروه با درجۀ اعتبار ۹۸ درصد قرار می‌گیرد.

بر اساس پژوهش امسیسکا و مورتون (31)، توالی‌های ژن بتاتوبولین در اعضای یک گونه بیش از ۹۴ درصد شباهت نشان می‌دهند. گونه‌های بررسی‌شده در این پژوهش بین ۹۴ تا 99 درصد با گونه‌های گروه خود شباهت نشان دادند.

 

بحث و نتیجه‌گیری

جدایه‌های بررسی‌شده در مطالعۀ حاضر بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی و فیلوژنی مبتنی بر ژن بتاتوبولین تجزیه‌و‌تحلیل و بر اساس آن، پنج گونه شامل Funneliformis mosseae، Funneliformis coronatum، Gigaspora giganteScutellospora calosporaو Septoglomus constrictum شناسایی شدند که به چهار جنس در دو خانوادۀ Glomeraceae و Gigasporaceae و راسته‌های Glomerales و Diversisporales تعلق دارند (شکل 4).

اسپورهای گونۀ F. mosseae در درجۀ اول و پس‌از‌آن، گونۀ F. coronatum به‌طور فراوان و غالب در دو منطقۀ بررسی‌شده شناسایی شدند. در بررسی‌های گوناگون در زمینۀ گیاهان مختلف در مناطق متفاوت به‌ویژه نواحی خشک ایران، همواره گونۀ F. mosseae به‌شکل گونۀ غالب شناسایی و گزارش شده است (17، 19، 20، 21 و 35) که این موضوع می‌تواند ناشی از سازگاری زیاد این گونه با شرایط محیطی و تنش‌های مختلف باشد. این گونه در مناطق مختلف جهان و در طیف گسترده‌ای از اکوسیستم‌های محیطی گزارش شده است که ترجیح کم میزبانی و فراوانی آن را نشان می‌دهد (36 و 37). نتایج مطالعۀ حاضر، اختصاصی‌نبودن گیاه میزبان برای F. mosseae را نشان دادند.

بررسی ریخت‌شناسی اسپورها نشان داد جدایه‌های مختلف F. mosseaeو F.coronatum تنوع ریخت‌شناسی زیادی دارند. باتوجه‌به تنوع زیاد ویژگی‌های ریخت‌شناسی اسپورهای یک گونه، امکان شناسایی ریخت‌شناسی در همۀ مراحل رشد وجود نداشت و از سوی دیگر، جمعیت و تنوع اسپورهای سالم در نمونه‌های بررسی‌شده کم بود. به‌منظور حل مشکل وجود اسپورهای پارازیته و نابالغ از کشت تله استفاده شد و گونه‌های قارچی به‌خوبی تکثیر شدند. قارچ‌های شناسایی‌شده در کشت تلۀ گلدانی و نمونه‌های مزرعه‌ای تقریباً مشابه بودند. به‌طور‌کلی، دلایل متعددی ازجمله تنوع زیاد اسپورهای قارچ، توانایی برخی گونه‌های قارچی در تولید اسپورهای دوشکلی و امکان تغییرات خودبه‌خودی در ویژگی‌های اسپورها ازجمله اندازه و رنگ، شناسایی ریخت‌شناسی این قارچ‌ها را همواره با خطاها و مشکلاتی روبه‌رو کرده است (5).

تنوع ژنتیکی قارچ‌های میکوریز آربوسکولار بین جدایه‌های مختلف یک گونه و درون تک‌اسپور یک گونه زیاد است و این مطلب یکی از مشکلات شناسایی مولکولی این قارچ‌ها به شمار می‌آید (9 و 38). به‌منظور غلبه بر مشکل یادشده و حذف آلودگی‌های جانبی از طریق سایر موجودات، استخراج DNA از تک‌اسپور انجام و به‌علت کم‌بودن میزان ژنوم دردسترس و برای افزایش دقت، روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آشیانه‌ای استفاده شد (39) که روش مناسبی برای مطالعۀ مولکولی این گروه از قارچ‌ها محسوب می‌شود. در مطالعۀ حاضر، بخشی از انتهای ژن بتاتوبولین از تک‌اسپور قارچ‌های میکوریز آربوسکولار با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آشیانه‌ای سه‌مرحله‌ای تکثیر شد و آغازگرهای استفاده‌شده قابلیت خوبی برای تفکیک جنس و گونۀ قارچ‌های انتخابی داشتند.

در قارچ‌های میکوریز آربوسکولار، شناسایی و تعیین موقعیت فیلوژنتیکی در سطح خانواده و جنس با استفاده از نواحی مختلف DNA ریبوزومی و به‌ویژه ناحیه‌های SSU، ITS و LSU بسیار متداول است؛ اما وجود چندین DNA ریبوزومی با کمی تفاوت، حتی در تک‌اسپور این قارچ‌ها اثبات شده است؛ علاوه‌براین، ناهمگنی در هستۀ این گروه از قارچ‌ها گزارش شده است و این ناهمگنی ممکن است با ساختار پلی‌ژنوم پیشنهاد‌شده برای قارچ‌های شاخۀ گلومرومایکوتا در ارتباط باشد (40)، درنتیجه، تشخیص گونه‌ها یا جدایه‌هایی که ارتباط نزدیکی باهم دارند، دشوار است و ممکن است نواحی یادشده امکان تمایز گونه‌های نزدیک به هم را نداشته باشند؛ به‌این‌دلیل، تعیین توالی هم‌زمان بخش‌های بیشتری از نواحی DNA ریبوزومی و همچنین سایر نواحی ژنی و همچنین تلفیق آنها با روش‌های ریخت‌شناسی سبب می‌شود نتایج دقیق‌تری حاصل شوند (41). کروگر[xiii] و همکاران با استفادۀ هم‌زمان از نشانگرهای SSU، ITS و LSU، امکان شناسایی قارچ‌های میکوریز آربوسکولار را تا سطح پایین‌تر از گونه فراهم کردند (42). امروزه، علاوه‌بر DNA ریبوزومی، نشانگرهای مولکولی دیگر ازجمله ژن‌های پروتئینی مثل بتاتوبولین دردسترس هستند که استفاده از آنها به حل روابط فیلوژنتیکی این قارچ‌ها کمک می‌کند. در سال 2004، کرادی و همکاران بر اساس فیلوژنی مبتنی بر ژن بتاتوبولین، رابطۀ خواهری دو خانوادۀ Acaulosporaceae و Gigasporaceae را اثبات کردند. در سال 2009، امسیسکا و مورتون با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز آشیانه‌ای سه‌مرحله‌ای، انتهای '3 بتاتوبولین را در 45 گونه از شاخۀ گلومرومایکوتا تکثیر کردند و استخراج DNA از تک‌اسپور قارچ‌های یادشده انجام شد. هدف این پژوهشگران، بررسی کارایی ژن بتاتوبولین در حل روابط تکاملی شاخۀ گلومرومایکوتا با افزایش تاکسون‌های مطالعه‌شده بود. نتایج نشان دادند ژن بتاتوبولین به اندازۀ ژن‌های 18S rDNA و 28S rDNA توانایی حل روابط فیلوژنتیکی بین قارچ‌های میکوریز آربوسکولار در سطح خانواده و گونه را دارد. در مطالعۀ حاضر، ژن بتاتوبولین به‌خوبی جنس‌های میکوریز آربوسکولار انتخابی را از یکدیگر تفکیک کرد و تمام گونه‌های شناسایی‌شده در جایگاه تاکسونومیکی اختصاصی خود قرار گرفتند. تقسیم‌بندی انجام‌شده و روابط جنس‌های مختلف به‌شکل زیر مشاهده شد:

(((Gigaspora,Dentiscutata),Racocetra),Scutellospora) , (((Funneliformis,Septoglomus), Claroideoglomus), (Diversispora, Acaulospora ))

گروه‌بندی ایجادشده و روابط خواهری مشاهده‌شده بر اساس ژن بتاتوبولین کاملاً با طبقه‌بندی ایجادشده بر اساس سه ناحیۀ LSU-SSU-ITS در پژوهش‌های گذشته (29) مطابقت دارد. در پژوهش حاضر، روش‌های شناسایی بر اساس ویژگی‌های ریخت‌شناسی و مولکولی تکمیل‌کنندۀ یکدیگر بودند. نتایج نشان دادند تقسیم‌بندی انجام‌شده تنها بر اساس تک‌ژن بتا‌توبولین نمونه‌های بررسی‌شده می‌تواند در تفکیک جنس و گونه‌های آنها مانند سیستم تقسیم‌بندی بر اساس روابط فیلوژنی چند ژن LSU-SSU-ITS عمل کند؛ ازجمله محدودیت‌های موجود می‌توان به کمبود داده‌های مربوط به ناحیۀ بتاتوبولین در بانک ژن و نام‌گذاری نادرست و کیفیت کم برخی توالی‌های ثبت‌شده اشاره کرد. انتظار می‌رود در مطالعه‌های شناسایی گونه‌های مختلف میکوریز آربوسکولار در ایران، نتایج قطعی‌تر و بهتری در زمینۀ شناسایی گونه‌ها با بررسی ژن بتاتوبولین در کنار بررسی سایر نواحی ژنی و همچنین تلفیق این روش‌های مولکولی با روش‌های ریخت‌شناسی حاصل شوند.



[1] -Tulasne

[2]- Corradi

[3] Msiska

[4]- Morton

[5]- Philips

[6]- Hyman

[7]- Polyvinyl-Lacto-Glycerol (PVLG)

[8]- Tris-Borate_EDTA

[9]- Sanger

[10]- Consensus

[11]- Maximum likelihood

[12]- Ultrafast Bootstrapping

[xiii]- Kruger

(1) Smith SE., Read JD. Mycorrhizal symbiosis. 3rd ed. London: Academic Press; 2008.
(2) Dotzler N., Walker C., Krings M., Hass H., Kerp H., Taylor TN., Agerer R. Acaulosporoid glomeromycotan spores with a germination shield from the 400-million-years old Rhynie chert. Mycological Progress 2009; 8: 9-18.
(3) Wehner J., Antunes PM., Powell JR., Mazukatow J., Rilling MC. Plant pathogen protection by Arbuscular mycorrhizas: A role for fungal diversity. Pedobiologia 2010; 53: 197-201.
(4) Tulasne LR., Tulasne C. Fungi Nonnulli hypogaei, novi v.minus cogniti. Giornale botanico Italiano 1845; 2(7-8): 55-63.
(5) Kruger M., Stockinger H., Kruger C., Schubler A. Phylogenetic refrence data for systematics and phylotaxonomy of arbuscular mycorrhizal fungi from phylum to species level. New phytologist 2012; 193: 970-984.
(6) Gamper HA., Walker C., Schubler A. Diversispora Celata sp.nov: molecular ecology and phylotaxonomy of an inconspicuous arbuscular mycorrhizal fungus. New Phytologist 2009; 182: 495-506.
(7) Jansa J., Mozafar A., Banke S., McDonald BA., Frossard E. Intra and inter sporal diversity of ITS rDNA sequences in Glomus intraradices assessed by cloning and sequencing, and by SSCP analysis. Mycology Research 2002; 106: 670-681.
(8) Schubler A., Schwarzott D., Walker C. A new fungal phylum, the Glomeromycota phylogeny and evolution. Mycological Research 2001; 105: 1413-1421.
(9) Sanders IR., Alt M., Groppe K., Boller T., Wiemken A. Identification of ribosomal DNA polymorphisms among and within spores of the Glomales: application to studies on the genetic diversity of arbuscular mycorrhizal fungal communities. New Phytologist 1995; 130: 419-427.
 
(10) Raab, PA. Development of new molecular markers for phylogeny and molecular identification of arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromycota) [Dissertation]. Basel: Basel Univ; 2007.
(11) Corradi N., Kuhn G., Sanders IR. Monophyly of ß -tublin and H-ATPase gene variants in Glomus intraradices: consequences for molecular evolutionary studies of AM fungal genes. Fungal genetic Biology 2004; 41: 262-273.
(12) Aminizadeh S. Identification of Arbuscular Mycorrhizal Fungi associated with Pistachio root in Rafsanjan city [Dissertation]. Rafsanjan: Vali-e-Asr Univ; 2012.
(13) Bahraminezhad M. Identification of Arbuscular Mycorrhizal Fungi associated with Almond roots in wet and dry farming in Baft city of Kerman province and Investigation of drought tolerance of some Almond rootstocks in the presence of these fungi [Dissertation]. Rafsanjan: Vali-e-Asr Univ: 2014.
(14) Kolahnamadi Chorsi M. Distribution of Arboscular mycorrhizal fungi associated with potato in the north of West Azerbaijan province [Dissertation]. Rafsanjan: Vali-e-Asr Univ: 2013.
(15) Sadravi M. Arbuscular mycorrhizal fungi in wheat fields in Golestan province. Vegetables 2006; 7: 129-140.
(16) Sedaghati E. Isolation and identification of Arbuscular Mycorrhizal Fungi associated with the roots of Grapes in Khorasan and Qazvin provinces [Dissertation]. Tehran: Tarbiat Modares Univ; 2002.
(17) Hatami N., Bazgir E., Sedaghat E., Darvishnia M. Isolation and study of morphology and phylogeny of arbuscular mycorrhizal fungi coexisting with the roots of some medicinal plants in Kerman province. Agricultural Biotechnology Journal 2020; 12(1): 23-44.
(18) Mahmoudi M. Purification, molecular and morphological identification of Arbuscular Mycorrhizal Fungi in some potato fields in Iran [Dissertation]. Rafsanjan: Vali-e-Asr Univ: 2015.
(19) Sabetjahromi M., Salehijozani G., Hoseini M. Isolation and characterization of native arbuscular mycorrhizal fungi in soils of arid regions of Iran using nested PCR method. Trbiat Modares Biotechnology 2012; 3: 1-13.
(20) Salehijozani G., Akbarivala S., SabetJahromi M. Isolation and identification of dominant arbuscular mycorrhizal fungi in wheat, barley and weeds in some saline Regions of Iran. Crop Biotechnology 2011; 1: 61-75.
(21) Yazdanpanah M., Sedaghati E., Khodygan P., Alaei H. Molecular and morphological identification of Arbuscular Mycorrhizal Fungi associated with pistachio roots in Kerman province. Pistachio Science and Technology 2017; 2(4): 11-28.
(22) Blaszkowski J. Comparative studies of the occurrence of arbuscular fungi and mycorrhizae (Glomales) in cultivated and uncultivated soils of poland. Acta Mycologica 1993; 28: 93-140.
(23) Menge JA. Inoculum production. Plant Pathology 1984; 59: 187-203.
(24) Philips JM., Hyman DS. Improved procedures clearing root and staining parasitic and vesicular Arbuscular Mycorrhizal Fungi for rapid assesment of infection. Mycological Research 1970; 55: 158-161.
(25) Gerdemann J., Nicolson, H. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society 1963; 46: 235-244.
(26) Cho NS., Kim DH., Eom AH., Lee JW., Choi TH., Cho HY., Leonowicz A., Ohaga S. Identification of symbiotic arbuscular mycorrhizal fungi in Korea by morphological and DNA sequencing features of their spores. Journal of the Faculty of Agriculture Kyushu University 2006; 51: 201-210.
(27) Schenck NC., Perez Y. Manual for the identification of VA Mycorrhizal Fungi. Florida: Synergistic Publication; 1990.
(28) Hall IR. Taxonomy of VA mycorrhizal fungi. Florida: CRC Press;1984.
29) Oehl F., Silva GA., Goto BT., Sieverding E. Glomeromycota: Three new genera, and glomoid species reorganized. Mycotaxon 2011; 116: 75-120.
(30) Sasvari Z., Agurno F., Galanics D., Hang TTN., Luyen, ND., Posta K. Isolation and identification of arbuscular mycorrhizal fungi from agricultural field of Vietnam. American Journal of Plant Sciences 2012; 3: 1796-1801.
(31) Msiska Z., Morton J. Phylogenetic analysis of the Glomeromycota by partial ß-tubulin gene sequences. Mycorrhiza 2009; 19: 1432-1890.
(32) Katoh K., Standley DM. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: Improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution 2013; 30: 772-780.
(33) Maddison WP., Maddison DR. Mesquite A modular system for evolutionary analysis. Version 3.04. 2015. http://www.mesquiteproject.org.
(34) Nguyen LT., Schmidt HA., Haeseler A., Minh BQ. IQ-TREE: A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies. Molecular Biology and Evolution 2014; 32(1): 268-274.
(35) Zarei M., Konig S., Hempel S., Nekouei MK., Savaghebi G., Buscot F. Community structure of arbuscular mycorrhizal fungi associated to veronica rechingeri at the Anguran zinc and lead mining region. Environmental Pollution 2008; 156: 1277-1283.
(36) Redecker D., Schussler A., Stockinger H., Sturmer SL., Morton JB., Walker C. An evidence-based consensus for the classification of arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromycota). Mycorrhiza 2013; 23: 515-531.
(37) Rillig MC., Mummey DL. Mycorrhizas and soil structure. New Phytologist 2006; 171: 41-53.
(38) Lanfranco L., Delpero M., Bonfante P. Intrasporal variability of ribosomal sequences in the endomycorrhizal fungus Gigaspora margarita. Molecular Ecology Resources 1999; 8: 37-45.
(39) Lee J., Park SH., Eom AH. Molecular identification of arbuscular mycorrhizal fungi spores collected in Korea. Mycobiology 2006; 34: 7-13.
(40) Kuhn G., Hijri M., Sanders IR. Evidenec for the evolution of multiple genomes in a arbuscular mycorrhizal fungi. Nature 2001; 414: 745-748.
(41) Walker C., Giovannetti M., Avio L., Citernesi AS., Nicolson TH. A new fungal species forming arbuscular mycorrhizas: Glomus viscosum. Mycological Research 1995; 99: 1500-1506.
(42) Kruger M., Stockinger H., Kruger C., Schubler A. DNA- based species level detection of Glomeromycota: one PCR primer set for all arbuscular mycorrhizal fungi. New Phytologist 2009; 183: 212-223.