تحلیل فیلوژنتیکی پروتئین HC-Pro جدایه‌های ایرانی ویروس موزاییک زرد لوبیا

مقدمه.

ویروس موزاییک زرد لوبیا^[1] (BYMV) به جنس Potyvirus و خانوادۀ Potyviridae تعلق دارد. ویروس یادشده دارای RNA تک‌رشته‌ای مثبت است و از طریق چندین گونه شته به‏شکل ناپایا منتقل می‏شود. اگرچه خسارت آلودگی با BYMV سبب نابودی گیاه نمی‌شود، میزان عملکرد آن را کاهش می‌دهد (1). نشانه‌های بیماری ناشی از ویروس BYMV در گیاهان آلوده متغیر است و به‌طور درخور توجهی تحت‌تأثیر استرین ویروس و ژنوتیپ گیاه قرار دارد. مهم‌ترین نشانه‌هایی که این ویروس ایجاد می‌کند، عبارتند از: موزاییک، کوچک‌شدن، پیچیدگی و بدشکلی برگ‌ها (2). مشابه بسیاری از پوتی‌ویروس‌ها، ویروس موزاییک زرد لوبیا گسترش جهانی وسیعی دارد و تعداد زیادی از میزبان‌های گیاهی را آلوده و خسارت‌ اقتصادی مهمی را به انواع گیاهان تک‌لپه‌ای و دو‌لپه‌ای وارد می‌کند. ویروس موزاییک زرد لوبیا دارای استرین‌ها یا پاتوتیپ‌های بسیاری در طبیعت است که ازنظر ویژگی‌های زیستی مانند دامنۀ میزبانی و شدت بیماری‌زایی با یکدیگر تفاوت دارند (3). نخستین گزارش BYMV در ایران را کایزر^[2] و همکاران (1968) از روی گیاهانی مانند نخود ایرانی، نخودفرنگی، عدس، لوبیا و باقلا ارائه کردند (4). تاکنون ویروس BYMV از استان‏های کرمان، هرمزگان، تهران، فارس، خوزستان، گیلان، مازندران، کرمانشاه، اصفهان، البرز و لرستان از روی باقلا (5 و 6)، آفتابگردان (7)، زعفران (8) و همچنین از پداژه‌های گلایول (9) گزارش شده است.

ویروس موزاییک زرد لوبیا (مانند سایر اعضای خانوادۀ Potyviridae) پلی‌پروتئینی را کد می‌کند که به 10 پروتئین با عملکرد مشخص تقسیم می‌شود (10). پروتئین‌هایی که ژنوم BYMV کد می‌کند، از قسمت َ5 به َ3 به‌ترتیب عبارتند از: P1، HC-Pro، P3، 6K1، CI، 6K2، VPg، NIa، NIb و CP (11)؛ همچنین یک قاب خواندنی باز^[3] (ORF) کوتاه در سیترون P3 با عنوان ^[4]PIPO و با حفاظت‌شدگی زیاد گزارش شده است (12). پروتئین HC یکی از پروتئین‌هایی است که ویروس کد می‌کند، چندین عملکرد دارد و در بسیاری از مراحل چرخۀ آلودگی با ویروس دخیل است (13). این پروتئین دارای حفاظت‌شدگی زیادی بین اعضای جنس Potyvirus است و آغازگرهای طراحی‌شده بر اساس ناحیۀ HC-Pro می‌توانند تمام گونه‌های Potyvirus را شناسایی کنند (14). بر اساس پیش‌بینی‌های ساختاری، پروتئین HC به سه ناحیۀ کاربردی تقسیم می‌شود: ناحیه‌های انتهای آمینی و انتهای کربوکسیلی که هرکدام تقریباً 100 آمینو‌اسید دارند و ناحیۀ مرکزی که حدود 250 آمینو‌اسید را پوشش می‌دهد و شامل دامنه‌ای (حدود 100 آمینو‌اسید) است که سبب اتصال ناحیۀ مرکزی و انتهای کربوکسیلی می‌شود. ابتدا این پروتئین به‌شکل مؤلفۀ کمکی برای انتقال پوتی‌ویروس‌ها به‌واسطۀ شته از گیاهی به گیاه دیگر شناسایی شد. بر اساس پژوهش‌های انجام‌شده، احتمالاً ژن یادشده به‌شکل پلی بین استایلت شته و ویروس عمل می‌کند (15). تاکنون پنج عملکرد مختلف برای پروتئین HC ذکر شده است: انتقال ویروس از طریق شته، تکثیر RNA، حرکت سیستمیک، سرکوب خاموشی RNA و عمل به‌شکل پروتئیناز (16 و 17). باتوجه‌به اهمیت پروتئین HC به‌عنوان ناحیه‌ای با عملکرد چندگانه و انجام‌نشدن مطالعه‌ای روی ساختار این پروتئین در جدایه‌های ایرانی، در پژوهش حاضر به بررسی ویژگی‌های ساختاری و فیلوژنتیکی ناحیۀ HC-Pro در جدایه‌های جمع‌‌آوری‌شده از مناطق جغرافیایی مختلف ایران پرداخته و با سایر جدایه‌های موجود در بانک ژن مقایسه شد.

مواد و روش‌ها.

.ردیابی و شناسایی ویروس موزاییک زرد لوبیا در مزارع باقلا: در فصل‌های زراعی ۱۳۹۶ تا ۱۳۹۷، برگ‌های گیاهان دارای نشانه‌های ویروسی از مزارع باقلای استان‌های آذربایجان شرقی، اردبیل، زنجان، قزوین، همدان، خوزستان، فارس و کرمان به‌طور جداگانه و با ثبت نام محل و تاریخ نمونه‏برداری در کیسه‏های پلاستیکی مخصوص جمع‌آوری و در مجاورت یخ به آزمایشگاه منتقل شدند. آزمون داس الیزا^[5] با بهره‌گیری از آنتی‏بادی‏ اختصاصی چندهمسانه‌ای BYMV که از مؤسسۀ Bioreba‏‏ تهیه شد، طبق دستورعمل کلارک^[6] و آدامز^[7] (1977) برای تشخیص BYMV در نمونه‏ها استفاده شد (18). پس‌از گذشت حدود ۳۰ دقیقه، نتایج با دستگاه الیزا‌خوان^[8] Epoch (BioTech) در طول ‌موج ۴۰۵ نانومتر خوانده شدند و یک نمونۀ آلوده به ویروس از هر منطقه برای بررسی‌های بیشتر انتخاب شد.

.استخراج RNAکل گیاه، تکثیر و توالی‌یابی ناحیۀ HC-Pro جدایه‌های انتخابی: RNA کل 8 نمونۀ انتخابی آلوده به BYMV با استفاده از کیت Top Plant and Fungi RNA Purification kit (شرکت توپازژن، ایران) بر اساس دستورعمل شرکت سازنده استخراج شد. ناحیۀ HC-Pro جدایه‏های بررسی‌شده به روش‏ مولکولی RT-PCR و به کمک جفت آغازگر اختصاصی 1370For (CTM^[9]CARATGGAGAAY^[10]CCYGC) و 2340R (CCAAAGTTCCAATCACCACC) تکثیر شد (19). واکنش RT-PCR برای تولید cDNA در دو مرحله و در حجم نهایی 20 میکرولیتر انجام شد. ابتدا میکروتیوب‌های حاوی 4 میکرولیتر Reverse transcriptase buffer 10X، 1 میکرولیتر dNTPs (10 mmol/ul) (تهیه‌شده از شرکت یکتا تجهیز آزما)، 1 میکرولیتر آغازگر 2340R (10pmol/ul)، 8 میکرولیتر آب مقطر استریل و 5 میکرولیتر RNA استخراج‌شده به‌مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجۀ سانتی‌گراد در دستگاه ترموسایکلر (Bio-Rad, T-100) و سپس روی یخ قرار داده شدند؛ در مرحله بعد، هرکدام از آنزیم‌های MuMLV Reverse transcriptase (RT) و RNase inhibitor (40U/ul) به میزان 5/0 میکرولیتر به میکروتیوب اضافه شدند و به‌مدت 1 ساعت در دمای 42 درجۀ سانتی‌گراد در دستگاه ترموسایکلر قرار گرفتند. واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل 5/5 میکرولیتر آب استریل، 5/12 میکرولیتر Master mix (1.5 mM MgCl₂) ساخت شرکت ویراژن، 1 میکرولیتر آغازگر (10 pmol/ul) و 5 میکرولیتر cDNA در دستگاه ترموسایکلر انجام شد. برنامۀ گرمایی واکنش PCR به‌شکل واسرشت‌سازی اولیه به‌مدت 3 دقیقه در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد و 35 چرخه شامل واسرشت‌سازی به‌مدت 1 دقیقه در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد، اتصال به‌مدت 1 دقیقه در دمای 53 درجۀ سانتی‌گراد و بسط به‌مدت 1 دقیقه در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد تنظیم شد و درنهایت، بسط نهایی به‌مدت 10 دقیقه در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد انجام شد. کیفیت قطعه‌های تکثیرشدۀ حاصل از واکنش روی ژل آگارز 1 درصد در بافر TBE (Tris-Borate-EDTA) بررسی شد. پس‌از اطمینان‌یافتن از خالص‌بودن قطعۀ تکثیری به‌ طول حدود 1100 جفت باز، ناحیۀ مدنظر تکثیرشده از جدایه‏‌های مختلف برای تعیین توالی به شرکت توپازژن ارسال شد.

.بررسی توالی ناحیۀ HC-Pro در جدایه‌های BYMV: به‌منظور مقایسۀ توالی جدایه‌های بررسی‌شده با سایر جدایه‌ها، تمام جدایه‌هایی که توالی HC-Pro آنها ثبت شده بود، از بانک ژن برداشت شدند. ویژگی‌های جدایه‌ها به‌طور خلاصه در جدول 1 بیان شده‌اند. توالی‌های نوکلئوتیدی به‌دست‌آمده از جدایه‌های ایرانی با برنامۀ ترجمه ExPASY (https://web.expasy.org/translate) به توالی آمینواسیدی تبدیل شدند. نرم‌افزار MAFFT v.7 با تنظیمات پیش‌فرض برای هم‌ردیف‌سازی چندگانه بر اساس توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی استفاده شد (20). فایل هم‌ردیف‌سازی‌شده به‌طوردستی با برنامۀ Mesquite v.3.04 بازبینی شد (21). به‌منظور مشاهدۀ توالی‌های حفاظت‌شده بین توالی‌های هم‌ردیف‌سازی‌شده، توالی‌های یادشده با برنامۀ Weblogo.v.2.8.2 به تصویر کشیده شدند (22).

جدول 1- جدایه‌های جمع‌آوری‌شده از مناطق جغرافیایی مختلف ایران و بانک ژن

.بررسی امکان نوترکیبی در جدایه‌های BYMV انتخابی: شش برنامۀ مختلف موجود در بستۀ نرم‌افزار RDP v.4 (RDP، GENECONV، BOOTSCAN، MAXCHI، SISCAN و 3SEQ) با تنظیمات پیش‌فرض برای بررسی احتمال نوترکیبی بین توالی‌های نوکلئوتیدی بررسی‌شده استفاده شدند. توالی‌هایی که دست‌کم با سه برنامه با P value کمتر از ^6-10 شناسایی شدند، توالی‌های نوترکیب در نظر گرفته شدند (23).

.بررسی روابط فیلوژنتیکی جدایه‌های BYMV: به‌منظور بررسی روابط فیلوژنتیکی جدایه‌های بررسی‌شده در پژوهش حاضر با سایر جدایه‌های برداشت‌شده از بانک ژن (جدول ۱)، درخت فیلوژنی به روش Maximum Likelihood و بر اساس توالی نوکلئوتیدی و پروتئینی با برنامۀ IQtree v.1.6 رسم شد (24)؛ این برنامه بهترین و مناسب‌ترین مدل برای رسم درخت فیلوژنی را به‌طور خودکار انتخاب می‌کند.

بررسی ساختار پروتئینی توالی‌های BYMV: ساختار پروتئینی جدایه‌های بررسی‌شده با برنامۀ Pfam^[11] ارزیابی شد. به‌منظور بررسی میزان حفاظت‌شدگی ژن HC-Pro، ساختاری کریستالی مربوط به بخش انتهای کربوکسیلی پروتئین یادشدۀ موجود در بانک دادۀ پروتئینی (PDB) با شماره شناسۀ 3RNV انتخاب شد؛ ساختار یادشده به ویروس موزاییک شلغم تعلق داشت و به روش تفرق اشعۀ ایکس تعیین شده بود (25). توالی‌های پروتئینی موجود که در بخش‌های پیش هم‌ردیف‌سازی شدند، با برنامۀ تحت‌وب Consurf (http://consurf.tau.ac.il) روی ساختار کریستالی پروتئین 3RNV هم‌ردیف‌سازی شدند.

نتایج و بحث

تکثیر و توالی‌یابی بخشی از ناحیۀ HC-Pro: به‌منظور بررسی ساختار HC-Pro در جدایه‌های ایرانی BYMV، یک جدایه از هر استان که در آزمون الیزا مثبت شده بود، انتخاب شد. واکنش RT-PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ناحیۀ HC-Pro به تکثیر قطعه‌ای به طول حدود 1100 جفت باز منجر شد. نتایج تکثیر ژن HC-Pro روی ژل آگارز 1 درصد در شکل 1 مشاهده می‌شوند. توالی‌های 8 جدایۀ بررسی‌شده با نام‌های 2Fa، 28KH، 50G، 1Z، 2Gh، 3H، 4A و 6T به‌ترتیب به استان‌های فارس، خوزستان، کرمان، زنجان، قزوین، همدان، اردبیل و تبریز تعلق داشتند.

بررسی ساختار توالی جدایه‌های HC-Pro: توالی نوکلئوتیدی جدایه‌های ایرانی انتخابی پس‌از ترجمه به توالی آمینواسید، با استفاده از برنامۀ Pfam بررسی شد. همان‌طورکه در جدول ۲ مشاهده می‌شود، ساختار پروتئینی 8 توالی بررسی‌شده از ناحیه‌ای با عملکرد پپتیداز و متعلق به گروه HC-Pro تشکیل شده است.

شکل 1- الکتروفورز محصولات آزمون  RT-PCRبا استفاده از آغازگرهای 1370Forو 2340Rev  روی  ژل آگارز 1 درصد رنگ‌آمیزی‌شده با Red-safe: راهک 1: DNA Ladder (1kb)، راهک 2: شاهد منفی، راهک‌های 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9 و 10: نمونۀ باقلای جدا‌شده از مناطق جغرافیایی مختلف ایران (آذربایجان شرقی، اردبیل، قزوین، زنجان، همدان، خوزستان، فارس و کرمان)

نتایج بررسی جدایه‌های ایرانی با سایر جدایه‌های موجود در بانک ژن به کمک برنامۀ بلاست نشان دادند جدایه‌های 2Fa و 50G بیشترین شباهت را به‌ترتیب به میزان 11/98 و 69/97 درصد با جدایۀ استرالیایی FB جداشده از باقلا نشان می‌دهند. جدایه‌های 28KH، 3H و 4A بیشترین شباهت را به‌ترتیب به میزان 69/97، 89/92 و 15/98 درصد با دیگر جدایۀ ایرانی (Bysun) جداشده از آفتابگردان نشان دادند. دو جدایۀ 1Z و 2Gh به‌ترتیب به میزان 34/97 و 16/96 درصد با جدایۀ ژاپنی 90.2 جداشده از باقلا شباهت داشتند و جدایۀ 6T به میزان 11/94 درصد با جدایۀ آمریکایی GDD جداشده از گلایول مشابهت نشان داد.

جدول ۲- بررسی عملکرد پروتئین HC-Pro جدایه‌های ایرانی با استفاده از برنامۀ Pfam

تاکنون توالی پروتئین HC مربوط به 54 جدایۀ BYMV در بانک ژن ثبت شده است. توالی‌های آمینواسیدی ثبت‌شده به همراه 8 توالی ایرانی بررسی‌شده در پژوهش حاضر پس‌از هم‌ردیف‌سازی با برنامۀ وب‌لوگو^[12] به تصویر کشیده شدند (شکل ۲، الف). همان‌طور که شکل ۲، الف نشان می‌دهد نخستین ناحیۀ پروتئین که شامل آمینواسیدهای موقعیت‌های ۱ تا ۱۰۰ هستند، ناحیۀ انتهایی آمینی نامیده می‌شود (26). ناحیۀ انتهایی آمینی در انتقال شته اهمیت دارد، اما نقشی در آلوده‌سازی و حیات ویروس ندارد (27). در پژوهش‌های انجام‌شده، ناحیۀ حفاظت‌شدۀ KITC در بخش انتهایی آمینی پوتی‌ویروس‌ها، ناحیۀ مهمی معرفی شده است که برای اتصال استایلت شتۀ ناقل و انتقال ویروس ضروری است. همان‌طور که در شکل ۲، الف مشخص شده است، جدایه‌های بررسی‌شدۀ ویروس موزاییک زرد لوبیا به‌جای KITC، توالی RITC را دارند. نتایج فلاسینسکی^[13] و همکاران نشان دادند اگرچه آرژنین در تعداد کمی از پوتی‌ویروس‌ها مانند ویروس موزاییک زرد لوبیا جایگزین لیزین می‌شود، خاصیت انتقال با شته حفظ می‌شود (28).

بخش دوم پروتئین یا ناحیۀ مرکزی شامل آمینواسیدهای موقعیت‌های ۱۰۰ تا ۳۰۰ است. همان‌طور که در شکل ۲، الف مشخص شده است، دو توالی حفظ‌شدۀ PTK و FRNK در این ناحیه وجود دارند. در پژوهش‌های انجام‌شده به نقش این توالی‌ها به‌ترتیب در انتقال شته از طریق واکنش با پروتئین پوششی (29) و در بازدارندگی خاموشی ژن (30) در برخی پوتی‌ویروس‌ها اشاره شده است.

ناحیۀ انتهایی کربوکسیلی در بخش انتهای پروتئین قرار دارد و شامل ۱۰۰ آمینواسید است. ویژگی پروتئازی پروتئین HC که از نوع سیستئین است، ازجمله ویژگی‌های این ناحیه است. ناحیۀ انتهایی کربوکسیلی خاصیت خودبرشی دارد و بر فعالیت بازدارندگی خاموشی ژن تأثیرگذار است (31). ناحیۀ حفظ‌شدۀ YXVG در انتهای توالی پروتئین HC به‌عنوان توالی ناحیۀ خودبرشی در پوتی‌ویروس‌های مختلف شناسایی شده است (32)؛ این توالی در جدایه‌های ویروس موزاییک زرد لوبیا به‌شکل توالی حفاظت‌شدۀ YRVG با رنگ قرمز در شکل ۲، الف مشخص شده است. دو آمینواسید هیستیدین و سیستئین که برای فعالیت خود‌برشی پروتئین HC ضروری هستند (33)، در توالی‌های بررسی‌شده به‌شکل حفظ‌شده وجود دارند و با پیکان در شکل ۲، الف مشخص شده‌اند.

به‌منظور بررسی بهتر و کسب اطلاعات بیشتر دربارۀ ساختار ناحیۀ انتهایی کربوکسیلی، توالی‌های بررسی‌شده در پژوهش حاضر روی ساختار سه‌بعدی این ناحیه که به ویروس موزابیک شلغم تعلق داشت، هم‌ردیف‌سازی شدند (شکل ۲، ب). همان‌طور که مشاهده می‌شود، ناحیۀ انتهایی کربوکسیلی از چهار مارپیچ آلفا و دو صفحۀ بتا تشکل شده است؛ موقعیت این نواحی به‌ترتیب به‌شکل مربع خاکستری و آبی روی وب‌لوگو (شکل ۲، الف) مشخص شده است. صفحه‌های بتا بین مارپیچ سوم و چهارم و پشت‌سرهم قرار گرفته‌اند. دو آمینواسید ضروری در فعالیت کاتالیتیک سیستئین و هیستیدین به‌ترتیب در بخش‌های ابتدایی مارپیچ آلفای اول و صفحۀ بتای دوم قرارگرفته‌اند. همان‌طور که در شکل سه‌بعدی مشاهده می‌شود، اتصال انتهای سه مارپیچ شماره‌های ۱، ۲ و ۳ از یک سو و اتصال به صفحۀ بتای ۲ از سوی دیگر که به هم باند شده‌اند، مانع پذیرش پیش‌مادۀ جدید به پروتئین برای ایجاد برش می‌شود؛ این ویژگی ساختاری سبب ایجاد فعالیت خودبرشی می‌شود (25).

               ب                                                                 الف

شکل 2- الف. نمایی کلی از هم‌ردیف‌سازی ترادف‌های آمینواسیدی پروتئین HC-Pro جدایه‌های ایرانی و سایر جدایه‌های موجود در بانک ژن با برنامۀ وب‌لوگو که به سه بخش ناحیۀ انتهای آمینی یا N-terminal، ناحیۀ مرکزی یا Central region و ناحیۀ انتهای کربوکسیلی یا C-terminal تقسیم می‌شوند. موتیف‌های مسئول انتقال شته و بازدارندگی خاموشی، ناحیۀ خودبرشی با رنگ قرمز، محل مارپیچ‌های آلفا و صفحه‌های بتا به‌ترتیب با رنگ‌های خاکستری و آبی مشخص شده‌اند. ب. طرح حفاظت‌شدگی توالی‌های پروتئینی HC-Pro هم‌ردیف‌سازی روی ساختار سه‌بعدی پروتئینی موجود در PDB با شماره شناسۀ 3RNV با استفاده از برنامۀ Consurf

بررسی احتمال نوترکیبی: نوترکیبی از پدیده‌های رایج در چرخۀ تکثیر ویروس‌هاست (34 و 35). نوترکیبی‌های ژنتیکی نقش مهمی را در خطاهای فیلوژنتیکی ایفا می‌کنند. معمولاً پدیدۀ نوترکیبی بین جدایه‌های یک پوتی‌ویروس بسیار متداول است، ولی با شدت کمتر بین گونه‌های مختلف نیز اتفاق می‌افتد (36). معمولاً پدیدۀ نوترکیبی بین جدایه‌های یک‌ گونۀ پوتی‌ویروسی سبب جابه‌جایی قطعه‌های ژنومی می‌شود؛ البته وقوع آن بین جنس‌های مختلف به‌ندرت گزارش ‌شده است. به‌منظور بررسی این پدیدۀ زیستی در ژنوم جدایه‌های بررسی‌شده در مطالعۀ حاضر، پس‌از هم‌ردیف‌سازی این توالی‌ها با سایر جدایه‌های انتخابی موجود در بانک ژن و با الگوریتم‌های مختلف، از نرم‌افزار RDP4 استفاده شد. در حالتی وجود نوترکیبی پذیرفته می‌شود که دست‌کم با سه روش با P value کمتر از ^6-10 شناسایی شود (23). همان‌طورکه در جدول 3 مشاهده می‌شود، نوترکیبی در جدایۀ 28KH جدا‌شده از استان خوزستان با دو برنامۀ GENECONV و 3Sec شناسایی شد و نکتۀ درخور توجه این است که جدایۀ ایرانی BYSun جداشده از آفتابگردان والد اصلی معرفی شده است؛ اما ازآنجاکه این نوترکیبی تنها با دو روش شناسایی شده است، چندان قابل‌اعتماد نیست و می‌توان نتیجه‌ گرفت هیچ‌کدام از جدایه‌های ایرانی بررسی‌شده نوترکیب نیستند. در زمینۀ سایر جدایه‌های موجود در بانک ژن نیز باتوجه‌به نتایج و همان‌طور که در جدول 3 مشاهده می‌شود، جدایه‌های CKGL3، M11، RM2 و GDD بر اساس معیارهای نتایج نوترکیبی، جدایه‌های نوترکیب هستند. مطالعه‌های انجام‌شده تغییر شرایط میزبانی و اقلیمی و درنتیجۀ آن، تغییر شدید ژنوم به‌منظور سازگاری با شرایط جدید را منشأ پیدایش بسیاری از گونه‌های ویروسی عنوان می‌کنند.

جدول 3- بررسی وقوع نوترکیبی در توالی HC-Pro جدایه‌‌هایBYMVبا استفاده از برنامۀ RDP

.

بررسی روابط فیلوژنتیکی جدایه‌های ایرانی با سایر جدایه‌های BYMV: به‌منظور بررسی روابط فیلوژنی جدایه‌های بررسی‌شده با سایر جدایه‌های موجود، پس‌از حذف توالی‌های نوترکیب، از برنامۀ IQtree استفاده شد. بهترین مدل‌ها برای رسم درخت فیلوژنی بر اساس توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی برآورد‌شده با برنامۀ مدل‌یاب موجود در نرم‌افزار IQtree به‌ترتیب مدل‌های TIM2+F+I+G4 و FLU+G4 بودند. درخت‌های فیلوژنتیکی رسم‌شده بر اساس توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی HC-Pro به‌ترتیب در شکل‌های ۳ و ۴ نمایش داده شده‌اند. همان‌طور که مشاهده می‌شود، شش گروه کلی در هر دو درخت فیلوژنتیکی رسم‌شده بر اساس توالی HC-Pro وجود دارند که با شماره‌های ۱ تا ۶ نام‌گذاری شده‌اند. همۀ نمونه‌ها به‌جز ۱۵ جدایۀ موجود در گروه ۴، در پنج گروه مونوفیلتیک با بوت‌استرپ بیش از ۹۶ درصد در درخت رسم‌شده بر اساس توالی نوکلئوتیدی و بیش از ۸۰ درصد بر اساس توالی پروتئینی قرار گرفتند. بوت‌استرپ درخت رسم‌شده بر اساس توالی نوکلئوتیدی بیشتر از توالی آمینواسیدی و ترتیب گروه‌های تشکیل‌شده در درخت رسم‌شده بر اساس توالی نوکلئوتیدی و آمینواسیدی با یکدیگر متفاوت است.

تقسیم‌بندی انجام‌شده در پژوهش حاضر بر اساس توالی پروتئینی HC-Pro با تقسیم‌بندی انجام‌شده بر اساس توالی کل ژنوم (کهو^[16] و همکاران، 2014( و توالی ناحیۀ CP (ویلی^[17] و همکاران، 2008) مطابقت کامل ندارد (37 و 38). در طبقه‌بندی ویلی و همکاران (2008) بر اساس ناحیۀ CP، جدایه‌ها در هفت گروه Canna، Monocot، General، W، Broad bean، Lupine و Pea قرار گرفته‌اند. نتایج این پژوهش نشان دادند بین گروه‌های فیلوژنتیکی، میزبان و منطقۀ جغرافیایی ارتباط وجود دارد (38). در بررسی کهو و همکاران (2014( بر اساس توالی کامل ژنوم BYMV، گروه‌های مونوفیلتیک تشکیل‌شده با اعداد لاتین از I تا IX نام‌گذاری شده‌اند. باتوجه‌به نتایج پژوهش یادشده، ارتباطی بین گروه‌های فیلوژنتیکی، میزبان و جغرافیا مشاهده نمی‌شود (34).

در درخت‌های رسم‌شده در شکل‌های ۳ و ۴، جدایه‌های استرالیایی که از گیاه لوبیای مصری (Lupin) جداسازی شده‌اند، در گروه ۱ قرار گرفته‌اند. تعدادی از این جدایه‌ها که توالی کامل آنها نیز وجود دارد، در گروه I کهو و همکاران (۲۰۱۴) قرار گرفته‌اند (34) و هیچ‌کدام از جدایه‌های یادشده در پژوهش ویلی و همکاران (2008) استفاده نشده‌اند (38).

گروه 2 شامل یک جدایه از کشور ژاپن است که در گروه‌های III کهو و همکاران (۲۰۱۴) (37) و Monocot ویلی و همکاران (2008) (38) قرار گرفته است.

در گروه ۳، پنج جدایۀ ایرانی بررسی‌شده در پژوهش حاضر و دو جدایه از استرالیا و ژاپن قرار گرفته‌اند که همگی از روی باقلا جدا شده‌اند. جدایه‌های استرالیا و ژاپن در طبقه‌بندی‌های انجام‌شده به‌ترتیب به گروه VII کهو و همکاران (۲۰۱۴) و Broad Bean ویلی و همکاران (2008) تعلق دارند (37 و 38).

در گروه 5، سه جدایۀ اردبیل، همدان و خوزستان همراه با دو جدایۀ ایرانی موجود در بانک ژن جداشده از آفتابگردان و گلایول و دو جدایه از هند (گلایول و باقلا) و دو جدایه از ژاپن (گلایول و شبدر) جای گرفته‌اند. بر اساس تقسیم‌بندی‌های انجام‌شده، جدایۀ ایرانی آفتابگردان و جدایۀ استرالیایی S و ژاپنی 1/92 در گروه V، دو جدایۀ LP و LPexFB استرالیایی جداشده از Lupine در گروه VI، جدایۀ گلایول هند Gla در گروه III و جدایۀ Vfaba2 در گروه IV کهو و همکاران (۲۰۱۴) قرار گرفته‌اند (37). در درختی که ویلی و همکاران (2008) رسم‌ کرده‌اند (38)، جدایۀ S به گروه Broad Bean تعلق گرفته است.

جدایۀ آمریکایی Alaska جداشده از شبدر و جدایۀ CS ژاپن در گروه 6 قرار گرفته‌اند؛ جدایۀ CS در گروه IX کهو و همکاران (۲۰۱۴) و Pea ویلی و همکاران (2008) قرار گرفته است (37 و 38). در کنار گروه‌های مونوفیلتیک یادشده، ده جدایه از کشور هند (جداشده از نخود، گلایول، باقلا و سویا)، یک جدایۀ تایوانی (Eustoma)، سه جدایۀ ژاپنی و یک جدایۀ آمریکایی (گلایول) در کنار هم قرار گرفته‌اند، اما گروه مونوفیلتیک ایجاد نکرده‌اند؛ این دسته با عنوان گروه 4 در شکل‌های 3 و 4 نام‌گذاری شده است.

شکل ۳- درخت‌ فیلوژنتیک ۵۸ جدایۀ BYMV همراه با گروه‌های ادغام‌شده؛ درخت بر اساس توالی نوکلئوتیدی ناحیۀ HC-Pro با نرم‌افزار IQtree رسم شده و CYVV برای ریشه به کار رفته است. جدایه‌های ایرانی با رنگ قرمز مشخص شده‌اند.

شکل ۴- درخت‌ فیلوژنتیک ۵۸ جدایۀ BYMV همراه با گروه‌های ادغام‌شده؛درخت بر اساس توالی آمینواسید ناحیۀ HC-Pro با نرم‌افزار IQtree رسم شده و CYVV برای ریشه به کار رفته است. جدایه‌های ایرانی با رنگ قرمز مشخص شده‌اند.