نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
گروه زیست‌شناسی، فیزیولوژی گیاهی، دانشکدۀ علوم، دانشگاه لرستان، خرم‌آباد، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Under unfavorable conditions, Reactive Oxygen Species (ROS) are produced inside living cells. Oxidant molecules such as H2O2 could be used to study the microorganism responses to oxidative stress. The treatment of algae with phytohormones can improve their physiological indices. In this study, the effect of H2O2 on unicellular green alga Dunaliella salina, pretreated by IAA (auxin), GA3 (gibberellin), Cyt (cytokinin), and SA (salicylic acid) was studied at three concentrations.
Materials and methods: A 23-days algal culture was treated by phytohormones (in three repetitions) at three concentrations, and two days later (day 25), H2O2 (0.1 mM) treatment was performed. Two controls were considered without hormone and without H2O2, respectively. Evaluation of the growth and number of cells, fresh and dry weights, cell size (length, width, and volume), Chl a and b, beta-carotene, soluble carbohydrate, and protein were performed in days 25 and 27.
Results: Hormones in most cases significantly improved the Indices (compared to the hormone-free control sample) (p <0.05). H2O2 treatment, two days after pre-treatment with hormones, caused the improvement of indices in most cases, except for protein and beta carotene. In contrast to the protein, the amount of carbohydrate was not sensitive to H2O2. The best results were obtained with IAA at medium concentration, GA3 at high concentration, Cyt and SA at low concentration.
Discussion and conclusion: H2O2 positively influenced the effects of the four phytohormones on algae cells, especially in relation to increased algal biomass and cell division. The positive effect of H2O2 treatment on both pretreated with or without hormones was probably due to its concentration which was lower than the toxicity level. Therefore, algal cells have benefited more from the useful and signaling effects of this molecule.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
جلبک‌ها به گروه بسیار بزرگ و متنوعی از ریزموجودات سادۀ فتواتوتروف تعلق دارند (1) که بیش از 50 درصد کل تولیدات اولیه و پایۀ زنجیرۀ غذایی جهان را تأمین می‌کنند (2). جنس Dunaliella، جلبک سبز تک‌سلولی بدون دیواره (Wall-less) و اغلب ویژۀ آب‌های شور است (3) که غنی از متابولیت‌های ارزشمند شامل کاروتنوئیدها (به‌ویژه بتاکاروتن)، ویتامین‌ها، کربوهیدرات‌ها، پروتئین‌ها و لیپیدهاست (2 و 4).
تنش‌های محیطی سبب اختلال در فرایندهای متابولیسمی و موجب کاهش بازده و تولید ترکیبات آلی در تولیدکنندگان و موجودات فتواتوتروف می‌شوند (5). تنش اکسیداتیو (Oxidative stress) یکی از مهم‌ترین تنش‌هایی است که مدنظر بسیاری از پژوهشگران قرار گرفته است و به‌شکل تنش ثانویه در تنش‌های متعدد اتفاق می‌افتد (6-8). رادیکال‌های آزاد اکسیژن (ROS) بر اثر تنش‌های محیطی مختلف تولید می‌شوند و سبب بروز آسیب اکسیداتیو و درنهایت، مرگ سلول می‌شوند؛ اما نقش دیگری نیز برای ROS تعریف شده است و آن، عملکرد مفید این مولکول‌ها به‌شکل مولکول‌های علامت در پیام‌رسانی و آماده‌سازی سلول‌ها برای واکنش در برابر تنش است (9). مولکول H2O2 یکی از مولکول‌های مهم با نقش دوگانه است و ازآنجاکه پایداری بیشتری نسبت به سایر رادیکال‌های آزاد اکسیژن دارد، در آزمایش‌های مختلف به‌منظور بررسی نقش‌های مثبت و منفی رادیکال‌های آزاد در متابولیسم و حیات موجودات زنده به‌طور تیمار خارجی (Exogen) استفاده می‌شود (10). گزارش‌هایی از تأثیر H2O2 روی جلبک‌ها در بررسی میزان حساسیت جلبک به آن و تأثیر تنش بر حیات و فرایندهای متابولیسمی جلبک‌ها وجود دارند (11 و 12).
فیتوهورمون‌ها یا تنظیم‌کننده‌های رشد نقش‌های بسیار مهمی در علامت‌دهی و تنظیم فرایندهای درون‌سلولی و بافتی بر عهده دارند و اگرچه این هورمونها در جلبک‌ها یافت می‌شوند (13 و 14)، تیمار جلبک‌ها با فیتوهورمون‌های طبیعی یا مصنوعی نتایج خوبی در پی داشته است. در مطالعه‌های یادشده، بهبود شاخص‌های فیزیولوژیک و مورفولوژیک جلبک‌ها، کاهش هزینه‌های تولید زیست‌توده و افزایش زیست‌پذیری اقتصادی جلبک‌ها بر اثر تیمار جلبک‌ها با فیتوهورمون‌ها حاصل شده است (2، 7 و 15) و درحقیقت، استحصال مواد و ترکیبات مفید و ارزشمند درون‌سلولی از میکروجلبک‌های تک‌سلولی نظیر Dunaliella همواره مدنظر دانشمندان بوده است و ازاینرو، تیمارهای تحریک‌کنندۀ آنها به‌طور مداوم بررسی شده‌اند (4، 6 و 16). گام اول در افزایش تولیدات یادشده، افزایش زیست‌تودۀ سلولی و بنابراین، تحریک رشد و تقسیم سلولی در سوسپانسیون سلولی جلبک است؛ به‌همین‌علت، آزمایش‌های بسیاری برای تحریک رشد و افزایش زیست‌تودۀ سلول‌ها انجام و تیمارهای بسیاری در این زمینه بررسی شده‌اند (2، 17 و 18).
فیتوهورمون اکسین در رشد و توسعۀ سلول‌ها، تقسیم سلولی و تمایز سلول‌ها نقش دارد (19). نقش جیبرلین‌ها در تحریک تقسیم و توسعۀ سلولی و افزایش مقاومت به تنش‌های زیستی و غیرزیستی خلاصه می‌شود (2 و 20). سیتوکینین‌ها، فیتوهورمون‌هایی هستند که بر عملکرد دستگاه فتوسنتزی از طریق تنظیم سرعت فتوسنتز، تمایز کلروپلاست‌ها، بیوسنتز کلروفیل و آنزیم‌های فتوسنتزی، جلوگیری از تخریب و تجزیۀ کلروفیل اثر می‌گذارند (4 و 21). سالیسیلیک‌اسید از گروه ترکیبات فنولیکی است که امروزه مادۀ شبه‌هورمونی محسوب می‌شود و در بسیاری از فرایندهای زیستی ازجمله نفوذپذیری غشا، کاهش نشت یونی، سرعت رشد، فتوسنتز، تنفس، گلیکولیز، سنتز اتیلن و ایجاد مقاومت نسبت به تنش‌های زیستی و غیرزیستی نقش دارد (20) و می‌تواند با تأثیر بر متابولیت‌هایی نظیر آسکوربیک‌اسید، گلوتاتیون و برخی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان از آثار ناشی از تنش بکاهد (6 و 22).
مشخص شده است توانایی فیتوهورمون‌ها در بهبود رشد و بیوسنتز میکروجلبک‌ها به غلظت آنها وابسته است و مؤثرترین غلظت‌ها در گزارش‌های مختلف با یکدیگر تفاوت دارند؛ چنین تفاوتی می‌تواند به‌علت تفاوت‌های فیزیولوژیک انواع مختلف میکروجلبک‌ها، شرایط رشد و مراحل رشد و نموی آنها باشد (23).
در مطالعۀ حاضر، چهار فیتوهورمون اکسین (IAA)، جیبرلین (GA3)، سیتوکینین (Cyt) و سالیسیلیک‌اسید (SA) (هریک در سه غلظت) برای پیش‌تیمار سوسپانسیون سلولی جلبک Dunaliellaاستفاده شدند و دو روز پس‌از تیمار، تأثیر هورمونها بر بهبود احتمالی برخی از شاخص‌های فیزیولوژیک جلبک ازجمله تعداد سلول‌ها، زیست‌تودۀ جلبک و تولید برخی متابولیت‌ها سنجیده و با نمونۀ بدون هورمون (شاهد) مقایسه شد؛ سپس سوسپانسیون‌های سلولی حاوی هورمون و بدون آن در معرض تیمار H2O2 قرار گرفتند و آثار احتمالی مثبت و منفی این مولکول اکسیدان بر شاخص‌های فیزیولوژیک رشد و تولید متابولیت‌هایی نظیر کربوهیدرات‌ها، پروتئین و رنگدانه‌های جلبک (شامل کلروفیل‌ها و بتاکاروتن) در هر دو نمونۀ دارای هورمون و بدون هورمون (شاهد) بررسی و مقایسه شدند.
مواد و روش‌ها
آماده‌سازی محیط‌کشت جلبک و طراحی تیمارها: جلبک Dunaliella salina از مجموعۀ جلبکی دانشگاه اصفهان تهیه شد و تمام مواد شیمیایی لازم برای تهیۀ محیط‌کشت جلبک‌ها از شرکت‌های سیگما یا مرک تهیه شدند. محیط‌کشت جانسون[1] (24) که شریعتی[2] و لیلی[3] آن را تغییر داده‌اند (25) با استفاده از پتاسیم‌دی‌هیدروژن‌فسفات (2/0 میلی‌مولار)، پتاسیم‌نیترات (5 میلی‌مولار)، سولفات‌منیزیم (5 میلی‌مولار)، کلریدکلسیم (2/0 میلی‌مولار)، کلریدآهن (III) (2 میکرومولار)، اتیلن‌دی‌آمین‌‌تترااستیک‌اسید‌دی سدیم (5 میکرومولار)، کلریدسدیم (1 مولار)، کلریدکبالت (1 میکرومولار)، کلریدمنگنز (7 میکرومولار)، کلریدروی (1 میکرومولار)، آمونیوم‌هپتامولیبدات (1 میکرومولار)، کلریدمس (1 میکرومولار)، بیکربنات‌سدیم (4 گرم‌در‌لیتر) در اسیدیتۀ 7 و شرایط استریل تهیه شد.
مقدار 100 میلی‌لیتر از محیط‌کشت آماده‌شده در شرایط کاملاً استریل به ارلن‌مایرهای 250 میلی‌لیتری اتوکلاوشده منتقل شد. تلقیح سلول‌های جلبک در ارلن‌مایرها به‌شکلی انجام شد که حدود 105×3 سلول در هر میلی‌لیتر از محیط‌کشت جدید را فراهم کند؛ سپس ارلن‌های حاوی جلبک به‌مدت چهار هفته در دمای 2±25 درجۀ سانتی‌گراد، شرایط نوری 100 میکرومول فوتون بر مترمربع بر ثانیه، دورۀ نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی قرار گرفتند. 23 روز پس‌از کشت، ارلن‌های حاوی جلبک‌ها با یکی از سه غلظت فیتوهورمون‌های اکسین (10، 100 و 500 نانومولار) (7)، جیبرلین (10، 50 و 100 پی‌پی‌ام) (26)، سیتوکینین (10، 100 و 500 نانومولار) (26) و سالیسیلیک‌اسید (01/0، 1/0 و 1 میلی‌مولار) (27) تیمار شدند و این تیمار به‌مدت دو روز ادامه یافت. نمونۀ بدون هورمون، شاهد در نظر گرفته شد. در روز 25 کشت، افزودن H2O2 (آب‌اکسیژنۀ صنعتی30 درصد، چگالی 11/1 گرم‌بر‌سانتی‌مترمکعب در دمای 20 درجۀ سانتی‌گراد) با غلظت نهایی 1/0 میلی‌مولار به تمام ارلن‌های حاوی هورمون و نمونۀ بدون هورمون (شاهد) انجام شد و دوباره تمام ارلن‌ها به‌مدت دو روز در شرایط رشد با مشخصات یادشده قرار گرفتند. نمونه‌برداری به‌منظور سنجش و ارزیابی شاخص‌های مورفولوژیک و فیزیولوژیک در روز 25 کشت (پیش‌از اعمال تنش H2O2) و روز 27 (دو روز پس‌از اِعمال تنش H2O2) در شرایط کاملاً استریل انجام شد. به‌منظور استخراج ترکیبات درون‌سلولی جلبک، سه مرتبه از دستگاه سونیکیاتور (مدل SONIC 4D، شرکت جیمز انگلستان) و هر بار به‌مدت 2 دقیقه در 80 هرتز و ورتکس در مجاورت گلوله‌های شیشه‌ای کوچک استفاده شد (28). غلظت پراکسیدهیدروژن بر اساس برخی پیش‌آزمون‌ها به‌شکلی تعیین شد که تا حد امکان تأثیر کشندگی بر سوسپانسیون جلبکی نداشته باشد (29 و 30).
شمارش سلولی: بلور ید برای ثابت‌کردن سلول‌ها استفاده شد و شمارش سلول‌ها با لام آینه‌ای هموسایتومتر و استفاده از میکروسکوپ نوری (با بزرگ‌نمایی 400×) انجام شد. نتایج بر حسب تعداد سلول × 106 در میلی‌لیتر گزارش شدند (31).
ارزیابی ابعاد و حجم سلول: روش ویدئو میکروسکوپی برای این مطالعه استفاده و میانگین طول و عرض 10 سلول به‌طور تصادفی ارزیابی شد؛ سپس حجم سلول از رابطۀ و بر حسب میکرومترمکعب به دست آمد (32).
|
رابطۀ 1 |
V=3/4πab2 |
V: حجم سلول، a: طول سلول، b: عرض سلول
اندازه‌گیری وزن تر و خشک جلبک: به‌منظور اندازه‌گیری وزن تر جلبک، حجم همگنی از سوسپانسیون سلولی به‌مدت 15 دقیقه در g13500 سانتریفیوژ (مدل 16-4KS، شرکت سیگما آلمان) شد و برای حذف هر گونه نمک، سطح زیست‌تودۀ تر جلبک سه بار با آب دوبارتقطیر شستشو و پس‌از خارج‌شدن کامل محلول رویی، توزین شد. به‌منظور اندازه‌گیری وزن خشک، زیست‌تودۀ تر حاصل به‌مدت 8 ساعت در دمای 55 درجۀ سانتی‌گراد درون آون خشک قرار گرفت و سپس توزین شد. وزن تر و خشک بر اساس میکروگرم بر 106 سلول گزارش شدند.
سنجش رنگدانه‌های فتوسنتزی: استخراج رنگدانه‌های کلروفیل a، کلروفیل b، کلروفیل کل و بتاکاروتن بر اساس روش ایجکلهوف[4] و دکر[5] (33) و با استفاده از حلال استون 80 درصد انجام شد. جذب نمونه‌ها با دستگاه میکروپلیت‌ریدر (مدل Epoch، شرکت بیوتک انگلستان) خوانده شد و نتایج با استفاده از روابط 2، 3 و 4 محاسبه و بر حسب میکروگرم بر 106 سلول گزارش شدند.
|
رابطۀ 1 |
Ca= -1.709 A412+ 11.970 A431- 2.998 A460- 5.708 A480 |
|
رابطۀ 2 |
Cb= -0.171 A412- 0.230 A431+ 11.871 A460- 13.248 A480 |
|
رابطۀ 3 |
Cc= -0.430 A412+ 0.251 A431- 4.376 A460+ 13.216 A480 |
Ca: غلظت کلروفیل a، Cb: غلظت کلروفیل b، Cc: غلظت بتاکاروتن
سنجش میزان کربوهیدرات محلول کل: ابتدا سوسپانسیون سلولی به‌مدت 15 دقیقه در g 13500 سانتریفیوژ (مدل 16-4KS، شرکت سیگما، آلمان) و سپس محلول رویی تخلیه شد. به‌منظور حذف تداخل رنگدانه‌ها، ابتدا استون 100 درصد افزوده و سپس سانتریفیوژ به‌مدت 15 دقیقه در g 13500 انجام شد (34). رسوب برداشت‌شده سه بار در اتانول 80 درصد فریز-ذوب-سونیک و ورتکس و دوباره سانتریفیوژ شد. پس‌از جداسازی مایع رویی، رسوب باقیمانده با اتانول هموژن شد و پس‌از ورتکس و سانتریفیوژ، مایع رویی جدا و با محلول به‌دست‌آمده از مرحلۀ پیش مخلوط شد؛ سپس از طریق روش آنترون بر اثر واکنش با سولفوریک‌اسید (72 درصد) در گرما (100 درجۀ سانتی‌گراد) سنجش شد (35). میزان جذب در طول موج 625 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل Epoch شرکت بیوتک، کشور انگلستان) خوانده و از گلوکز خالص برای رسم منحنی استاندارد استفاده شد. نتایج بر حسب میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن خشک جلبک گزارش شدند.
سنجش پروتئین محلول: مقدار پروتئین بر اساس روش برادفورد[6] (36) و با استفاده از پروتئین آلبومین گاوی (استاندارد) سنجیده و جذب نمونه‌ها در طول موج 595 نانومتر با دستگاه میکروپلیت‌ریدر (مدل Epoch، شرکت بیوتک انگلستان) خوانده شد. نتایج بر حسب میلی‌گرم‌بر‌گرم وزن تر جلبک گزارش شدند.
تجزیه‌وتحلیل آماری: تمام آزمون‌ها در سه تکرار و در قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شدند. محاسبه‌های داده‌ها و ترسیم نمودارها با نرم‌افزار Excel، نسخۀ 2016 و تحلیل آماری داده‌ها با استفاده از تحلیل واریانس یک‌طرفه (ANOVA) به کمک نرم‌افزار SPSS و مقایسه میانگین دانکن (Duncan) در سطح احتمال 05/0P< انجام شد.
نتایج
نتایج تحلیل واریانس داده‌ها نشان‌دهندۀ معناداربودن (05/0P< و 01/0P<) آثار اصلی عوامل تیمار یعنی هورمون و پراکسیدهیدروژن و معنادارنبودن آثار متقابل به معنای وجودنداشتن اختلاف معنادار میان نمونه‌های پیشتیمارشده با هورمون (در سه غلظت) تحت‌تأثیر پراکسیدهیدروژن بودند. تفاوت‌های معنادار میان غلظت‌های مختلف از طریق آزمون چنددامنۀ دانکن مشخص شدند (جدول‌های 1 و 2).
جدول 1- میانگین مربعات جدول تجزیه واریانس شاخص‌های ارزیابی‌شدۀ جلبک D. salina بر اثر تیمارهای فیتوهورمون و پراکسیدهیدروژن
|
منابع تغییرات |
درجۀ آزادی |
میانگین مربعات |
|||||
|
تعداد سلول |
طول سلول |
عرض سلول |
حجم سلول |
وزن تر |
وزن خشک |
||
|
فیتوهورمون |
3 |
**115/18 |
**494/3 |
**882/0 |
**905/13610 |
**708/16042 |
* 470/182 |
|
پراکسیدهیدروژن |
1 |
**629/25 |
**801/15 |
**010/3 |
**793/4497 |
** 286/18327 |
**059/1792 |
|
فیتوهورمون×پراکسیدهیدروژن |
3 |
ns 354/0 |
ns 328/0 |
ns 228/0 |
ns 346/777 |
ns 459/876 |
ns 000/115 |
|
خطا |
56 |
958/2 |
828/0 |
149/0 |
726/1874 |
234/2482 |
522/143 |
|
مجموع |
64 |
|
|
|
|
|
|
ns، * و ** به‌ترتیب وجودنداشتن اختلاف معنادار، وجود اختلاف معنادار در سطح احتمال 5 و 1 درصد را نشان می‌دهند.
جدول 2- میانگین مربعات جدول تجزیه واریانس شاخص‌های ارزیابی‌شدۀ جلبک D. salina بر اثر تیمارهای فیتوهورمون و پراکسیدهیدروژن
|
منابع تغییرات |
درجۀ آزادی |
میانگین مربعات |
|||||
|
کلروفیل a |
کلروفیل b |
کلروفیل کل |
بتاکاروتن |
کربوهیدرات محلول |
پروتئین |
||
|
فیتوهورمون |
3 |
**019/0 |
**003/0 |
**037/0 |
ns 001/0 |
** 067/18 |
** 615/13 |
|
پراکسیدهیدروژن |
1 |
**062/0 |
*006/0 |
**106/0 |
ns 002/0 |
**695/76 |
**809/278 |
|
فیتوهورمون×پراکسیدهیدروژن |
3 |
ns 001/0 |
* 002/0 |
ns 050/0 |
ns 001/0 |
ns 733/0 |
ns 373/5 |
|
خطا |
56 |
004/0 |
001/0 |
007/0 |
001/0 |
364/7 |
688/4 |
|
مجموع |
64 |
|
|
|
|
|
|
ns، * و ** به‌ترتیب وجودنداشتن اختلاف معنادار، وجود اختلاف معنادار در سطح احتمال 5 و 1 درصد را نشان می‌دهند.
.تاثیر تیمارها بر تعداد سلول‌ها در سوسپانسیون Dunaliella:در تمام تیمارها به‌جز غلظت زیاد SA، تیمار سوسپانسیون‌های سلولی جلبک D. salina با هورمونها سبب افزایش تعداد سلول‌ها شد و بیشترین تعداد سلول‌ها در غلظت متوسط IAA به دست آمد که افزایش تقریباً دو برابری را نسبت به نمونۀ شاهد نشان داد (شکل 1).
شکل 1- تعداد سلول بر میلی‌لیتر در سوسپانسیون سلولی جلبک D. salinaدرشرایط: -H2O2) نمونۀ شاهد بدون پراکسیدهیدروژن، +H2O2) نمونۀ شاهد دو روز پس‌از تیمار پراکسیدهیدروژن، +Hormone) حاوی سه غلظت (کم، متوسط و زیاد) از هورمون‌های IAA (اکسین)، GA3 (جیبرلین)، Cyt (سیتوکینین) و SA (سالیسیلیک‌اسید)، +Hormone+H2O2) دو روز پس‌از پیش‌تیمار با هورمونها به‌علاوۀ تیمار پراکسیدهیدروژن. مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند. حرف‌های متفاوت بیان‌کنندۀ تفاوت معنادار در سطح 05/0P< بر اساس آزمون دانکن هستند.
افزودن H2O2 به نمونۀ شاهد و نمونه‌های حاوی هورمونها (دو روز پس‌از اِعمال تیمارهای هورمونی) سبب تحریک بیشتر تقسیم سلولی در تمام سوسپانسیون‌ها شد. صرفاً سوسپانسیون‌های حاوی Cyt و SA با افزایش غلظت هورمون از کم به زیاد، روند کاهشی را در تعداد سلول‌هایشان نشان دادند و تعداد سلول‌ها در هر دو حالت +H2O2 و –H2O2 کاهش یافت؛ اما در سایر حالت‌ها، تعداد سلول‌ها افزایش یافت. تیمار با هورمونها و نیز H2O2 سبب افزایش تعداد سلول‌ها در سوسپانسیون شد، ولی سوسپانسیون‌هایی که هورمون دریافت کرده بودند، پس‌از افزودن H2O2 دارای تعداد سلول بر میلی‌لیتر بیشتری شدند و بسته به غلظت هورمون، میزان تحریک تقسیم سلولی نیز متفاوت بود.
تأثیر تیمارها بر اندازه و ابعاد سلول: تیمار سوسپانسیون سلولی جلبک Dunaliella با هورمون‌های IAA، GA3 و Cyt در تمام غلظت‌ها سبب افزایش معنادار (P<0.05) طول، عرض و حجم سلول‌ها در مقادیر متفاوت شد (به‌ترتیب شکل 2، A، B و C)، اما بیشترین میزان افزایش حجم در غلظت متوسط هورمون IAA (100 نانومولار) به میزان 115 درصد نسبت به نمونۀ شاهد مشاهده شد؛ از سوی دیگر، افزودن H2O2 به سوسپانسیون تیمارشده با کمترین غلظت SA سبب افزایش طول و عرض سلول‌ها به‌ترتیب به میزان 2/14 و 6/29 درصد شد و بنابراین، حجم سلول‌ها را به میزان 8/91 درصد افزایش داد؛ درحالیکه غلظت‌های بیشتر SA، آنها را کاهش دادند. افزودن پراکسیدهیدروژن به نمونۀ شاهد سبب افزایش طول، عرض و بنابراین، حجم سلول‌ها به میزان به‌ترتیب 5/24، 13 و60 درصد شد و در سایر نمونه‌های حاوی هورمون، افزودن پراکسیدهیدروژن سبب افزایش یا کاهش طول، عرض یا حجم سلول شد؛ هرچند در بیشتر حالت‌ها به‌شکل افزایش نمایان شد.
|
A |
|
|
B |
|
|
C |
شکل 2- طول (A)، عرض (B) و حجم (C) سلول جلبک D. salinaدرشرایط: -H2O2) نمونۀ شاهد بدون پراکسیدهیدروژن، +H2O2) نمونۀ شاهد دو روز پس‌از تیمار پراکسیدهیدروژن، +Hormone) حاوی سه غلظت (کم، متوسط و زیاد) از هورمون‌های IAA (اکسین)، GA3 (جیبرلین)، Cyt (سیتوکینین) و SA (سالیسیلیک‌اسید)، +Hormone+H2O2) دو روز پس‌از پیش‌تیمار با هورمونها به‌علاوۀ تیمار پراکسیدهیدروژن. مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند. حرف‌های متفاوت بیان‌کنندۀ تفاوت معنادار در سطح 05/0P< بر اساس آزمون دانکن هستند.
تأثیر تیمارها بر وزن تر و خشک سلول‌ها: مقایسۀ وزن تر بر حسب میکروگرم در میلیون سلول (شکل 3، A) با تعداد سلول‌ها (شکل 1) و نیز با وزن خشک آنها بر حسب میکروگرم بر میلیون سلول (شکل 3، B) نشان داد تطابق زیادی میان تعداد سلول‌ها بر میلی‌لیتر با وزن خشک سلول‌ها بر حسب میکروگرم بر سلول وجود دارد؛ درحالیکه وزن تر سلول‌ها با تعداد سلول‌ها رابطۀ عکس نشان می‌دهد. در غالب حالت‌ها، تیمار با هورمونها سبب کاهش وزن تر نسبت به نمونۀ شاهد شد؛ درحالیکه میزان وزن خشک سلول‌ها را افزایش داد. افزودن H2O2 به سوسپانسیون‌های حاوی هورمون سبب تحریک تقسیم سلولی در تمام حالت‌ها شد و وزن خشک سلول‌ها را بر حسب میکروگرم بر میلیون سلول افزایش داد و سبب کاهش وزن تر سلول‌ها نسبت به حالت بدون H2O2 شد؛ به‌طوری‌که بیشترین میزان وزن تر در بیشترین غلظت SA و کمترین میزان وزن تر در غلظت متوسط IAA مشاهده شد. درمجموع می‌توان گفت تیمار با غلظت‌هایی از هورمونها که سبب تحریک تقسیم سلولی می‌شوند، وزن خشک سلول‌ها را افزایش و وزن تر آنها را کاهش می‌دهد و تیمار با H2O2 که سبب تحریک بیشتر تقسیم سلولی می‌شود، وزن خشک سلول‌ها را افزایش می‌دهد، اما وزن تر را نسبت به حالت بدون H2O2 کمتر می‌کند.
|
A |
|
|
B |
شکل 3- وزن تر (A) و وزن خشک (B) جلبک D. salinaدرشرایط: -H2O2) نمونۀ شاهد بدون پراکسیدهیدروژن، +H2O2) نمونۀ شاهد دو روز پس‌از تیمار پراکسیدهیدروژن، +Hormone) حاوی سه غلظت (کم، متوسط و زیاد) از هورمون‌های IAA (اکسین)، GA3 (جیبرلین)، Cyt (سیتوکینین) و SA (سالیسیلیک‌اسید)، +Hormone+H2O2) دو روز پس‌از پیش‌تیمار با هورمونها به‌علاوۀ تیمار پراکسیدهیدروژن. مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند. حرف‌های متفاوت بیان‌کنندۀ تفاوت معنادار در سطح 05/0P< بر اساس آزمون دانکن هستند.
تأثیر تیمارها بر رنگدانه‌های سلول‌ها: مقدار کلروفیل a (شکل 4، A) نسبت به کلروفیل b (شکل 4، B) همخوانی بیشتری با تغییرات تعداد سلول‌ها نشان داد؛ به‌طوری‌که مقدار آن با تیمارهای هورمونی و نیز با تیمار پراکسیدهیدروژن افزایش یافت.
مقدار کلروفیل b همخوانی کمتری با تعداد تقسیم‌های سلولی نشان داد و مقدار آن بر اثر تیمار با غلظت زیاد GA3 با H2O2 بیشتر از سایر تیمارها افزایش یافت.
|
A |
|
|
B |
|
|
C |
|
|
D |
شکل 4- مقادیر کلروفیل a (A)، کلروفیل b (B)، کلروفیل کل (C) و بتاکاروتن (D) در جلبک D. salinaدرشرایط: -H2O2) نمونۀ شاهد بدون پراکسیدهیدروژن، +H2O2) نمونۀ شاهد دو روز پس‌از تیمار پراکسیدهیدروژن، +Hormone) حاوی سه غلظت (کم، متوسط و زیاد) از هورمون‌های IAA (اکسین)، GA3 (جیبرلین)، Cyt (سیتوکینین) و SA (سالیسیلیک‌اسید)، +Hormone+H2O2) دو روز پس‌از پیش‌تیمار با هورمونها به‌علاوۀ تیمار پراکسیدهیدروژن. مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند. حرف‌های متفاوت بیان‌کنندۀ تفاوت معنادار در سطح 05/0P< بر اساس آزمون دانکن هستند.
تغییرات کلروفیل کل (شکل 4، C) تطابق بیشتری با کلروفیل a داشت و بیشترین مقدار کلروفیل کل و کلروفیل a بر اثر تیمار غلظت متوسط IAA، غلظت زیاد GA3 و کمترین غلظت‌های Cyt و SA با H2O2 به دست آمد. درکل، مقدار تولید کلروفیل a، کلروفیل b و کلروفیل کل بر اثر تیمار با هورمونها و نیز H2O2 تحریک شد. اگرچه اندازه‌گیری مقدار بتاکاروتن سلولی (شکل 4، D) تفاوت معناداری (05/0P<) در اثر کلی هورمون بر مقدار بتاکاروتن در مقایسه با نمونۀ شاهد بدون هورمون را نشان نداد، تفاوت‌های معناداری (05/0P<) میان تأثیر تیمارها و غلظت‌های مختلف هورمونی مشاهده شدند. بیشترین مقدار بتاکاروتن بر اثر تیمار با هورمون‌های IAA و GA3 به دست آمد. تیمار سوسپانسیون‌های سلولی با H2O2 در غلظت‌های مختلف هورمون نیز در بیشتر نمونه‌ها سبب افزایش و در برخی نمونه‌ها سبب کاهش مقدار بتاکاروتن شد.
تاثیر تیمارها بر کربوهیدرات و پروتئین سلولی: مقدار کربوهیدرات محلول سلول‌ها (شکل 5، A) بر اثر تیمار با اغلب غلظت‌های هورمونها افزایش یافت. هورمون IAA در تمام غلظت‌ها توانست مقدار کربوهیدارت سلول‌ها را افزایش دهد؛ درحالیکه صرفاً غلظت زیاد GA3 و غلظت‌های کم Cyt و SA توانستند مقدار قند سلول‌ها را افزایش دهند که افزایش وابسته به غلظت هورمونها را نشان می‌دهد. مقدار پروتئین سلول‌ها (شکل 5، B) بر اثر تیمار با هورمونها در همۀ حالت‌ها افزایش یافت (مشابه کربوهیدرات)، اما تأثیر H2O2 بر میزان قند و پروتئین معکوس بود؛ به‌طوری‌که بر اثر تیمار با H2O2، مقدار کربوهیدرات در نمونه‌های حاوی هورمون افزایش و مقدار پروتئین در آنها کاهش یافت. تأثیر H2O2 بر نمونۀ شاهد بدون هورمون به‌شکل کاهش درخور توجه مقدار پروتئین و تغییر‌نکردن مقدار کربوهیدرات سلول‌ها نمایان شد.
|
A |
|
|
B |
شکل 5- مقادیر کربوهیدرات محلول (A) و پروتئین (B) در جلبک D. salinaدرشرایط: -H2O2) نمونۀ شاهد بدون پراکسیدهیدروژن، +H2O2) نمونۀ شاهد دو روز پس‌از تیمار پراکسیدهیدروژن، +Hormone) حاوی سه غلظت (کم، متوسط و زیاد) از هورمون‌های IAA (اکسین)، GA3 (جیبرلین)، Cyt (سیتوکینین) و SA (سالیسیلیک‌اسید)، +Hormone+H2O2) دو روز پس‌از پیش‌تیمار با هورمونها به‌علاوۀ تیمار پراکسیدهیدروژن. مقادیر میانگین سه تکرار± SD هستند. حرف‌های متفاوت بیان‌کنندۀ تفاوت معنادار در سطح 05/0P< بر اساس آزمون دانکن هستند.
نتیجه‌گیری و بحث
نتایج پژوهش حاضر نشان‌دهندۀ تأثیر مثبت وابسته به غلظت هورمونها بر تعداد سلول‌ها و تقسیم‌های سلولی بودند و تأثیر H2O2 به‌شکل تأثیر فزاینده بر تعداد سلول‌های جلبک D. salina در حضور هر چهار هورمون و تمام غلظت‌ها نمایان شد. بر اساس برخی پژوهش‌ها، فیتوهورمون‌ها سبب تحریک تقسیم‌های سلولی در جلبک‌ها می‌شوند و مقدار زیست‌تودۀ آنها را افزایش می‌دهند (13). افزایش تقسیم‌های سلولی در گیاهان بر اثر استعمال خارجی (Exogen) هورمون‌های اکسین و سیتوکینین مشاهده شده است (37). نتایج برخی پژوهش‌ها نشان داده‌اند پراکسیدهیدروژن در غلظت‌های بیشتر از 1 میلی‌مولار از طریق ایجاد تنش اکسیداتیو بر فعالیت‌های سلولی تأثیر منفی می‌گذارد؛ اما برخی گزارش‌های دیگر به آثار علامت‌دهی و مثبت آن در غلظت‌های کمتر اشاره کرده‌اند (10). در پژوهش حاضر، H2O2 در غلظت 1/0 میلی‌مولار دارای تأثیر مثبت بر هر دو نمونۀ دارای هورمون و بدون هورمون (نمونۀ شاهد) به‌شکل تحریک‌کنندگی تقسیم‌های سلولی بود (شکل 1). برخی پژوهش‌ها در زمینۀ تأثیر پراکسیدهیدروژن خارجی بر جوانه‌زنی بذرهای نخود و رشد گیاهچۀ آن نشان داده‌اند H2O2 از طریق افزایش مقدار و فعالیت آنزیم‌های اکسید‌کنندۀ آسکوربات سبب رشد طولی هیپوکوتیل نخود می‌شود و با تخفیف آثار هورمون ABA سبب تسریع رشد و تقسیم‌های سلولی ریشه‌چه، جوانه‌زنی بذر نخود و وزن تر بذرها می‌شود؛ درحالیکه نمی‌تواند از آثار ممانعت‌کنندگی ABA بر درصد جوانه‌زنی و طویل‌شدن کولئوپتیل بکاهد (38 و 39). برخی دیگر از آزمایش‌ها به دخالت H2O2 در تنظیم آنزیم شبه‌پروتئین‌کیناز فعال‌کنندۀ میتوز (MAPK) اشاره کرده‌اند که دال بر نقش علامت‌دهی این مولکول است (39).
بر اساس گزارش‌ها، برخی هورمونها نظیر IAA، Cyt و GA3 می‌توانند اندازۀ سلول‌ها را افزایش دهند (19، 40 و 41). در پژوهش حاضر، تیمار خارجی هورمون‌های IAA، GA3 و Cyt در تمام حالت‌ها و SA در برخی حالت‌ها سبب افزایش اندازه و حجم سلول‌های جلبک شد (شکل 2)؛ در این میان، هورمون IAA در غلظت متوسط خود سبب بیشترین افزایش طول، عرض و حجم سلول‌های میکروجلبک D. salina شد. بر اساس اطلاعات موجود، افزایش اندازه و طویل‌شدن سلول‌ها از طریق اکسین به فرضیۀ رشد اسیدی و تأثیر این هورمون در گسترش میکروفیبریل‌های سلولزی دیواره باز می‌گردد؛ باوجوداین، سلول میکروجلبک D. salina بدون دیواره است و ازاینرو، احتمال می‌رود استعمال خارجی هورمون IAA بتواند از آثار خود نظیر تحریک فعالیت پمپ‌های پروتون غشا، کانال‌های پتاسیم یا سایر گیرندگان غشایی جلبک برای ارسال علامت به داخل سلول و درنتیجه، تحریک افزایش اندازۀ سلول بهره گیرد (19). برخی پژوهش‌ها، تغییر نفوذپذیری غشای جلبک به‌واسطۀ IAA از طریق فعال‌کردن پمپ‌های پروتون H+-ATPase غشای پلاسمایی را نشان داده‌اند (42). بر اساس نتایج، تأثیر تیمار H2O2 در برخی نمونه‌ها به‌شکل آثار مثبت بر افزایش طول و عرض سلول‌ها نمایان می‌شود که به نظر می‌رسد با آثار علامت‌دهی این مولکول بر تحریک‌کنندگی فرایندهای درون سلولی مرتبط باشد (10)؛ از سوی دیگر، افزایش اندازۀ سلول می‌تواند مرتبط با افزایش وزن تر یا وزن خشک سلول‌ها در نظر گرفته شود. بررسی میزان وزن تر و خشک سلول‌های میکروجلبک D. salina نشان داد در میان همۀ تیمارهای هورمونی، تیمار غلظت متوسط اکسین سبب ایجاد بیشترین حجم سلولی و بیشترین مقدار وزن خشک سلول‌ها در مقایسه با سایر تیمارها می‌شود (شکل‌های 2، C و 3، B)؛ درحالیکه وزن تر سلول‌ها در شرایط یادشده به مقدار زیادی کاهش می‌یابد (شکل 3، A) و این نشان می‌دهد افزایش ترکیباتی نظیر کربوهیدرات‌ها، پروتئین و رنگدانه‌های سلول که بر اثر غلظت متوسط اکسین مشاهده می‌شوند (شکل‌های 4 و 5)، علت افزایش وزن خشک سلول‌هاست. برخی پژوهش‌ها در زمینۀ تأثیر اکسین به تحریک ورود آب به درون سلول بر اثر تحریک ورود پتاسیم به‌منظور گسترش و توسعۀ میکروفیبریل‌های دیوارۀ سلولزی اشاره کرده‌اند (43- 45)، اما سلول‌های جلبک Dunaliella دیواره ندارند و دست‌کم در روز نمونه‌برداری، یعنی دو روز پس‌از اِعمال هورمونها (به‌غیر‌از غلظت زیاد SA)، وزن تر سلول‌ها کاهش و وزن خشک آنها افزایش یافت؛ به نظر می‌رسد این وضعیت با تحریک تقسیم سلولی از طریق تیمارهای هورمونی و تیمار H2O2 مرتبط باشد. بر اساس گزارش‌ها، سلول‌هایی که از فاز رشد و تقسیم به فاز ایستایی می‌روند، وزن خشک خود را افزایش می‌دهند (46)، اما افزایش وزن خشک هم‌گام با افزایش تعداد تقسیم‌ها می‌تواند به معنای بهبود شاخص‌های رشد و وزن خشک باشد.
تیمار با اغلب غلظت‌های هورمون‌های GA3، Cyt و SA سبب کاهش وزن تر و افزایش وزن خشک شد که این روند بر اثر تیمار با H2O2 نیز به همین شکل ادامه یافت؛ این اطلاعات گویای تأثیر مثبت هورمون‌های یادشده بر بیوسنتز مواد و ترکیبات درون‌سلولی است. در مطالعه‌ای با اِعمال خارجی هورمون‌های سیتوکینین و جیبرلین بر گیاه ذرت متوجه شدند با افزایش غلظت هورمونها از 50 به 150 میکرومولار، شاخص‌های رشد بذر و گیاهچه بهبود و میزان وزن خشک گیاهچه افزایش می‌یابند (26). در پژوهش حاضر، افزایش غلظت هورمون جیبرلین از کم و متوسط (حدود 30 و 150 میکرومولار) به زیاد (حدود 300 میکرومولار) سبب بهبود شاخص‌ها و افزایش میزان وزن خشک جلبک شد؛ درحالیکه افزایش غلظت هورمون سیتوکینین از کم (10 نانومولار) به زیاد (500 نانو مولار)، کاهش میزان وزن خشک و سایر ترکیبات را در پی داشت؛ این تفاوت در اثربخشی غلظت‌ها را می‌توان علاوه‌بر نوع هورمون، ناشی از تفاوت میان جلبک‌ها و گیاهان دانست.
مقدار کلروفیل a و کلروفیل کل (که بخش اعظم آن کلروفیلaاست) تحت‌تأثیر تیمار هورمونی و نیز تیمار H2O2 در حالت وابسته به نوع و غلظت هورمون افزایش یافتند که تأیید دیگری بر بهبود شرایط متابولیسمی سلول‌هاست (17)؛ اما مقدار کلروفیل b نسبت به کلروفیل a تغییرات بیشتری را نشان داد. یافته‌ها نشان می‌دهند کلروفیلb علاوه‌بر آنکه رنگدانۀ کمکی است، در تشکیل‌شدن گیرنده‌های نوری و تناسب اندازۀ گیرنده‌ها با میزان انرژی دریافتی مشارکت دارد (47) و ازاینرو می‌تواند در فرایندهایی نقش داشته باشد که سبب تحریک فتوسنتز و تولیدات فتوسنتزی نظیر کربوهیدرات‌ها می‌شوند. میکروجلبک D. salina ازنظر تولید بتاکاروتن اهمیت زیادی دارد؛ به‌طوری‌که در برخی شرایط، بتاکاروتن بیشتر از 10 درصد وزن خشک جلبک را شامل می‌شود. تاکنون مطالعه‌ها و پژوهش‌های فراوانی برای یافتن راهکارهای افزایش میزان بتاکاروتن در میکروجلبک‌ها انجام شده‌اند (2، 6، 48 و 49). افزایش مقدار بتاکاروتن در برخی غلظت‌های هورمونی که با پراکسیدهیدروژن تیمارشده یا بدون پراکسیدهیدروژن بودند، مشاهده شد؛ اما در نمونه‌هایی، تیمار با H2O2 سبب افزایش مقدار این رنگدانه در غلظت‌های متفاوت هورمونی شد. تأثیر مثبت هورمونها بر افزایش مقدار کاروتنوئیدها در برخی آزمایش‌ها گزارش (6 و 50) و آثار منفی برخی غلظت‌های آنها بر مقدار کاروتنوئیدها در برخی آزمون‌ها مشاهده شده است (7).
باتوجه‌به بهبود سایر شاخص‌های فیزیولوژیک نظیر افزایش تقسیم‌های سلولی و افزایش مقدار رنگدانه‌های فتوسنتزی، تیمار هورمونها آثار مثبتی بر فعالیت‌های فیزیولوژیک و تحریک متابولیسم سلول‌ها داشت و بیشترین مقدار آن در غلظت متوسط هورمون IAA مشاهده شد. در زمینۀ رنگدانه‌ها پیشنهاد شده است اکسین می‌تواند حالت ردوکس سلولی را در سلول‌های جلبک تنظیم و از تخریب اکسیداتیو رنگدانه‌های فتوسنتزی ممانعت کند (51)؛ از سویی، افزودن H2O2 به سلول‌های پیشتیمارشده با هورمون در مقایسه با سلول‌های تیمارنشده با هورمون (نمونۀ شاهد) نشان داد تنها در سوسپانسیون‌های پیشتیمارشده با هورمون، آمادگی افزایش بیشتر کربوهیدرات‌های محلول وجود دارد و تغییری در نمونۀ شاهد ایجاد نمی‌شود. بهبود شاخص بر اثر پیش‌تیمار هورمونی در‌رابطه‌با تقسیم‌های سلولی، وزن خشک و مقدار رنگدانه‌ها در مقایسه با نمونۀ شاهد که بدون پیش‌تیمار هورمونی بود، مشاهده شد؛ این مطلب نشان می‌دهد متابولیسم و تجمع کربوهیدرات محلول در سلول‌های Dunaliella به H2O2 حساسیت ندارد؛ درحالیکه مقدار پروتئین به‌شدت تحت‌تأثیر آن قرار می‌گیرد. میزان افت پروتئین پس‌از تیمار با H2O2 به وجودداشتن یا نداشتن پیش‌تیمار هورمونی، نوع هورمون و غلظت هورمون وابسته است. نتایج آزمایش‌های چکشی[vii] و همکاران (52) و لی[viii] و همکاران (53) حساسیت متابولیسم پروتئین‌ها در سلول به تنش اکسیداتیو حاصل از تنش شوری و فلزات سنگین را نشان می‌دهند. تأثیر تحریک‌کنندگی سیتوکینین بر افزایش مقدار پروتئین که در پژوهش حاضر مشاهده شد، بر اساس پژوهش‌ها می‌تواند به‌علت افزایش تمایل اتصال tRNAs به ریبوزوم‌ها باشد (4).
باتوجه‌به عملکرد وابسته به غلظت مولکول H2O2، مشاهده می‌شود در غالب پژوهش‌های انجام‌شده از نقش مخرب و کشندگی آن برای حذف جلبک‌های مختلف در صنعت و محیط‌های آبی و نیز محدود‌کردن رشد جلبک‌ها در محدودۀ رشد گیاهان استفاده شده است (54-57)؛ اما در پژوهش حاضر که از غلظت کم این ماده روی جلبک Dunaliella استفاده شد، آثار آن به‌شکل تحریک رشد و تقسیم‌های سلولی آشکار شد. باتوجه‌به اهمیت افزایش زیست‌توده در استفاده از جلبک‌ها و درنظرگرفتن کم‌بودن خطر آثار سمی غلظت استفاده‌شده که به‌تدریج در محیط‌کشت تجزیه می‌شود، به نظر می‌رسد بتوان از این تیمار در تحریک افزایش زیست‌تودۀ جلبک Dunaliella بهره گرفت.
)