نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد گروه زیستشناسی، دانشکدۀ علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران
2 استاد گروه زیستشناسی، دانشکدۀ علوم، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Today, one of the main environmental problems is hydrocarbon pollution due to the activities of oil and petrochemical industries. Accidental oil spills occur in the environment during the exploration, production, transportation, and storage of petroleum products. Technologies commonly used for soil remediation are expensive and can lead to the incomplete degradation of pollutants. Biodegradation is a cost-effective technology for the recovery of oil-contaminated areas.
Materials and methods: This study was conducted to isolate crude oil degrading bacteria, soil, and sludge from seven oil-contaminated areas in Masjed Soleyman. To determine the frequency of heterotrophic and degrading bacteria, the bacteria were counted by the serial dilution and MPN methods. Twenty-four strains were isolated by the culture enrichment method in Bushnell-Haas broth medium containing 0.5% crude oil. Then, based on warm staining and colonial characteristics, oil spreading test, cell surface hydrophobicity, and the emulsion activity of the strains were examined for initial screening. Finally, the top 10 strains were screened by spectrophotometric and gravimetric methods with a concentration of 0.5% crude oil. Also, Gas Chromatography (GC) was performed on the superior strain.
Results: The identified strains belonged to the genus Rhodococcus jostii strain D3 and Arthrobacter citreus strain E3. The top two strains were studied to investigate the effects of different concentrations of crude oil, nutrient effects, time effects, and mixed culture. The highest oil expansion was related to F3 strain and the highest emulsion activity rate was related to E3 strain. D3 strain with 41% degradation at the concentration of 4.5 and E3 strain with 73.5% degradation at the concentration of 1.5 showed the best results in response to different crude oil concentrations. The results of gas chromatography analysis confirmed that strain D3 can degrade 95 percent of crude oil at the concentration of 0.5%.
Discussion and conclusion: The identified strains have a great potential in removing hydrocarbon pollution and can be used at the field level to reduce and eliminate oil pollution in the contaminated areas in the future.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
مسئلۀ هیدروکربنهای نفتی[1] و آلودگی خاک و اکوسیستمهای آبزی، مسئلۀ جدی جهانی است. آلودگیهای ناشی از هیدروکربنهای نفتی، خطری جدی برای سلامتِ همۀ موجودات زندۀ دنیا هستند و باتوجهبه ویژگیهای بازدارندۀ خود، جزءِ آلایندههای اولویتدار و در حال ظهور طبقهبندی میشوند (1). تجزیۀ زیستی آلایندهها فرایندی اساسی و طبیعی برای حذف قسمت غیرفرّار آلایندههای آلی از محیط توسط میکروارگانیسمهاست (2). قرارگرفتن یک جمعیت میکروبی در معرض هیدروکربنهای نفتی در تعیین سرعت تجزیۀ آلایندههای هیدروکربنی بسیار مهم است.
آلایندههای هیدروکربنی نفت، ترکیباتی هیدروفوب هستند و محلولسازی آنها پیش از تجزیه توسط میکروارگانیسمها ضرورت دارد. ماهیت هیدروفوبیک سطح سلولهای باکتریایی نقش مهمی در تجزیۀ زیستی دارد؛ ازاینرو وجود سورفکتانتها میتواند موجب افزایش تجزیۀ هیدروکربنهای نفتی شود. افزودن سورفاکتانتها تنش سطحی آلایندههای هیدروفوبیک را کاهش میدهد و و با ایجاد امولسیون، حلّالیت هیدروکربنها را بهبود میبخشد (3، 4). آلکانها بهطورِ کلی اجزائی در نظر گرفته میشوند که بهراحتی در ترکیب نفت تجزیه میشوند. آلودگیهای هیدروکربنی ممکن است بهطورِ کامل یا جزئی در طی چند ساعت، چند روز یا چند ماه با فعالیت میکروارگانیسمها از مسیرهای مختلفی تجزیه شوند (5).
میکروارگانیسمهای متابولیزهکنندۀ هیدروکربنهای نفتی بهطورِ گسترده در محیطزیست توزیع میشوند و برای درک بهتر فراوانی و توزیع میکروبی در محیطهای طبیعی، ابزارهایی توسعهیافتهاند. شناختهشدهترین روشهای مرسوم، روشهای مبتنیبر کشت براساسِ شاخصهای متابولیکی و فیزیولوژیکی شامل جداسازی و کشت با استفاده از محیطهای جامد و مایع است. با پیشرفت سریع روشهای مولکولی مبتنیبر PCR روشهای شناسایی و مطالعه برای میکروارگانیسمی خاص و یا گروههای مختلف میکروارگانیسمها و همچنین ژنهای خاصی که برای ارزیابی کلی جوامع میکروبی، مثلاً مطالعۀ میکروارگانیسمهای غیرقابلکشت به کار گرفته شود، گسترش یافتهاند (6).
شهرستان مسجدسلیمان در شمال شرقی استان خوزستان و در 125کیلومتری شهرستان اهواز واقع شده است. مسجدسلیمان ازلحاظ اقلیمی دارای آبوهوای نیمهصحرایی است. مسجدسلیمان یکی از نخستین مناطق نفتخیز ایران است و مکانهای با آلودگی نفتی زیادی در این شهر وجود دارد که به محیطزیست آن صدمات جبرانناپذیری وارد کرده است (7). از این مکانهای نفتی میتوان پالایشگاه LDU را نام برد. تولید این پالایشگاه 500 تا 580 بشکه نفت خام در روز بوده است که از این مادۀ خامْ روزانه 30 هزار لیتر گازوئیل، 25 هزار لیتر بنزین معمولی و 25 هزار لیتر نفت کوره تولید میشد. همچنین میتوان به کارخانۀ تقطیر اشاره کرد.این پالایشگاه شامل سه واحد A، B و C است (7). هماکنون چاه نفت فعال و در حال بهرهبرداری، چاه نفت شمارۀ 9 است. مسجدسلیمان حوزۀ نفتی بسیار گسترده و بزرگی را با شهرهای همجوار خود مانند لالی و هفتگل دارد که همگی فعال هستند. استخراج نفت و گاز از دهها چاهی که در حومۀ شهر مسجدسلیمان قرار دارند، آلودگی و آلایندههای زیستمحیطی را در این شهرستان ایجاد کرده است و هماکنون، پس از گذشت بیش از یکصد سال از اکتشاف نخستین چاه نفتْ آثارِ این آلایندهها همچنان پابرجاست (7). هدف از این پژوهش، بررسی پراکندگی باکتریهای تجزیهکنندۀ نفت خام در مناطقی از مسجدسلیمان است که آلودگی نفتی زیادی دارند. همچنین غربالگری و بهدستآوردن سویههای بومی با قابلیت زیادِ تجزیۀ نفت خام از دیگر اهداف این پژوهش است. درنهایت، سنجش اثر عوامل محیطی بر میزان تجزیهپذیری نفت خام توسط بهترین سویههای بهدستآمده، هدف نهایی این پژوهش است.
مواد و روشها
نمونهبرداری: نمونههای خاک (5 نمونه) و لجن نفتی (2 نمونه) از پنج منطقۀ آلوده به مواد نفتی در شهرستان مسجدسلیمان به فواصل 5-3کیلومتری از یکدیگر جمعآوری شدند. مناطق نمونهبرداری شامل پالایشگاه نفت بیبیان در محل لولۀ نفت خام عبوری چاه شمارۀ 9، محلۀ کوی نفتخیز (چاه نفتی)، محلۀ سیبرنج (کمپ کرسنت)، محلۀ مدرسهخارجیها (هشتبنگله) در محل لولۀ نفت خام عبوری چاه شمارۀ 34 و محلۀ نمرهیک در محل لولۀ نفت خام عبوری چاه شمارۀ یک قدیم انتخاب شدند. نمونهبرداری از عمق 10-5سانتیمتری خاک بهمیزانِ 500 گرم در شرایط کاملاً استریل انجام گرفت و در کیسههای پلاستیکی پلیاتیلناستریل[2] در دمای 4 سانتیگراد تا رسیدن به آزمایشگاه نگهداری شدند (8). در جدول 1، مناطق نمونهبرداری با ذکر نام اختصاری نشان داده شده است. طول و عرض جغرافیایی مناطق نمونهبرداری بدین صورت بود: N "26°32'613 و " E 55°52'634
جدول 1- مناطق نمونهبرداری با ذکر نام اختصاری
|
نام اختصاری |
منطقۀ نمونهبرداری |
|
A |
خاک منطقۀ نمرۀ یک |
|
B |
خاک منطقۀ کوی نفتخیز |
|
C |
خاک منطقۀ سیبرنج |
|
D |
خاک پالایشگاه بیبیان |
|
E |
خاک منطقۀ مدرسهخارجیها |
|
F |
لجن نفتی منطقۀ سیبرنج |
|
G |
لجن نفتی پالایشگاه بیبیان |
شمارش تعداد کل هتروتروفها و تجزیهکنندهها در خاکهای آلوده با روش سریال رقت: تجزیه و تحلیل نخستینِ خاک، با شمارش تعداد کل باکتریهای هتروتروف و تجزیهکننده در خاکهای آلوده انجام شد. ابتدا 10 گرم از خاکهای آلوده در 100 میلیلیتر بافر فسفات نمکی حل شد و بهمدتِ 60 دقیقه در انکوباتور شیکردار با دور rpm 160 و دمای 30 درجۀ سانتیگراد قرار داده شد. سپس درون لولههای آزمایش بهمیزانِ 9 میلیلیتر بافر فسفات نمکی ریخته شد. برای شمارش باکتریهای هتروتروف پس از رقتسازیهای متوالی 1 میلیلیتر از سوسپانسیون تهیهشده در رقتهای 5- 10 و 6- 10 در لولۀ آزمایش تهیه شد. سپس 100 میکرولیتر از این رقتها در پلیتهای حاوی نوترینت آگار کشت سفرهای داده شد و برای شمارش باکتریهای تجزیهکننده رقت 1- 10 و 2- 10 تهیه شد. در مرحلۀ بعد، 100 میکرولیتر از این رقتها در پلیتهای بوشنل هاس آگار حاوی نیمدرصد نفت خام بهعنوانِ تنها منبع کربن محیط، کشت سفرهای داده شد. پس از انکوباسیون در دمای 30 درجۀ سانتیگراد و پس از گذشت زمان 48ـ24 ساعت شمارش کلنی باکتریهای هتروتروف و پس از گذشت 10 روز در دمای 30 درجۀ سانتیگراد شمارش کلنی باکتریهای تجزیهکننده انجام شد و طبق فرمول زیر تعداد کلنی در هر گرم خاک محاسبه شد (9).
10×عکس رقت×میانگین تعداد کلنیهای شمارششده[3]Cfu/gram =
شمارش تعداد کل هتروتروفها و تجزیهکنندهها در خاکهای آلوده با روش MPN[4]: برای شمارش باکتریها با استفاده از روش بیشینۀ تعداد احتمالی (MPN)، ابتدا 10 گرم از خاکهای آلوده در 100 میلیلیتر بافر فسفات حل شد و بهمدتِ 30 دقیقه در انکوباتور شیکردار در دمای 30 درجۀ سانتیگراد قرار داده شد. سپس 1 میلیلیتر از امولسیون تهیهشده به درون لولههای آزمایش حاوی 9 میلیلیتر بافر فسفات منتقل شد. برای شمارش باکتریهای هتروتروف رقتهای 7- 10- 5- 10 ایجاد شد و میزان 100 میکرولیتر از این رقتها در میکروپلیتهای 24خانۀ حاوی 1800 میکرولیتر نوترینت براث ریخته شد و برای شمارش باکتریهای تجزیهکننده، رقتهای 4-10 -2- 10 تهیه شد و در میکروپلیتهای حاوی1800 میکرولیتر بوشنل هاس براث دارای نیمدرصد نفت خام بهعنوانِ تنها منبع کربن و انرژی در شرایط کاملاً استریل ریخته شد. هر رقت 3 تکرار داشت و MPN بهصورتِ 3تایی انجام شد. سپس میکروپلیتها برای شمارش هتروتروفها بهمدتِ 2 روز در دمای 30 درجۀ سانتیگراد و میکروپلیتها برای شمارش تجزیهکنندهها بهمدتِ 4 روز در دمای 30 درجۀ سانتیگراد انکوبه شدند. پس از گذشت زمان انکوباسیون، ایجاد کدورت در مقایسه با شاهد، شاخص مثبت آزمایش MPN به حساب آمد و با استفاده از نرمافزار MPN calculator version 23 تعداد باکتریها در هر گرم خاک محاسبه شد (10، 11).
.جداسازی و غربالگری باکتریهای تجزیهکنندۀ نفت خام: برای جداسازی باکتریهای تجزیهکنندۀ نفت خام از محیط بوشنل هاس براث حاوی نیمدرصد نفت خام بهعنوانِ تنها منبع کربن و انرژی استفاده شد. ابتدا برای غنیسازی باکتریها 10 گرم از نمونههای خاک به 100 میلیلیتر محیط بوشنل هاس براث حاوی نیمدرصد نفت خام در فلاسکهای ارلن مایر[5] در شرایط کاملاً استریل اضافه شد. سپس در شیکر انکوباتور با دور rpm 160 و دمای 30 درجۀ سانتیگراد بهمدتِ 10 روز قرار داده شدند. پس از 10 روز باتوجهبه غلظتهای خاک در نمونههای مختلف بهمیزانِ 5 و 10 میلیلیتر از محیط برداشته و به محیط بوشنل هاس براث تازه حاوی نیمدرصد نفت خام منتقل شد. از پاساژ پایانی (پاساژ سوم)، پس از رقتسازیهای متوالی باتوجهبه غلظت نمونهها، از رقتهای 6- 10- 3- 10 میزان 100 میکرولیتر به محیط NA تلقیح شد و بهصورتِ کشت سفرهای پخش شد و پس از رشد در دمای 30 درجۀ سانتیگراد پس از 24 ساعت کلنیهای متفاوتی ازنظرِ مورفولوژی مشاهده شدند که هرکدام از این کلنیها در پلیتهای NA جدید خالصسازی و در دمای 4 نگهداری شدند. ذخیرهسازی باکتریها نیز در گلیسرول با غلظت 3درصد در دمای 20- درجۀ سانتیگراد برای توصیفات بعدی قرار گرفت (12، 13). برای غربالگری باکتریهای تجزیهکنندۀ بهدستآمده از روشهای سنجش فعالیت امولسیونکنندگی (E24) استفاده شد و تست گسترش قطرۀ نفت براساسِ پروتکلهای شرحدادهشده انجام شد.
شناسایی باکتریهای جداشده
شناسایی بیوشیمیایی: برای شناسایی باکتریهای تجزیهکنندۀ نفت خام جداشده از منابع فوق، آزمایشهای نخستینِ بیوشیمیایی رنگآمیزی گرم، شکل کلنی، شکل میکروسکوپی، اکسیداسیون/فرمانتاسیون (O/F)، تریپل شوگر آیرون آگار (TSI)، حرکت، تولید سولفید هیدروژن، اندول (SIM) و سیمون سیترات آگار استفاده شد (14).
شناسایی مولکولی: شناسایی مولکولی با تکثیر قسمتی از ژن16S rDNA توسط پرایمرهای ForwardPrimer: 5́-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3́و:Reverse Primer5́-TACGYTACCTTGTTACGACTT -3 ́ انجام شد. برنامۀ PCR برای تکثیر ژن بدین صورت بود: دمای دناتوراسیون 94 درجۀ سانتیگراد بهمدتِ یک دقیقه، دمای اتصال پرایمرها 55 درجۀ سانتیگراد بهمدتِ یک دقیقه و دمای تکثیر 72 درجۀ سانتیگراد بهمدتِ 1 دقیقه و تعداد سیکلها 35 است. محصول حاصل از PCR در ژل آگاروز 1درصد بارگذاری شد و سپس باند bp 1400 از ژل آگاروز طبق شیوهنامۀ کیت فرمنتاژ (K0513) استخراج و برای تعیین توالی فرستاده شد. نتایج حاصل از تعیین توالی در بانکهای ژنی بلاست شد و همولوژی آنها بررسی شد و قرابت بیشتر از 98درصد بهعنوانِ جنس و گونۀ باکتری مجهول لحاظ شد (15).
.سنجش میزان حذف نفت توسط باکتری با روش اسپکتروفتومتری و گراویمتری[6]: ابتدا یک کشت 24ساعته از باکتری در محیط NB در لولههای آزمایش بهمیزانِ 10 میلیلیتر تهیه شد. در مرحلۀ بعد، وزن ارلنهای خشک اندازهگیری شد و 100 میلیلیتر محیط بوشنل هاس براث تهیه شد و در شرایط استریل، سوسپانسیون باکتری به ارلنهای حاوی محیط BHB اضافه شد. در مرحلۀ بعد، به هر ارلن نیمدرصد نفت خام اضافه شد و درِ ارلنها با استفاده از فویل آلومینیومی و پنبۀ استریل بسته شد و در دستگاه شیکر انکوباتور با دور rpm 160 و دمای 30 درجۀ سانتیگراد در شرایط استریل بهمدتِ 15 روز نگهداری شدند. پس از طی دورۀ 15روزه ابتدا جذب کمّی و کیفی نمونهها در طول موج 600 نانومتر خوانده شد. سپس 50 میلیلیتر محلول دیکلرومتان[7] (DCM) به ارلنهای حاوی محیط کشت و نفت اضافه شد و با یکدیگر مخلوط شدند. سپس محتویات ارلن به درون قیف جداکننده منتقل شدند و بهآرامی هم زده شدند تا فاز آبی (بالا) و آلی (پایین) بهخوبی از یکدیگر جدا شوند. سپس فاز آلی (DCM و نفت) به درون ارلنهایی ریخته شد که وزن خشک آنها ازپیش اندازهگیری شده بود. پس از آن، 1 میلیلیتر از محلول با 2 میلیلیتر DCM مخلوط شد و کدورت نفت استخراجشده در مقابل شاهد در طول موج 420 نانومتر تعیین شد (روش اسپکتروفتومتری). سپس فاز آلی در معرض هوا قرار گرفت تا دیکلرومتان آن تبخیر شود. نفت مصرفشده با کمکردن هیدروکربنهای باقیمانده از وزن اصلی هیدروکربنهای نفتی بهعنوانِ شاهد محاسبه شد و از فرمول زیر برای محاسبۀ درصد حذف نفت خام (نفت باقیمانده) استفاده شد (16).
100× میزان جذب شاهد/ میزان جذب نمونه-میزان جذب شاهد = درصد حذف نفت خام
.سنجش حذف نفت خام با روش گاز کروماتوگرافی (GC[8]): برای تأیید حذف نفت با روشهای اسپکتروفتومتری و گراویمتری، سنجش حذف با روش گاز کروماتوگرافی نیز انجام شد؛ بدین منظور، یکی از سویههای برتر بهمدتِ پانزده روز در محیط کشت ONR حاوی یکدرصد نفت خام و در دمای ºC30 روی شیکر با دور rpm 180 انکوبه شد. پس از استخراج نفت باقیمانده با دیکلرومتان، درصد تجزیۀ نفت توسط هر سویه با استفاده از آنالیز گاز کروماتوگرافی از نفت باقیمانده در محیط کشت برای هر سویه انجام شد. ستونGC بهکاررفته با دکتور FID بود. حلّال بهکاررفته، دیکلرومتان و دمای نگهداری ستون برای 17 دقیقه بود. گاز حامل هلیوم و جریان عبوری 3 میلیلیتر بر دقیقه بود.
تأثیر برخی شرایط در تجزیۀ نفت خام توسط باکتریهای برتر تجزیهکننده: آثارِ غلظت، زمان، مواد مغذی (منبع نیتروژن و کربن) و کشت مخلوط بر تجزیۀ نفت خام توسط سویههای برتر بررسی شد و از غلظتهای 5/1، 3، 5/4 و 6درصد نفت خام استفاده شد.برای بررسی اثر مواد مغذی توسط باکتریها 1 گرم پپتون (منبع نیتروژن)، 1 گرم گلوکز (منبع کربن) و 1 گرم پپتون + 1 گرم گلوکز (منبع نیتروژن و کربن) به ارلنها اضافه شد و کشت تازۀ باکتری به ارلنها اضافه شد. برای بررسی اثر کشت، مخلوط کشت تازۀ باکتریهای مختلف همراه با هم به ارلنهای حاوی محیط کشت اضافه شدند. برای بررسی اثر زمان باکتریها بدون اضافهکردن، مواد مغذی به ارلنهای حاوی محیط کشت اضافه شدند. در مرحلۀ آخر نیمدرصد نفت خام فیلترشده به ارلنها اضافه شد و درِ ارلنها با درپوش استریل بسته شد. سپس ارلنها در انکوباتور شیکردار با دور rpm 160 و دمای 30 درجۀ سانتیگراد قرار گرفتند. پس از گذشت 30 روز، نتایج اثر زمان و پس از گذشت زمان 15 روز، سایر شرایط مؤثر بر رشد کمّی (OD600) و کیفی باکتریها و میزان حذف نفت خام توسط آنها (OD420) بررسی شد. میزان حذف نفت خام با روش اسپکتروفتومتری و گراویمتری مشخص شد (17).آزمایشها با سه تکرار انجام شد و آنالیز آماری دانکن انجام گرفت.
نتایج
کمّیت باکتریهای هتروتروف و تجزیهکننده در نمونهها با استفاده از روش سریال رقت و MPN: نتایج حاصل از شمارش تعداد کل هتروتروفها و تجزیهکنندههای نفت خام با دو روش سریال رقت و شمارش بیشینۀ احتمالی در مناطق مختلف نمونهبرداری در جدول 2 نشان داده شده است. باتوجهبه جدول 2 بیشترین تعداد باکتریهای هتروتروف در روش سریال رقت مربوطبه نمونۀA (خاک منطقۀ نمرۀ یک) و کمترین تعداد مربوطبه نمونۀ D (خاک پالایشگاه بیبیان) است و بیشترین تعداد باکتریهای تجزیهکننده مربوطبه نمونۀ F(لجن نفتی منطقۀ سیبرنج)، و کمترین تعداد مربوطبه نمونۀ G(لجن نفتی پالایشگاه بیبیان) است. در روش شمارش بیشینۀ احتمالی، ایجاد کدورت در رقتهای تهیهشده شاخص مثبت MPN در نظر گرفته شد. نتایج حاصلشده نشان داد بیشترین تراکم باکتریهای هتروتروف مربوطبه نمونۀ B(خاک منطقۀ کوی نفتخیز) و نمونۀ C (خاک منطقۀ سیبرنج) و کمترین تراکم مربوطبه نمونۀ Gاست. بیشترین تراکم باکتریهای تجزیهکننده مربوطبه نمونۀ E (خاک منطقۀ مدرسهخارجیها) و کمترین تراکم مربوطبه نمونۀ G است.
غربالگری باکتریهای تجزیهکنندۀ نفت خام: در این پژوهش، 24 سویۀ باکتری تجزیهکنندۀ نفت خام از نمونههای خاک آلوده به نفت جداسازی شد. این سویهها براساسِ رشد در محیط حاوی نفت خام بهعنوانِ تنها منبع کربن، حذف کیفی نفت، فعالیت امولسیونهکنندگی (E24) و گسترش نفتْ غربالگری شدند. نتایج حاصل از غربالگری در جدول 3 آمده است. باتوجهبه نتایج، 10 سویه که در همۀ شاخصها ارزش بیشتری داشتند، برای مطالعات بعدی انتخاب شدند.
جدول 2- شمارش تعداد کل هتروتروفها و تجزیهکنندهها
|
نمونه |
تعداد کل هتروتروفها برحسب cfu/g |
تعداد کل تجزیهکنندهها برحسب cfu/g |
تعداد کل هتروتروفها MPN cell/g |
تعداد کل تجزیهکنندهها MPN cell/g |
|
A |
109×63/1 |
104×32/4 |
106 × 2/0 |
104 × 2 |
|
B |
107×4/4 |
103×25/5 |
106 × 9/2 |
106 × 6/4 |
|
C |
107×7/2 |
103×9/3 |
106 × 9/2 |
106 × 5/1 |
|
D |
107×7/1 |
103×75/1 |
105 × ¾ |
105 × 5/7 |
|
E |
107×25/2 |
103×25/5 |
106 × 5/1 |
108 × 1/1 |
|
F |
109×40/1 |
105×46/1 |
106 × 1/1 |
104 × 1/1 |
|
G |
109×91/0 |
103×45/1 |
104 × 6/4 |
103 × 1/2 |
جدول 3- نتایج رشد، فعالیت امولسیونکنندگی (E24) و تست گسترش نفت توسط سویههای جداسازیشده
|
نام سویه |
OD=600 |
E24 (درصد) |
گسترش نفت (میلیمتر) |
نام سویه |
OD= 600 |
E24 (درصد) |
گسترش نفت |
|
A1 |
95/1 |
- |
4 |
E3 |
837/0 |
76/30 |
10 |
|
A2 |
058/0 |
- |
- |
F1 |
475/1 |
30/32 |
7 |
|
A3 |
342/0 |
84/13 |
5 |
F2 |
494/0 |
15/26 |
12 |
|
B1 |
821/1 |
- |
- |
F3 |
529/0 |
- |
19 |
|
B2 |
355/0 |
- |
- |
G1 |
253/0 |
15/46 |
- |
|
B3 |
190/0 |
- |
5 |
G2 |
291/0 |
61/44 |
15 |
|
B4 |
541/0 |
- |
5 |
G3 |
579/0 |
43 |
11 |
|
B5 |
105/0 |
61/4 |
- |
D2 |
672/1 |
- |
3 |
|
C1 |
097/1 |
- |
- |
D3 |
706/0 |
46/38 |
14 |
|
C2 |
537/0 |
23/9 |
3 |
D4 |
830/0 |
- |
2 |
|
C3 |
164/0 |
- |
- |
E1 |
233/0 |
38/15 |
mm 10 |
|
D1 |
340/0 |
- |
mm 5 |
E2 |
030/1 |
- |
- |
شناسایی بیوشیمیایی: پس از غربالگریِ نخستین، تستهای بیوشیمیایی برای شناسایی سویههای برتر انجام شد. در جدول 4، نتایج حاصل از این تستها برای هر سویه آمده است. این نتایج نشان میدهد سویهها در برخی صفات بیوشیمیایی با یکدیگر تفاوت دارند و برخی با یکدیگر مشابه هستند.
میزان رشد و حذف نفت خام توسط سویههای برتر: میزان رشد سویههای برتر با خواندن جذب نوری در طولموج 600 نانومتر تعیین شد. در جدول 5، میزان رشد بهصورتِ کمّی و کیفی و درصد حذف نفت خام با هردو روش توسط هر سویه آمده است. نتایج حاصل از این جدول نشان داد نمونههای E3و D3 با بیشترین درصد تجزیهبرترین سویههای تجزیه شناخته شدند و برای تعیین توالی انتخاب شدند. شکل 1 نیز تجزیۀ نفت توسط این دو سویه در ارلن را نشان میدهد.
جدول 4- نتایج تستهای بیوشیمیایی 10 سویۀ برتر
|
نام سویه |
TSI
|
O/F |
سیمونسیترات |
حرکت |
H2S |
تولید اندول |
|
A1 |
اسید/قلیا |
-/- |
+ تأخیری |
+ |
- |
- |
|
B1 |
اسید/قلیا |
-/- |
+ تأخیری |
- |
- |
- |
|
C1 |
اسید/اسید |
-/- |
- |
+ |
- |
- |
|
C2 |
قلیا/قلیا |
-/- |
+ |
+ |
- |
- |
|
D2 |
اسید/قلیا |
-/- |
+ |
+ |
- |
- |
|
D3 |
اسید/قلیا |
+/+ |
- |
- |
- |
- |
|
E2 |
قلیا/قلیا |
-/- |
+ تأخیری |
+ |
- |
- |
|
E3 |
اسید/قلیا |
+/+ |
- |
+ |
- |
- |
|
F1 |
قلیا/قلیا |
+/+ |
+ |
+ |
- |
- |
|
G3 |
اسید/قلیا |
-/- |
- |
- |
- |
- |
جدول 5- میزان رشد و درصد حذف نفت خام توسط سویههای برتر پس از 15 روز
|
نام سویه |
OD600 |
رشد کیفی |
نوع امولسیون |
درصد تجزیۀ نفت (OD420) |
درصد تجزیۀ نفت (گراویمتری) |
|
A1 |
56/0 |
+ |
- |
87/12 |
70 |
|
B1 |
67/0 |
+++ |
امولسیون ناقص |
68/55 |
90 |
|
C1 |
66/0 |
++ |
- |
53/15 |
70 |
|
C2 |
67/0 |
+ |
میکروگلوله |
25/13 |
85/62 |
|
D2 |
51/0 |
++ |
میکروگلوله |
62/24 |
42/71 |
|
D3 |
53/2 |
+++ |
امولسیون کامل |
18/68 |
42/91 |
|
E2 |
48/0 |
++ |
میکروگلوله |
95/7 |
14/57 |
|
E3 |
44/1 |
+++ |
امولسیون کامل |
22/60 |
14/97 |
|
F1 |
19/0 |
++ |
گلولۀ نفتی |
98/10 |
14/47 |
|
G3 |
38/0 |
++ |
گلولۀ نفتی |
45/20 |
71/55 |
شکل 1- تجزیۀ نفت خام توسط برترین سویههای تجزیهکننده در ارلن
شناسایی مولکولی برترین سویههای تجزیهکنندۀ نفت خام: دو سویۀE3 و D3 که بهترین سویۀ تجزیهکنندۀ نفت خام در آزمایشهای پیشن بودند، با تکثیر ژن 16S rRNA شناسایی مولکولی شدند. در شکل 2 نتیجۀ حاصل از PCR آمده است که هردو سویه واجد باند 1400 جفت بازی بودند. نتایج حاصل از تعیین توالی نشان داد بیشترین همسانی سویۀ D3 پس از بلاستکردن با جنس و گونۀ Rhodococcus jostii تطابق دارد. شمارۀ دستیابی توالی این سویه در پایگاه EMBL، LN856587 است. همچنین توالی بهدستآمده برای سویۀ E3 نشان داد بیشترین همسانی این سویه پس از بلاستکردن با جنس و گونه Arthrobacter citreus تطابق دارد. شمارۀ دستیابی توالی این سویه در پایگاه EMBL، LK391634 است. درخت فیلوژنی این دو سویه در شکل 3 نشان داده شده است.
آنالیز گاز کروماتوگرافی میزان تجزیۀ نفت در سویۀ برتر D3: در شکل 4، نتایج حاصل از گاز کروماتوگرافی بههمراهِ طیف مربوط به سویۀ D3 و شاهد آمده است. همانطور که در این شکل دیده میشود، طیفهای کروماتوگرافی سویۀ D3 نسبت به شاهد کمتر شدهاند که نشاندهندۀ تجزیه و حذف ترکیبات نفتی است. درصد تجزیۀ نفت خام توسط سویۀ D3 با محاسبۀ سطح زیرمنحنی طیفهای گاز کروماتوگرافی حاصل از هر سویه با کسرکردن پیک حلّال به دست آمد. نتیجه نشان داد این سویه توانِ حذف 95درصد نفت خام را دارد؛ بنابراین، با این آنالیز نتایج بهدستآمده از دو روش گراویمتری و اسپکترومتری، حذف نفت تأیید میشود؛ چون این سویه در این دو روش بهترتیب میزان 91 و 68درصد نفت خام را تجزیه کرده بودند.
نتایج حاصل از اثر عوامل بر میزان تجزیۀ نفت خام توسط سویههای برتر E3 و D3: اثر چهار غلظت نفت بر تجزیۀ نفت خام بهوسیلۀ دو سویۀ برتر بررسی شد. نتیجۀ حاصل در شکل 5 آمده است. همانطور که در این شکل مشاهده میشود، با افزایش غلظت نفت خام از 5/1درصد به 5/6درصد، تجزیه بهطورِ محسوسی کاهش یافته است. سویۀ E3 تجزیۀ بهتری نسبتبه سویۀ D3 در همۀ غلظتها داشت. بهترین غلظتی که هردو سویه میتوانستند تجزیه کنند، غلطت 5/1درصد نفت بود. نتایج حاصل از سایر عواملِ بررسیشده، در شکل 6 آمده است. باتوجهبه این شکل، تقریباً تمامی سویهها رشد درخورِتوجهی را در حضور منابع اضافی کربن از خود نشان دادند و رشد در حضور پپتون و گلوکز بهخوبی صورت گرفته و تقریباً تجزیه بهطورِ کامل انجام گرفته است. سویۀ R. jostii strain D3 در تمامی شرایط نفت را بهطورِ کامل تجزیه کرد. سویۀ A. citreus strain E3 با اضافهکردن پپتون، تجزیۀ بیشتری انجام داد و زمان تجزیه از 15 روز به 3 روز کاهش یافت و همچنین در این سویه اثر ترکیب منبع پپتون و گلوکز در تجزیه کمتر از اثر پپتون مشاهده شد. اثر کشت مخلوط، زمان تجزیه را از 30 روز به 3 روز کاهش داد که برتری کشت مخلوط دو سویۀ D3و E3 را در تجزیۀ نفت خام نشان میدهد.
شکل 2- ژل الکتروفورز محصول PCR سویههای برتر؛ چاهک L: مارکر 100 جفت بازی، چاهک 1: سویۀ E3، چاهک 2: سویۀ D3، چاهک 3: کنترل مثبت
شکل 3- درخت فیلوژنی دو سویۀ برتر؛ این درخت فیلوژنی با نرمافزار مگا و از روش Neighbor-Joining رسم شده است. الف. درخت فیلوژنی سویۀ D3، ب. درخت فیلوژنی سویۀ E3
شکل 4- پیکهای گاز کرماتوگرافی حاصل از تجزیۀ نفت خام بهوسیلۀ سویۀ D3
شکل 5- اثر غلظتهای مختلف نفت خام بر میزان تجزیۀ نفت خام در دو سویۀ E3 و D3
شکل 6- اثر برخی عوامل بر میزان تجزیۀ نفت خام توسط دو سویۀ E3 و D3
بحث و نتیجهگیری.
براساسِ گزارشهای منتشرشده در سال 2003 مصرف جهانی نفت بیش از 5/63 میلیون بشکه در روز بود و انتظار میرود تا سال 2030 به 118 میلیون بشکه در روز برسد. ارزش سالانۀ نفت خام طبیعی 600.000 تن در هر سال گزارش شده است. در چنین مواردی، استفاده از تکنیکهای بیولوژیکی برای اصلاح سایتهای آلوده روشی سازگار با محیطزیست، مقرونبهصرفه و خودگردان شناخته شده و توجه دانشمندان محیطزیست را به خود جلب کرده است. باتوجهبه سازگاری میکروارگانیسمها با شرایط محیطی حاد در محیطزیستهای آلوده توجه بیشتری را به خود جلب کردهاند (18).
استفادۀ گسترده از فرآوردههای نفتی به آلودگی خاک و محیط آبزی میانجامد؛ درنتیجه تهدیدی جدی ازنظر سلامتی بر همۀ اشکال زندگی ازجمله انسان به شمار میآید. اصلاح زیستیْ روشی مقرونبهصرفه و بیخطر ازنظر زیستمحیطی برای اصلاح سایتهای آلودۀ نفتی در نظر گرفته شده است؛ بنابراین، جداسازی میکروارگانیسمهای تجزیهکنندۀ نفت و بهینهسازی شرایط برای فرایند تجزیه از جنبههای مهم میکروبیولوژی است (19). در این پژوهش کمّیت باکتریهای تجزیهکنندۀ نفت خام و هتروتروف در مکانهای مختلف آلوده به نفت مسجدسلیمان ارزیابی شد. این نتیجه به دست آمد که باکتریهای هتروتروف نسبتبه تجزیهکننده، کمّیت بیشتری در همۀ خاکها داشتند. این نتیجه را اینطور میتوان تفسیر کرد که باکتریهای هتروتروف موجود در خاک از سایر منابع کربنی موجود در خاک استفاده میکنند؛ ولی باکتریهای تجزیهکننده فقط از نفت بهعنوانِ تنها منبع کربن استفاده میکنند؛ بنابراین، کمّیت هتروتروفها بیشتر از تجزیهکنندهها خواهد شد. سایر پژوهشگران نیز نتیجۀ مشابهی از تعیین کمّیت این دو گروه از باکتریها در خاک گزارش کردهاند؛ مثلاً اوبافمی[ix] و همکاران کمّیت باکتریها را در خاکهای قدیمی آلوده به مواد نفتی در ایستگاه نفتی اوگان[x] در جنوب غربی نیجریه بررسی کردند. نتایج آنها نشان داد تعداد باکتریهای هتروتروف در محدودۀcfu/g 107×5/4- 107×6/2 و تعداد باکتریهای تجزیهکننده cfu/g 104×5/1-2/1 بود. این مطالعه نشان داد نسبت باکتریهای تجزیهکنندۀ هیدروکربن به باکتریهای هتروتروف، زیر نیمدرصد بود و چنین مشاهده شد که در خاکهای غیرآلوده معمولاً فراوانی باکتریهای مصرفکنندۀ هیدروکربن نسبتبه باکتریهای هتروتروف کمتر از یکدرصد است؛ بنابراین، آلودگی نفتی خاک میتواند باکتریهای هتروتروف عادی را به باکتریهای مصرفکنندۀ هیدروکربن تبدیل کند (20). در این پژوهش از خاکهای بررسیشده ابتدا 24 باکتری تجزیهکنندۀ نفت خام جداسازی شد. پس از انجام آزمایشهای غربالگری تعداد 10 باکتری انتخاب شدند که توانایی بیشتری در تجزیۀ نفت خام داشتند. میزان رشد و حذف نفت خام توسط این ۱۰ سویۀ برتر انجام شد و دو سویه بهعنوانِ برترین سویههای تجزیهکنندۀ نفت خام مشخص شدند. این سویهها متعلقبه دو جنس Arthrobacter و Rhodococcus بودند. گزارشهای زیادی دربارۀ جداساز باکتریهای تجزیهکننده از خاکهای آلوده به نفت در ایران و سایر مناطق دنیا وجود دارد که در اینجا برای مقایسه با این پژوهش چند نمونه ذکر میشود. چیکر[xi] و همکاران یک سایت آلوده به نفت در نیجریه را بررسی کردند. آنها نتیجه گرفتند فراوانی باکتریهای گرممنفی تجزیهکننده در مناطق آلوده معمولاً نسبتبه باکتریهای گرممثبت بیشتر است و باکتریهای گرممثبت در طول تجزیه هرگز متنوع و غالب نبودهاند و معمولاً در طی زمان و با انطباق با شرایط خاص متابولیکی حاکم میشوند. آنها جنسهای مختلفی از اکتینومیستهای گرممثبت مؤثر در حذف هیدروکربنهای نفتی را جداسازی کردند. باکتریها مربوطبه جنسهای Gordonia، Rhodococcus، Corynebacterium، Nocardia، Mycobacterium و Arthrobacter بودند. این مطالعات اثبات کرد اکتینومیستهایی مانند Rhodococcus، Gordonia، Nocardia و Mycobacterium بهدلیلِ تواناییهای کاتابولیکی گسترده، انعطافپذیری در محیطهای خشک و گرمسیری و تولید بیوسورفکتانتْ اهمیت زیستی زیادی دارند (21).
در این پژوهش، مطابق با پژوهشِ پیشین، فراوانی باکتریهای گرممنفی از باکتریهای گرممثبت بیشتر بود و نیز سویههای جداسازیشده از یک منطقۀ گرموخشک و با شرایط بدون آب و تقریباً بیابانی جداسازی شدند و درصد زیادِ تجزیه تا 70درصد در سویۀ Arthrobacter citreus و تولید بیوامولسیفایر پایدار، نشاندهندۀ توانایی زیادِ سویهها در تجزیۀ نفت و تولید مواد شبهبیوسورفکتانت در محیطهای با خشکی بسیار زیاد است. شینی[xii] و همکاران 10 سویۀ باکتریایی از لجن نفتی چاه شمارۀ 9 مسجدسلیمان جداسازی کردند. میزان حذف نفت و میزان نفت باقیمانده با استفاده از روش گراویمتری انجام شد که 2 سویۀMIS1 Arthrobacter aurescens وMIS2 Pseudomonas aeruginosa تجزیۀ نفت را در مدت 7 روز بهترتیب با بازدهی 62 و 72درصد انجام دادند (22). در این پژوهش، باکتری jostii Rhodococcusبرای نخستینبار از خاکهای آلوده نفتی اطراف چاه شمارۀ 9 مسجدسلیمان (بیبیان) و باکتری Arthrobacter citreusاز منطقۀ مدرسهخارجیها (چاه شمارۀ 34) جداسازی شد. میزان نفت باقیمانده نیز با روش گراویمتری بررسی شد و باکتری jostii Rhodococcus رشد بسیار زیادی را در غلظت 3 و 5/4درصد نفت خام نشان داد و میزان تجزیه در غلظت 5/4درصد نفت خام 41درصد بود که باتوجهبه شرایط خشک منطقه و آلودگیهای بسیار قدیمی در نوع خود کمنظیر است. همچنین باکتریها ازنظر فعالیت امولسیونکنندگی و گسترش قطره نیز بررسی شدند. کورال[xiii] و همکاران سویۀ Arthtobacter sp. K1 را از یک خاک آلوده به نفت خام در پالایشگاه مرسین[xiv] ترکیه جداسازی کردند که توانِ تجزیۀ دینیتروتولوئن بهعنوانِ تنها منبع کربن و انرژی را داشت. زوکل[xv] و همکاران Rhodococcus erythropolis CCM2595 و Rhodococcus jostii را باکتریهایی معرفی کردند که بهطورِ مؤثر توان تجزیۀ فنل و دیگر ترکیبات آروماتیک را دارند. در پژوهش آنها ژنهای کامل درگیر در مسیر تجزیهْ شناسایی و تعیین توالی شدند. آنها دریافتند آنزیم اصلی در مسیر تجزیۀ فنل ترکیب فنلهیدروکسیلاز است و زمانی که فنل و سوکسینات در محیط حضور داشته باشند، این آنزیم فعال میشود (23، 24). باتوجهبه آلودگیهای نفتی گسترده در شهرستان مسجدسلیمان، بهکارگیری روشهای تجزیۀ زیستی در کاهش و حذف لکههای نفتی از خاک بسیار مهم است. باتوجهبه اینکه روشهای فیزیکی و شیمیایی در ازبینبردن آلودگیهای هیدروکربنی ازنظر اقتصادی بسیار پُرهزینه است و ممکن است موجب تجزیۀ ناقص آلایندهها شود، روشهای زیستی و استفاده از باکتریهای جداسازیشدۀ بومیْ راهبردی معقول و مقرونبهصرفه برای حذف آلودگیهای نفتی محسوب میشود. باتوجهبه ویژگیهای اقلیمی شهرستان مسجدسلیمان که در ناحیهای گرموخشک قرار دارد، تنوع باکتریهای مختلف تجزیهکننده در خاک زیاد بود و سویهها قابلیت زیادی در حذف غلظتهای مختلف نفت خام و با حداقل مواد مغذی نشان دادند. این ویژگی باکتریهای جداسازیشده، ظرفیت زیادِ سویهها را در استفاده در سطح میدانی برای احیا و پاکسازی خاک نشان میدهد.
سپاسگزاری
نویسندگان از شرکت ملی مناطق نفتخیز جنوب، شرکت بهرهبرداری نفتوگاز مسجدسلیمان، جناب آقای مهندس کریم سوارنژاد، متصدی واحد تجهیزات اختصاصی و مواد ناریۀ شرکت بهرهبرداری نفتوگاز مسجدسلیمان و افسر آموزش سازمان حراست وزارت نفت برای همکاری در مراحل مختلف نمونهبرداری پژوهش تشکر و قدردانی میکنند.
)