نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری گروه بیماریشناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
2 استادیار بخش بیوتکنولوژی میکروبی، پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، کرج، ایران
3 دانشیار گروه بیماریشناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Abstract
Introduction: The purpose of this study was to select moderate extremophile antagonistic Streptomyces strains from the Microbial Collection of Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran to improve the growth and protection of cucumber against Phytophthora capsici, the causal agent of seedling damping-off disease in greenhouse conditions.
Materials and methods: First, the antagonistic activity of eight strains of Streptomyces against three important cucumber pathogens including Pythium aphanidermatum, p < /em>. drechsleri and P. capsiciwas investigated in in vitro conditions. These strains were examined for physiological characteristics, plant growth promoting traits and siderophore and cellulase production in the presence of different amount of NaCl (0%, 6%, 10%, and 12%) and temperatures of 29, 37 and 42 °C. Three strains with a similar potential for auxin production including IT25 (salinity tolerant), IT20 (thermophilic) and SS14 with the highest growth inhibition percentage of P. capsici for further studies including SA production and the ability to induce plant growth and biocontrol of cucumber seedling under greenhouse conditions were selected.
Results: The strains were able to produce siderophore at temperatures above 29 °C and siderophore production increased in SS14 and IT20 strains. Conversely, increasing the NaCl concentrations decreased siderophore production by Streptomyces. The increase in the cellulase activity at elevated temperatures was strain-dependent and was observed only for IT20. However, the increase in salinity did not change the activity of this enzyme. The treatment of soil with SS14 and IT20 increased shoot fresh and dry weights in all treatments. IT20 treatment reduced seedling damping-offby 83% compared to the infected control.
Discussion and conclusion: The two SS14 and IT20 strains, which had a good ability to control the disease and enhance plant growth, had common characteristics such as growth in the presence of 6% NaCl, siderophore production and cellulase activity under different temperatures and salinity conditions. The better performance of the IT20 and the poor performance of the IT25 may be related to their high temperature (42 °C) tolerance and intolerance, respectively, as well as their increased cellular activity and inactivity at this temperature.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
بیمارگرهای گیاهی خـاک‌بـرد سالانه خسـارت‌هـای زیـادی را ایجـاد مـی‌کننـد و کنتـرل آنهـا بسـیار دشوار اسـت؛ از سویی، روش‌هـای زراعـی و تیمارهای شـیمیایی موجود نمی‌توانند خسارت عوامل بیماری‌زا را به‌طور کامل متوقف کنند (1). گیاهچه‌میری و پوسیدگی طوقه و ریشه یکی از شایع‌ترین بیماری‌های صیفی‌جات است که سبب ایجاد خسارت‌های بسیار به‌ویژه طی تولید خیار در گلخانه‌ها می‌شود (2). گیاهچه‌میری با عامل Phytophthora capsici Leonian یکی از مخرب‌ترین بیماری‌های خیار در سراسر جهان است (3).
اکتینومیست‌ها و به‌طور عمده جنس استرپتومایسس[1] گروه مهمی ازنظر زیست‌محیطی‌اند که نقش مهمی در بسیاری از فرایندهای زیستی ازجمله تحریک رشد گیاه و کنترل زیستی ایفا می‌کنند (4)؛ این توانایی به سازوکارهایی ازجمله تولید فیتوهورمون‌ها[2]، انواع آنتی‌بیوتیک‌‌ها، سیدروفور[3]ها، آنزیم‌هایی که فعالیت ضدمیکروبی دارند و رقابت با عوامل بیماری‌زای گیاهی برای بستر و مواد مغذی مربوط می‌شود (5). این باکتری‌ها ازفراوان‌ترین ریزموجودات[4] زندۀ خاک هستند که نقش مهمی در فرایند تجزیۀ مواد آلی خاک به‌ویژه مولکول‌های پیچیده مانند سلولز دارند؛ علاوهبراین، سویه‌های استرپتومایسس تولیدکنندۀ آنزیم سلولاز با هیدرولیزکردن سلولز (یکی از اجزای دیوارۀ سلولی) سبب مهار زیستی بیمارگرهای شبه‌قارچی (اوومیست‌ها[5]) مانند P. drechsleri می‌شوند و از ایجاد بیماری در گیاه جلوگیری می‌کنند (6). این دسته از باکتری‌ها انواعی از مولکول‌های آلی معروف به سیدروفور را ترشح می‌کنند؛ این مواد شکل نامحلول آهن را کلاته و در ریزوسفر گیاهان روییده در خاک‌های فقیر ازنظر آهن جمع می‌کنند. گیاهان دولپه معمولاً می‌توانند آهنی را که این باکتری‌ها کلات می‌کنند، استفاده کنند (7)؛ از‌این‌رو، گونه‌های استرپتومایسس می‌توانند جایگزین‌های طبیعی سموم و کودهای شیمیایی در تولید محصولات گلخانه‌ای باشند (8 و 9). این دسته باکتری‌ها در زیستگاه‌های طبیعی و در زیستگاه‌های غیرمعمول با درجه‌حرارت‌های کم یا زیاد و در معرض تنش آب و شوری نیز مشاهده می‌شوند (10). برخی باکتری‌های ریزوسفری افزایندۀ رشد گیاه[6] با تولید متابولیت‌ها یا اسمولیت[7]ها نقش مهمی در افزایش تحمل گیاه به تنشهای محیطی ایفا می‌کنند (11).
شوری و دمای خاک ازجمله عوامل غیرزنده‌ای‌اند که در ظرفیت رقابتی عوامل زیستی منتخب دخالت می‌کنند؛ بنابراین، تحمل شوری و دمای زیاد باید یکی از معیارهای انتخاب باکتری‌ها با هدف سازگاری در خاک‌های شور یا محیط‌های دارای دمای زیاد باشد (12). دستیابی به شرایط بهینه و مقرون‌به‌صرفۀ کشت سویۀ برتر میکروبی نقش مهمی در تولید صنعتی آن دارد و متغیرهایی مانند نوع محیط‌کشت، افزودنی‌‌های ضروری، دما و اسیدیته باید برای تکثیر جمعیت باکتری همراه با حفظ فیزیولوژی سلول در نظر گرفته شوند (13).
مطالعۀ حاضر با اهداف زیر انجام شد:
1) غربال استرپتومایسس‌های جداشده از ریزوسفر صیفی‌جات گلخانه‌ای برای سویه‌های آنتاگونیست سه عامل بیمارگر خاک‌برد خیار (Pythium aphanidermatum،P. drechsleri و P. capsici)؛
2) تعیین ویژگی‌های فیزیولوژیکی و فعالیت‌های زیستی سویه‌های منتخب در دماهای زیاد و غلظت‌های مختلف شوری در شرایط آزمایشگاه؛
3) بررسی تأثیر دمای محیط بر فعالیت آنتاگونیستی سوسپانسیون سلولی و عصارۀ کشت سویۀ برتر در شرایط آزمایشگاه؛
4) بررسی توانایی تحریک رشد گیاه و کنترل زیستی بیماری گیاهچه‌میری خیار ناشی از P. capsici در سطح گلخانه.
مواد و روش‌ها
سویه‌های میکروبی: هشت سویه با کدهای IC13، IC15، IC6، IS8، IT20، IT25، IT8 و SS14 از 106 سویۀ موجود در مجموعۀ میکروبی پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران (ABRIICC) که ویژگی‌های محرک رشدی (PGP) مانند تولید اکسین، انحلال فسفات معدنی و توانایی رشد روی محیط بدون نیتروژن را داشتند، انتخاب شدند (14). ازآنجاکه به مقایسۀ این سویهها ازنظر تولید اکسین در بخش بحث مقالۀ حاضر اشاره شده است، نتایج مربوط به تولید اکسین از منبع شمارۀ 14 استخراج و در مطالعۀ حاضر با ذکر منبع در قالب شکل 1 و در بخش مواد و روش‌ها آورده شدند. تمام سویه‌های یادشده (به‌جز سویۀ IT25) توانایی تولید سیدروفور را داشتند و ازنظر فعالیت سلولازی مثبت بودند. عوامل بیمارگر P. drechsleri و P. capsici از ABRIICC وP. aphanidermatumاز مؤسسۀ چغندرقند کرج (دکتر مژدۀ کاکوئی‌نژاد) تهیه و آزمون‌های بیماری‌زایی با مایه‌زنی پرگنۀ قارچ در کنار گیاهچه‌های خیار انجام شدند (15).
شکل1- میزان تولید اکسین (IAA) سویهها (برگرفته از منبع 14)؛ حرف‌های مشابه تفاوت‌های غیرمعنادار مطابق دامنۀ دانکن را نشان می‌دهند (P<0.05).
اثر آنتاگونیستی سویه‌های استرپتومایسس:مقدار 20 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی سویهها (108 واحد تشکیل‌دهندۀ کلنی در میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی استریل) به‌طور خطی در دو سمت مقابل پلیت حاوی محیط PDA[8] (در 1 سانتی‌متری از لبه) تلقیح شد. پلیت‌ها بهمدت 48 ساعت در دمای 29 درجۀ سانتیگراد در انکوباتور نگهداری شدند؛ سپس قرصی از کشت پنجروزۀ عامل بیمارگر (قطر 5 میلی‌متر) در مرکز پلیت PDA قرار داده شد و پلیت‌ها بهمدت 4 روز در انکوباتور نگهداری شدند (16). درصد مهار رشد میسلیومی عامل بیمارگر از رابطۀ (a-b)/a×100 محاسبه شد؛ در این رابطه، a رشد شعاعی قارچ در پلیت شاهد[9] (پلیت حاوی قرص قارچ بدون باکتری) و b رشد قارچ کشت‌شده با باکتری به سانتی‌متر است.
ویژگی‌های فیزیولوژیکی و فعالیت زیستی سویهها در شرایط مختلف کشت:به‌منظور مطالعۀ توانایی رشد سویه‌های استرپتومایسس در دماهای زیاد، سویه‌های کشت‌شده (به‌طور خطی) روی محیط[10] ISP2 (10 گرمدرلیتر عصارۀ مالت، 4 گرمدرلیتر عصارۀ مخمر، 4 گرمدرلیتر گلوکز و 18 گرمدرلیتر آگار با اسیدیتۀ 2/7) بهمدت 5 روز در دماهای 29، 37 و 42 درجۀ سانتیگراد نگهداری شدند. به‌منظور بررسی تحمل به شوری، باکتری‌ها روی محیط ISP2 حاوی غلظت‌های مختلف نمک NaCl (صفر، 6، 10 و 12 درصد) به‌طور لکه‌ا‌ی کشت و ارزیابی شدند (17). فعالیت زیستی سویهها شامل تغیرات در تولید سیدروفور روی محیط CAS-agar (18) و فعالیت آنزیم سلولاز روی محیط حاوی CMC (19) در این تیمارها تا 10 روز پس‌از کشت بررسی شد. به‌منظور بررسی آزمون حساسیت به قارچ‌کش ریدومیل (Ridomil GOLD® MZ 68)، سویه‌های استرپتومایسس روی محیط ISP2 ترکیب‌شده با قارچ‌کش به میزان 2 گرمدرلیتر کشت و بهمدت 5 روز در دمای 29 درجۀ سانتیگراد در انکوباتور نگهداری شدند. به‌منظور نمایش رشد زیاد، رشد متوسط و رشدنکردن باکتری به‌ترتیب از نشانه‌های ++، + و – استفاده شد.
تولید سالیسیلیک‌اسید[11](SA):مقدار 1 میلی‌لیتر سوسپانسیون باکتری کشت‌شده در محیط ISP2 مایع به ارلن 250 میلی‌لیتری حاوی 50 میلی‌لیتر محیط‌کشت سوکسینات اضافه شد. ارلن روی دستگاه شیکرانکوباتور با سرعت 150 دوردردقیقه در دمای 29 درجۀ سانتیگراد قرار داده شد (20). پس‌از 48 ساعت، سوسپانسیون کشت بهمدت 5 دقیقه با سرعت 8000 دوردردقیقه سانتریفیوژ و 4 میلی‌لیتر از مایع رویی با کلریدریک‌اسید، اسیدی (اسیدیتۀ 2) شد و SA با کلروفرم استخراج شد. جذب ترکیب آهن SA- در فاز مایع در طول موج 527 نانومتر با اسپکتروفتومتر (Tecan M100 infinit, Switzerland) خوانده شد. منحنی استاندارد با SA حل‌شده در محیط سوکسینات با غلظت‌های صفر، 100، 200، 300، 400 و 500 پی‌پی‌ام تهیه شد. مقدار SA به‌شکل میلی‌گرم‌در‌میلی‌لیتر بیان شد (21).
شرایط رشد گیاه،تیمار باکتری‌ها در خاک و مایه‌زنی گیاهچه‌های خیار با P. capsici:بذر‌های ضدعفونی‌‌شده (Cucumis sativus L. cv Negin) درون پلیت شیشه‌ای قرار گرفتند و در اتاقک رشد با دمای 27 درجۀ سانتیگراد و 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی نگهداری شدند. رسوب باکتری در محیط‌کشت مایع ISP2 با استفاده از سانتریفیوژ (بهمدت 15 دقیقه در 8000 دوردردقیقه) تهیه شد و دوباره در محلول سرم فیزیولوژیک استریل سوسپانسیون شد؛ این سوسپانسیون به ماسۀ استریل اضافه و در غلظت نهایی 106 واحد تشکیل‌دهنده کلنی در گرم تنظیم شد. مقدار 3 گرم ماسۀ حاوی باکتری به هر سلول سینی کشت 84 سلولی (عمق 5×30×50 سانتی‌متر) حاوی خاک مزرعه و پیت‌ماس (1: 2) اضافه شد و ماسۀ استریل برای شاهد استفاده شد. پنج روز پس‌از تیمار خاک با باکتری، یک گیاهچه در هر سلول سینی کشت شد. دمای هوا در طول آزمایش از 30 تا 32 درجۀ سانتیگراد متغیر بود. پیش از تلقیح عامل بیمارگر، خاک تا سطح اشباع آبیاری شد و آبیاری در دورۀ آزمایش به‌طور روزانه انجام شد. پنج روز پس‌از تیمار خاک با باکتری، پرگنه‌های 2×2 سانتی‌مترمربعی از کشت پنجروزۀ عامل بیمارگر در کنار طوقۀ گیاهچه تلقیح شدند. تیمارها شامل شاهد منفی، شاهد مثبت (تلقیح‌شده باP. capsici ) و سه سویۀ استرپتومایسس (IT20، IT25 و SS14) تلقیح‌شده یا تلقیح‌نشده با P. capsiciبودند. دو هفته پس‌از مایه‌زنی، شیوع بیماری پوسیدگی طوقه (درصد گیاهچه‌های بیمار و دارای علامت پوسیدگی) محاسبه و بررسی شد؛ سپس گیاهچه‌‌ها برداشت و شاخص‌های رشد شامل وزن تر و خشک ریشه و بخش‌های هوایی اندازه‌گیری و ثبت شدند.
.اثر ترکیبات فرار[12] سویۀ منتخب باکتری بر رشد P. capsici: به‌منظور بررسی مواد مؤثرۀ فرار، مقدار 100 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری رشدیافته در دمای 29 درجۀ سانتیگراد بر سطح پلیت حـاوی محـیط ISP2 پخش شد. سـر این پلیت بـا کـف پلیت حاوی کشت پنجروزۀ P. capsiciرویمحیط PDA جایگزین و اطراف آن با نــوار پــارافیلم بســته شد و در انکوبــاتور با دمــای 29 درجۀ سانتیگراد قـرار گرفـت. در نمونۀ شـاهد، باکتری روی پلیت حـاوی محـیط ISP2 کشت نشـد. پنج روز پـس‌از کشـت، میـزان رشـد شـعاعی بیمـارگر انـدازه‌گیـری و درصد مهار رشد میسلیومی عامل بیمارگر از رابطۀ (a-b)/a×100 محاسبه شد (22).
.اثر عصاره‌های خارج‌سلولی[13] سویۀ منتخب بر رشد P. capsici:سه قـرص به قطر 5 میلی‌متـر ازکشـت پنجروزۀ باکتری جدا و در ارلن 500 میلی‌لیتری حاوی 100 میلی‌لیتـر محـیط ISP2 انداخته شد. ارلن حـاوی محیط مایه‌زنی‌شده بـا باکتری بـه‌مـدت 48 ساعت در شیکرانکوباتور با سرعت 125 دوردردقیقه و دمای 29 یا 42 درجۀ سانتیگراد نگهداری شد. به‌منظور تهیۀ عصاره‌های خارج‌سلولی باکتری، محتویات ارلن از کاغذ صـافی و سپس از فیلتر (22/0 میکرومتـر) عبـور داده شدند. تیمارها شامل سوسپانسیون باکتری رشدیافته در دمای 29 یا 42 درجۀ سانتیگراد، عصارۀ فیلترشدۀ باکتری رشدیافته در دمای 29 یا 42 درجۀ سانتیگراد و عصارۀ فیلترشدۀ جوشیده (بهمدت 8 دقیقه در دمای 90 درجۀ سانتیگراد) بودند. مقدار 100 میکرولیتر از هر تیمار در چاهک ایجادشده بر سطح محیط PDA ریخته شد. محیط ISP2 مایع استریل (کشت‌نشده) برای شاهد استفاده شد. پنج ساعت پس‌از اضافه‌کردن محلول در چاهک، قرصـی بـه قطر 5 میلی‌متر از کشت پنجروزۀ P. capsiciدر وسـط پلیت قرار داده شد. پلیت‌ها در دمای 29 درجۀ سانتیگراد در انکوباتور نگهداری شدند و رشد شعاعی بیمارگر پس‌از پنج روز بررسی شـد (22).
تجزیه‌وتحلیل آماری نتایج:تجزیه‌وتحلیل آماری با آنالیز واریانس (ANOVA) به کمک Microsoft Excel(نسخۀ 22) وSPSS انجام شد. تمام بررسی‌های درون شیشه‌ای (in vitro) در سه تکرار انجام شدند. آزمایش گلخانه‌ای در قالب طرح کاملاً تصادفی با 10 تکرار انجام شد. آزمایش‌های گلخانه‌ای دو بار تکرار شدند. اختلاف معنادار بین تیمارها با آزمون دانکن در سطح P<0.05بررسی شد.
نتایج
غربال سویه‌های آنتاگونیست استرپتومایسس:تمام سویه‌های بررسی‌شده اثر بازداری از رشد روی قارچ‌های مطالعه‌شده نشان دادند. سویه‌های IC6، IS8 و IC13 بیش از50 درصد از رشد میسلیومی P. drechsleri جلوگیری کردند. سویه‌های IC6 و IT25 در حدود 50 درصد از رشد P. capsiciممانعت کردند. سویه‌های IT20 و SS14 بیش از 60 درصد از رشد P. capsiciجلوگیری کردند؛ این دو سویه در مقایسه با سایر سویهها بیشترین میزان مهار زیستی علیه P. capsici رانشان دادند. دو سویۀ IT20 و SS14 ازنظر میزان ممانعت از رشد P. drechsleri در یک گروه آماری قرار گرفتند و دو سویه در برابر دو گونۀ مختلف از جنس Phytophthora رفتار تقریباً مشابهی از خود نشان دادند. سویۀ IT20 بیش از 60 درصد از رشد P. aphanidermatumممانعت کرد؛ این دو باکتری باتوجه‌به درصد متفاوت مهار زیستی Pythium aphanidermatum از هم تفکیک شدند (جدول 1).
جدول 1- درصد جلوگیری از رشد سویه‌هایمطالعه‌شده روی Phytophthora drechsleri، P. capsici و Pythium aphanidermatum پنج روز پس‌از نگهداری در انکوباتور با دمای 29 درجۀ سانتیگراد
|
سویه |
(درصد)مهار رشد قارچ بیمارگر |
||
|
|
P. drechsleri |
P. capsici |
P. aphanidermatum |
|
IC13 |
0/52±0/1c |
7/58±2/1c |
4/54±0/1b |
|
IC15 |
4/47±2/2d |
0/40±0/0e |
8/17±3/0e |
|
IC6 |
6/69±6/0a |
1/49±9/0d |
7/2±1/0g |
|
IS8 |
6/57±0/1b |
8/18±1/1f |
6/12±6/0f |
|
IT20 |
9/18±0/1 f* |
5/69±0/1a |
3/60±1/1a |
|
IT25 |
0/27±2/1e |
6/49±5/0d |
2/34±8/0c |
|
IT8 |
0/12±1/1g |
0/50±1/0d |
9/11±4/0f |
|
SS14 |
23/19±7/0f |
1/63±8/0b |
5/23±9/0d |
عددها میانگین سه تکرار±خطای استاندارد هستند
*حرف‌های مشابه تفاوت‌های غیرمعنادار مطابق دامنۀ دانکن را نشان می‌دهند (P<0.05)
.ویژگی‌های فیزیولوژیکی و فعالیت زیستی سویهها در شرایط مختلف کشت: تمام سویهها قادر به رشد روی محیط حاوی 6 درصد نمک بودند و در غلظت بیشتر نمک، تنها سویۀ IC6 رشد کرد. تنوع سویهها ازنظر رشد در دمای 42 درجۀ سانتیگراد بیشتر بود و سویۀ IT20 بیشترین رشد را در این دما داشت؛ درحالیکه دو سویۀ IT25 و SS14 قادر به رشد در این دما نبودند. از هشت سویۀ مطالعه‌شده، پنج سویه در محیط حاوی قارچ‌کش شیمیایی رشد کردند، اما سه سویۀ IC13، IT8 و SS14 در این شرایط رشد نکردند (جدول 2).
در برخی سویهها، افزایش دما سبب افزایش تولید هالۀ نارنجی سیدروفور روی محیط CAS-agar و در دیگر سویهها سبب کاهش آن شد. سویه‌های IT20 و SS14 در دمای 42 درجۀ سانتیگراد هالۀ سیدروفور بزرگ‌تری را نسبت به دماهای کمتر و در مقایسه با باکتری‌های دیگر تولید کردند (جدول 3)؛ این دو سویه بزرگ‌ترین هالۀ سیدروفوری را در شوری‌های 6 و 10 درصد تشکیل دادند. رشد دو سویۀ IC6 و IT25 با افزایش درصد شوری افزایش یافت و اگرچه سویۀ IC6 توانایی رشد در شوری 13 درصد را داشت، بزرگ‌ترین هالۀ سیدروفوری تشکیل‌شده در شوری 13 درصد به IT25 مربوط بود. سویۀ IT8 در دو سطح شوری بیش از 6 درصد هالۀ سیدروفوری تشکیل نداد. در برخی سویهها، فعالیت آنزیم سلولاز همانند فعالیت سیدروفوری با افزایش دما افزایش یافت. میزان فعالیت آنزیم سلولاز در سویه‌های IC6 و IT20 در دمای 37 درجۀ سانتیگراد در مقایسه با 29 درجۀ سانتیگراد افزایش یافت. فعالیت سلولازی IT20 در دمای 42 درجۀ سانتیگراد ثابت ماند، اما فعالیت سلولازی IC6 کاهش یافت. سویۀ IT25 فعالیت سلولازی نداشت و افزایش دما هیچ‌گونه فعالیت آنزیمی را در آن القا نکرد؛ همچنین افزایش شوری هیچ تأثیری بر فعالیت سلولازی سویهها نداشت (جدول 3).
جدول2- تعیین ویژگی‌های فیزیولوژیکی و ژنتیکی سویهها
|
سویه |
بیشترین شباهت |
کد بانک ژن NCBI |
رشد در 42 درجۀ سانتیگراد |
رشد در حضور NaCl 6 درصد |
رشد در حضور NaCl 10 درصد |
تحمل به قارچ‌کش ریدومیل (2000 پی‌پی‌ام) |
|
IC13 |
S. mutabilis |
MG676358 |
+ |
+ |
- |
- |
|
IC15 |
S. viridodiastaticus |
MG685667 |
+ |
+ |
- |
+ |
|
IC6 |
S. luteus |
MH041276 |
+ |
++ |
+ |
+ |
|
IS8 |
S. luteus |
MH041315 |
+ |
+ |
- |
+ |
|
IT20 |
S. rochei |
++ |
+ |
- |
+ |
|
|
IT25 |
S. enissocaesilis |
MG722685 |
- |
++ |
- |
+ |
|
IT8 |
S. mutabilis |
MG685901 |
+ |
+ |
- |
- |
|
SS14 |
S. vinaceusdrappus |
MH041316 |
- |
+ |
- |
- |
رشد زیاد، رشد متوسط و رشدنکردن باکتری به‌ترتیب با نشانه‌های ++، + و – نشان داده شده است.
جدول 3- تولید سیدروفور و فعالیت سلولازی سویه‌های آنتاگونیست در دماها و غلظت‌های مختلف نمک
|
سویه |
سیدروفور (29∘C) |
سیدروفور (37∘C) |
سیدروفور (42∘C) |
سیدروفور (NaCl 6%) |
سیدروفور (NaCl 10%) |
سیدروفور (NaCl 13%) |
سلولاز (29∘C) |
سلولاز (37∘C) |
سلولاز (42∘C) |
سلولاز (NaCl 6%) |
سلولاز (NaCl 10%) |
سلولاز (NaCl 13%) |
|
|
IC13 |
+ |
++ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
++ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
IC15 |
+ |
+ |
+ |
++ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
IC6 |
+ |
++ |
+ |
++ |
+ |
+ |
+ |
++ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
IS8 |
+ |
++ |
+ |
+ |
+ |
+ |
++ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
IT20 |
+ |
+ |
++ |
++ |
++ |
+ |
+ |
++ |
++ |
+ |
+ |
+ |
|
|
IT25 |
+ |
+ |
+ |
+ |
++ |
++ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
|
|
IT8 |
+ |
++ |
+ |
+ |
- |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
|
SS14 |
+ |
+ |
++ |
++ |
++ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
رشد زیاد، رشد متوسط و رشدنکردن باکتری به‌ترتیب با نشانه‌های ++، + و – نشان داده شده است.
تولید SA:دو سویۀ IT20 و SS14 تفاوت معناداری ازنظر میزان تولید SA نشان ندادند. تفاوت معناداری بین IT20 و IT25 ازنظر میزان تولید SA مشاهده شد. بیشترین مقدار SA مربوط به سویۀ IT20 بود (شکل 2).
کنترل زیستی بیماری گیاهچه‌میری در شرایط گلخانه:پانزده روز پس‌از مایه‌زنی عامل بیمارگر، کارایی محرک رشدی و کنترل زیستی سویه‌های منتخب روی بیماری گیاهچه‌میری در خیار با عاملP. capsiciدر شرایط گلخانه بررسی شد و تفاوت معناداری ازنظر وزن تر و خشک ریشه بین تیمارها و شاهد مشاهده نشد (داده‌ها نشان داده نشده‌اند) (شکل 3).
شکل 2- میزان تولید سالیسیلیک‌اسید در سویه‌های منتخب آنتاگونیست؛ حرف‌های مشابه تفاوت‌های غیرمعنادار مطابق دامنۀ دانکن را نشان می‌دهند (P<0.05)
شکل 3- گیاهچه‌های خیار مایه‌زنی‌شده با P. capsici (PC) و بدون مایه‌زنی پس‌از پانزده روز از تیمار باکتری‌ها
در تیمار IT20 مایه‌زنی‌شده با عامل بیمارگر، وزن تر و خشک بخش‌های هوایی به‌ترتیب 180 و 73 درصد نسبت به تیمار قارچ بیمارگر (شاهد آلوده[xiv]) و به‌طور معنادار افزایش یافت (شکل 4، A و B). کمترین میزان وزن خشک بخش‌های هوایی به شاهد آلوده و تیمار IT25 مربوط بود. وزن خشک گیاهچه‌های تیمارشده با سویۀ SS14 مایه‌زنی‌شده با عامل بیمارگر نیز افزایش یافت و تفاوت معناداری بین تیمارهای IT20 و SS14 وجود نداشت (شکل 4،B). تفاوت معناداری ازنظر شیوع بیماری بین تیمارها مشاهده شد (P<0.05) و بیشترین درصد شیوع بیماری (66 درصد) به شاهد آلوده مربوط بود و کمترین میزان شیوع بیماری (17 درصد در مقایسه با شاهد آلوده) در تیمار IT20 مشاهده شد (شکل 4، C).
القای رشد گیاه:پانزده روز پس‌از تیمار خاک با باکتری‌ها، کارایی سویه‌های منتخب در شرایط گلخانه بررسی شد و تفاوت معناداری ازنظر وزن تر و خشک ریشه بین تیمارها و شاهد مشاهده نشد (داده‌ها نشان داده نشده‌اند). SS14 و IT20 به‌طور معناداری وزن خشک بخش‌های هوایی را 30 درصد نسبت به شاهد افزایش دادند (شکل 5، B). تیمار IT20 با 5/3 برابر افزایش وزن تر و 30 درصد افزایش وزن خشک بخش‌های هوایی در مقایسه با شاهد، بهترین تیمار انتخاب شد (شکل 5).
شکل 4- مقایسۀ اثر کنترل زیستی بیماری گیاهچه‌میری سویه‌های باکتریایی بر اساس شاخص‌های وزن تر بخش‌های هوایی (A)، وزن خشک بخش‌های هوایی (B) و شیوع بیماری (C) پانزده روز پس‌از مایه‌زنی عامل بیمارگر در شرایط گلخانه؛ شاهد مثبت: P.capsici،شاهد منفی: Control. حرف‌های مشابه تفاوت‌های غیرمعنادار مطابق دامنۀ دانکن را نشان می‌دهند (P<0.05).
شکل 5- مقایسۀ اثر محرک رشد سویهها روی وزن تر و خشک بخش‌های هوایی پانزده روز پس‌از تیمار باکتری‌ها در شرایط گلخانه؛ شاهد منفی: Control. حرف‌های مشابه تفاوت‌های غیرمعنادار مطابق دامنۀ دانکن را نشان می‌دهند (P<0.05)
بررسی اثر ترکیبات فرار و غیرفرار سویۀ منتخب (IT20) روی P. capsici:ترکیبات فرار سویۀ IT20 ممانعت از رشد معناداری روی P. capsici نشان ندادند (داده‌ها نشان داده نشده‌اند). عصارۀ غیرفرارIT20 در شرایط مختلف بین صفر تا 55 درصد مانع از رشد P. capsici شد (شکل 6). ممانعت از رشد سوسپانسیون سلولی باکتری رشدیافته در دمای 42 درجۀ سانتیگراد، 10 درصد بیش از سوسپانسیون سلولی رشدیافته در انکوباتور با دمای 29 درجۀ سانتیگراد بود. ممانعت از رشد P. capsici در اثر عصارۀ IT20 رشدیافته در دمای 42 درجۀ سانتیگراد، 15 درصد بیشتر از عصارۀ IT20 رشدیافته در دمای 29 درجۀ سانتیگراد بود. عصارۀ جوشاندۀ باکتری هیچ‌گونه اثر ممانعت از رشد روی P. capsici نداشت (شکل 6، F).
شکل 6- تأثیر سویۀ IT20 رشدکرده در دمای 29 درجۀ سانتیگراد (A) و 42 درجۀ سانتیگراد (B)، سوسپانسیون کشت فیلترشدۀ باکتری رشدیافته در 42 درجۀ سانتیگراد (C) و 29 درجۀ سانتیگراد (D)، محیط مایع بدون کشت باکتری (E) و عصارۀ باکتری جوشانده (F) در مهار رشد P.capsici هفت روز پس‌از نگهداری در انکوباتور 29 درجۀ سانتیگراد
بحث و نتیجه‌گیری
دماهای زیاد و شوری از مهم‌ترین عوامل غیرزیستی تأثیرگذار بر رقابت و زنده‌مانی میکروب‌ها در ریزوسفر به شمار می‌آیند. یکی از نتایج جالب پژوهش حاضر، مشاهدۀ فعالیت آنزیمی و تولید سیدروفور در دمای 42 درجۀ سانتیگراد به‌واسطۀ سویه‌هایی بود که توانایی رشد روی محیط‌کشت بهینه (ISP2) را در این دما نداشتند؛ این مسئله کاملاً به سویه و نوع فعالیت (تولید سیدروفور یا فعالیت سلولازی) وابسته است. نتایج پژوهش حاضر نشان دادند دماهای بیش از 29 درجۀ سانتیگراد عامل تحریک‌کننده‌ای برای افزایش تولید سیدروفور هستند و برعکس، افزایش درصد شوری موجب کاهش تولید سیدروفور گونه‌های استرپتومایسس می‌شود؛ از سوی دیگر، افزایش دما تا محدودۀ معینی موجب افزایش فعالیت آنزیم سلولاز شد، ولی درصد شوری تغییری در میزان فعالیت این آنزیم ایجاد نکرد (جدول 3). سویۀ IT20 (باکتری نسبتاً گرمادوست) بیشترین درصد ممانعت از رشد را روی P. capsiciوP. aphanidermatum در مقایسه با سایر سویهها نشان داد. سویۀ IC6 (سویۀ متحمل به شوری) بیشترین درصد ممانعت از رشد را روی P. drechsleri در مقایسه با سایر سویهها نشان داد. بر اساس نتایج یادشده، گونه‌ای از استرپتومایسس مانند S. rochei می‌تواند دو جنس متفاوت از اوومیست (Phytophthora و Pythium) را کنترل کند و از سوی دیگر، توان گونه‌های مختلف استرپتومایسس برای مهار زیستی گونه‌ها یا جنس‌های اوومیستی متفاوت است..تمام سویهها (به‌جز IC13، SS14 و IT8) غلظت 2000 پی‌پی‌ام قارچ‌کش ریدومیل را تحمل کردند (جدول 2) و غلظت‌های کمتر از 2000 پی‌پی‌ام قارچ‌کش ریدومیل تأثیری بر رشد سویه‌های مطالعه‌شده نداشتند؛ این قارچ‌کش به‌طور معمول علیه بیمارگرهای اوومیستی استفاده می‌شود. توانایی استرپتومایسسها در تحمل و تخریب انواع سموم شیمیایی گزارش شده است (23)؛ بنابراین، به‌منظور کاهش استفاده از این سم شیمیایی می‌توان سویه‌های متحمل را در شرایطی که از سموم بیش از حد استفاده شده است و قارچ‌ها مقاوم شده‌اند یا حتی پس‌از سم‌پاشی استفاده کرد.ایندول-3- استیک‌اسید (IAA)، هورمون گیاهی رایجی است که به کلاس اکسین‌ها تعلق دارد. این هورمون نقش مهمی در رشد و نمو گیاهان دارد و سبب افزایش رشد و تقسیم سلولی می‌شود. افزایش تولید IAA در گیاهان تحریک‌شده با Streptomyces sp. گزارش شده است (24 و 25). در آزمایش‌های گلخانه‌ای، عملکرد گونه‌های مختلف اسپریتومایسس که توانایی تولید اکسین را دارند، ممکن است متفاوت باشد (26). در مطالعۀ حاضر، سه سویه با توان مشابه برای تولید اکسین شامل IT25 (متحمل به شوری)، IT20 (نسبتاً گرمادوست) و SS14 با بیشترین درصد ممانعت از رشد P. capsici برای بررسی‌های بیشتر شامل تولید SA و آزمایش‌های گلخانه‌ای انتخاب شدند.باکتری‌ها به‌طور معمول SA را به‌شکل متابولیت‌های حاوی SA شامل سیدروفور مبتنی بر سالیسیلیک‌اسید (salicylic acid-based siderophore) تولید می‌کنند. تولید SA در برخی گونه‌های سودوموناس که توانایی کنترل زیستی برخی اوومیست‌های بیمارگر خیار را دارند، گزارش شده است (27). افزایش غلظت SA به‌طور معناداری مانع از رشد هیف‌ها و جوانه‌زنی کنیدی برخی قارچ‌هادر محیط مایع و جامد می‌شود و می‌تواند روش بالقوه‌ای در مدیریت بیماری‌ها باشد (28). استفاده از SA به‌شکل اسپری روی برگ به محافظت در برابر طیف وسیعی از بیمارگرهای گیاهی از طریق ایجاد مقاومت سیستمیک منجر می‌شود (29). علت عملکرد متفاوت سه سویۀ IT20، SS14 و IT25 در شرایط گلخانه به تولید SA در شرایط مختلف مربوط است. تولید SA در باکتری با دما مرتبط است و برخی باکتری‌ها می‌توانند SA را در دماهای زیاد تولید می‌کنند؛ در این شرایط، بیوسنتز SA و سیدروفور مبتنی بر سالیسیلیک‌اسید افزایش می‌یابد و موجب واکنش در گیاه می‌شود، ولی چنین عملکردی در دمای کم مشاهده نمی‌شود (29). توانایی باکتری‌های محرک رشد گیاه در تولید SA که در بسیاری حالات با تولید سیدروفورها در شرایط آهن محدود مرتبط است، گزارش شده است؛ برخی از این ریزوباکتری‌ها توانایی القای مقاومت سیستمیک گیاه در برابر بیماری‌ها را نیز دارند. میر[xv] و هافته[xvi] عوامل مهم و تعیین‌کنندۀ القای مقاومت لوبیا در برابر Botrytis cinerea (عامل بیماری پوسیدگی خاکستری) به‌وسیلۀ ریزوباکتری‌های Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 را بررسی کردند. مطالعۀ جهش‌یافته‌های P. aeruginosa 7NSK2 که سه سیدروفور پایووردین، پیوچلین و سیدروفور مبتنی بر SA را در شرایط کمبود آهن تولید می‌کنند، نشان داد مقاومت ناشی از 7NSK2 با سیدروفور مبتنی بر SA مرتبط است (30). در مطالعۀ حاضر برای نخستین‌بار، کنترل زیستی بیماری گیاهچه‌میری خیار ناشی از P. capsici از طریق سویه‌ای از S. rochei به نام IT20 که قادر به تولید مقادیر زیاد SA (1/19میکروگرم‌در‌میلی‌لیتر) است، گزارش شد. توانایی تولید سیدروفور این سویه نه‌تنها در غلظت‌های زیاد نمک و دماهای بیش از 29 درجۀ سانتیگراد مشاهده شد، در این شرایط افزایش نیز یافت. ازآنجاکه تغییرات دمایی و شوری خاک در شرایط گلخانه‌های خیار به‌وفور اتفاق می‌افتند، انتخاب عوامل کنترل زیستی و محرک رشد گیاهی که در دامنۀ وسیع‌تری از تغییرات محیطی فعال باشند، ضروری است (6). سویۀ IC13 در شرایط آزمایشگاه از رشد هر سه عامل بیمارگر خیار ممانعت کرد؛ علاوهبراین، بیشترین میزان تولید اکسین را در مقایسه با سایر سویهها داشت، اما در دمای 42 درجۀ سانتیگراد و نمک 13 درصد، فعالیت سیدروفوری و سلولازی این سویه کاهش یافت؛ این سویه در آزمایش گلخانه استفاده نشد. اگرچه سویۀ IT25 روی محیط دارای نمک 6 درصد افزایش رشد نشان داد و هالۀ سیدروفوری آن نیز با افزایش درصد شوری افزایش یافت، نسبت به افزایش دما حساس بود و در دمای 42 درجۀ سانتیگراد رشد نکرد. سویۀ IT25 در شرایط گلخانه ویژگی‌های محرک رشدی نداشت؛ این سویه فعالیت آنزیم سلولازی ندارد و در شرایط درون شیشه‌ای تنها حدود 50 درصد از رشد P. capsici ممانعت کرد و عملکرد خوبی درارزیابی‌های گلخانه‌ای ازنظر ویژگی‌های کنترل زیستی روی بیماری نداشت. دو سویۀ SS14 و IT20 که قابلیت خوبی در کنترل بیماری و افزایش رشد گیاه داشتند، ویژگی‌های مشترکی مانند رشد در حضور نمک 6 درصد، تولید سیدروفور و فعالیت سلولازی در شرایط گرمایی و شوری مختلف نشان دادند. عملکرد بهتر سویۀ IT20 (نسبت به سویۀ (SS14 و عملکرد ضعیف سویۀ IT25 را می‌توان به‌ترتیب با تحمل‌کردن و تحمل‌نکردن دمای زیاد (42 درجۀ سانتیگراد) و همچنین به‌ترتیب با افزایش فعالیت و نداشتن فعالیت سلولازی آنها در این دما مرتبط دانست؛ این نتایج به پژوهشگران برای انتخاب سریع‌تر سویه‌های کنترل زیستی محرک رشد کمک می‌کنند و هزینه‌های جداسازی و غربال‌گری را کاهش می‌دهند.
سپاسگزاری
از پژوهشگاه بیوتکنولوژی کشاورزی ایران برای فراهم‌کردن امکانات پژوهش حاضر مصوب با شمارۀ 12-05-05-034-09454-950941 سپاسگزاری می‌شود.
)