نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانش آموخته ژنتیک، دانشکده علوم دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران
2 دانشیار ژنتیک، دانشکده علوم، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران
3 استاد میکروبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد، ایران
چکیده
کلیدواژهها
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Abstract
Introduction: Ciprofloxacin is a broad-spectrum antibiotic and a member of fluoroquinolones. Its main target in Escheichia coli is DNA gyrase. Ciprofloxacin induces the SOS response via RecA. The presence of RecF protein is essential for RecA activity. The recF is increased in the logarithmic phase by its operon promoter and the stagnation phase by its specific promoter. The activity of the specific promoter is dependent on rpoS. This study aimed to evaluate the expression of rpoS in a ciprofloxacin-resistant mutant.
Materials and methods: To evaluate the expression of rpoS, cellular RNAs in the early and middle logarithmic phases of growth were extracted. Then, after synthetizing cDNA, the relative gene expression in the wild type and mutant strains was measured by real-time PCR.
Results: Results showed that the extracted RNAs were free of contamination and have a suitable quality for the production of cDNA. Moreover, the expression of rpoS in the early and middle logarithmic phases after ciprofloxacin treatment in the high ciprofloxacin resistant mutant was approximately similar to the wild type strain.
Discussion and conclusion: In conclusion, it seems that the increased expression of recF was related to the operon promoter, and treatment with ciprofloxacin did not cause the stationary phase-like conditions.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
مقاومت آنتیبیوتیکی ریزموجوداتی که ابتدا به آنتیبیوتیکها حساس بودند، در طول درمان طولانیمدت با آنتیبیوتیکها افزایش یافته است؛ بهطوریکه این مقاومت میتواند آثار داروهای ضدمیکروبی را کاهش دهد و به افزایش عوارض و هزینههای درمان و مرگومیر منجر شود (1). مقاومت آنتیبیوتیکی از تغییرات ژنتیکی در باکتریها ناشی میشود و کاهش توانایی آنتیبیوتیکها برای نابودی عوامل میکروبی را در پی دارد (2). کینولونها و فلوروکینولونها ازکلاسهای نسبتاً جدید آنتیبیوتیکهای مصنوعی با فعالیت ضدباکتریایی قوی به شمار میآیند. تفاوت فلوروکینولونها با کینولونها در جایگزینی کربن ۸ با اتم نیتروژن و داشتن اتم فلوئور[1] در موقعیت ششم است که سبب عملکرد بهتر آنتیبیوتیک شده است. در حال حاضر، چهار نسل از آنتیبیوتیکهای کینولونی و فلوروکینولونی وجود دارند و متداولترین فلوروکینولونها در پزشکی عبارتند از: سیپروفلوکسازین، لوروفلوکسازین و موکسیفلوکسازین (3).
پاسخ SOS، مسیر کلاسیک پاسخ به تنش باکتریایی است که آسیب DNA در اثر طیفی از عوامل تنشزا ازجمله آنتیبیوتیکها آن را القا میکند (4)؛ این پاسخ از عملکرد رگولونی[2] ناشی میشود که از 20 ژن غیرمشابه تشکیل شده است و بسیاری از این ژنها در تحمل آسیب DNA و ترمیم DNA درگیرند؛ برای نمونه، lexAوrecA که پساز رویارویی سلول با آسیب DNA القا میشوند. پاسخ SOS از طریق پروتئینهای تنظیمی RecA (القاگر) و LexA (سرکوبگر) تنظیم میشود که این پروتئینها رونویسی از گروههای پاییندست شامل ژنهای SOS ([3]din) را تنظیم میکنند (5). پروتئین RecF بارگیری مستقیم RecA بر بخشهایی از شکاف تکرشته در DNA دورشته را تسهیل میکند (6)؛ ژن recF در اپرونی قرار دارد که شامل چهار ژن dnaA(کدکنندۀ پروتئین متصلشونده به DNA و لازم برای شروع همانندسازی DNA مبدأ کروموزومی)، dnaN(کدکنندۀ زیرواحد ß و عامل پردازشی DNAپلیمراز III)، recF و gyrB (کدکنندۀ زیرواحدB در DNAژیراز) است که در یک جهت رونویسی میشوند. علاوهبر پروموتر عمومی که در فاز نمایی استفاده میشود، recF دارای پروموتر اختصاصی است که در فاز سکون فعال میشود. بیان ژن recF به تولید پروتئین RecF منجر و بیان ژن gyrB سبب تولید زیرواحد B پروتئین DNAژیراز میشود؛ علاوهبراین، recF دارای یک منطقۀ پروموتری مربوط به خودش است که در وسط ژن dnaN قرار دارد. recF و gyrB در فاز نمایی از پروموتر dnaA رونویسی میشوند. پروتئین RecF برای پیشبرد فرایند ترمیمی که در آن نقش دارد، در منطقۀ DNA تکرشتۀ آسیبدیده به تشکیل کمپلکس RecFOR متشکل از محصولات دو ژن دیگر (recR و recO)و همچنین دایمریشدن تمام این محصولات به همراه هیدرولیز ATP در جایگاه اتصال ATP به خودش نیازمند است؛ از دیگر وظایف پروتئین RecF، واکنش با پروتئینی به نام RecX است که این پروتئین اثر مهاری روی فعالیت RecA دارد و با این عمل RecF، اثر مهاری آن خنثی میشود (7). ژن rpoS(RNAپلیمراز، سیگما S) پروتئین سیگما 38 (σ38 یا RpoS) پروتئین 8/37 کیلودالتونی را در اشریشیا کلی کدگذاری میکند. سیگمافاکتورها، پروتئینهاییاند که رونویسی را در باکتری تنظیم میکنند و در پاسخ به شرایط محیطی مختلف فعال میشوند. rpoS در اواخر فاز نمایی[4] رونویسی میشود و RpoS تنظیمکنندۀ اصلی ژنهای فاز سکون[5] است (8). در شرایط خاص، جایگزینی سیگما 38 در ساختار آنزیم RNAپلیمراز سبب روشنشدن ژنهایی مانند ژن recF میشود.
در مطالعهای که پوراحمد جکتاجی[6] و پسند[7] در سال 2016 انجام دادند، بیان ژنهای recA و LexA در سویههای مقاوم به سیپروفلوکسازین باکتری اشریشیا کلی اندازهگیری شد و هر دو ژن افزایش بیان نشان دادند (9). در سویههای جهشیافتۀ dinI نیز افزایش بیان recA مشاهده شده است (10). پروتئین RecF در افزایش فعالیت recAنقش دارد و پساز تیمار با سیپروفلوکسازین، افزایش بیان مییابد (11)؛ همچنین با اندازهگیری بیان ژن gyrBمشخص شده است این ژن افزایش بیانی بهاندازۀ recF دارد و برآورد میشود recF در رشد نمایی از طریق پروموتر اصلی اپرون بیان میشود و از پروموتر اختصاصی خود استفاده نمیکند (12).
مشخص نشده است افزایش بیان recF از طریق پروموترهای اپرون یا پروموتر اختصاصی recF انجام میشود؛ پروموتر recF تحتکنترل سیگمافاکتور S است که در فاز سکون بیان میشود. هدف پژوهش حاضر، بررسی بیان ژن rpoS در جهشیافتۀ اشریشیا کلی دارای مقاومت زیاد به سیپروفلوکسازین در طول فاز نمایی است.
مواد و روشها
در جدول 1، ویژگیهای ژنتیکی و فنوتیپی سویههای بررسیشده دیده میشود. منابع این سویهها پیش از این شرح داده شد (9) و برای اطمینان از درستی آنها، مقاومت آنها به سیپروفلوکسازین اندازهگیری شد.
بهمنظور طراحی آغازگرها، ابتدا توالی ژن rpoS از سایت NCBI به دست آمد و سپس آغازگرها با نرمافزار Gene Runner طراحی شدند؛ همچنین توالی آغازگرهای gapA (ژن خانهزاد) و شاهد مثبت از مطالعههای پیشین به دست آمد (10). ویژگیهای آغازگرهای استفادهشده در مطالعۀ حاضر در جدول 2 آمده است.
جدول 1- ویژگی سویههای تیپ وحشی و جهشیافتۀ اشریشیا کلی
|
نام سویه |
ویژگیهای ژنتیکی/فنوتیپی |
|
MG1655 |
تیپ وحشی/حساس به سیپروفلوکسازین |
|
PM1 |
تیپ جهشیافتۀ gyrA(Ser83→Leu) marOR(20 bp duplication) acrAB overexpression/مقاوم به سیپروفلوکسازین |
جدول 2- آغازگرهای استفادهشده
|
نوع آغازگر |
ترتیب توالی |
طول توالی (جفت باز) |
اندازۀ محصول (جفت باز) |
|
rpoS F |
5′-ACTGTTAACGGCCGAAGAAG-3′ |
19 |
147 |
|
rpoS R |
5′-TCCAGCAACGCCAGACCAC-3′ |
20 |
147 |
|
gapA F |
5′-ACTTACGAGCAG ATCAAAGC-3′´ |
20 |
170 |
|
gapA R |
5′-AGTTTCACGAAGTTGTCGTT-3′´ |
20 |
170 |
بهمنظور استخراج RNA، ابتدا کشت تازه از استوک سویۀ جهشیافته و تیپ وحشی روی محیطکشت LB آگار تهیه شد. کلنیهای تک سویههای تازهکشتشده برای تلقیح در محیطهای کشت مایع LB استفاده شدند و سپس آنتیبیوتیک سیپروفلوکسازین به محیطهای مربوط به سویۀ جهشیافته با مقاومت زیاد اضافه شد و نمونهها در انکوباتورشیکردار با دمای ۳۷ درجۀ سانتیگراد و 180 دوردردقیقه قرار داده شد. پساز سپریشدن مدت زمان لازم، جذب نوری (OD)[viii] نمونهها در طول موج ۶00 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد که 3/0و 6/0 بودند و هرکدام در زمان خاص خود برداشت شدند. محلول شاهد[ix] همان محیطکشت LB مایع بدون باکتری بود. استخراج RNA نمونههای یادشده مطابق دستورعمل کیت RNeasy Plus Mini Kit انجام شد. در راستای اطمینانیافتن از آلودهنبودن نمونههای RNA به DNA، واکنش PCR بهمنظور تکثیر ژن rpoSبرای هرکدام از نمونهها انجام شد و دمای اتصال آغازگرهای ژن rpoSبرابر 55 بود. جذب نوری و غلظت RNA و میزان خلوص آن در هریک از نمونهها با دستگاه اسپکتروفتومتر UV/Visible (بیوکروم انگلستان) اندازهگیری شد. بهمنظور سنتز cDNA از کیت یکتاتجهیز RevertAid™ (Reverse Transcriptase) استفاده و تمام مراحل کار طبق دستورعمل کیت انجام شد. جذب نوری و غلظت cDNA و میزان خلوص آن در هریک از نمونهها با دستگاه اسپکتروفتومتر UV/Visible (بیوکروم انگلستان) اندازهگیری شد و سپس PCR برای نمونۀ cDNA در شرایط دمایی بهینه برای ژن rpoS انجام شد تا پساز مشاهدۀ باند اختصاصی حاصل از تکثیر cDNA روی ژل آگارز، درستی سنتز و شرایط دمایی برای بهکاربردن در واکنش Real time PCR احراز شود؛ شرایط دمایی بهینۀ PCR در جدول 3 آمده است. در مرحلۀ بعد، واکنش Real time PCR برای نمونهها انجام شد؛ شرایط دمایی بهینه برای این واکنش در جدول 4 نشان داده شده است. بهمنظور انجام این واکنش از کیت سایبرگرین (یکتاتجهیز) استفاده شد. سایبرگرین، ترکیب فلورسنسی است که به DNA دورشتهای متصل میشود و چنانچه اندازۀ محصول ژنی کوتاه باشد و احتمال تشکیل دایمر بین آغازگرها وجود داشته باشد، از کاوشگر برای درستی انجام واکنش استفاده میشود. نتایج بیان ژن با آزمون تی[x] جفت و نرمافزار SPSS (نسخۀ 16) و Excel بررسی شدند. حدود اطمینان برای تمام آزمایشها 95 درصد و 05/0P< در نظر گرفته شد. بیان بیش از 2، بیشبیان بود (05/0P<).
جدول 3- شرایط دمایی بهینۀ PCR
|
مرحله |
درجهحرارت |
مدت زمان(دقیقه/ثانیه) |
تعداد چرخه |
|
واسرشتگی اولیه |
95 |
3 دقیقه |
1 |
|
واسرشتگی |
94 |
30 ثانیه |
35 |
|
اتصال آغازگر |
55 |
30 ثانیه |
35 |
|
بسط |
72 |
30 ثانیه |
35 |
|
بسط نهایی |
72 |
5 دقیقه |
1 |
جدول 4- شرایط دمایی بهینۀ Real time PCR
|
مرحله |
درجهحرارت |
مدت زمان(دقیقه/ثانیه) |
تعداد چرخه |
|
واسرشتگی اولیه |
95 |
5 دقیقه |
1 |
|
واسرشتگی |
95 |
10 ثانیه |
40 |
|
اتصال آغازگر |
55 |
15 ثانیه |
40 |
|
بسط |
72 |
20 ثانیه |
40 |
|
ذوب |
97-65 |
برای هر چرخه 5ثانیه |
- |
نتایج
روش PCR و ژل الکتروفورز بهمنظور بررسی و تعیین کمیت و کیفیت RNA و آلودهنبودن RNA استخراجشده به DNA استفاده شد. نتایج، هیچ باندی را نشان ندادند که گویای آلودهنبودن نمونهها به DNA ژنومی است. آغازگر استفادهشده در واکنش PCR به ژن rpoSمربوط بود (شکل 1).
|
250 bp |
|
500 bp |
|
1kbاندازهنما |
شکل 1- نتیجۀ PCR آلودهنبودن RNA استخراجشده به DNA. چاهک دوم و سوم به نمونههای RNA مربوط است.
بررسی غلظت RNAهای استخراجشده با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 260 نانومتر انجام شد. کل RNAهای استخراجشده غلظت مناسبی داشتند و نسبت A260/A280 (Absorption) برای تمام نمونهها مناسب و بیش از 8/1 بود. جذب و غلظت cDNA در هریک از نمونهها مناسب و نسبت A260/A280 برابر با 8/1 بود. شکل 2، نتیجۀ PCR یک نمونه cDNA برای ژن مطالعهشده را روی ژل آگارز 5/2 درصد مشخص میکند که باتوجهبه شدت باند میتوان بهطور کیفی از سنتز cDNA اطمینان یافت.
|
100 bpاندازهنما |
|
147 bp |
|
100 bp |
|
200 bp |
|
300 bp |
|
rpoS
|
شکل 2- تجزیهوتحلیل ژل الکتروفورز cDNAسنتزشده با اندازهنما 100جفت بازی (چاهک اول). چاهک دوم به نمونۀ cDNA مربوط است.
ارزیابی کمّی تغییرات بیان ژن rpoS به روش Real time PCR در سویههای جهشیافته و تیپ وحشی انجام شد. پساز تنظیم و بهینهکردن شرایط، منحنی تکثیر نمونهها بررسی شد که افزایش سیگنالهای فلورسنس ساطعشده از رنگ سایبرگرین را هنگام پیشروی چرخههای واکنش مشخص کرد و با رسم خط آستانه، چرخۀ آستانه (Ct) برای هریک از نمونهها محاسبه شد؛ منحنی تکثیر ژن rpoS در شکل 3نشان داده شده است. نقطۀ ذوب ژن نیز اندازهگیری شد که برای rpoS برابر 86 درجۀ سانتیگراد بود (شکل 4). باتوجهبه نتایج نمودارها و تجزیهوتحلیلهای منحنی استاندارد و Ct واکنش Real time PCR نمونۀ جهشیافته، سنجش نسبی بیان ژن به روش فافل (9) انجام شد؛ میزان بیان ژن در جدول 5 دیده میشود که میانگین سه بار تکرار آزمایش است و میزان خطا کمتر 10 درصد است. کارایی هر واکنش بین 9/0 تا 1/1 بود.
مقایسۀ بیان ژن در هریک از نمونههای جهشیافته نسبت به تیپ وحشی با نرمافزار SPSS (نسخۀ 16) و Excel انجام شد. بیان بیش از 2، بیشبیان در نظر گرفته شد (05/0P<).
شکل 3- منحنی تکثیر واکنش Real time PCR ژن rpoS
شکل 4- منحنی ذوب Real time PCR ژن rpoS
جدول 5- بیان نسبی ژن rpoS در سویۀ تیپ وحشی و جهشیافتۀ با مقاومت زیاد به سیپروفلوکسازین
|
سویه |
بیان نسبی |
مقدار P (معناداری آماری) |
|
MG1655(0.3) |
1 |
- |
|
MG1655(0.6) |
01/1 |
3/0 |
|
PM1(0.3) |
26/1 |
06/0 |
|
PM1(0.6) |
49/1 |
15/0 |
اعداد 3/0 و 6/0 که روبهروی هر سویه در جدول نوشته شدهاند، نمونههاییاند که OD آنها بهترتیب برابر با 3/0 و 6/0 است.
بحث و نتیجهگیری
سیگما 38 یا RpoS، فاکتوری است که در حالت گرسنگی، کاهش سرعت رشد مانند فاز سکون، دمای کم و اسیدیتۀ کم در حالت اسیدی سبب افزایش بیان تعدادی از ژنهای ضروری میشود و تنظیمکنندۀ مرکزی در پاسخ به تنش است. سه نوع پاسخ ژنها به افزایش بیان rpoSگزارش شده است:
ژنهایی که بیان آنها بهطور خطی با افزایش بیان rpoS افزایش مییابد؛ برای نمونه، osmY که کدکنندۀ پروتئینی است که با پاسخ اسمزی و فعالیت تاخوردگی پروتئین مرتبط است.
ژنهایی که بیان آنها بهطور چشمگیری با افزایش بیان rpoS افزایش مییابد، ولی این افزایش بیان خطی نیست (حساس)؛ مانند astA با فعالیت کاتالیزوری.
ژنهایی که بیان آنها به میزان ناچیزی تغییر مییابد؛ مانند gadCکه در مقاومت اسیدی فعالیت دارد (11).
در شرایط خاص، جایگزینی سیگما 38 در ساختار آنزیم رونویسی میتواند به روشنشدن ژنهایی منجر شود که ژن recF ازجملۀ آنها به شمار میآید (13). پروموتر اصلی rpoSدرون ژن nlpD قرار دارد که در اشریشیا کلی با نام rpoSp1 شناخته میشود. عوامل مؤثر بر بیان rpoS شامل خانوادۀ TetR است که مستقیماً سبب تنظیم rpoSو افزایش آن در فاز سکون میشوند. GacA/GacS نیز سبب افزایش بیان rpoS میشوند، اما هنوز مشخص نیست این کار را بهطور مستقیم انجام میدهند یا غیرمستقیم. ppGpp نیز بیان rpoS را القا میکند و احتمالاً این کار را با کنترل سطوح فسفات و مسدودکردن فسفاتار خارجسلولی[xi] انجام میدهد. cAMP–CRP تنظیم منفی rpoSرا بر عهده دارد و در مقابل، BarA سبب تنظیم آن بهطور مثبت میشود. UvrY بهواسطۀ BarA فسفریله و سبب تنظیم منفی یا به عبارتی، کاهش بیان rpoSمیشود و تحریک BarA را نیز بر عهده دارد (14).
چنانچه ژن rpoSدر جهشیافتۀ مقاوم به سیپروفلوکسازین افزایش بیان یابد، این احتمال وجود دارد که افزایش بیان ژن recF ناشی از افزایش بیان این ژن نیز باشد. در برخی پژوهشها ثابت شده است هنگامی که سلول باکتری در معرض آنتیبیوتیکهای اکسیداتیو قرار میگیرد، سیستم SOS نیز فعال میشود. بیان بیشتر rpoSدر شرایطی همچون فقر مواد غذایی و تنش اکسیداتیو برای باکتری گرم منفیVibrio cholerae پیشبینی شده است (14)؛ همچنین زمانی که باکتری اشریشیا کلی در معرض پرتودهی اشعۀ UV قرار میگیرد، آسیب به DNA سبب ایجاد تکرشتههایی در ساختار آن میشود که متعاقب آن، سیستم SOS و rpoS بهطور جداگانه فعال میشوند (15). در پاسخ به شرایط اسیدی، rpoS و DsrA، RprA، ArcZ شرکت دارند که نقش این سه sRNA (DsrA، RprA، ArcZ) در این مسیر هنوز مشخص نیست، اما آنچه واضح است، نقش کلیدی rpoS است؛ همچنین افزایش بیان rpoS درSalmonella typhimurium در شرایط اسیدی مشاهده شده است که بیرسون[xii] و همکاران (1996)، هولینگ[xiii] و همکاران (2001) و باتستی[xiv] و همکاران (2008) آن را اثبات کردهاند (16). در مطالعۀ فادتار[xv] و اینویی[xvi] نیز به این نکته پی برده شده است که rpoSکنترل بیان پروتئینهای تنشی OsmY و Dps را از طریق تغییرات بیانی CspCوCspE بر عهده دارد (17).
یافتههای پژوهش حاضر نشان دادند بیان ژن rpoS در فاز نمایی (اوایل و میانۀ فاز) در جهشیافته افزایش معناداری نسبت به سویۀ تیپ وحشی ندارد (05/0P>) که این مطلب در سویۀ جهشیافته نشان میدهد افزایش بیان ژن recF در جهشیافتههای مقاوم به سیپروفلوکسازین در این مراحل فاز نمایی نمیتواند به rpoS وابسته باشد و بیان آن به سیگمافاکتور فاز نمایی (سیگما 70) وابسته است. در مطالعهای که کوجیک[xvii] و ونتوری[xviii]در سال 2001 روی باکتری Pseudomonas aeruginosa انجام دادند، رشد آهسته و رونویسی پیش از موعد rpoS در اوایل فاز نمایی نشان داده شد (18)؛ البته این باکتری بهطور ذاتی به آنتیبیوتیکها مقاوم است.
نتایج پژوهش حاضر، افزایش بیان rpoS را در اوایل و میانۀ فاز نمایی نشان ندادند؛ درنتیجه، به نظر میرسد افزایش بیان recFدر اینمراحلاز طریق پروموتور اپرون باشد و تیمار با سیپروفلوکسازین سبب ایجاد شرایطی مشابه با فاز سکون نمیشود.
سپاسگزاری
از دانشگاه شهرکرد برای حمایت از پژوهش حاضر سپاسگزاری میشود.
)