تولید صمغ زانتان توسط سویه بومی باکتری زانتوموناس سیتری در محیط آب پنیر وارزیابی خصوصیات فیزیکو شیمیایی آن

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکترا ی زیست شناسی-میکروبیولوژی، واحد علوم و تحقیقات ،دانشگاه آزاد اسلامی،تهران ، ایران

2 استادیار زیست شناسی سلولی و ملکولی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فن آوری، تهران، ایران

3 دانشیار بیوتکنولوژی، سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران، تهران، ایران

4 دانشیار بیوتکنولوژی،پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فن آوری ، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: زانتان یک پلی‌ساکارید خارج سلولی است که توسط باکتری زانتوموناس تولید می شود. به دلیل ویسکوزیته بالا و دیگر خواص منحصر به فرد، این صمغ در صنایع مختلف کاربرد دارد. از این رو، جهت تولید صمغ زانتان توسط سویه‌های لاکتوز مثبت باکتری زانتوموناس، استفاده از منابع کربنی ارزان قیمت نظیر آب‌پنیر می‌تواند ازنظر اقتصادی مقرون به صرفه باشد.
مواد و روش‌ها: در این مطالعه از سویه بومی باکتری زانتوموناس سیتری 386، جهت تولید صمغ زانتان در محیط آب‌پنیر استفاده شد. سویه موردنظر در محیط حاوی عصاره مخمر و قند لاکتوز (YL)، کشت داده شد و سپس به محیط تولید واجد آب‌پنیر تلقیح شد. فرآیند تخمیر در مدت 5 شبانه‌روز ازنظر متغییر های تولید نظیر رشد، مصرف قند لاکتوز، ویسکوزیته و مقدار وزنی زانتان، مورد بررسی قرار گرفت. محتوای پیرووات و استات زانتان تولیدشده با زانتان استاندارد، مقایسه شدند و جهت تعیین گروه‌های عاملی، روش طیف‌سنجی مادون‌قرمز انجام شد.
نتایج: سویه مورد استفاده قابلیت مصرف لاکتوز در محیط آب‌پنیر را داشت. در انتهای فرآیند تخمیر مقدار و ویسکوزیته زانتان به ترتیب 3/20 گرم بر لیتر و 5/2066 سانتی پواز برآورد شد. محصول زانتان، محتوای استات و پیرووات قابل قبولی در مقایسه با زانتان استاندارد داشت و بررسی FTIR ، موقعیت گروه‌های عاملی ساختار زانتان بدست آمده را تأیید نمود.
بحث و نتیجه‌گیری: در این مطالعه برای نخستین بار، جدایه بومی زانتوموناس سیتری 386 جهت تولید زانتان در محیط آب پنیر مورد ارزیابی قرار گرفت.این سویه، توان بالایی برای مصرف قند لاکتوز در محیط آب پنیر نشان داد و مقدار قابل توجهی زانتان با ویسکوزیته مطلوب تولید کرد . بنابراین استفاده از این جدایه بومی می تواند جهت تولید زانتان درمحیط ارزان قیمت آب پنیر، در مقیاس صنعتی مناسب باشد.

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Production of xanthan gum by the native strain of Xanthmonas citri in whey medium and evaluation of its physicochemical properties

نویسندگان [English]

  • Roya Moravej 1
  • Seyed Mehdi Alavi 2
  • mehrdad azin 3
  • ali hatef salmanian 4
1 pHD student of biology,science and research branch,islamic azad university,tehran,iran
2 Assistant professor of Plant cellular and molecular biology, National institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran
3 Associate professor of Biotechnology, Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST), Tehran, Iran
4 Associate professor of Biotechnology, National institute of genetic engineering and biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Xanthan is an extracellular polysaccharide produced by Xanthomonas genus. Because of high viscosity and other properties, this gum is used in various industries. Hence, the use of cheap carbon sources such as whey can be economically feasible to produce Xanthan gum with positive lactose strains of Xanthomonas.
Materials and Methods: In this study, the native strain of Xanthmonas citri 386 was used to produce xanthan gum in cheese whey medium. The strain was cultured in a yeast extract lactose broth (YL) and then inoculated into production medium, the fermentation process was investigated in 5 days’ time in terms of production variables such as growth, consumption of lactose, viscosity and amount of xanthan. The content of pyruvate and acetate of product were compared with standard xanthan and the FTIR method was used to determine the functional groups.
Results: The strain used was the ability to use lactose in cheese whey. At the end of the fermentation process, the amount and viscosity of xanthan were estimated to be 20.3 g/L and 2066.5 centipoise respectively. The acetate and pyruvate content was acceptable in comparison with standard xanthan, and the FTIR study confirmed the position of the functional groups of the xanthan structure.
Conclusion: In this study, for the first time, the native isolate of Xanthomonas citri 386 was evaluated for the production of xanthan in whey. This strain showed high potential for lactose consumption in whey and produced a significant amount of xanthan with an optimum viscosity. Therefore, at an industrial scale, the use of this native isolate, can be suitable for the production of xanthan by low-priced whey medium.
Keywords: Xanthan gum, Xanthomonas citri, cheese whey, acetate and Pyruvate

کلیدواژه‌ها [English]

  • Xanthan gum
  • Xanthomonas citri
  • cheese whey
  • pyruvate and acetate

مقدمه.

صمغ زانتان، پلیمر ‌تجزیه‌پذیریست که نخستین‌بار، دانشمندان آمریکایی در سال 1950 آن را کشف کردند. باکتری زانتوموناس[1] بیماری‌زای گیاهی از خانوادۀ زانتوموناداسه[2] این صمغ را طی فرایند تخمیر تولید می‌کند (1). از میان همۀ صمغ‌های میکروبی، ویژگی‌های منحصربه‌فرد زانتان مانند درجۀ بالای الاستیسیتۀ کاذب و ویسکوزیته، حلالیت در آب و پایداری موجب شده‌اند همواره تقاضا برای تولید انبوه آن در جهان مطرح باشد و سهم زیادی را در بازار تجاری به خود اختصاص دهد. این پلیمر زیستی کاربرد گسترده‌ای در صنایع بهداشتی- آرایشی، غذایی، نساجی و نفتی دارد (2-4). ساختار زانتان متشکل از اسکلتی سلولزی با شاخه‌های جانبی قند دی‌مانوز، دی‌گلوکورونیک‌اسید و دی‌مانوز انتهایی است و گروه‌های استیل و پیروویل به نسبت‌های مختلف به زنجیرۀ جانبی متصلند؛ این امر موجب ویژگی‌های روانه‌شناسی متفاوت در محلول‌های زانتان شده است (5 و 6). زانتان بسته به مقدار جایگزینی واحدهای استیل و پیروویل در زنجیرۀ جانبی می‌تواند وزن مولکولی متفاوتی داشته باشد (7). عموماً 66 تا 88 درصد و 5 تا 21 درصد مانوز خارجی در زنجیرۀ جانبی زانتان به‌ترتیب پیروویله و استیله شده است (8). پژوهش‌های انجام‌شده روی باکتری زانتوموناس کمپستریس[3]، آن را سویه‌ای مطرح در صنعت تولید زانتان معرفی کرده‌اند (1)؛ باوجوداین، گزارش‌های محدودی دربارۀ تولید زانتان توسط سویه‌های بومی مانند زانتوموناس سیتری[4] وجود دارند. عموماً برای تولید زانتان از مواد کربنی نظیر گلوکز، ساکارز و نشاسته استفاده می‌شود (7).

آب‌پنیر، فراوردۀ جانبی کارخانه‌های لبنی و شامل 4 تا 5 درصد لاکتوز، 8/0 تا 1 درصد پروتئین و مقادیر کمی اسیدهای آلی است که دورریختن آن موجب نگرانی‌هایی دربارۀ محیط‌زیست شده است (9)؛ ازاین‌رو، به‌منظور غلبه بر مشکلات ناشی از دفع و نفوذ آن به آب‌های زیرزمینی می‌توان آب‌پنیر را برای تولید فراورده‌های زیستی مانند اتانول، متانول، پروتئین مخمری، لاکتات، استات و حتی زانتان استفاده کرد (10)، از سویی به‌علت میزان بیان کم و در برخی موارد نقص آنزیم بتاگالاکتوزیداز در باکتری‌های جنس زانتوموناس، استفاده از لاکتوز به‌عنوان منبع کربن در محیط‌های کشت امکان‌پذیر نیست (11)؛ ازاین‌رو، بدیهی است دستیابی به سویه‌های لاکتوز مثبت طبیعی یا دست‌ورزی ژنتیکی سویه‌های تجاری برای کسب قابلیت رشد در محیط‌های لاکتوزی و بهره‌مندی از ضایعات صنایع غذایی (مانند آب‌پنیر) در تولید زانتان می‌تواند مزیت نسبی مطلوبی ازنظر اقتصادی داشته باشد (9 و 12)؛ بنابراین، استفاده از آب‌پنیر به‌عنوان منبع غذایی کربنی برای تولید صمغ زانتان توسط سویه‌های مصرف‌کنندۀ لاکتوز باکتری زانتوموناس همواره مدنظر پژوهشگران بوده است (9). در مطالعۀ حاضر، قابلیت تولید و ویژگی‌های کیفی و کمّی صمغ زانتان با استفاده از محیط آب‌پنیر و سویۀ بومی زانتوموناس سیتری زیرگونۀ سیتری ارزیابی شد. پیش‌ازاین، پژوهشگران پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست‌فناوری این سویهرا از مرکبات جنوب ایران جدا و با عنوان X. citri/ NIGEB-386 (Xci/386)  نام‌گذاری کرده‌اند.

 

مواد و روش‌ها

کشت و نگهداری باکتری: سویۀ بومی Xci/NIGEB-386 از بخش ذخایر میکروبی پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست‌فناوری[5] (NIGEB) تهیه شد. به‌منظور تهیۀ پیش‌کشت، لوپ باکتری در محیط مایع Yeast Lactose شامل 5 گرم‌بر‌لیتر عصارۀ مخمر، 5 گرم‌بر‌لیتر پپتون کازئین و 7 گرم‌بر‌لیتر لاکتوز کشت داده شد (1 و 5)؛ برای تلقیح از سلول‌های باکتریایی‌ای استفاده شد که در مرحلۀ نمایی رشد قرار داشتند. به‌منظور نگهداری طولانی‌مدت باکتری، سوسپانسیون باکتری در محیط یادشده حاوی 20 درصد گلیسرول تهیه و در دمای منفی 80 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد (8).

محیط تولید زانتان: پودر آب‌پنیر کارخانۀ پگاه تهران به‌عنوان منبع کربن استفاده شد. پروتئین‌های آب‌پنیر در اثر حرارت دلمه می‌شوند و در فرایند تولید و استخراج زانتان مشکل ایجاد می‌کنند؛ درنتیجه، محیط تولید باید عاری از این پروتئین‌ها باشد. به‌منظور جداسازی پروتئین‌های آب‌پنیر از روش تیمار حرارتی استفاده شد؛ به‌این‌ترتیب که 60 گرم پودر آب‌پنیر در 1 لیتر آب حل و به‌مدت 10 دقیقه حرارت داده شد، محلول پس‌از صاف‌شدن دوباره 10 دقیقه جوشانده و سپس سانتریفوژ شد و درنهایت از محیط نیمه‌شفاف رویی به‌عنوان محیط پایۀ آب‌پنیر استفاده شد (13 و 14).

محیط تولید آب‌پنیر از ترکیب 1 لیتر آب‌پنیر تیمار‌شده، 2/2 گرم‌بر‌لیتر پودر عصارۀ خیساندۀ ذرت[1] (منبع نیتروژن) و محلول‌های نمکی طبق جدول 1 ساخته و اسیدیتۀ نهایی محیط معادل 7 در نظر گرفته شد. مقدار تلقیح پیش‌کشت برای فرایند تخمیر، 10 درصد (حجمی/حجمی) در نظر گرفته شد و محیط‌ها به‌مدت پنج شبانه‌روز در دمای 28 درجۀ سانتی‌گراد با دور 180 دوردردقیقه گرماگذاری شدند (1 و 15).

 

جدول 1- محلول‌های نمکی لازم برای ساخت محیط تولید زانتان

ترکیبات

مقدار (گرم‌بر‌لیتر)

K2HPO4

7/0

KH2PO4

2/0

(NH4)2SO4

1/0

MgCl2 6H2O

1/0

FeSO4 7H2O

01/0

MnCl2

001/0

 

استخراج زانتان: پس‌از اتمام فرایند تولید، نمونه‌ها به نسبت (1:1) با آب مقطر رقیق و سپس به‌مدت 15 دقیقه در 10000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند تا تودۀ سلولی جدا شود. اتانول 98 درصد سرد (به حجم سه برابر محیط) به مایع رویی اضافه شد تا زانتان رسوب کند و برای از‌بین‌بردن بقایای محیط‌کشت، محصول زانتان دوباره با الکل 98 درصد تیمار و به‌مدت 10 دقیقه در 10000 دور در دقیقه سانتریفیوژشد (1 و 14). محصول رسوب‌یافته به‌مدت 24 ساعت در دمای منفی 20 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری و سپس با دستگاه فریز درایر[6] (مدل (LYOVACTM -GT 3 خشک شد.

مطالعۀ روند فرایند تولید زانتان در محیط آب‌پنیر: نمونه‌گیری از محیط تولید در فواصل زمانی 24 ساعته انجام و رشد باکتری به دو روش سنجش جذب نوری و شمارش سلولی سنجیده شد (15). به‌منظور ارزیابی میزان مصرف قند، به‌طور هم‌زمان فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز و مقدار لاکتوز باقیمانده سنجیده شد. فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز با استفاده از شیوه‌کار استاندارد روش Miller و پیش‌مادۀ اورتونیتروفنیل‌گالاکتوپیرانوزید[7] (ONPG) اندازه‌گیری شد. منحنی استاندارد لاکتوز با استفاده از روش هیدرولیز اسیدی و روش دی‌نیترو‌سالیسیلیک‌اسید[8] (DNS) رسم و میزان قند باقیمانده در محیط اندازه‌گیری شد (16 و 17). به‌منظور دستیابی به مقدار وزنی محصول زانتان، پس‌از هر بار نمونه‌گیری و استخراج، محصول خشک و با ترازوی دیجیتال وزن شد (1).

ارزیابی ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی محصول زانتان: تعیین ویسکوزیته: در مدت‌ زمان فرایند تخمیر طی پنج شبانه‌روز، مقدار ویسکوزیتۀ محیط پس‌از هر بار نمونه‌گیری با ویسکومتر استوالد[9] در دمای محیط 25 درجۀ سانتی‌گراد سنجیده شد (9 و 18)؛ همچنین به‌منظور دستیابی به ویسکوزیتۀ محصول زانتان، محلول 1 درصد زانتان حاصل از سویۀ 386 در آب مقطر تهیه و یکنواخت و سپس ویسکوزیتۀ آن اندازه‌گیری شد. به‌منظور مقایسه از محلول 1 درصد زانتان استاندارد (تهیه‌شده از شرکت سیگما مربوط به باکتری صنعتی زانتوموناس کمپستریس با کد 2-66-11138) استفاده شد (19).

سنجش محتوای پیرووات و استات: به‌منظور ارزیابی محتوای پیرووات و استات موجود در ساختار زانتان به‌ترتیب از روش 2 و 4 دی‌نیتروفنیل‌هیدرازین و هیدروکسامیک‌اسید استفاده شد (20 و 21). منحنی استاندارد استیل‌کولین و پیرووات تهیه و برای شاهد از پودر زانتان استاندارد استفاده شد (22).

بررسی ساختار زانتان با روش طیف‌سنجی مادون‌قرمز[10](FTIR): محصول صمغ زانتان پودر و همراه با پتاسیم‌بروماید به‌شکل قرص تهیه شد. FTIR نمونه به روش طیف‌سنجی مادون‌قرمز و با استفاده از دستگاه FTIR (Perkin Elmer spectrum one) در محدودۀ400 تا 4000 بر سانتی‌متر انجام و طیف‌های FTIR آن به‌منظور تعیین ویژگی‌ها و گروه‌های عاملی با زانتان استاندارد مقایسه شدند (19 و 23).

نتایج

تغییرات هنگام فرایند تخمیر طی مدت پنج شبانه‌روز بررسی شدند. نتایج ارزیابی رشد باکتری در شکل 1 نشان می‌دهند طی 24 ساعت اول، بیشینه جذب نوری حاصل از رشد باکتری در طول ‌موج 600 نانومتر برابر 5/2 است و این روند افزایشی با شمارش سلول‌های زنده روی محیط لاکتوز آگار مطابقت دارد؛ همچنین طی مدت پنج شبانه‌روز از آغاز تخمیر و هم‌زمان با افزایش فعالیت آنزیم، مصرف قند نیز افزایش می‌یابد؛ به‌طوری‌که تا روز سوم فرایند، باکتری بیش از نیمی از قند محیط را مصرف می‌کند.

 

 

شکل 1- بررسی روند رشد زانتوموناس سیتری سویۀ 386 در محیط تولید

 

شکل 2 نشان می‌دهد مقدار قند و فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز از زمان آغاز فرایند تا 24 ساعت اول نسبتاً ثابت است، ولی فعالیت آنزیم پس‌از 24 ساعت به‌طور تصاعدی افزایش می‌یابد که نشان‌دهندۀ شدت‌گرفتن مصرف قند لاکتوز محیط توسط سویۀ بومی است. بیشترین فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز پس‌از 96 ساعت معادل 27/1302 واحدبرمیلی‌لیتر ثبت شد.

 

شکل 2- بررسی مصرف لاکتوز و فعالیت آنزیم توسط زانتوموناس سیتری سویۀ 386 در محیط تولید

 

فرایند تولید زانتان در محیط تولید بر پایۀ آب‌پنیر طی مدت پنج شبانه‌روز در شکل 3 دیده می‌شود. ویسکوزیتۀ نهایی محیط پس‌از پنج شبانه‌روز به 5/2066 سانتی‌پواز رسید؛ همچنین روند افزایشی تولید زانتان از روز سوم آغاز شد و در پایان فرایند، بیشترین مقدار وزنی زانتان معادل 3/20 گرم‌برلیتر به دست آمد.

 

شکل 3- بررسی تولید زانتان و ویسکوزیته در محیط تولید

 

ویسکوزیتۀ محلول 1 درصد زانتان نیز سنجیده شد. نتایج مقایسۀ ویسکوزیته و محتوای استات و پیرووات زانتان حاصل از پژوهش حاضر و زانتان سویۀ استاندارد زانتوموناس کمپستریس (تهیه‌شده از شرکت سیگما با شماره ثبت 2-66-11138) در جدول 2 نشان داده‌ شده است.

 

 

جدول 2- مقایسۀ ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی زانتان حاصل از زانتوموناس سیتری سویۀ 386 و نمونۀ استاندارد

استات (درصد)

پیرووات (درصد)

ویسکوزیتۀ محلول 1 درصد

باکتری

01/0±289/0

1/0±1/2

5±325

X. citri/NIGEB-386

02/0±33/0

04/0±4/5

12±695

X. campestris

± نشان‌دهندۀ انحراف معیار است.

 

 

در مطالعۀ حاضر با‌توجه‌به شکل 4، گروه‌های عاملی استیل در محدوده‌های 2900 تا 2950 و 1730 تا 1735 بر سانتی‌متر و گروه‌های کربونیل در محدوده‌های 1600 تا 1645 و 1070 تا 1200 بر سانتی‌متر ‌مشاهده شدند. جدول 3، نتایج مقایسۀ گروه‌های عاملی را بین دو نمونه زانتان نشان می‌دهد؛ اختلاف جزئی در محدودۀ پیک‌های مدنظر با نمونۀ استاندارد به‌علت ناخالصی‌های موجود در محصول زانتان حاصل از پژوهش حاضر است.

 

 

شکل 4- طیف FTIR زانتان؛ A. زانتان سویۀ استاندارد (زانتوموناس کمپستریس)، B. محصول زانتان باکتری زانتوموناس سیتری سویۀ 386

 

جدول 3- مقایسۀ گسترۀ جذب (cm-1) گروه‌های عاملی موجود در ساختار زانتان به روش FTIR

گروه‌های عاملی

هیدروکسیل

کربونیل

کربوکسیل

استیل

زانتان سیگما

3426

1733، 1634

1253، 1454

1076، 2927

زانتان سویه 386

3421

1735، 1611

1252، 1454

1076، 2933

 


بحث و نتیجه‌گیری

در مطالعۀ حاضر برای نخستین‌بار، تولید صمغ زانتان با استفاده از سویۀ بومی Xci/ NIGEB-386 در محیط آب‌پنیر ارزیابی شد و تمام متغیرهای تخمیر بررسی شدند. نتایج نشان دادند این سویه با داشتن فعالیت بتاگالاکتوزیدازی از لاکتوز موجود در آب‌پنیر استفاده و مقدار درخور توجهی صمغ زانتان (3/20 گرم‌بر‌لیتر) تولید می‌کند. با‌توجه‌به هزینۀ زیاد منابع کربنی مورداستفاده در فرایندهای میکروبی، همیشه استفاده از منابع کربنی ارزان‌قیمتی مانند ضایعات کشاورزی و پساب‌های صنایع غذایی مدنظر بوده است (1). با‌توجه‌به اینکه آب‌پنیر مقادیر زیادی لاکتوز دارد، محیط مناسبی برای تولید کم‌هزینۀ صمغ زانتان با ماهیت پلی‌ساکاریدی توسط باکتری مولد محسوب می‌شود (9). تلاش‌ در راستای استفاده از محیط‌های لاکتوزی نظیر آب‌پنیر برای رشد باکتری و تولید زانتان همواره مدنظر پژوهشگران بوده است.

باکتری صنعتی زانتوموناس کمپستریس، سویۀ صنعتی تولیدکنندۀ زانتان معرفی ‌شده است (11)؛ همان‌طور که نیک‌نژاد[1] و همکاران بیشترین مقدار تولید زانتان توسط زانتوموناس کمپستریس را در شرایط بهینه برابر با 4/16 گرم‌بر‌لیتر در محیط آب‌پنیر دارای لاکتوز گزارش کرده‌اند (13). باکتری زانتوموناس کمپستریس عموماً قابلیت کمی برای مصرف لاکتوز نشان می‌دهد و پژوهشگران راه دستیابی به سویه‌های جهش‌یافتۀ لاکتوز مثبت را از طریق روش‌های جهش‌زایی و مهندسی ژنتیک فراهم می‌کنند. کانیشک[xi] و همکاران (1993) سویۀ جهش‌یافتۀ لاکتوز مثبت زانتوموناس کمپستریس را با استفاده از جهش‌زایی تصادفی و عوامل جهش‌زای ان‌متیل، ان‌نیترو، ان‌نیتروز و گوانیدین غربال کردند و سپس با بهینه‌کردن شرایط تولید در محیط دارای 4 درصد لاکتوز توانستند 20 گرم‌برلیتر زانتان به دست آورند (24). به‌تازگی سویه‌های بومی‌ای از جنوب ایران با ‌عنوان باکتری‌های لاکتوز مثبت جدا شده‌اند که به‌طور طبیعی لاکتوز را مصرف می‌کنند؛ به‌طوری‌که رمضانی[xii] و همکاران (2013) مقدار وزنی زانتان به‌دست‌آمده از سویۀ بومی زانتوموناس سیتری K37 (Xcc/NIGEB K37) در محیط دارای 5 درصد لاکتوز را پس‌از 120 ساعت تخمیر معادل 14 گرم‌برلیتر محاسبه کرده‌اند (15)؛ درحالی‌که مقدار وزن خالص زانتان حاصل از سویۀ 386 روی محیط آب‌پنیر، 3/20 گرم‌بر‌لیتر بود و این نشان‌دهندۀ قابلیت زیاد این سویه برای مصرف لاکتوز و تولید زانتان در محیط آب‌پنیر است؛ هرچند فعالیت آنزیم بتاگالاکتوزیداز سویۀ Xcc/NIGEB K37 در مطالعۀ رمضانی و همکاران حدود 200 واحد فعالیت آنزیمی نسبت به سویۀ Xci/386 بیشتر بود و این احتمالاً به‌علت استفاده از محیط دارای لاکتوز به‌جای آب‌پنیر است. از سویی، مطالعۀ حاضر نشان داد آنزیم بتاگالاکتوزیداز، آنزیم نسبتاً پایداری است؛ زیرا باتوجه‌به شکل 2 و برخلاف کاهش تعداد سلول‌های زنده در پایان فرایند تخمیر، مقدار آنزیم ثابت بود و افت بسیار ناچیزی در پایان فرایند نشان داد. پژوهش‌ها نشان می‌دهند غلظت اولیۀ سوبسترای لاکتوز در پایداری آنزیم موثر است و حتی اگر سوبسترا هنگام فرایند اضافه شود، اثر منفی روی فعالیت آنزیم خواهد داشت (25).در پژوهش حاضر، غلظت اولیۀ لاکتوز در محیط تولید برابر 5/3 درصد بود و باوجود کاهش لاکتوز در پایان فرایند، همچنان تأثیر مثبت غلظت اولیۀ پیش‌ماده روی پایداری آنزیم مشهود بود.

ویسکومتری ابزار مهمی برای تشخیص ترکیبات شیمیایی اگزوپلیمری سنتزشده در فرایندهای تخمیری است (26) و کیفیت ویسکوزیتۀ ذاتی بر اساس نوع سویه، شرایط تخمیر و روش‌های استخراج متغیر است (27). نتایج بررسی تولید زانتان نشان دادند با افزایش مدت‌ زمان فرایند تولید، مقدار زانتان و ویسکوزیته افزایش می‌یابد. طی 48 تا 72 ساعت پس‌از آغاز فرایند، تغییرات افزایشی در مقدار وزنی زانتان و ویسکوزیته مشاهده شد و این روند افزایشی بین روزهای چهارم تا پنجم معنا‌دار بود. ازآنجاکه تولید صمغ در فاز سکون رشد باکتری اتفاق می‌افتد؛ می‌توان گفت با کاهش لاکتوز، منابع غذایی دردسترس باکتری پایان می‌یابند و باکتری وارد مرحلۀ تولید صمغ برای مقابله با شرایط نامساعد غذایی می‌شود (28 و 29). پژوهش‌ها نشان می‌دهند محتوای استات و پیرووات موجود در ساختار زانتان روی ویسکوزیتۀ زانتان بسیار مؤثر است و با افزایش گروه‌های عاملی استیل و پیروویل، ویسکوزیته افزایش می‌یابد (26 و 30)؛ بنابراین با‌توجه‌به نتایج سنجش ویسکوزیته، این فرضیه وجود داشت که محتوای استات و پیرووات نمونۀ زانتان سویۀ 386 از زانتان استاندارد کمتر باشد و پس‌از بررسی نتایج سنجش طبق جدول 2 مشخص شد محتوای استات در هر دو نمونۀ زانتان نسبتاً یکسان است؛ بنابراین، تجربه‌های پژوهش حاضر از نقش استات در افزایش ویسکوزیته پشتیبانی نمی‌کنند؛ این نتیجه با نتایج رودریگوئز[xiii] و همکاران (1997) همخوانی دارد (6 و 31). در بررسی‌های دیگر نیز مشخص شده است محتوای زیاد پیرووات و محتوای کم استات موجب افزایش ویسکوزیتۀ محلول زانتان می‌شود (32)؛ به‌طوری‌که با افزایش محتوای پیرووات (حدود 1/0 تا 5/0 درصد)، ویسکوزیته حدود 60 تا 80 درصد افزایش می‌یابد (29). مطالعۀ حاضر نشان داد ارتباط مستقیم و معناداری بین محتوای پیرووات و ویسکوزیته وجود دارد؛ زیرا محتوای پیرووات و همچنین ویسکوزیتۀ محلول 1 درصد نمونۀ زانتان استاندارد نسبت به محتوای پیرووات و ویسکوزیته زانتان سویۀ 386 حدود 5/2 برابر بیشتر بود. درحقیقت، به نظر می‌رسد محتوای پیروویک‌اسید بهترین شاخص کیفیت پلی‌ساکارید زانتان است و درصد استیله و پیروویله‌شدن مانوز ساختار زانتان می‌تواند موجب تغییرات ویسکوزیته و ویژگی‌های روانه‌شناختی آن شود (6)؛ هرچند نوع ریزموجود و تغییر شرایط تخمیر دو عامل مهم در تنوع ساختاری و ویژگی‌های روانه‌شناختی زانتان محسوب می‌شوند (33 و 34). شرایط محیطی در ساختار اولیۀ زانتان تأثیری ندارد، ولی در شکل‌گیری ساختار ثانویۀ زانتان، وزن مولکولی و بازده مؤثر است (4 و 35). FTIR روشی برای تشخیص شباهت‌ها و تفاوت‌ها در ساختار شیمیایی ترکیبات است (23). بررسی‌هایی که تاکنون به کمک FTIR روی ساختار زانتان انجام‌ شده‌اند، نشان می‌دهند هر گروه عاملی در ساختار زانتان در محدودۀ طول ‌موج خاصی پیک می‌دهد. نمونۀ محصول زانتان سویۀ 386 و نمونۀ استاندارد برای شناسایی گروه‌های شیمیایی موجود تجزیه‌وتحلیل شدند و منطقۀ مطالعه‌شده شامل تمام باندهای طیفی در محدودۀ 400 تا 4000 بر سانتی‌متر بود و باوجود تفاوت‌های جزئی جمع‌آوری‌شده در طیف FTIR، این نتیجه نشان می‌دهد ماهیت زانتان تولیدشده توسط سویۀ 386 با نمونۀ زانتان استاندارد (شرکت سیگما با شماره ثبت 2-66-11138) ازنظر جایگاه گروه‌های عاملی مطابقت دارد. دا سیلوا[xiv] و همکاران (2018) دو سویۀ 1866 و 1867 از باکتریزانتوموناس کمپستریس را ازنظر تولید زانتان ارزیابی کردند و نشان دادند با استفاده از منابع کربنی مختلف و سویه‌های متفاوت، طیف‌های حاصل از FTIR در هر دو سویه گروه‌های عاملی مشابهی دارند (18)؛ اما با‌توجه‌به اینکه روش FTIR به‌‌تنهایی برای شناسایی پلیمر زیستی کافی نیست، روش‌های کامل‌تری ازجمله استروسکوپی با رزونانس مغناطیسی هستۀ کربن و پروتون نیز پیشنهاد می‌شوند. با استناد به نتایج پژوهش حاضر و در مقایسه با سویۀ صنعتی زانتوموناس کمپستریس، سویۀ زانتوموناس سیتری 386 نیز نامزد مناسب تولید زانتان در محیط آب‌پنیر معرفی می‌شود.

سپاسگزاری

نویسندگان از امکانات سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران و پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک ایران که در اختیار پژوهش حاضر قرار گرفتند، سپاسگزاری می‌کنند.

 
 
References
(1) Garcia-Ochoa F., Santos VE., Casas JA., Gomez E. Xanthan gum: Production, recovery, and properties. Biotechnology Advances 2000; 18(7): 549-579.
(2) Katzbauer B. Properties and application of xanthan gum. Polymer Degradation and Stability 1998; 59: 81-84.
(3) Kennedy J., Bradshaw I. Production, properties and applications of xanthan. Progress in Industrial Microbiology 1984; 19: 319-371.
(4) Monaco-Lopez BD., Lessa VL., Silva BM., Schnitzler E., Lacerda LG. Xanthan gum: Properties, production conditions, quality and economic perspective. Journal of Food and Nutrition Research 2015; 54(3): 185-194.
(5) Palaniraj A., Jayaraman V. Production, recovery and applications of xanthan gum by Xanthomonas campestris. Journal of Food Engineering 2011; 106: 1-11.
(6) Shatwell KP., Sutherland IV., Ross-Murphy SB. Influence of acetyl and pyruvate substituents on the solution properties of xanthan polysaccharide. International Journal of Biology and Macromolecules 1990; 12: 71-78.
(7) Callet F., Milas M., Rinaudo M. Influence of acetyl and pyruvate content on rheological properties of xanthan in dilute solution. International Journal of Biological Macromolecules 1987; 9(5): 291-293.
(8) Kool MM., Gruppen H., Sworn G., Schols HA. Comparison of xanthan by the relative abundance of its six constituent repeating units. Carbohydrate Polymer 2013; 98(1): 914-921.
(9) Fu JF., Tseng YH. Construction of lactose-utilizing Xanthomonas campestris and production of xanthan gum from whey. Applied and Environmental Microbiology 1990; 56: 919-923.
(10) Siso MG. The biotechnological utilization of cheese whey: A review. Bioresource Technology 1996; 57: 1-11.
(11) Yang TC., Wu GH., Tseng YH. Isolation of a Xanthomonas campestris strain with elevated beta-galactosidase activity for direct use of lactose in xanthan gum production. Letters in Applied Microbiology 2002; 35(5): 375-379.
(12) Leela JK., Sharma J. Studies on xanthan production from Xanthomonas campestris. Bioprocess and Engineering 2000; 23: 687-689.
(13) Niknezhad SV., Asadollahi MA., Zamani A., Biria D., Doostmohamadi M. Optimization of xanthan gum production using cheese whey and response surface methodology. Food Science and Biotechnology 2015; 24(2): 453-460.
(14) Ashraf S., Soudi MR., Sadeghizadeh M. Xanthomonas of a novel mutated strain of xanthomonas campestris for xanthan production using whey as the sole substrate. African Journal of Microbiology 2008; 3(11): 438-442.
(15) Ramezani A., Jafari M., Goodarzi T., Alavi SM., Salmanian AH., Azin M. Lactose consuming strains of Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) insight into the emergence of natural field resources for xanthan gum production. World Journal Microbiology and Biotechnology 2014; 30(5): 1511-1517.
(16) Miller GD. Handbook of Dairy Foods and Nutrition. 3rd ed. Boca Raton, Florida: CRC Press; 2006.
(17) Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry 1959; 31: 426-428.
 
(18) da Silva JA., Cardoso LG., de Jesus Assis D., Gomes JVP., Oliveira MBPP., de Souza OC., et al. Xanthan gum production by Xanthomonas campestris pv. campestris IBSBF 1866 and 1867 from lignocellulose agro industrial wastes. Applied Biochemistry and Biotechnology 2018; 1-14.
(19) Faria S., de Oliveira Petkowicz CL., de Morais SAL., Hernandez Terrones MG., de Resende MM., de Franc FP., et al. Characterization of xanthan gum produced from sugar cane broth. Carbohydrate Polymer 2011; 86: 469-476.
(20) Katsuki H., Kawano C., Yoshida T., Kanayuki H., Tanaka S. The determination of pyruvic acid by 2, 4-Dinitrophenylhydrazin method. Analytical Chemistry 1961; 2: 433-439.
(21) McComb EA., McCready RM. Determination of acetyl in pectin and in acetylated carbohydrate polymer. Analytical Chemistry 1957; 29(5): 819-821.
(22) Hsu CS. Integrated rotating fibrous-bed bioreactor-ultrafiltration process for xanthan gum production from whey lactose [Dissertion]. Athens: Ohio State University; 2011.
(23) Griffiths PR., de Hasseth JA. Fourier transform infrared spectrometry. 2nd ed. New Jersey: Wiley-Blackwell; 2007
(24) Koníček J., Lasík J., Šafář H. Xanthan gum produced from whey by a mutant strain of Xanthomonas campestris. Folia Microbiologica 1993; 38: 403-405.
(25) Warmerdam A., Boom RM., Janseen AEM. β-galactosidase stability at high substrate concentrations. Springerplus 2013; 2(1): 402.
(26) Erten T., Adams GG., Foster TG., Harding SE. Comparative heterogeneity, molecular weights and viscosities of xanthan of different pyruvate and acetate content. Food Hydrocolloids 2014; 1-7.
(27) Bourne MC. Food texture and viscosity concept and measurement. 2nd ed. New York: Academic Press; 1997.
(28) De Vuyst L., Vermeire A. Use of industrial medium components for xanthan production by Xanthomonas campestris NRRL-B-1459. Applied Microbiology and Biotechnology 1994; 42: 187-191.
(29) Silva MF., Fornari RCG., Mazutti M de Oliveira D., Padilha FF., Cichoski AJ., Cansian RL., et al. Production and characterization of xanthan gum by Xanthomonas campestris using cheese whey as sole carbon source. Journal of Food Engineering 2009; 90: 119-123.
(30) Cheetham NWH., Nik Norma NM. The effect of pyruvate on viscosity properties of xanthan. Carbohydrate Polymer 1989; 10: 55-60.
(31) Rodriguez H., Aguilar L., Lao M. Variations in xanthan production by antibiotic-resistant mutants of Xanthomonas campestris. Applied Microbiology and Biotechnology 1997; 48(5): 626-629.
(32) Sandford PA., Pittsley JE., Knutson CA., Watson PR., Cadmus MC., Jeanes A. Variation in Xanthomonas campestris NRRL B-1459: Characterization of xanthan products of differing pyruvic acid content. Extracellular microbial polysaccharide. ACS Symposium Series 1977; 45: 192-210.
(33) Rehm B. Microbial production of biopolymers and polymer precursors: Applications and perspectives. 1st ed. Horizon Scientific Press; 2009.
(34) Mesomo M., Silva MF., Boni G., Padilha FF., Mazutti M., Mossi M., et al. Xanthan gum produced by Xanthomonas campestris from cheese whey: Production optimisation and rheological characterisation. Journal of the Science of Food and Agriculture 2009; 89: 2440-2445.
(35) Savvides AL., Katsifas EA., Hatzinikolaou DG., Karagouni AD. Xanthan production by Xanthomonas campestris using whey permeate medium. World Journal Microbiology Biotechnology 2012; 28: 2759-2764.