بررسی اثر ‏UV‏ روی فرایند فروشویی زیستی اورانیوم در باکتری ‏Acidithiobacillus sp. FJ2‎‏ و ‏اثر احتمالی آن روی توالی ژن ‏coxB

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران

2 گروه پژوهشی مواد اولیه و فناوری سوخت، پژوهشکده مواد و سوخت هسته ای، پژوهشگاه علوم و فنون هسته ای، تهران، ایران

3 گروه نانوبیوتکنولوژی، دانشکده علوم و فنون نوین، دانشگاه تهران، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: استفادۀ روزافزون از اورانیوم برای منبع مناسب تأمین انرژی در صنایع گوناگون و کشورهای مختلف باعث تخلیۀ معادن با عیار بالای این عنصر شده است. امروزه فرایند فروشویی زیستی اورانیوم برای دستیابی آسان و ارزان به اورانیوم لازم در کشورهای مختلف استفاده می‌شود. در این فرایند، ریزموجودات برای استخراج اورانیوم از معادن با عیار پایین آن استفاده می‌شوند.
مواد و روش‏‏ها: ابتدا باکتری اسیدی تیوباسیلوس سویۀ FJ2 در معرض UV قرار گرفت، سپس فرایند فروشویی زیستی اورانیوم در حضور باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV انجام شد. پس‌از استخراج DNA از هر دو نوع باکتری و طراحی آغازگر ژن coxB، تکثیر ژن با استفاده از PCR انجام شد. پس‌از تعیین توالی ژن و ویرایش با نرم‌افزار بیوادیت، توالی نهایی ژن coxB هر دو نوع باکتری تعیین و برای اثبات وجودداشتن یا نداشتن جهش در نمونۀ قرارگرفته در معرض UV بررسی و مقایسه شد.
نتایج: میزان استخراج اورانیوم در باکتری قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ 5 درصد در نیمۀ روز سوم به 100 درصد و در چگالی پالپ 50 درصد در روز سیزدهم به 62/94 درصد رسید. این میزان در حضور باکتری قرارگرفته در معرض UV در چگالی پالپ 5 درصد در روز دوم به 100 درصد و در چگالی پالپ 50 درصد در روز سیزدهم به 34/96 درصد رسید. توالی ژن coxB در هر دو نمونه باکتری یکسان بود. 
بحث و نتیجه‏گیری: در پژوهش حاضر، پرتودهی با UV در باکتری اسیدی تیوباسیلوس سویۀ FJ2 سرعت فروشویی زیستی اورانیوم در چگالی پالپ 5 درصد را افزایش داد؛ در‌حالی‌ که میزان استخراج اورانیوم در چگالی پالپ 50 درصد ابقا شد. نتیجۀ یادشده غیروابسته به ژن coxB است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Investigation the UV Effect on Uranium Bioleaching Process in Acidithiobacillus sp FJ2 ‎and its Possible Consequences on the CoxB Gene Sequence ‎

نویسندگان [English]

  • Roghayeh Jafarpoor 1
  • Faezeh Fatemi 2
  • Faramarz Mehrnejad 3
  • Akram Eidi 1
1 Department of Biology, Faculty of Basic Science, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Department of research on raw materials and fuel technology, Institute of materials and nuclear fuel, Research Center for Nuclear Science and Technology, Tehran, Iran
3 Department of Nanobiotechnology, Faculty of Science and Technology, Tehran University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: The increasing use of uranium as a suitable source of energy in various industries has led to the depletion of high-grade uranium mines in different countries. Today, the uranium bioleaching process has been used in different countries for easy and cheap access to uranium. In this process, microorganisms are used to extract uranium from low-grade mines.
Materials and methods: The Acidithiobacillus sp. FJ2 bacterium was exposed to UV radiation. Then, the uranium bioleaching process was conducted in the presence of bacteria exposed to UV and non-exposed bacteria. In followings, this gene was amplified by PCR technique after DNA extraction from bacterial species and coxB gene primer design. Subsequent to gene sequencing and editing with bioedit software, the final sequence of the coxB gene was determined from both bacterial species. Later than, the sequences were examined and compared to prove the presence or absence of the mutation in the radiation sample.
Results: The amount of uranium extraction in the presence of bacteria exposed to UV reached to 100% on the second day at the 5% pulp density, whereas the 96.36% extraction yield was obtained on the thirteenth day in pulp density of 50%. This amount was recorded in an unexposed bacterium, in the third and thirteenth days at 5& 50% pulp densities, respectively. The coxB gene sequence was identical in both bacterial specimens.
Discussion and conclusion: In this study, UV irradiation to Acidithiobacillus sp. FJ2 increased the rate of uranium bioleaching in the pulp density of 5%, whereas uranium extraction yield was sustained in the 50% pulp density. These effects were independent to the coxB gene.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Uranium Bioleaching
  • UV
  • CoxB
  • Acidithiobacillus sp. FJ2.‎

مقدمه.

استفادۀ روزافزون از اورانیوم برای منبع مداوم انرژی در صنعت حمل‌ونقل، انرژی هسته‌ای و تولید برق موجب تخلیۀ پیوستۀ معادن اورانیوم با عیار بالا و فرسودگی این ذخایر شده است (1)؛ این مسئله باعث شکل‌گیری عزم و اراده برای جستجو و یافتن روش‌های ساده، مؤثر و منجر به آلودگی‌های کمتر در استخراج اورانیوم از معادن شده است (2 و 3). روش‌های هیدرومتالورژیکال (استخراج فلزها به‌وسیلۀ آب) دارای معایبی مانند بازیابی ضعیف، قیمت زیاد انرژی، پردازش زیاد و افزایش آلودگی منابع آب هستند (4 و 5). در روش فروشویی شیمیایی نیز استخراج اورانیوم از معادن با عیار پایین به‌علت بسیار کم‌ بودن حجم معادن اورانیوم ازنظر وزنی مقرون‌به‌صرفه نیست. استفاده از روش اسیدفروشویی، فرایندی که در آن اسیدهای قوی به‌عنوان معرف استفاده می‌شوند، نیز علاوه‌بر ایجاد مشکلات محیطی نیازمند مقدار زیاد انرژی و مستلزم واحد صنعتی پیچیده است (6)؛ به‌همین‌علت، فروشویی زیستی (بیولیچینگ) معادن با عیار پایین راهکاری عمومی در نظر گرفته می‌شود. فروشویی زیستی استفاده از ریزموجودات برای استخراج فلزها از معادن است. این فرایند از توانایی طبیعی ریزموجودات برای تغییردادن شکل فلزهای موجود در معادن از شکل جامد به شکل محلول استفاده می‌کند (7). در فروشویی زیستی اورانیوم، یون فریک به‌شکل پذیرندۀ الکترون عمل می‌کند و U⁺⁴ را به U⁺⁶ (حالتی که در آب حل می‌شود) تبدیل می‌کند و خود احیا و به یون فروس تبدیل می‌شود؛ ازاین‌رو فلز وارد محلول آبی می‌شود (8 و 9). این فرایند ارزان‌تر و آسان‌تر از روش‌های رایج است، ازنظر اقتصادی به‌صرفه و ازنظر زیست‌محیطی مناسب است (7). در این فرایند، ریزموجودات مانند باکتری‌ها و قارچ‌ها که توانایی رشد در محیط‌های دارای اسیدیتۀ زیاد (اسیدیته‌های بین 5/1 تا 3) و حجم زیاد یون‌های فلزهای سنگین را دارند به‌عنوان کاتالیست‌های فروشویی به کار می‌روند (1، 8، 10)؛ علاوه‌بر‌این، انعطاف‌پذیری ریزموجودات بدون مشکل تطبیق‌یافتن آنها با شرایط زندگی متفاوت سودمندی درخور توجهی است (7). اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس یکی از باکتری‌هایی است که به‌طور گسترده در فرایند فروشویی زیستی اورانیوم به کار می‌رود. اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس باکتری گرم منفی و گاما- پروتئوباکتری است که به‌طور بهینه در 30 درجۀ سانتی‌گراد و اسیدیتۀ 2 رشد می‌کند (هرچند می‌تواند در اسیدیتۀ 1 یا کمتر نیز رشد کند) (11) و انرژی را از اکسیداسیون آهن فروس و ترکیبات سولفور احیا به‌ دست می‌آورد (12). بیشترین بازدهی فروشویی اورانیوم (18 درصد در نبود باکتری‌ها) به دنبال واردکردن اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس در حدود 80 درصد افزایش می‌یابد (13).

باکتری اسیدی تیوباسیلوس سویۀ FJ2گونه‌ای بومی از جنس اسیدی تیوباسیلوس‌ها[1] است که از چشمه‌های رامسر در ایران جدا شده و قادر به فروشویی زیستی اورانیوم است (14). ازآنجاکه پدیدۀ فروشویی زیستی مستلزم وجود موجودات زنده است محصول فروشویی فلز از عوامل فیزیکوشیمیایی، زیستی و محیطی تأثیر می‌پذیرد (1 و 8). متابولیسم بیوانرژیتیک در باکتری اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس مستلزم زنجیرۀ انتقال الکترونی است که اکسیداسیون آهن فروس را به احیای O2 (آخرین پذیرندۀ الکترون) مرتبط می‌کند. مسیر زنجیرۀ تنفسی اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس به‌شکل زیر است (15):

 

Fe(II)→Cyc2→rusticyanin→cytochrome c4 (Cyc1)→cytochrome oxidase aa3→O2 cytoplasmic

 

ژن‌های اپرون rus این پروتئین‌ها را کد می‌کنند. ترتیب ژن‌های اپرون یادشده در ژنوماسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس به‌شکل زیر است (16):

cyc2, cyc1, ORF1, coxB, coxA, coxC, coxD, and rus.

کمپلکس ژنی coxBACD کدکنندۀ چهار زیرواحد تشکیل‌دهندۀ سیتوکروم‌اکسیداز نوع aa3 است. ژن coxB کدکنندۀ زیرواحد II CoxB سیتوکروم‌اکسیداز نوع aa3 است. CoxB پلی‌پپتیدی با 254 آمینواسید و وزن مولکولی 28240 کیلودالتون است (16). 51 آمینواسید اول این زیرواحد یک توالی طولانی و استاندارد تشکیل می‌دهند. این زیرواحد از دو دامنۀ عبور‌کننده از غشا در انتهای N و یک دامنۀ پری‌پلاسمیک در انتهای C تشکیل شده است و الکترون‌ها را از پروتئین Cyc1 می‌گیرد و به زیرواحد CoxA منتقل می‌کند (17 و 18). مسیر حرکت الکترون و جایگاه این زیرواحد در غشای باکتری اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس در شکل 1 نشان داده شده است (19).

 

 

b

a

   

شکل 1- a. مسیر حرکت الکترون در زنجیرۀ انتقال الکترون در غشای باکتری اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس، b. الگوی استقرار و اتصال اجزای زنجیرۀ انتقال الکترون در غشای باکتری اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس

 

 

جهش‌یافته‌های اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس که با استفاده از عوامل فیزیکی و شیمیایی ایجاد می‌شوند به‌طور فزاینده‌ای برای بهبود فعالیت فروشویی زیستی گونه‌ها استفاده می شوند (20). جهشی که UV القا می‌کند ساده‌ترین و مؤثرترین روش ایجاد جهش فیزیکی در باکتری‌ها است و طول موج UV مؤثر حدود 255 نانومتر است که مشابه طیف جذبی DNA عموم باکتری‌ها است؛ از‌این‌رو، جهش UV دارای اثر باکتریایی قوی است (21). هدف پژوهش حاضر، بررسی میزان بهبود فرایند فروشویی زیستی اورانیوم در حضور باکتری اسیدی تیوباسیلوس سویۀ FJ2 متأثر از اشعۀ UV در چگالی پالپ 5 و 50 درصد سنگ معدن اورانیوم است. همچنین برای بررسی آثار احتمالی UV روی توالی نوکلئوتیدی ژن coxB، این ژن از باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV استخراج و توالی نوکلئوتیدی آن در هر دو نوع باکتری تعیین و با یکدیگر مقایسه شد.

 

مواد و روش‌ها

تهیۀ باکتری: باکتری اسیدی تیوباسیلوس سویۀFJ2 باکتری استفاده‌شده در مطالعۀ حاضر است که جهانی و همکاران (2015) آن را از چشمه‌های گوگردی رامسر در ایران جدا کرده‌اند (14).

تهیۀ سنگ معدن اورانیوم: در مطالعۀ حاضر از سنگ معدن اورانیوم با عیار پایین و تهیه‌شده از معدن ساغند یزد استفاده شد. نمونۀ سنگ معدن آزمایش‌شده در ابعاد d80=106µm انتخاب شد. به‌منظور به‌دست‌آوردن ترکیب شیمیایی نمونه سنگ خردشده، نمونه برای تجزیه‌وتحلیل XRF فرستاده شد.

کشت باکتری و تهیۀ مایۀ تلقیح:برای تهیۀ مایۀ تلقیح از باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV، باکتری‌ها در محیط‌کشت 9K (حاوی 3 گرم (NH4)2SO4، 5/0 گرم K2HPO4، 5/0 گرم MgSO4.7H2O، 1/0 گرم KCl، 01/0 گرم Ca(NO3)2.4H2O و 7/44 گرم FeSO4.7H2O در 100 ملی‌لیتر آب مقطر) کشت شدند (22). اسیدیتۀ محیط‌کشت پس‌از اضافه‌کردن 10 درصد (v/v) باکتری به محیط روی 2 تنظیم شد (23 و 24) و به‌مدت دو روز (تا زمان رسیدن باکتری‌ها به فاز نمایی) در دمای 30 درجۀ سانتی‌گراد درون انکوباتور شیکردار با دور ×g180 گرماگذاری شد (25). پس‌از‌آن، باکتری‌ها با استفاده از سانتریفیوژ در دور ×g2422 به‌مدت 30 دقیقه جمع‌آوری شدند.

قراردادن باکتری اسیدی تیوباسیلوس سویه FJ2 در معرض UV:برای تاباندن UV،ابتدا باکتری در فاز نمایی برداشته و با سانتریفیوژ در دور rpm4000×g=3320 به‌مدت 20 دقیقه جمع‌آوری شد. سپس رسوب باکتری سه بار با آب اسیدی شسته و درنهایت در محیط‌کشت بدون منبع آهن حل شد. در ادامه، 10 میلی‌لیتر از باکتری‌های آماده‌سازی‌شده درون پلیت ریخته شد. فاصلۀ بین پلیت و منبع نور UV برابر 30 سانتی‌متر تنظیم شد. نمونه به‌مدت 180 ثانیه در معرض نور UV با قدرت 30 وات و طول موج 254 نانومتر قرار گرفت. پس‌ازآن، به‌منظور حفظ تغییر ایجادشده و بازسازی‌نشدن ژنوم باکتری، نمونه به‌مدت 12 ساعت در تاریکی و دمای 4 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد (26). درنهایت، نمونه در محیط‌کشت 9K (همان‌طور که در مرحلۀ پیش توضیح داده شد) در شرایط بهینۀ رشد کشت و برای آزمایش‌های فروشویی زیستی اورانیوم استفاده شد.

فرایند فروشویی زیستی اورانیوم:برای انجام فرایند فروشویی زیستی، 10 درصد از مایه‌های تلقیح باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV به‌طور جداگانه به محیط‌کشت‌های 9K حاوی 5 و 50 درصد سنگ معدن اورانیوم اضافه شد. نمونۀ شاهد منفی به‌جای مایۀ تلقیح حاوی مخلوط متانول- فرمالدهید به نسبت 9:1 بود (27). نمونه‌ها در انکوباتور 35 درجۀ سانتی‌گراد و دور ×g150 گرماگذاری شدند. میزان استخراج اورانیوم هر 24 ساعت یک بار اندازه‌گیری شد و زمانی که به بیشینۀ استخراج رسید فروشویی زیستی متوقف شد. پس‌از توقف، باکتری‌ها با سانتریفیوژ در دور rpm4500×g=3735 به‌مدت 30 دقیقه جمع‌آوری شدند.

اندازه‌گیری میزان استخراج اورانیوم:برای اندازه‌گیری میزان استخراج اورانیوم، هر 24 ساعت یک بار 5 میلی‌لیتر از محلول آب‌شویه برداشته شد و پس‌از فیلترشدن برای تجزیه‌وتحلیل طیف‌سنجی پلاسمای جفت‌شده القایی (ICP[2]) فرستاده شد. هر بار به میزان آب‌شویه برداشته‌شده آب مقطر با اسیدیتۀ 2 اضافه شد. نمونه‌برداری تا زمانی ادامه یافت که میزان استخراج اورانیوم در هر دو چگالی پالپ به 100 درصد رسید (14). 

اندازه‌گیری اسیدیته:اسیدیتۀ اولیۀ محیط روی 2 تنظیم شد. اسیدیته هر 24 ساعت یک بار اندازه‌گیری و دوباره روی 2 تنظیم می‌شد. مقدار اسیدیته با دستگاه pHمتر (Metrohm827) اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری پتانسیل احیا:میزان پتانسیل احیا (Eh) با دستگاه Ehمتر (Metrohm827) اندازه‌گیری شد.

اندازه‌گیری آهن فروس: آهن فروس با به‌دست‌آوردن اختلاف آهن فریک و آهن کل اندازه‌گیری شد. به‌منظور اندازه‌گیری آهن فریک و آهن کل، پس‌از تهیۀ منحنی کالیبراسیون برای هریک، میزان 2 میلی‌لیتر از آب‌شویه برداشته و در دو بالن 50 میلی‌لیتری (1 میلی‌لیتر درون هرکدام) ریخته شد و به هریک از بالن‌ها 3 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک‌اسید 10 درصد اضافه شد. به بالن دوم، 3 میلی‌لیتر محلول آمونیاک 25 درصد نیز اضافه شد. سپس، محتویات دو بالن به حجم رسانده شد. میزان آهن فریک با تعیین جذب محلول بالن اول با دستگاه اسپکتروفتومتر (UV-Vis) در طول موج 500 نانومتر اندازه‌گیری شد. میزان آهن کل با اندازه‌گیری جذب محلول بالن دوم در طول موج 425 نانومتر به دست آورده شد (28).

استخراج DNA از باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV:برای بررسی و تعیین توالی ژن coxB در هر دو نوع باکتری قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV، استخراج DNA ازهر دو نوع باکتری با کیت جداسازی CinnaPure DNA (کد PR881603، ساخت شرکت سیناژن) پس‌از فرایند فروشویی زیستی انجام شد.

طراحی آغازگر ژن coxB:به‌منظورتکثیر ژن coxBاستخراج‌شده، ابتدا آغازگرهای اختصاصی F (5′- TTTGCCACCCAAGTCTTG -3′) و R (5′- TGGCTTGGTGATGGTCTG -3′) با نرم‌افزارهای Primer3 و runner Gen طراحی شدند.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز:برای انجام PCR، محلول 1 میکرولیتر از هر آغازگر (4/0 میکرومولار)، 5/0 میکرولیتر dNTPs (2/0 میکرومولار)، 75/0 میکرولیتر MgCl2 (5/1 میلی‌مولار)، 1/3 میکرولیتر DNA الگو، 5/2 میکرولیتر بافر 4x PCR، و 4/0 میکرولیترDNA polymerase pfu (2u/25μl) با افزودن آب تا حجم کل 25 میکرولیتر استفاده شد. سه مرحلۀ PCR شامل 5 دقیقه واسرشت‌شدن اولیه در 95 درجۀ سانتی‌گراد؛ 35 چرخۀ واسرشت‌شدن شامل‌ 20 ثانیه در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد، 30 ثانیه اتصال آغازگر در دمای 60 درجۀ سانتی‌گراد و 2 دقیقه و 30 ثانیه طویل‌سازی در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد و پس‌از تکمیل چرخه، طویل‌سازی نهایی به‌مدت 7 دقیقه در 72 درجۀ سانتی‌گراد انجام شد. به‌منظور کنترل و تأیید درستی انجام هر آزمون PCR از نمونه‌های شاهد منفی و مثبت استفاده شد. نمونه شاهد مثبت واکنشی از PCR بود که در آن cDNA تأیید‌شده قبلی وجود داشت و نمونۀ شاهد منفی واکنشی از PCR بود که در آن cDNA وجود نداشت.

الکتروفورز:برای اطمینان‌یافتن از استخراج و تکثیر ژن مدنظر، الکتروفورز محصولات PCR روی ژل آگارز 1 درصد انجام شد و باندها با نور UV مشاهده شدند. باند مربوط به ژن coxB در حدود ناحیۀ مربوط به آن (720 جفت باز) مشاهده شد و استخراج این ژن از هر دو نمونه تأیید شد.

تعیین توالی ژن coxB باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV:در این مرحله، ژن‌های تکثیرشده از هر دو نمونه برای تعیین توالی به شرکت تکاپوزیست فرستاده شدند و توالی دقیق ژن‌ها با نرم‌افزار Bioedit v 7.2.5 تعیین و وجودداشتن یا نداشتن جهش بررسی شد.

آنالیز آماری: تفاوت‌های بین داده‌ها با نرم‌افزار SPSS و آزمون ANOVA تعیین شدند. با این نرم‌افزار P value داده‌ها محاسبه و P

 

نتایج و بحث

تاکنون چندین مطالعه در زمینۀ بررسی اثر چگالی پالپ‌های مختلف سنگ معدن معادن مختلف روی فرایند فروشویی زیستی اورانیوم و تأثیر UV روی فرایند فروشویی زیستی مس در باکتری اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس انجام شده است (14، 21، 29-32) اما هیچ گزارشی مبنی بر ایجاد جهش با UV در اسیدی تیوباسیلوس سویۀ FJ2 و تأثیر آن روی فرایند فروشویی زیستی اورانیوم مشاهده نشده است.

بررسی میزان استخراج اورانیوم در باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ‌های 5 و 50 درصد:مطابق نتایج شکل 2، میزان استخراج اورانیوم در چگالی پالپ 5 درصد در حضور باکتری قرارگرفته در معرض UV در روز دوم و در حضور باکتری قرارنگرفته در معرض UV در نیمۀ روز سوم به 100 درصد می‌رسد. استخراج اورانیوم در چگالی پالپ 50 درصد در هر دو نمونه باکتری پس‌از 13 روز به حداکثر می‌رسد. از سوی دیگر، بیشترین استخراج در چگالی پالپ 5 درصد به 100 درصد می‌‌رسد اما در چگالی پالپ 50 درصد در نمونۀ قرارگرفته در معرض UV به 34/96 درصد و در نمونۀ قرارنگرفته در معرض UV به 62/94 درصد می‌رسد؛ بنابراین در چگالی پالپ 5 درصد، زمان رسیدن به بیشترین استخراج کوتاه‌تر و مقدار استخراج نیز بیشتر است و میزان استخراج در چگالی پالپ 50 درصد ابقا می‌شود. در نتیجه، تابش UV روی باکتری باعث بهبود فرایند فروشویی زیستی اورانیوم می‌‌شود.

 

 

شکل 2- میزان استخراج اورانیوم در حضور باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ‌های 5 و 50 درصد

در مطالعۀ پال[3] و همکاران (2010) دربارۀ فروشویی زیستی نمونۀ کان‌سنگ با عیار پایین معادن جیدی گودا[4] هند مشخص شد بازدهی فروشویی زیستی اورانیوم با افزایش چگالی تا 10 درصد افزایش می‌یابد اما پس‌از‌آن، بازدهی با افزایش چگالی پالپ کاهش می‌یابد (29). نتایج پژوهش فاطمی[5] و همکاران (2017)نیز نشان داد در باکتری اسیدی تیوباسیوس سویۀFJ2 میزان استخراج اورانیوم با افزایش چگالی پالپ کاهش می‌یابد. آنها بیشترین میزان استخراج را در چگالی پالپ 5 درصد مشاهده کردند (30). در پژوهش جهانی[6] و همکاران (2015) دربارۀ فروشویی زیستی اورانیوم توسط باکتری اسیدی تیوباسیلوس سویۀ FJ2 مشخص شد از چگالی پالپ 2 تا 10 درصد (البته با افزایش زمان فروشویی) بازدهی به 100 درصد می‌رسد و پس‌از‌آن، کاهش بازدهی در چگالی 5/12 درصد دیده می‌شود (14). عبداللهی[7] و همکاران (2011) ثابت کردند بازدهی استخراج در چگالی پالپ‌های 5/7 و 10 درصد پس‌از 260 ساعت به بیشترین مقدار یعنی به‌ترتیب 100 و 98 درصد می‌رسد؛ درحالی‌که در چگالی‌های پالپ 5/2 و 5 درصد در زمان کوتاه‌تری به 100 درصد می‌رسد (31). در نتایج پژوهش ابهیلاش[8] و پاندی[9] (2011) دربارۀ کان‌سنگ‌های با عیار پایین از معدن تورامدی، جیدی گودا هند بیشترین بازدهی در چگالی پالپ 20 درصد دیده شد. طبق نتایج آنها، در چگالی پالپ 20 درصد (W/V)، اندازه ذرۀ کمتر از 76 میکرومتر، دمای 35 درجۀ سانتی‌گراد، زمان 40 روز و اسیدیتۀ 7/1 بازیابی زیستی اورانیوم 98 درصد است (32)؛ بنابراین، آنچه اهمیت پژوهش حاضر را آشکار می‌کند ارائۀ روشی است که با انجام آن بازدهی فرایند فروشویی زیستی در چگالی پالپ 5 درصد در زمان کوتاه‌تری به 100 درصد رسید و در چگالی پالپ 50 درصد در روز 13 (با افزایش بسیار جزئی) در میزان 34/96 درصد ابقا شد. آنچه بیشتر پژوهشگران در توجیه کاهش بازدهی با افزایش چگالی در فرایند فروشویی زیستی بر آن تأکید داشته‌اند نفوذ ناکافی اکسیژن و کم‌شدن رشد باکتریایی در چگالی پالپ بیشتر است (33)؛ علاوه‌بر‌این، زیادشدن غلظت یون‌های فلزی با افزایش چگالی پالپ روی سیستم فروشویی زیستی اثر سمی و بازدارندگی دارد (34). گین[10] و همکاران (2006) پیشنهاد کردند آثار سمی فلزهای سنگین روی رشد باکتری‌ها از عملکرد غلظت فلز سنگین نیست بلکه به زمان تماس تجمعی آنها بستگی دارد (35).

.بررسی میزان تغییرات اسیدیته در باکتری‌های .قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ‌های 5 و 50 درصد:شرایط بهینۀ اسیدیته برای باکتری اسیدی تیوباسیلوس سویۀ FJ2به‌منظور بیشترین استخراج اورانیوم 2 است و استخراج اورانیوم در اسیدیته‌های 5/1 و 5/2کاهش می‌یابد (14). نگهداشتن اسیدیتۀ محیط فروشویی بین 5/1 تا 5/2 الزامی است زیرا باکتری‌ها در اسیدیتۀ بیش از 5/2 فعالیتشان را از دست می‌دهند. اسیدیتۀ بیش از 2 باعث تشکیل ژاروسیت[11] می‌شود که سدی فیزیکی بین آهن فروس و باکتری ایجاد و از اکسیداسیون آهن ممانعت می‌کند (31). در اسیدیتۀ کمتر از 1 نیز رسوب بازی سولفات‌های فریک در حضور یون‌های هیدروژن تشکیل می‌شود که سطوح سولفید معدنی را غیرفعال و حتی از روند رشد محیط‌کشت ممانعت می‌کند (36). علت افزایش مقدار اسیدیته در دو روز اول در چگالی پالپ 50 درصد در حضور باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV به انحلال شیمیایی تغلیظ‌شده‌ها بین روز آغازی و روزهای اولیه نسبت داده می‌شود (30) اما از سوی دیگر، در ابتدای فروشویی زیستی مطابق واکنش زیر اکسیداسیون آهن فروس به فریک اتفاق می‌افتد:

.FeSO4+H2SO4+O2→Fe(SO4)3+H2O

این واکنش در حضور باکتری‌ها انجام می‌شود.

در نتیجه، افزایش اسیدیته به مصرف اسید در واکنش یادشده نسبت داده می‌شود. در چگالی پالپ 5 درصد در روز اول و در چگالی پالپ 50 درصد از روز دوم به بعد کاهش اسیدیته دیده می‌شود (شکل های 3 و 4). این کاهش به‌علت تولید یون‌های فریک از یون‌های فروس به‌وسیلۀ باکتری‌ها و هیدرولیز یون‌های فریک است که به تولید سولفوریک‌اسید منجر می‌شود. رسوب ژاروسیت‌ها همراه با تولید H و عملکرد شلاته‌کننده از EPS که دارای –OH و –COOH برای آزادکردن H+ به درون محلول است به وجود می‌آید (37-39). تجزیۀ پیریت پس‌از شروع فروشویی زیستی و آزاد‌شدن آن از کان‌سنگ نیز دلیلی بر اسیدی‌شدن محیط است (40). در چگالی پالپ 5 درصد در حضور باکتری قرارگرفته در معرض UV در روز اول کاهش اسیدیته دیده می‌شود؛ ازاین‌رو، پیشنهاد می‌شود در این محیط نیز ابتدا افزایش اسیدیته وجود داشته است اما این افزایش به‌علت افزایش سرعت فروشویی زیستی تا پیش‌از اندازه‌گیری اسیدیته در روز اول بسیار سریع اتفاق ‌افتاده است به‌طوری‌که در زمان اندازه‌گیری اسیدیته در روز اول کاهش اسیدیته مشاهده می‌شود.

 

 

 

شکل 3- تغییرات اسیدیته در حضور باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV و شاهد منفی در چگالی پالپ 50 درصد. حرف‌های غیریکسان نشان‌دهندۀ معناداری اختلاف دو نمونه و حرف‌های یکسان نشان‌دهندۀ معنادار‌نبودن اختلاف دو نمونه هستند.

 

 

شکل 4- تغییرات اسیدیته در حضور باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ 5 درصد. حرف‌های غیریکسان نشان‌دهندۀ معناداری اختلاف دو نمونه و حرف‌های یکسان نشان‌دهندۀ معنادار‌نبودن اختلاف دو نمونه هستند.

 


بررسی میزان تغییرات Eh در باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ‌های 5 و 50 درصد: تغییرات Eh نمونۀ شاهد منفی در هر دو چگالی پالپ 5 و 50 درصد کمتر از نمونه‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV بود که نشان‌دهندۀ فعالیت اکسیداتیوی باکتری‌ها است (شکل‌های 5 و 6).

 

 

 

شکل 5- تغییرات Eh در حضور باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ 50 درصد. حرف‌های غیریکسان نشان‌دهندۀ معناداری اختلاف دو نمونه و حرف‌های یکسان نشان‌دهندۀ معنادار‌نبودن اختلاف دو نمونه هستند.

 

شکل 6- تغییرات Eh در حضور باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ 5 درصد. حرف‌های غیریکسان نشان‌دهندۀ معناداری اختلاف دو نمونه و حرف‌های یکسان نشان‌دهندۀ معنادار‌نبودن اختلاف دو نمونه هستند.

 

 

تغییرات Eh (پتانسیل احیا) طی فرایند فروشویی زیستی اورانیوم نشان می‌دهد این فرایند دارای طبیعت الکتروشیمیایی است و پتانسیل احیا به‌علت اکسیداسیون Fe2+ توسط باکتری و افزایش غلظت Fe3+ افزایش می‌یابد (شکل‌های 5 و 6) (13). ازنظر بیوهیدرومتالیکالی، این ریزموجود از تفاوت پتانسیل احیا بین جفت Fe(II)/Fe(III) و S°/SO4²¯ یا O2/H2O به‌عنوان منبع انرژی استفاده می‌کند (41).

.بررسی میزان تغییرات (Fe2) در باکتری‌های .قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ‌های 5 و 50 درصد:اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس باکتری شیمیولیتوتروف و اسیددوستی است که از آهن و سولفور برای منبع انرژی استفاده می‌کند. غلظت آهن فروس و اسیدیته اثر زیادی روی فعالیت باکتری‌ها در فرایند فروشویی زیستی دارند (14). رشد این ‌باکتری به اکسیداسیون Fe(II) (منبع انرژی) بستگی دارد و ممکن است سه عامل غلظت Fe(II) و Fe(III) و اسیدیتۀ محلول روی فروشویی زیستی آن اثر بگذارند (32). در آزمایش‌های فروشویی زیستی، سولفات‌فروس به‌شکل اکسیدانت قوی عمل می‌کند (13). مقدارهای کم آهن برای اکسید‌کردن مقادیر مختلف اورانیوم مناسب هستند (42). در محلول اسیدی بدون باکتری‌، Fe(II) پایدار است و فروشویی به‌وسیلۀ Fe(III) به‌آهستگی انجام می‌شود. اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس واکنش اکسیداسیون را بیش از یک میلیون بار شتاب می‌بخشد (43). نقش اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس در فروشویی زیستی اورانیوم در تولید اکسیدانت (سولفات‌فریک) و در تولید عامل حل‌کننده (سولفوریک‌اسید) است و این کار را از طریق حملۀ فیزیکی به پیریت که نسبت به مواد معدنی رادیواکتیو دردسترس‌تر قرار گرفته است و تولید آهن فریک و سولفوریک‌اسید انجام می‌دهد (32). با انحلال مواد معدنی، مقدار اضافی یون‌های آهن استخراج‌‌شده دارای اثر منفی روی سرعت انحلال اورانیوم هستند.

 

 

شکل 7- تغییرات (Fe2⁺) در حضور باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ 50 درصد. حرف‌های غیریکسان نشان‌دهندۀ معناداری اختلاف دو نمونه و حرف‌های یکسان نشان‌دهندۀ معنادار‌نبودن اختلاف دو نمونه هستند.

 

 

شکل 8- تغییرات (Fe2⁺) در حضور باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ 5 درصد. حرف‌های غیریکسان نشان‌دهندۀ معناداری اختلاف دو نمونه و حرف‌های یکسان نشان‌دهندۀ معنادار‌نبودن اختلاف دو نمونه هستند.

 

 

هنگام فرایند فروشویی زیستی، ژاروسیت به‌تدریج تشکیل می‌شود و سطح سنگ معدن واکنش‌نداده را می‌پوشاند. رسوب ژاروسیت فروشویی اورانیوم را از طریق ایجاد سدی فیزیکی بین فروس و سطح باکتری‌ها و ممانعت از انتقال الکترون از سلول‌های باکتری ممانعت می‌کند (44 و 45). مطابق نتایج (شکل‌های 7 و 8) در هر دو چگالی پالپ 5 و 50 درصد کاهش اولیۀ (Fe2⁺) در هر سه نمونه دیده می‌شود. کاهش آهستۀ (Fe2⁺) در نمونۀ شاهد منفی در هر دو چگالی پالپ. به‌علت اکسیداسیون هوایی آهن است که مطابق با زمان پیش رفته است؛ هرچند نوسانات اندکی داشته است. در نمونه‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV کاهش درخور توجه (Fe2⁺) در روز دوم دیده می‌شود که به‌علت اکسیداسیون این یون به یون فریک و نشانۀ پیشرفت روند فروشویی زیستی است اما در روزهای چهارم و ششم افزایش (Fe2⁺) مشاهده می‌شود. پس‌از روز دوم نیز به‌علت حملۀ باکتری به کان‌سنگ، مقدار اضافی یون‌های آهن استخراج‌‌شده به تشکیل رسوب ژاروسیت روی باقیماندۀ کان‌سنگ منجر می‌شوند و در نتیجه، اکسیداسیون (Fe2⁺) کاهش و مقدار (Fe2⁺) کمی افزایش می‌یابد. در روزهای هشتم، نهم و دهم کاهش (Fe2⁺) دیده می‌شود که نشانۀ پیشرفت روند فروشویی زیستی است. در روز سیزدهم، مقدار (Fe2⁺) در هر دو محیط حاوی باکتری قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV نسبت به شروع فرایند کاهش چشمگیری دارد (کاهش در حضور باکتری قرارگرفته در معرض UV 3635 واحد و در حضور باکتری قرارنگرفته در معرض UV 3449 واحد است) که نشان‌دهندۀ پیشرفت خوب فرایند فروشویی زیستی است. در چگالی پالپ 5 درصد، کاهش (Fe2⁺) در روزهای اول و دوم در هر دو نمونه زیاد است که نشان‌دهنده پیشرفت سریع‌تر روند فروشویی زیستی در چگالی پالپ کمتر نسبت به 50 درصد است. در نمونۀ قرارگرفته در معرض UV در روز دوم کاهش نهایی 34/3943 واحد مشاهده می‌شود که نسبت به نوع قرارنگرفته در معرض UV کاهش درخور توجه‌تری است..

.ارزیابی کلی تغییرات اسیدیته، Eh و (Fe2) طی فرایند فروشویی زیستی اورانیوم:فعالیت اکسیداسیون باکتری‌ها در سیستم‌های فروشویی زیستی در هر دو چگالی پالپ با افزایش مقدار Eh، کاهش آهن فروس و کاهش اسیدیته همراه است. همچنان‌که آهن فروس به آهن فریک اکسید می‌شود مقدار اسیدیته کاهش و مقدار Eh افزایش می‌یابد؛ افزایش مقدار Eh دلیلی بر فعالیت اکسیداسیون باکتری است. نتایج مطالعۀ حاضر نشان می‌دهند مقدار افزایش Eh در چگالی پالپ 50 درصد کمتر از افزایش در چگالی پالپ 5 درصد است. افزایش بیشتر Eh در چگالی پالپ 5 درصد نشان‌دهندۀ سرعت اکسیداسیون بیشتر در این سیستم است.

بررسی اثر UV روی فرایند فروشویی زیستی:در چند پژوهش‌ انجام‌شده مشخص شده است UV یک جهش‌زای فیزیکی است که در بهبود فرایند فروشویی زیستی عناصر مختلف نقش دارد. در پژوهش انگبو[xii] و همکاران (2011) مشخص شد تابش UV روی باکتری اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس LD-1 به‌مدت 30 دقیقه نسبت به 10، 60 و 120 دقیقه باعث بهترین بهبود در فرایند فروشویی زیستی مس می‌شود و در این شرایط، استخراج مس حدود 17 درصد افزایش می‌یابد؛ علاوه‌براین، آنها نشان دادند استفاده از باکتری‌های قرارگرفته در معرض UV زمان فروشویی را 6 تا 8 روز کم می‌کند (21). در پژوهش دیگری اثر UV روی دو گونۀ باکتریایی اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس GF[xiii]و اسیدیفیلوم کریپتوم DX1-1[xiv] و میزان بهبود فرایند فروشویی زیستی مس بررسی شد. اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس GF پس‌از جهش دارای ظرفیت اکسیدکنندگی آهن بیشتری نسبت به گونۀ اولیه شد و مشخص شد فروشویی زیستی در حضور مخلوط دو باکتری جهش‌یافته دارای بازدهی بیشتری نسبت به فروشویی زیستی در حضور مخلوط آنها پیش‌از جهش است (46)؛ بنابراین، نتایج دو پژوهش یادشده با نتایج مطالعۀ حاضر مطابقت دارند و هر سه نتیجه تأیید‌کنندۀ بهبود فرایند فروشویی زیستی توسط باکتری قرارگرفته در معرض تابشUV است. استفاده از UV روش مؤثری است که به‌طور مکرر برای ایجاد جهش استفاده می‌شود. بازهای پیریمیدین دارای قدرت جذب UV هستند و وقتی اشعۀ UV را جذب کنند تیمین‌های دوتایی همسایه در زنجیرۀ DNA تشکیل دایمر تیمین می‌‌دهند که باعث جهش‌ می‌شود (46)..

بررسی نتیجۀ الکتروفورز:ژن coxB با‌توجه‌به تعداد جفت بازهای آن بایستی در ناحیۀ 750 جفت باز ظاهر شود. طبق نتایج الکتروفورز (شکل 9) ظاهرشدن باندها در موقعیت تقریبی 720 جفت باز نشان‌دهندۀ درستی انجام PCR است. همچنین ظاهرشدن باندهای مربوط به ژن‌های coxBباکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در یک ناحیه نشان‌دهندۀ یکسانی و ایجادنشدن جهش در این ژن‌ها پس‌از تابش UV است.

 

 

شکل 9- ژل الکتروفورز محصولات PCR با آغازگر ویژه برای ژن coxBاستخراج‌شده از باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV در چگالی پالپ‌های 5 و 50 درصد

بررسی و مقایسۀ توالی ژن coxB باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV:مطابق نتیجۀ بلاست ژن CoxBنمونه‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV (شکل 10) بجز نواحی ابتدایی و انتهایی که درخور توجه نیستند در تمام نواحی به‌ویژه در ناحیه‌ای که انتظار می‌رود ناحیۀ احتمالی عملکردی باشد هیچ تغییری در توالی نمونۀ قرارگرفته در معرض UV نسبت به نمونۀ قرارنگرفته در معرض UV دیده نمی‌شود.

 

 

شکل 10- بلاست توالی ژن coxB باکتری‌های قرارگرفته و قرارنگرفته در معرض UV

 

طبق نتایج بلاست و تجزیه‌وتحلیل با نرم‌افزار بیوادیت مشخص شد UV هیچ اثر جهش‌زایی روی توالی ژن coxB نداشته است.

ژن coxB کدکنندۀ زیرواحد II CoxB سیتوکروم‌اکسیداز نوع aa3 است. سیتوکروم‌اکسیداز نوع aa3 پروتئین انتهایی زنجیرۀ انتقال الکترون باکتری اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس است که از چهار زیرواحد تشکیل شده است. پژوهش‌های انجام‌شده دربارۀ این پروتئین به‌علت موقعیت خاص و فرورفتن آن در غشا و مشکل دسترسی آسان به آن اندک بوده و این پروتئین تاکنون ازنظر ساختمانی و عملکردی به‌طور دقیق بررسی نشده است. سیتوکروم‌اکسیداز نوع aa3از باکتری اسیدی تیوباسیلوس فرواکسیدانس 23270 تخلیص جزئی شده (47) و مشخص شده است دارای فعالیت سولفیت‌اکسیدازی است (48).

 

نتیجه‌گیری کلی

1) میزان استخراج اورانیوم در چگالی پالپ 5 درصد نسبت به چگالی پالپ 50 درصد بیشتر بود. قراردادن باکتری اسیدی تیوباسیلوس سویۀ FJ2 در معرض UV سرعت فروشویی زیستی اورانیوم در چگالی پالپ 5 درصد را افزایش داد و میزان بازدهی فروشویی زیستی در چگالی پالپ 50 درصد را ابقا کرد.

2) در روش ارائه‌شده در مطالعۀ حاضر، اشعۀ UV هیچ‌گونه اثر جهش‌زایی روی توالی ژن coxB باکتری اسیدی تیوباسیلوس سویۀFJ2 نداشت.

3) سازوکارهای احتمالی تأثیر UV روی باکتری اسیدی تیوباسیلوس سویۀ FJ2 که به بهبود فرایند فروشویی زیستی اورانیوم در حضور این باکتری منجر می‌شوند عبارتند از:

- تأثیر UV روی باکتری از طریق تأثیر و ایجاد جهش در نواحی تنظیمی مربوط به ژن‌های کد‌کنندۀ پروتئین‌های دخیل در فرایند فروشویی زیستی در باکتری و تأثیر بر میزان بیان این ژن‌ها؛

– تأثیر اشعۀ UV بر ساختمان و عملکرد پروتئین‌های دخیل در فرایند فروشویی زیستی از طریق ایجاد جهش در mRNA مربوط به این پروتئین‌ها؛

- این احتمال وجود دارد که اشعۀ UV از طریق افزایش تعداد سلول‌های باکتریایی باعث بهبود فروشویی زیستی اورانیوم شود اما اثبات هریک از این پیشنهادهای یادشده نیازمند مطالعه‌های آتی است.



[1]- Acidithiobacillus

[2]- Inductively coupled plasma

[3]- Pal

[4]- Jaduguda

[5]- Fatemi

[6]- Jahani

[7]- Abdollahy

[8]- Abhilash

[9]- Pandey

[10]- Ginn

[11]- Jarosite

[xii]- Yingbo

[xiii]- Acidithiobacillus ferrooxidans GF

[xiv]- Acidiphilium cryptum DX1-1

(1)              Choi M-S., Cho K-S., Kim D-S., Ryu H-W. Bioleaching of uranium from low grade black schists by Acidithiobacillus ferrooxidans. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2005; 21(3): 377-380.
(2)              Torma AE. Biotechnology applied to mining of metals. Biotechnology Advances 1983; 1(1): 73-80.
(3)              Bosecker K. Microbial leaching in environmental clean-up programmes. Process Metallurgy 1999; 9: 533-536.
(4)              Bruynesteyn A. Mineral biotechnology. Journal of Biotechnology 1989; 11(1): 1-10.
(5)              Dwivedy K., Mathur A. Bioleaching- our experience. Hydrometallurgy 1995; 38(1): 99-109.
(6)              Bosecker K. Bioleaching: metal solubilization by microorganisms. FEMS Microbiology Reviews 1997; 20(3‐4): 591-604.
(7)              Willner J., Fornalczyk A. Extraction of metals from electronic waste by bacterial leaching. Environment Protection Engineering 2013; 39(1): 197-208.
(8)              Munoz J., Gonzalez F., Blazquez M., Ballester A. A study of the bioleaching of a Spanish uranium ore. Part I: A review of the bacterial leaching in the treatment of uranium ores. Hydrometallurgy 1995; 38(1): 39-57.
(9)              Munoz J., Ballester A., Gonzalez F., Blazquez M. A study of the bioleaching of a Spanish uranium ore. Part II: Orbital shaker experiments. Hydrometallurgy 1995; 38(1): 59-78.
(10)          Agate A. Recent advances in microbial mining. World Journal of Microbiology and Biotechnology 1996; 12(5): 487-495.
(11)          Vera M., Schippers A., Sand W. Progress in bioleaching: fundamentals and mechanisms of bacterial metal sulfide oxidation- part A. Applied Microbiology and Biotechnology 2013; 97(17): 7529-7541.
 
(12)          Johnson DB., Hallberg KB. The microbiology of acidic mine waters. Research in Microbiology 2003; 154(7): 466-473.
(13)          Baranska JA., Sadowski Z. Bioleaching of uranium minerals and biosynthesis of UO2 nanoparticles. Physicochemical Problems of Mineral Processing 2013; 49(1): 71-79.
(14)          Fatemi F., Rashidi A., Jahani S. Isolation and identification of native sulfuroxidizing bacterium capable of uranium extraction. Progress in Biological Sciences 2015; 5(2): 207-221.
(15)          Appia-Ayme C., Guiliani N., Ratouchniak J., Bonnefoy V. Characterization of an operon encoding two c-type cytochromes, an aa3-type cytochrome oxidase, and rusticyanin in thiobacillus ferrooxidansATCC 33020. Applied and Eenvironmental Microbiology 1999; 65(11): 4781-4787.
(16)          Yarzábal A., Brasseur G., Ratouchniak J., Lund K., Lemesle-Meunier D., DeMoss JA., et al. The high-molecular-weight cytochrome c Cyc2 of Acidithiobacillus ferrooxidans is an outer membrane protein. Journal of Bacteriology 2002; 184(1): 313-317.
(17)          Iwata S., Ostermeier C., Ludwig B., Michel H. Structure at 2.8 Å resolution of cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans. Nature 1995; 376: 660-669.
(18)          Lappalainen P., Watmough NJ., Greenwood C., Saraste M. Electron transfer between cytochrome c and the isolated CuA domain: identification of substrate-binding residues in cytochrome c oxidase. Biochemistry 1995; 34(17): 5824-5830.
(19)          Patra MC., Pradhan SK., Rath SN., Maharana J. Structural analysis of respirasomes in electron transfer pathway of Acidithiobacillus ferrooxidans: a computer-aided molecular designing study. ISRN Biophysics 2013; 2013: 1-14.
(20)          Xia L., Zeng J., Ding J., Yang Y., Zhang B., Liu J., et al. Comparison of three induced mutation methods for Acidiothiobacillus caldus in processing sphalerite. Minerals Engineering 2007; 20(14): 1323-1326.
(21)          Dong Y., Lin H., Wang H., Mo X., Fu K., Wen H. Effects of ultraviolet irradiation on bacteria mutation and bioleaching of low-grade copper tailings. Minerals Engineering 2011; 24(8): 870-875.
(22)          Fatemi F., Arabieh M., Jahani S. Application of response surface methodology to optimize uranium biological leaching at high pulp density. Radiochimica Acta 2016; 104(4): 239-246.
(23)          Zeng L., Huang J., Zhang Y., Qiu G., Tong J., Chen D., et al. An effective method of DNA extraction for bioleaching bacteria from acid mine drainage. Applied Microbiology and Biotechnology 2008; 79(5): 881.
(24)          Chen P., Xu R., Yan L., Wu Z., Wei Y., Zhao W., et al. Properties of realgar bioleaching using an extremely acidophilic bacterium and its antitumor mechanism as an anticancer agent. Biological Research 2017; 50(1): 17.
(25)          Khan S., Haq F., Hasan F., Saeed K., Ullah R. Growth and biochemical activities of Acidithiobacillus thiooxidans collected from black shale. Journal of Microbiology Research 2012; 2(4): 78-83.
(26)          Yuan X-w., Xie X-h., Fan F-x., Zhu W-x., Na L., Liu J-s. Effects of mutation on a new strain Leptospirillum ferriphilum YXW and bioleaching of gold ore. Transactions of Nonferrous Metals Society of China 2013; 23(9): 2751-2758.
(27)          Neely WB. Action of formaldehyde on microorganisms III. Bactericidal action of sublethal concentrations of formaldehyde on Aerobacter aerogenes. Journal of Bacteriology 1963; 86(3): 445-448.
(28)          Karamanev D., Nikolov L., Mamatarkova V. Rapid simultaneous quantitative determination of ferric and ferrous ions in drainage waters and similar solutions. Minerals Engineering 2002; 15(5): 341-346.
(29)          Pal S., Pradhan D., Das T., Sukla L., Chaudhury GR. Bioleaching of low-grade uranium ore using Acidithiobacillus ferrooxidans. Indian Journal of Microbiology 2010; 50(1): 70-75.
(30)          Fatemi F., Miri S., Jahani S. Effect of metal sulfide pulp density on gene expression of electron transporters in Acidithiobacillus sp. FJ2. Archives of Microbiology 2017; 199(4): 521-530.
(31)          Abdollahy M., Shojaosadati SA., Zare Tavakoli H., Valivand A. Bioleaching of low grade uranium ore of Saghand mine. Iranian Journal of Chemistry and Chemical Engineering (IJCCE) 2011; 30(4): 71-79.
(32)          Abhilash BD. Pandey. Role of ferric ions in bioleaching of uranium from low tenor Indian ore. Canadian Metallurgical Quarterly 2011; 50(2): 102-112.
(33)          Pradhan D., Kim DJ., Ahn JG., Lee SW. Microbial leaching process to recover valuable metals from spent petroleum catalyst using iron oxidizing bacteria. World Academy Science, Engineering Technology 2010; 38: 495-499.
(34)          Li H-M., Ke J-J. Influence of Cu2+ and Mg2+ on the growth and activity of Ni2+ adapted Thiobacillus ferrooxidans. Minerals Engineering 2001; 14(1): 113-116.
(35)          Ginn T., Sengor SS., Barua S., Moberly J., Peyton B. Metal toxicity effects on microbial growth and degradation. In: Slovenia and US Workshop on Environmental Science and Engineering. Ljubljana: Slovenia; 2006: 39-40
(36)          Rossi G. Biohydrometallurgy. New York: McGraw-Hill Companies; 1990.
(37)          Gomez E., Ballester A., Gonzalez F., Blazquez M. Leaching capacity of a new extremely thermophilic microorganism, Sulfolobus rivotincti. Hydrometallurgy 1999; 52(3): 349-366.
(38)          Yu R-l., Tan J-x., Gu G-h., Hu Y-h., Qiu G-z. Mechanism of bioleaching chalcopyrite by Acidithiobacillus ferrooxidans in agar-simulated extracellular polymeric substances media. Journal of Central South University of Technology 2010; 17(1): 56-61.
(39)          Liang G., Tang J., Liu W., Zhou Q. Optimizing mixed culture of two acidophiles to improve copper recovery from printed circuit boards (PCBs). Journal of Hazardous Materials 2013; 250: 238-245.
(40)          Umanskii AB., Klyushnikov AM. Bioleaching of low grade uranium ore containing pyrite using A. ferrooxidans and A. thiooxidans. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2013; 295(1): 151-156.
(41)          Abhilash BD. Pandey. Microbially assisted leaching of uranium- A review. Mineral Processing and Extractive Metallurgy Review 2013; 34(2): 81-113.
(42)          Cabral T., Ignatiadis I. Mechanistic study of the pyrite- solution interface during the oxidative bacterial dissolution of pyrite (FeS2) by using electrochemical techniques. International Journal of Mineral Processing 2001; 62(1-4): 41-64.
(43)          Tuovinen OH., Hsu JC. Effect of pH, iron concentration, and pulp density on the solubilization of uranium from ore material in chemical and microbiological acid leach solutions: Regression equation and confidence band analysis. Hydrometallurgy 1984; 12(2): 141-149.
(44)          Shafia F., Wilkinson RF. Growth of Ferrobacillus ferrooxidans on organic matter. Journal of Bacteriology 1969; 97(1): 256-260.
(45)          Fu K., Lin H., Luo D., Jiang W., Zeng P. Comparsion of bioleaching of copper sulphides by Acidithiobacillus ferrooxidans. African Journal of Biotechnology 2014; 13(5): 664-672.
(46)          Xu A-L., Xia J-L., Zhang S., Yu Y., Nie Z-Y., Qiu G-Z. Bioleaching of chalcopyrite by UV-induced mutagenized Acidiphilium cryptum and Acidithiobacillus ferrooxidans. Transactions of Nonferrous Metals Society of China 2010; 20(2): 315-321.
(47)          Taha TM., Kanao T., Takeuchi F., Sugio T. Reconstitution of iron oxidase from sulfur-grown Acidithiobacillus ferrooxidans. Applied and Environmental Microbiology 2008; 74(21): 6808-6810.
(48)          Sugio T., Ako A., Takeuchi F. Sulfite oxidation catalyzed by aa3-type cytochrome c oxidase in Acidithiobacillus ferrooxidans. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2010; 74(11): 2242-2247.