نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم، دانشگاه مراغه، مراغه، ایران.
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: L-Asparaginase catalyzes the hydrolysis of L-asparagine to L-aspartic acid and ammonia. This enzyme is used for the treatment of patients with acute lymphoblastic leukemia, melanosarcoma and lymphosarcoma. It is also used in the production of acrylamide-free foods. Considering the important applications of this enzyme, the aim of this study was to introduce a new microbial source for the production of eukaryotic L-asparaginase.
Materials and Methods: The quality and quantity production of L-asparaginase was investigated in four strains of yeast Yarrowia lipolytica. The quality assessment of L-asparaginase production was done on asparagine minimal agar. Quantitative assay of the enzyme was done in Czapex Dox’s medium by spectrophotometric method using Nessler’s reagent.
Results: All of four strains show that they are able to produce asparaginase making a purple halo around the colony. Y. lipolytica DSM3286, DSM70562, DSM3218 and CBS6303 were produced 17/14, 11, 6/98 and 5/61 U/mL of asparaginase in Czapex Dox’s medium after 24 h, respectively.
Discussion and Conclusion: Y. lipolytica DSM3286 was selected as the best asparaginase producer strain with the largest halo and the highest asparaginase production. The Y. lipolytica could be used as a potential source of L-asparaginase production.
کلیدواژهها [English]
مقدمه.
آنزیم ال- آسپاراژیناز (EC.3.5.1.1; asparagine amidohydrolase) تجزیۀ ال- آسپاراژین به ال- آسپاراتیکاسید و آمونیاک را تسریع میکند (1). آسپاراژیناز با ازبینبردن آسپاراژین موجود در خون باعث کاهش دسترسی سلولهای سرطانی به این آمینواسید میشود و در نتیجه، این سلولها در اثر ناتوانی در ساخت آسپاراژین دچار مرگ سلولی میشوند و از بین میروند (2). آسپاراژین آمینواسیدی غیرضروری برای بدن است که بهواسطۀ مسیرهای متابولیکی مرکزی در بدن انسان تولید میشود و به حضور آن در غذا نیازی نیست؛ برخلاف سلولهای طبیعی، سلولهای سرطانی بهعلت نداشتن فعالیت آسپاراژینسنتتازی قادر به سنتز ال- آسپاراژین نیستند. تزریق داخل وریدی آسپاراژیناز موجب کاهش منابع آسپاراژین در بدن میشود و سلولهای سرطانی را در شرایط فقر آسپاراژین قرار میدهد؛ بنابراین رشد آنها متوقف میشود و یا حتی مرگ آنها اتفاق میافتد. آسپاراژیناز یکی از مهمترین آنزیمهای درمانی ازنظر فناوری و زیستپزشکی است که در درمان انواع لوسمیها مانند لوسمی لنفوبلاستیک حاد، لنفوسارکوما، لنفومای هوچکین، لنفومای غیرهوچکین و ملانوسارکوما بهویژه در کودکان و نوجوانان به کار میرود (3).
آسپاراژیناز با ازبینبردن آکریلآمیدی که در اثر حرارت زیاد از آسپاراژین موجود در غذاهای نشاستهدار ایجاد میشود خطر ابتلا به سرطان را کاهش میدهد. آکریلآمید ترکیب بالقوه سرطانزایی است که چنانچه وارد بدن شود تجزیه میشود و گلاسیدآمید تولید میکند. گلاسیدآمید سبب ایجاد جهش در DNA سلول و بروز سرطان میشود. هنگامی که غذاهای نشاستهدار مانند غلات، سیبزمینی، نان، ذرت و پاستا در دمای بیشتر از 120 درجۀ سانتیگراد قرار گیرند و یا گریل شوند از آسپاراژین موجود در آنها آکریلآمید به وجود میآید؛ در نتیجه، استفاده از ال- آسپاراژیناز در صنایع غذایی و تولید مواد غذایی بدون آکریلآمید مفید خواهد بود (4 و 5). پژوهشگران در سال 1953 نشان دادند سرم خوکچۀ هندی دارای ویژگی ضدتوموری است (6) و سپس دریافتند ویژگی ضدتوموری سرم خوکچۀ هندی ناشی از آنزیم آسپاراژیناز است (7). در پژوهشهای بعدی مشخص شد آنزیم آسپاراژیناز خالصشده از باکتری اشریشیا کلی مشابه سرم خوکچۀ هندی دارای فعالیت ضدتوموری است. ایمادا و همکاران در سال 1973 ریزموجودات بسیاری را ازنظر وجود آنزیم آسپاراژیناز و گلوتامیناز بررسی کردند و وجود هر دو آنزیم را در تعدادی از باکتریها، قارچها و مخمرها نشان دادند (8).
هاریسون در سال 1928 برای نخستین بار مخمر یارروویا لیپولیتیکا را شناسایی کرد. بیشترین دمای رشد این مخمر 32 تا 34 درجۀ سانتیگراد است؛ ازاینرو برای انسان بیماریزا نیست و سازمان غذا و داروی امریکا (FDA) آن را ریزموجود ایمنی تأیید کرده است که کاربردهای بسیار متفاوتی در فناوری دارد (9 و 10). مخمر یارروویا لیپولیتیکا منابع مختلف کربن ازجمله هیدروکربنها، اسیدهای چرب، الکلها و استات را مصرف میکند و بهعلت چربیدوستبودن بهآسانی از منابع مختلف لیپیدی و هیدروکربنی جدا میشود. این مخمر بهعلت قابلیت تولید آنزیمها و متابولیتهای مختلف ازجمله سیتریکاسید، لیپازها و استرازها موردتوجه بسیاری از دانشمندان قرار گرفته است (11 و 12).
باتوجهبه اهمیت و کاربرد روزافزون آنزیم یادشده، نخستین گام برای تولید انبوه آسپاراژیناز یافتن ریزموجودات جدید با توان تولید زیاد و آثار سمیت سلولی کمتر است. از مخمر یارروویا لیپولیتیکا میتوان برای دستیابی به آسپاراژیناز جدید با منشأ یوکاریوتی و دارای آثار نامطلوب کمتر و همچنین مقرونبهصرفهکردن تولید آنزیم برای درمان بیماران مبتلا به سرطان استفاده کرد.
مواد و روشها
سویههای میکروبی:در پژوهش حاضر از چهار سویۀ استاندارد مخمر یارروویا لیپولیتیکا DSM 3286، CBS 6303، DSM 70562 و DSM 3218 استفاده شد که از مجموعۀ DSMZ آلمان تهیه شده بودند. از محیطکشت YPD حاوی 20 گرمدرلیتر گلوکز، 20 گرمدرلیتر پپتون، 10 گرمدرلیتر عصارۀ مخمر و 17 گرمدرلیتر آگار برای کشت این مخمر در دمای 29 درجه سانتیگراد بهشکل جامد و مایع استفاده شد و نمونه در دمای 4 درجۀ سانتیگراد نگهداری شد (13).
محیط سنجش کیفی تولید آسپاراژیناز: برای شناسایی مخمرهای تولیدکنندۀ آسپاراژیناز بر اساس روش سنجش سریع از محیط حداقل آسپاراژینآگار حاوی 1 درصد آسپاراژین، 05/0 درصد سولفاتمنیزیم، 05/0 درصد کلرایدپتاسیم، 02/0 درصد کلرایدسدیم، 012/0 درصد فنلرد (شناساگر اسیدیته) و 5/1 درصد آگار استفاده شد. مخمرهایی که قادر به تولید آنزیم باشند در محیط آمونیاک تولید میکنند، اسیدیته را تغییر میدهند و هالۀ ارغوانیرنگ اطراف کلنی ایجاد میکنند. قطر هالههای ایجادشده پساز 24 ساعت گرماگذاری در دمای 29 درجۀ سانتیگراد اندازهگیری شد (14).
آمادهسازی مایع تلقیح:فعالسازی سویهها با کشت روی محیط YPD انجام شد. پساز گرماگذاری بهمدت 24 ساعت در دمای 29 درجۀ سانتیگراد، یک کلنی (مایع تلقیح) به ارلن 100 میلیلیتری حاوی 20 میلیلیتر محیط YPDمایع بدون آگار انتقال داده شد. سپس ارلنها بهمدت 24 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 29 درجۀ سانتیگراد و سرعت چرخش 200 دوردردقیقه گرماگذاری شدند (15).
محیط سنجش تولید آسپاراژیناز: محیط سیزپکس داکس محیط تولید آنزیم آسپاراژیناز است که برای تولید آسپاراژیناز در ارلن استفاده شد. 50 میلیلیتر محیطکشت تولید حاوی 2 گرمدرلیتر گلوکز، 10 گرمدرلیتر آسپاراژین، 25/1 گرمدرلیتر فسفاتهیدروژندیپتاسیم، 52/0 گرمدرلیتر کلرایدپتاسیم، 03/0 گرمدرلیتر سولفاتآهن، 05/0 گرمدرلیتر سولفاتروی در ارلنهای 250 میلیلیتری تهیه شد. سپس در شرایط استریل، 1 درصد مایع تلقیح به محیط تولید منتقل شد و میزان رشد مخمرها پساز 24 ساعت گرماگذاری در دمای 29 درجۀ سانتیگراد بررسی شد. میزان تولید آسپاراژیناز به روش رنگسنجی بر پایۀ تغییر رنگ آمونیاک بر اساس روش ایمادا و با دستگاه اسپکتروفتومتر سنجیده شد (8 و 14).
اندازگیری رشد و فعالیت آنزیمی:لام نئوبار برای بررسی رشد و شمارش تعداد سلولهای مخمر استفاده شد. روش تیتراسیون برای سنجش فعالیت آسپاراژیناز به کار رفت. در مرحلۀ نخست، از محیطهای کشت مخمر نمونهبرداری شد و نمونهها بهمدت 15 دقیقه در 5000 دوردردقیقه سانتریفیوژ شدند. 5/0 میلیلیتر محلول رویی به لولههای آزمایش حاوی 5/0 میلیلیتر بافر تریس با اسیدیتۀ حدود 2/8، 5/0 میلیلیتر آب مقطر و 5/0 میلیلیتر ال- آسپاراژین اضافه و مخلوط شد و نمونهها بهمدت نیم ساعت در بنماری 37 درجۀ سانتیگراد قرار داده شد. پساز پایانیافتن زمان یادشده، 5/0 میلیلیتر تریکلرواستیکاسید (متوقفکنندۀ واکنش) به همۀ لولهها اضافه و با محتویات لوله مخلوط شد. برای هریک از نمونهها، 7/3 میلیلیتر آب مقطر، 1/0 میلیلیتر از محلول لولههای مرحلۀ اول و 2/0 میلیلیتر معرف نسلر در لولۀ آزمایش جداگانهای اضافه و مخلوط شد؛ میزان جذب نوری رنگ حاصل از فعالیت آنزیم آسپاراژیناز موجود در نمونهها پساز 15 دقیقه در طول موج 450 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد. لولۀ جداگانهای حاوی محلولهای مرحلۀ اول و دوم که در آن بهجای محلول رویی حاوی آنزیم از آب مقطر استفاده شده بود شاهد در نظر گرفته شد. میزان فعالیت آنزیم آسپاراژیناز بر حسب واحددرمیلیلیتر طبق این تعریف گزارش شد که یک واحد فعالیت آنزیم مقدار آنزیمی است که در مدت 1 دقیقه در دمای 37 درجۀ سانتیگراد و اسیدیتۀ حدود 8، 1 میکرومول آمونیاک در محیط آزاد کند (8).
نتایج.
سویههای مخمر یارروویا لیپولیتیکا در محیطکشت حداقل آسپاراژینآگار کشت و 24 ساعت در دمای 29 درجۀ سانتیگراد گرماگذاری شدند. با تولید آسپاراژیناز خارجسلولی توسط مخمر، آسپاراژین موجود در محیط به آسپاراتیکاسید و آمونیاک تجزیه و محیط قلیایی میشود. محیطکشت یادشده دارای معرف فنلرد (شناساگر اسیدیته) است که در شرایط قلیایی رنگ ارغوانی تا صورتی ایجاد میکند؛ در نتیجه همانطور که در شکل 1 مشاهده میشود همۀ سویهها هالۀ صورتی نشاندهندۀ تولید آنزیم آسپاراژیناز را ایجاد میکنند. نسبت قطر هالۀ تولید آنزیم به قطر کلنی سویۀ DSM 3286 بیشترین میزان را داشت.
شکل 1- تغییر رنگ محیطکشت حداقل آسپاراژینآگار حاوی معرف فنلرد در اثر تولید آنزیم خارجسلولی آسپاراژیناز توسط سویههای مختلف مخمر یارروویا لیپولیتیکا پساز 24 ساعت. نسبت قطر هالۀ تولید آنزیم به قطر کلنی سویهها بهترتیب میزان نسبت عبارتست از: DSM 3286، DSM 70562، DSM 3218 و 6303 CBS.
.پساز انتقال 1 درصد مایع تلقیح به 50 میلیلیتر محیطکشت سیزپکس داکس در ارلن 250 میلیلیتری، نمونه در انکوباتور شیکردار با سرعت چرخش 200 دوردردقیقه و دمای 29 درجۀ سانتیگراد قرار گرفت. نمونهگیری 24، 48، 72 و 96 ساعت پساز تلقیح انجام و میزان رشد سلولهای مخمری و مقدار تولید آسپاراژیناز سنجیده شد. همانطورکه در شکل 2 مشاهده میشود پساز 24 ساعت، سویههای DSM3286، DSM70562، DSM3218 و CBS6303 بهترتیب 14/17، 11، 98/6 و 61/5 واحددرمیلیلیتر آسپاراژیناز تولید کردند. سویۀ DSM 3286 با بیشترین تولید آنزیم آسپاراژیناز سویۀ برتر تولیدکنندۀ آسپاراژیناز انتخاب شد.
میزان رشد چهار سویه در محیط تولید در زمان تلقیح و 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از تلقیح اندازهگیری شد (شکل 3) و سویهها رشد تقریباً مشابهی داشتند.
شکل 2- تولید آسپاراژیناز توسط سویههایDSM 3286، DSM 70562، DSM 3218 و 6303 CBS مخمر یارروویا لیپولیتیکا در محیط تولید سیزپکس داکس
شکل 3- منحنی رشد سویههای DSM 3286، DSM 70562، DSM 3218 و 6303 CBS مخمر یارروویا لیپولیتیکا در محیط تولید سیزپکس داکس
بحث و نتیجهگیری.
ال- آسپاراژیناز آنزیمی است که برای درمان انواع سرطانها و کاهش غلظت آکریلآمید در صنایع غذایی به کار میرود. اگرچه این آنزیم در مقایسه با سایر داروهای استفادهشده در شیمیدرمانی سازگاری بسیار زیادی با بافت و سازوکارهای حیاتی بدن دارد ممکن است مانند هر داروی دیگری آثار جانبی نامطلوبی نشان دهد؛ ازاینرو، پژوهشگران در تلاش برای دستیابی به آسپاراژیناز دارای توان درمانی زیاد و عوارض جانبی کم و تولید ارزان و مقرونبهصرفۀ آن هستند. جستجو برای یافتن آنزیم ال- آسپاراژیناز مناسب دارای اهمیت است و پژوهشگران بسیاری تولید آنزیم ال- آسپاراژیناز از ریزموجودات مختلف راگزارش کردهاند (16).
سونیامبی و همکاران طی پژوهشی در سال 2011 فعالیت ضدسرطانی آسپاراژیناز در پنیسیلیوم را بررسی کردند. در پژوهش یادشده، 22 گونه از این ریزموجود انتخاب شد و بیشترین میزان تولید آنزیم پساز 96 ساعت گرماگذاری در دمای 30 درجۀ سانتیگراد با میزان 50 درصد رطوبت برابر 12 واحد در میلی لیتر به دست آمد (17)..
در پژوهشی، چهار سویه باکتری اشریشیا کلی شامل TOPTEN، K12، LAB و DH5 برای تولید آنزیم آسپاراژیناز بررسی شدند. پساز اندازهگیری فعالیت این آنزیم به روش رنگسنجی آمونیاک، نتایج نشان دادند همۀ سویهها بهغیراز TOPTEN آسپاراژیناز تولید میکنند و میزان فعالیت آنزیم 6/3 واحددرمیلیلیتر است (18).
در پژوهش حاضر از مخمر یارروویا لیپولیتیکا بهعنوان سویهای با پتانسیل زیاد برای تولید آسپاراژیناز استفاده شد؛ به این منظور، چند سویه مخمر یارروویا لیپولیتیکا استاندارد بهعنوان ریزموجود تولیدکنندۀ این آنزیم بررسی شدند. باتوجهبه نتایج مطالعههای پیشین، تولید آسپاراژیناز با مقدار 14/17 واحددرمیلیلیتر توسط سویۀ DSM 3286 مخمر یارروویا لیپولیتیکا پذیرفتنی است. این نخستین گزارش در زمینۀ تولید آسپاراژیناز توسط مخمر یارروویا لیپولیتیکا است. باتوجهبه اهمیت و کاربرد آسپاراژیناز یوکاریوتی با آثار جانبی کمتر در صنایع دارویی و غذایی، امکان استفاده از نتایج پژوهش حاضر برای گسترشدادن و مقرونبهصرفهکردن تولید آنزیم آسپاراژیناز در داخل کشور وجود دارد.
)