نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجو-گروه ژنتیک- دانشکده علوم-دانشگاه شهرکرد-شهرکرد-ایران
2 دانشیار ژنتیک، گروه ژنتیک-دانشکده علوم، دانشگاه شهرکرد، شهرکرد-ایران
3 استاد میکروبیولوژی دامپزشکی-گروه پاتوبیولوژی-دانشکده دامپزشکی -دانشگاه شهرکرد-شهرکرد-ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Replication and recombination are two fundamental cellular processes. GyrB and RecF are two proteins that are involved in these processes, respectively. GyrB is a subunit of DNA gyrase, the enzyme maintains negative supercoil in genomic DNA. RecF helps to load RecA in a single-strand gap, which is then repaired by RecA. Genes encoding these proteins are located in the same operon. Besides the general promoter, which is used in logarithmic phase, RecF has its own promoter, which is activated in stationary phase. The aims of this study were to investigate the expression of these genes and to estimate the pattern of RecF expression in the presence of ciprofloxacin.
Materials and Methods: RNAs of the cells were first extracted in logarithmic phase and after cDNA synthesis, the relative expression of these genes was determined in the E. coli mutant with low resistance to ciprofloxacin by Real-Time PCR.
Results: Results showed that both genes are overexpressed similarly in the mutant cell treated with a low amount of ciprofloxacin in the exponential phase of growth.
Conclusion: The present work revealed that the variety and the number of the Cyanobacteria in this desert area are dependent on different parameters such as weather, humidity, source of nutrients, the amount of light absorbed by the surface and the temperature. The results of molecular identification validated the results of morphological tests.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
کینولون‌ها و فلوروکینولون‌ها کلاس نسبتاً جدیدی از آنتی‌بیوتیک‌های مصنوعی با فعالیت ضد‌‌باکتریایی قوی و طیف اثر گسترده در برابر بسیاری از بیماری‌زاهای مهم هستند (1). سیپروفلوکساسین یکی از موفق‌ترین و گسترده‌ترین فلوروکینولون‌های استفاده‌شده است (2). این گروه از آنتی‌بیوتیک‌ها مانع فعالیت DNAجیراز در باکتری‌های گرم منفی نظیر اشریشیا کلی می‌شوند (3)؛ برای این منظور به آنزیم جیراز متصل به DNA که کمپلکس قابل‌شکست نامیده می‌شود (به‌علت وجود شکست در دو رشته) وصل می‌شوند و کمپلکس سه‌تایی ایجاد می‌کنند که مانع ادامۀ رونویسی و همانندسازی DNA باکتری می‌شود. جداشدن آنزیم از کمپلکس باعث آزادشدن شکست دورشته‌ای می‌شود که چنانچه با فرایند نوترکیبی وابسته به RecB ترمیم نشود سبب مرگ سلول می‌شود؛ ازاین‌رو، RecB پروتئینی حیاتی برای سلول تیمارشده با سیپروفلوکساسین محسوب می‌شود (4). پژوهش‌های پیشین فعال‌شدن سیستم SOS در پی تیمار با سیپروفلوکساسین را نشان میدهند (4 و 5). علاوه‌بر RecB، پروتئین RecF نیز در فعال‌شدن این سیستم نقش دارد. ازآنجاکه مطالعه‌های مبتنی بر تجزیه‌وتحلیل جهش و ایجاد جهش در ژن recFنتایج متناقضی دربارۀ اهمیت RecF ارائه میدهند (4)، بررسی بیان این ژن در سلول‌های تیمارشده با سیپروفلوکساسین اطلاعات بیشتری در این زمینه فراهم می‌کند.
RecF به بارگیری RecA در شکاف تک‌رشته کمک می‌کند (6) و باعث تثبیت فیلامنت RecA-DNA پس‌از تشکیل می‌شود. فیلامنت RecA-RecF ممکن است در مکان چنگال همانندسازی متوقف‌شده تشکیل شود و با شروع جفت‌شدن در شکاف تک‌رشته مانع شروع دوبارۀ همانندسازی و ترمیم شکست شود (7).
recF در یک اپرون ژنی قرار دارد که در متابولیسم DNA شرکت می‌کند. ژنهای این اپرون بجز recF عبارتند از: dnaA کدکنندۀ پروتئین متصل‌شونده به DNA و لازم برای شروع همانندسازی DNA مبدأ کروموزومی (8)؛ dnaN کدکنندۀ زیرواحد β و فاکتور پردازشی DNAپلیمراز III (9)؛ gyrB کدکنندۀ زیرواحد B در DNA gyrase (10). چهار ژن یادشده در یک جهت (از dnaA به gyrB) باهم رونویسی می‌شوند. مناطق بین‌ژنی dnaA-dnaN و recF-gyrB به‌ترتیب 4 و 30 باز دارند و dnaN و recF در یک باز مشترک هستند. ناحیۀ پروموتر recF حدود 600 جفت باز بالادست از کدون آغاز ژن ساختاری recF در وسط ژن ساختاری dnaN قرار دارد. توالی‌هایی که در بالادست پروموترهای recF قرار دارند برای بیان مطلوب ژن recF ضروری هستند (9 و 11).
در سلول‌های در حال رشد در فاز نمایی، dnaN و recF عمدتاً برای شروع رونویسی از پروموتر اصلی اپرون شروع به رونویسی می‌کنند. پژوهش‌ها نشان میدهند فعالیت رونویسی منطقۀ پروموتری recF در dnaN طی گذر از فاز نمایی به فاز ثابت رشد افزایش می‌یابد (12). تیمار با سیپروفلوکساسین ممکن است شرایط تنشی مشابه با فاز رکود ایجاد کند. مطالعه‌های پیشین که در زمینۀ سویه‌های پرسیستر و فاز رکود انجام شده‌اند اهمیت حضور RecF را در این سویه‌ها نشان میدهند و مشاهده شده است RecF برای بقای باکتری در رویارویی با آنتی‌بیوتیک ضروری است. پرسیستر سویه‌هایی هستند که در حضور فلوروکینولون قادر به ادامۀ بقا بدون ایجاد مقاومت ژنتیکی هستند. هدف پژوهش حاضر بررسی بیان ژنهای recF و gyrB در سویۀ باکتری اشریشیا کلی دارای مقاومت کم به سیپروفلوکساسین در فاز نمایی و مقایسۀ میزان بیان دو ژن به‌منظور تعیین احتمالی الگوی بیان ژن recF است.
مواد و روش‌ها
ویژگی‌های ژنتیکی و فنوتیپی جهش‌یافته و تیپ وحشی باکتری اشریشیا کلی در جدول 1 دیده می‌شوند (13).
جدول 1- ویژگی‌های سویه‌ها
|
نام سویه |
ویژگی‌های ژنتیکی/فنوتیپی |
|
MG1655 |
تیپ وحشی/ حساس به سیپروفلوکساسین |
|
SM1 |
F- ʎ- dinI:km /جهش‌یافته با مقاومت کم به سیپروفلوکساسین |
به‌منظور طراحی پرایمرها ابتدا توالی ژن recF از سامانۀ NCBI دریافت شد؛ سپس پرایمر recF با نرم‌افزار الیگو[1] و به کمک سامانۀ یادشده طراحی شد. آغازگر gyrB در مطالعه‌های پیشین طراحی شده بود (14). ویژگی‌های تمام پرایمرهای استفاده‌شده در پژوهش حاضر در جدول 2 آمده است.
جدول 2- آغازگرهای استفاده‌شده
|
نوع آغازگر |
توالی |
اندازۀ محصول (جفت باز) |
|
recF F |
5´-TAT GGC TGA TAC CTG TAA GC-3´ |
169 |
|
recF R |
5´-AAT GCG TAA GTC CGC TTT GT-3´ |
|
|
gyrB F |
5´-GAAATTATCGTCACCATTCACGC-3´ |
278 |
|
gyrB R |
5´-GTACACCGTGTTCGTAGATCT-3´ |
ابتدا از جهش‌یافته‌ها روی محیط‌کشت Luria Bertoni (LB)آگار کشت تازه تهیه شد و سپس از محیط LBمایع حاوی آنتی‌بیوتیک سیپروفلوکساسین و محیط LBمایع بدون آنتی‌بیوتیک برای کشت باکتری تیپ وحشی استفاده شد؛ به این منظور، یک کلنی تک از سویه‌های تازه‌کشت‌شده برداشته و در محیط LB مایع تلقیح شد و سپس به‌مدت یک شب در گرمخانۀ 37 درجۀ سانتی‌گراد نگهداری شد؛ سپس از این کشت مایع تازه برای تلقیح به محیط LB مایع استفاده شد و پس‌از سپری‌شدن مدت زمان لازم، جذب نوری نمونه‌ها در طول موج 650 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری شد که تقریباً برابر 4/0 بود. برای کالیبره‌کردن دستگاه اسپکتروفتومتر باید محلول شاهد یا استاندارد تهیه می‌شد که در اینجا از محلول LB مایع بدون باکتری استفاده شد. پس‌از بررسی رسیدن باکتری به فاز نمایی از طریق اندازه‌گیری جذب نوری نمونۀ باکتری، نمونه‌ها برای استخراج RNA استفاده شدند و استخراج RNA با استفاده از کیت استخراج RNA (کیاژن، امریکا) انجام شد. تیمار DNase با استفاده از کیت فرمنتاس (DNaseI RNase-free، فنلاند) روی نمونه‌های RNA به‌منظور حذف DNA انجام شد (13). برای اطمینان‌یافتن از اینکه نمونه‌های تیمارشده با DNase بدون DNA هستند، واکنش PCR با دمای اتصال آغازگر 50 درجۀ سانتی‌گراد برای هریک از نمونه‌ها انجام شد و باندی مشاهده نشد. پس‌از اطمینان‌یافتن از نبودآلودگی DNA در نمونه‌های RNA، جذب نوری و غلظت RNA و میزان خلوص آن در هریک از نمونه‌ها با دستگاه اسپکتروفتومتر UV/Visible (بیوکروم انگلستان) اندازه‌گیری شد. برای سنتز cDNA از کیت یکتاتجهیز (RevertAid™ Reverse Transcriptase، آلمان) استفاده شد و تمام مراحل کار طبق راهنمای کیت انجام شد. جذب نوری و غلظت cDNA و میزان خلوص آن در هریک از نمونه‌ها با دستگاه اسپکتروفتومتر UV/Visible سنجیده شد و سپس PCR برای نمونۀ cDNA در شرایط دمایی بهینه برای ژنهای recF و gyrB انجام شد تا با مشاهده و بررسی باند اختصاصی حاصل از تکثیر cDNA روی ژل آگارز، درستی سنتز cDNA تأیید و از مطلوب‌بودن شرایط دمایی برای به‌کار‌بردن آن در واکنش Real Time PCR اطمینان حاصل شود (شرایط دمایی بهینه در جدول 3 آورده شده است). دمای اتصال آغازگرهای recF و gyrB به‌ترتیب 50 و 56 درجۀ سانتی‌گراد بود؛ سپس واکنش Real Time PCR برای نمونه‌ها انجام شد (شرایط دمایی بهینه برای Real Time PCR ژن‌ها در جدول 4 آمده است). نتایج حاصل برای بیان ژن‌ها با استفاده از آزمون تی جفت (T student) و به کمک نرم‌افزارهای SPSS نسخۀ 16 و Excel بررسی شدند.
جدول 3- شرایط دماییPCR ژن‌ها
|
مرحله |
درجه‌حرارت (سانتی‌گراد) |
مدت زمان (دقیقه، ثانیه) |
چرخه |
|
واسرشت اولیه |
95 |
3 دقیقه |
1 چرخه |
|
واسرشت |
95 |
45 ثانیه |
35 چرخه |
|
اتصال پرایمر |
50 و 56 |
30 ثانیه |
35 چرخه |
|
طویل‌شدن |
72 |
30 ثانیه |
35 چرخه |
|
طویل‌شدن نهایی |
72 |
3 دقیقه |
1 چرخه |
جدول 4- شرایط دمایی Real Time PCR برای ژن‌ها
|
مرحله |
درجه‌حرارت (سانتی‌گراد) |
مدت زمان (دقیقه، ثانیه) |
چرخه |
|
واسرشت اولیه |
95 |
3 دقیقه |
1 چرخه |
|
واسرشت |
95 |
10 ثانیه |
40 چرخه |
|
اتصال پرایمر |
50 و 56 |
20 ثانیه |
40 چرخه |
|
طویل‌شدن |
72 |
30 ثانیه |
40 چرخه |
|
ذوب |
72 تا 95 |
برای هر چرخه 5 ثانیه |
- |
نتایج
برای تعیین کیفیت و کمیت RNA استخراج‌شده و اطمینان از آلودهنبودن نمونه‌ها به DNA از روش PCR استفاده شد. نتیجۀ ژل الکتروفورز محصول PCR (ژن recF) نمونه‌های RNA تیمارشده با DNase برای کسب اطمینان از آلودهنبودن به DNA ژنومی در شکل 1 ارائه شده است. در نمونه‌های RNA تیمارشده با DNase هیچ باندی رویت نشد که نشان‌دهندۀ آلودهنبودن نمونه‌ها به DNA ژنومی است.
|
recF gyrB M |
شکل 1- ژل الکتروفورز بررسی آلودهنبودن RNA استخراج‌شده به DNA
تعیین غلظت RNA نمونه‌ها به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر روشی دقیق و کمّی برای ارزیابی RNA استخراج‌شده است. جذب نوری و غلظت RNA استخراج‌شده بر حسب میکروگرم بر میکرولیتر و با دستگاه اسپکتوفتونتر UV/Visible در طول موج 260 نانومتر اندازه‌گیری شد. کیفیت RNA استخراج‌شده برای همۀ نمونه‌ها مطلوب و درصد خلوص زیاد بود. مقادیر A260/A280 مناسب و از 85/1 تا 2/2 بود؛ این نسبت برای نمونۀ SM1 برابر 15/2 بود. حجم نمونۀ RNA لازم برای سنتز cDNA باتوجهبه غلظت RNA در هر نمونه مشخص شد.
پس‌از سنتز cDNA با استفاده از کیت RevertAid™Reverse Transcriptase، واکنش PCR به‌منظور اطمینان‌یافتن از سنتز cDNA برای ژنهای موردبررسی تمام نمونه‌ها انجام شد؛ برای نمونه، cDNA نمونۀ SM1 که با آغازگرهای recF تکثیر شده بود در شکل 2 ارائه شده است. باتوجهبه نتیجۀ PCR و شدت باند به‌شکل کیفی از سنتز cDNA اطمینان حاصل شد. نتیجۀ ژل الکتروفورز محصول PCR نمونه‌های cDNA با آغازگر recF روی ژل آگارز 1 درصد در شکل 2 مشخص شده است.
ارزیابی کمّی تغییرات بیان ژنهای recF و gyrB در سویۀ تیپ وحشی و نمونۀ جهش‌یافته به روش Real Time PCR انجام شد. پس‌از تنظیم و بهینه‌کردن شرایط، منحنی تکثیر نمونه‌ها بررسی شد که افزایش سیگنالهای فلورسنس ساطع‌شده از رنگ سایبرگرین را حین پیشروی چرخه‌های واکنش مشخص می‌کند و با ترسیم خط آستانه، چرخۀ آستانه برای هریک از نمونه‌ها محاسبه می‌شود. منحنی تکثیر ژنهای recF و gyrB به‌ترتیب در شکل‌های 3 و 4 نشان داده شده است. نقطۀ ذوب ژن‌ها نیز اندازه‌گیری شد که برای ژنهای recF و gyrB به‌ترتیب 87 و 90 درجۀ سانتی‌گراد بود.
باتوجهبه نتایج نمودار‌ها و تجزیه‌وتحلیل‌های انجام‌شده روی منحنی استاندارد و Ct واکنش Real Time PCR نمونۀ تیپ وحشی و جهش‌یافته، سنجش نسبی بیان ژن‌ها به روش فافل (pfaffl) انجام شد. میزان بیان ژن‌ها در سویه‌ها در جدول 5 ارائه شده است که میانگین سه بار تکرار آزمایش با میزان خطای 5 درصد است. کارایی هر واکنش بین 9/0 تا 1/1 بود. مقایسۀ بیان ژن‌ها در هریک از نمونه‌ها نسبت به تیپ وحشی با نرم‌افزارهای SPSS نسخۀ 16 و اکسل نشان داد میزان بیان این ژن‌ها در نمونۀ جهش‌یافته نسبت به سویۀ وحشی تفاوت معنا‌داری دارد (P<0.05). بیان بیشتر از 2 بیش‌بیان در نظر گرفته شد.
|
M recF |
|
169 bp |
|
250 bp |
شکل 2- تجزیه‌وتحلیل cDNA سنتز‌شده با نشانگر 1 کیلوباز
شکل 3- منحنی تکثیر ژن recF
شکل 4- منحنی تکثیر ژن gyrB
جدول 5- بیان نسبی ژنهای recFو gyrB
|
سویه |
بیان نسبی recF |
Pمقدار |
بیان نسبی gyrB |
P مقدار |
|
تیپ وحشی |
1 |
|
1 |
|
|
SM1 |
3/2 |
007/0 |
5/2 |
01/0 |
بحث و نتیجه‌گیری.
همان‌طورکه گفته شد حضور RecF برای بقای باکتری در رویارویی با آنتی‌بیوتیک در سویه‌های پرسیستر ضروری است (7). هنگام تیمار با سیپروفلوکساسین، RecF به بارگیری RecA در شکاف تک‌رشته کمک می‌کند و باعث تثبیت فیلامنت RecA-DNA می‌شود (6 و 7). ژن recF در یک اپرون قرار دارد که شامل چهار ژن dnaA، dnaN، gyrB و recF است که در یک جهت رونویسی می‌شوند (9 و 11).. بیان ژن recF باعث تولید پروتئین RecF و ژن gyrB منجر به تولید زیرواحد B پروتئین DNAجیراز می‌شود؛ همچنین recF یک منطقۀ پروموتری مربوط به خودش دارد که در وسط ژن dnaN قرار دارد و recF و gyrB در فاز نمایی از پروموتر dnaA رونویسی می‌شوند (11).
در پژوهش حاضر، بررسی بیان ژن recF در سویۀ جهش‌یافتۀ SM1 در مقایسه با سویۀ وحشی MG1655 به روش Real Time PCR از طریق سنجش بیان نسبی انجام شد. نمونۀ جهش‌یافته دارای مقاومت کم به آنتی‌بیوتیک سیپروفلوکساسین بود (14).
یافته‌های پژوهش اختلاف معنادار بیان ژن recF را در نمونۀ دارای مقاومت کم به آنتی‌بیوتیک سیپروفلوکساسین و تیپ وحشی نشان دادند و مشاهده شد این ژن در سویۀ دارای مقاومت کم به سیپروفلوکساسین افزایش بیان دو برابری نسبت به تیپ وحشی دارد. همچنین یافته‌های پژوهش نشان دادند ژن gyrB دارای افزایش بیان تا حد زیادی به‌اندازۀ recF است (P<0.05) و نتیجه گرفته می‌شود احتمالاً recF در رشد نمایی در حضور سیپروفلوکساسین از طریق پروموتر اصلی اپرون بیان می‌شود و از پروموتر اختصاصی خود استفاده نمی‌کند. به نظر می‌رسد در تیمار با آنتی‌بیوتیک شرایط مشابه با فاز رکود ایجاد نمی‌شود و باکتری به‌شکل پرسیستر تبدیل نمی‌شود؛ شاید این میزان آنتی‌بیوتیک باکتری را به این مرحله نرساند و شاید مقدار آنتی‌بیوتیک بیشتر شرایط متفاوتی ایجاد کند؛ هرچند مقاومت به سیپروفلوکساسین در مقدار کم دیده شد و در نتیجه امکان استفاده از مقادیر بیشتر آنتی‌بیوتیک وجود نداشت.
سپاسگزاری
از دانشگاه شهرکرد برای حمایت مالی از پژوهش حاضر تشکر و قدردانی می‌شود.
)