نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناسی ارشد ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران
2 استادیار میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران
3 استادیار ژنتیک، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی، تهران، ایران
4 دانشیار میکروبیولوژی، دانشکده علوم، دانشگاه تهران، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Pectinase or pectinolytic enzymes are complex enzymes which include pectin methyl esterase (EC.3.1.1.11), pectin lyase (EC.4.2.2.2) and polygalacturonase (EC.3.3.1.15) which degrade pectin in the cell wall of plant cells. These enzymes have many industrial applications that some of them are active in extreme condition regarding to temperature, pH and salt concentration. In this study, the bacteria with an ability to produce pectinase enzyme in salty condition were identified and the corresponding gene was analyzed.
Materials and methods: Strains from Urmia, Inche boron and Gomeshan Ponds were inoculated in the media containing pectin precursors. By analyzing the clear zones around the colonies based on I2/KI indicator, the positive strains were selected. Quantification of enzyme activity on all three types of pectinase was carried out by spectrophotometry. In order to molecularly screen the bacterium contained pectinase gene, the bacterium genome was amplified using appropriate primers.
Results: Seventeen positive strains for pectinase (10 from Gomeshan Lake, 6 from Inche Boron Lake and 1 from where Urmia Lake) were identified among 130 studied samples. According to size of clear zone of enzyme activity in the qualitative test, activity level of all three pectinase enzymes in R2S25 strain of Inche Boron Lake was measured and the growth curve was obtained. Molecular study showed that all strains contain desired gene segment.
Discussion and conclusion: Quantitative evaluation showed that production and activity of pectinase enzyme in R2S25 strain increased simultaneously with increasing the growth of selected strain in logarithmic phase. Molecular study also showed that the genuses of Martelella, Aeromocrobium, Planococcus, Marinobacter, Virgibacillus, Kocuria and Micrococcus contain the pectinase gene.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
پکتین و دیگر ترکیبات پکتینی، پلیساکاریدهای پیچیدهای هستند که در ساختار و بافتهای گیاهی و بهویژه دیواره میانی سلولهای گیاهی توزیع شدهاند. واحد اصلی پیشماده پکتینی، گالاکتورونان و α دیگالاکتورونیکاسید است (1). این ماده بر اساس میزان استریشدن پیشماده پکتیک به چهار گروه پروتوپکتیک، پکتیکاسید، پکتین و پلیگالاکتورونیکاسید تقسیم میشود (2). عواملی مانند اندازه مولکولی، درجه استریشدن و تعداد باقیماندههای گالاکتورونیکاسید عوامل مهمی در تعیین میزان تنوع پیشماده پکتیک هستند و تنوع پیشمادههای پکتینی موجود در سلولهای گیاهی سبب تنوع آنزیمهای پکتینازی شده است (3). دستهبندی این آنزیمها بر اساس نوع پیشماده و نحوه عملکرد آنهاست. کمپلکس آنزیمی پکتیناز عامل بازیافت کربن در طبیعت است که ابتدا پیشماده پکتینی را به گالاکتورونات اشباع و غیراشباع تجزیه و سپس مواد حاصل را به 5-کتو4-دِاُکسیاورونات تبدیل و درنهایت به پیروات و 3-فسفو گلیسرآلدئید تبدیل میکند. پکتینازها، نقش اساسی را در شکستن پکتین طی مراحل نهایی رسیدن میوهها بازی میکنند (4).
پلیمتیلگالاکتوروناز، پلیگالاکتوروناز و پکتینلیاز، پلیگالاکتورونازلیاز و پکتینمتیلاستراز، پکتینازهای مهم صنعتی هستند. با توجه به اینکه آنزیم پکتیناز کاربردهای صنعتی بسیاری دارد (5) و بسیاری از این فرآیندهای صنعتی در شرایط حاد مانند میزان زیاد نمک، دماهای غیرمعمول و یا اسیدیتههایی با محدودههای متغیر انجام میشوند و همچنین از آنجا که باکتریهای ساکن محیطهای شور آنزیمهایی با ویژگیهای نوین تولید میکنند، مطالعه روی این باکتریها برای یافتن آنزیمهایی با کاربردهای صنعتی مناسب به نظر میرسد (6).
در پژوهش حاضر، حضور آنزیم پکتیناز در سویههای نمکدوست جداشده از سه دریاچه نمکی ایران به روش سنجش کمی آنزیم و غربالگری مولکولی ژن پکتاتلیاز انجام شد.
مواد و روشها
مواد: پکتین سیب از شرکت سیگما آلدریچ[1] (آمریکا) و سایر مواد از شرکت مرک[2] آلمان تهیه شدند.
سویهها و محیطکشت: سویههای نمکدوست جداشده از سه دریاچه نمکی ایران به نامهای اینچهبرون (40 سویه)، ارومیه (25 سویه) و گمیشان (65 سویه) روی محیط نمکدوست نسبی[3] شامل 40 گرم بر لیتر کلریدکلسیم، 3 گرم بر لیتر کلریدمنیزیم، 5 گرم بر لیتر سولفاتمنیزیم، 5/0 گرم بر لیتر کلریدکلسیم، 5/0 گرم بر لیتر کلریدپتاسیم،02/0 گرم بر لیتر بیکربنات سدیم، 5 گرم بر لیتر عصاره مخمر، 5 گرم بر لیتر پپتون گوشت، 1 گرم بر لیتر گلوکز و 15 گرم بر لیتر آگار کشت شدند (7).
سنجش فعالیت پکتیناز خارجسلولی: سنجش فعالیت پکتینازی روی پلیت با محیطکشت سنجش کیفی این آنزیم شامل 10 گرم بر لیتر پکتین، 4/1 گرم بر لیتر آمونیومسولفات، 2 گرم بر لیتر دیپتاسیمفسفات، 02/0 گرم بر لیتر سولفاتمنیزیم و 1 گرم بر لیتر محلول مغذی (شامل 5 میلیگرم بر لیتر سولفاتآهن، 6/1 میلیگرم بر لیتر سولفاتمنگنز، 4/1 میلیگرم بر لیتر سولفاتروی و 2 میلیگرم بر لیتر کلریدکلسیم) به همراه 20 گرم بر لیتر آگار و 5 درصد نمک کلریدسدیم برای سویههای نمکدوست معتدل انجام شد. سویههای نمکدوست روی محیطکشت یادشده پس از انکوباسیون در دمای 37 درجه و به مدت 5 روز رشد کردند و سپس پلیتها با محلول یدید 3/0 درصد- یدید پتاسیم 6/0 درصد آزمایش شدند. وجود هالههای شفاف پیرامون ناحیه رشد باکتری، فعالیت پکتینازی را نشان میدهد (8 و 9). برای سنجش کمی آنزیم از روش اسپکتوفتومتری استفاده شد. برای آنزیم پکتینمتیلاستراز از روش اسپکتوفتومتری پیوسته در طول موج 620 نانومتر استفاده و در حضور معرف برموتیمول بلو[4] فعالیت آنزیم (U/ml) سنجیده شد (10). برای آنزیم پکتینلیاز با توجه به ایجاد باند دوگانه در ساختار محصول بر اثر فعالیت آنزیم لیاز، جذب در طول موج 235 نانومتر خوانده شد (11). برای آنزیم پلیگالاکتوروناز، سنجش در حضور دینیتروسالسیلیکاسید[5] و در طول موج 595 نانومتر انجام شد. مقدار واحد آنزیمی به مقدار آنزیمی گفته میشود که در واحد زمان (1 دقیقه)، 1 میکرومول از ماده اولیه را به محصول تبدیل کند (12).
طراحی پرایمر: برای شناسایی ژن آنزیم پکتاتلیاز، با استفاده از دادههای موجود در پایگاه NCBI[6] و نرمافزارهای Clustal W[7] و Gene Runner ، یک جفت پرایمر دجنره طراحی شد. ژن مربوطه از سه گونه باکتریایی باسیلوس هالودورانس[8] سویه ATCC، باسیلوس سویه P-4-N و باسیلوس سویه KSM-P7 از پایگاه داده NCBI استخراج و پس از همردیفسازی با نرمافزار Clustal W، یک جفت پرایمر دجنره از نواحی حفظشده طراحی شد. سپس پرایمرها با نرمافزار Runner Gene ارزیابی شدند. این پرایمرها شامل پرایمر 60F با توالی 5'CCACG/ATTAAATGGG/CGGA/TACAAC3'و پرایمر 240R با توالی 5'GCCATACTTTAATACCG/AATCC3' هستند.
غربال مولکولی آنزیم پکتیناز در سویههای منتخب: به این منظور، DNA ژنومی سویههای پکتیناز مثبت استخراج و بهعنوان الگو در واکنش زنجیرهای پلیمراز استفاده شد. این واکنش، شامل بافر 1X، کلریدمنیزیم با 5/2 غلظت میلیمولار، dNTP با غلظت 4/0 میلیمول، آنزیم Taq DNA پلیمراز به میزان 5/0 واحد و هر کدام از پرایمرهای رفت و برگشت 3/0 میلیمول و DNA الگوی رقیقشده به میزان مناسب در حجم 20 میکرولیتر بود. واکنش زنجیرهای بهشکل واکنش واسرشتسازی اولیه با دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه و 30 چرخه تکرارشونده شامل واسرشتسازی با دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، اتصال پرایمرها در 58 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، گسترش در 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه و پس از اتمام 30 چرخه، یک مرحله گسترش نهایی در 72 درجه سانتیگراد به مدت 7 دقیقه انجام و محصول نهایی واکنش برای تعیین توالی به شرکت ماکروژن کره جنوبی[9] ارسال شد.
نتایج
سنجش اولیه فعالیت پکتینازی: فعالیت پکتینازی سویههای نمکدوست جداشده از سه دریاچه نمکی ایران روی محیطکشت کیفی سنجش این آنزیم بررسی شدند (جدول 1). از 130 سویه موجود که 63 سویه از گمیشان، 25 سویه از دریاچه ارومیه و 42 سویه از اینچهبرون جدا شده بودند، 17 سویه دارای هاله شفاف اطراف کلنی بودند که فعالیت پکتینازی آنها را نشان میدهد (شکل 1). از این 17 سویه، 10 سویه از دریاچه گمیشان، 6 سویه از دریاچه اینچهبرون و 1 سویه از دریاچه ارومیه آنزیم پکتیناز را داشتند.
جدول 1- ویژگیهای سویههای نمکدوست دارای آنزیم پکتیناز
|
سویههای مثبت دریاچه گمیشان |
||||||||
|
ردیف |
علامت اختصاری |
شکل سلول |
رنگ کلنی |
رنگ آمیزی گرم |
رشد در 5 درصد نمک |
سویه استاندارد با بیشترین میزان شباهت |
درصد میزان شباهت |
Accession number |
|
1 |
GAAx7 |
باسیل کوتاه |
کرم روشن |
- |
+ |
Martelella mediterranea MACL11(T) |
97 |
IBRC-M -4040 |
|
2 |
GASx6 |
باسیل |
سفید |
+ |
+ |
Bacillus circulans ATCC4513(T) |
3/99 |
IBRC-M -4069 |
|
3 |
GASx9 |
باسیل |
صورتی-قهوهای |
V |
- |
Bacillus cohnii DSM 6307(T) |
97 |
IBRC-M -4079 |
|
4 |
GBPy11 |
باسیل |
زرد تیره |
+ |
+ |
Aeromocrobium halocynthiae KME |
7/99 |
IBRC-M -4042 |
|
5 |
GBPy13 |
کوکوس |
نارنجی |
+ |
- |
Planococcus rifietoensis M8(T) |
99 |
IBRC-M -4022 |
|
6 |
GBPy16 |
باسیل |
کرم |
+ |
+ |
Bacillus horikoshii DSM 8719(T) |
3/99 |
IBRC-M -4041 |
|
7 |
GCFy5 |
خمیده |
کرم |
- |
- |
Halomonas andesensis LC6(T) |
3/99 |
IBRC-M-4081 |
|
8 |
GCFy1 |
باسیل |
کرم |
- |
- |
Marinobacter lipoliticus SM19(T) |
5/96 |
IBRC-M -4081 |
|
9 |
GBWy1 |
باسیل |
کرم |
+ |
+ |
Bacillus horikoshii SW-72(T) |
9/98 |
IBRC-M -4021 |
|
10 |
GBWx15 |
باسیل |
کرم تیره |
+ |
- |
Bacillus hwajinpoensis SW-72 |
4/99 |
IBRC-M -4023 |
|
سویههای مثبت دریاچه اینچه برون |
||||||||
|
ردیف |
علامت اختصاری |
شکل سلول |
رنگ کلنی |
رنگ آمیزی گرم |
رشد در 5% نمک |
سویه استاندارد با بیشترین میزان شباهت |
درصد میزان شباهت |
Accession number |
|
1 |
W4S38 |
باسیل |
شیری |
+ |
+ |
Bacillus safensisFO-036b(T) |
100 |
IBRC-M 4092 |
|
2 |
LbS2 |
باسیل |
شیری |
+ |
+ |
Virgibacillus salariusSA-Vb1(T) |
100 |
IBRC-M 4091 |
|
3 |
R3A34 |
کوکوس |
نارنجی |
+ |
+ |
Kocuria roseaDSM 20447(T) |
7/99 |
IBRC-M 4166 |
|
4 |
R2S25 |
باسیل |
شیری |
+ |
+ |
Bacillus sonorensisNRRL B-23154(T) |
2/99 |
IBRC-M 4099 |
|
5 |
R1S1 |
کوکوس |
زرد |
+ |
+ |
Micrococcus yunnanensisYIM 65004(T) |
8/99 |
IBRC-M 4090 |
|
6 |
LbA49 |
باسیل |
کرم |
- |
- |
Marinobacter pelagiusHS225(T) |
4/97 |
|
|
سویههای مثبت دریاچه ارومیه |
||||||||
|
ردیف |
علامت اختصاری |
شکل سلول |
رنگ کلنی |
رنگ آمیزی گرم |
رشد در 5% نمک |
سویه استاندارد با بیشترین میزان شباهت |
درصد میزان شباهت |
Accession number |
|
1 |
Wt4 |
باسیل |
کرم |
+ |
+ |
Bacillus Vallismortis |
100 |
- |
سنجش کمی فعالیت آنزیم پکتینازی: برای رسیدن به بیشترین تولید آنزیم طی رشد باکتری، سویه منتخب R2S25 (حاصل از دریاچه اینچهبرون) از میان سویههای مثبت و از باکتریهای دارای بیشترین قطر هاله شفاف در آزمون کیفی به محیطکشت مایع تلقیح و همزمان منحنی رشد و سنجش فعالیت آنزیمها بررسی شد. فعالیت آنزیم پکتینمتیلاستراز، پکتینلیاز و پلیگالاکتوروناز همزمان با منحنی رشد باکتری R2S25 در شکل 2 نشان داده شده است. بیشترین میزان فعالیت برای آنزیم پکتینمتیلاستراز، 50 ساعت پس از تلقیح و (U/ml) 08/0 بود. بیشترین میزان فعالیت برای آنزیم پکتینلیاز (U/ml) 06/0 در 48 ساعت پس از تلقیح مشاهده شد و بیشینه فعالیت برای آنزیم پلیگالاکتوروناز در 48 ساعت پس از تلقیح به میزان (U/ml) 05/0 بود.
شکل 1- الف. نمونه شاهد: نبود هاله پس از افزودن معرف یدید-یدیدپتاسیم، ب. نمونه مثبت: وجود هاله شفاف پس از افزودن معرف یدید- یدید پتاسیم
شکل 2- منحنی رشد و فعالیت آنزیمهای پکتین لیاز، پکتین متیل استراز و پلی گالاکتوروناز در سویه R2S25
تکثیر و بررسی ژن پکتیناز: 130 سویه باکتریایی نمکدوست برای سنجش فعالیت پکتینازی کشت شدند. سپس برای سویههای مثبت، پرایمر طراحی و واکنش زنجیرهای پلیمرازی انجام شد (شکل 3). همه سویههای منتخب، قطعه ژنی مدنظر به طول 250 جفت باز را داشتند.
شکل 3- تصویر قطعه ژنی 255 جفت بازی مربوط به ژن پکتاتلیاز در 6 نمونه از باکتریهای نمکدوست
بررسی توالی ژن پکتاتلیاز: پس از تکثیر ژن لیاز و تعیین توالی مشخص شد بهطور کلی توالیهای ژنی حاصل بیشترین شباهت (بیش از 90 درصد) را با توالی ژن لیاز در دو سویه باسیلوس لیکنیفورمیس[x] و باسیلوس پامیلوس[xi] دارند؛ به این ترتیب که سویههای GAAx7 و GCFy1 جداشده از دریاچه گمیشان بیش از 90 درصد به ژن پکتیناز باسیلوس پامیلوس و سویههای GASx6 ،GASx9، GCFy5،GBPy11، GBPy13، GBPy16، GBWx15 و GBWy1جداشده از دریاچه گمیشان بیش از 90 درصد به باسیلوس لیکنیفورمیس شباهت نشان دادند. سویهWT4 جداشده از دریاچه ارومیه 85 درصد به باسیلوس لیکنیفورمیس شباهت نشان داد. سویههایW4S38، LbS2، R3A34 و R2S25 جداشده از دریاچه اینچهبرون بیش از 90 درصد به باسیلوس لیکنیفورمیس و دو سویهR1S1 وLbA49 جداشده از این دریاچه 90 درصد به باسیلوس پامیلوس شباهت نشان دادند.
بحث و نتیجهگیری
پکتینازها، کمپلکس آنزیمی هستند که نقش ویژهای در تجزیه پکتین موجود در بافتهای گیاهی ایفا میکنند (13). این آنزیمها در صنایع تولید آبمیوه، کاغذ و نساجی نقش (14) و در بررسی فیوژن پروتوپلاست سلولهای گیاهی و مطالعه بیماریزاهای گیاهی کاربرد دارند (15). این آنزیم پتانسیل تجاری خوبی پیش رو دارد، زیرا علاوه بر تجزیه پیشماده ویژه خود (پکتین)، قدرت کاتالیزوری زیادی برای انجام فرآیند تجزیه پکتین از خود نشان میدهد (16). در پژوهش حاضر، سه دریاچه اینچهبرون و گمیشان و ارومیه از دریاچههای نمکی ایران انتخاب شدند تا سویههای باکتریایی نمکدوست آنها برای تولید آنزیم پکتیناز بررسی شوند. در پژوهش حاضر، فقط 1 سویه (4 درصد) از 25 سویه جداشده از دریاچه ارومیه، 6 سویه (15 درصد) از 40 سویه جداشده از اینچهبرون و 10 سویه نمکدوست (3/15 درصد) از 65 سویه جداشده از گمیشان فعالیت پکتینازی نشان دادند و در مجموع، 17 سویه از 130 سویه نمکدوست بر اساس روش هالهسنجی فعالیت پکتینازی مثبت داشتند. با توجه به این دادهها مشخص شد فراوانی سویههای دارای پکتیناز در دریاچههای گمیشان و اینچهبرون بیش از دریاچه ارومیه است. در پژوهشهای روهبان و همکاران (2009)، از 231 سویه جداشده از دریاچه نمکی حوض سلطان، 28 سویه مولد پکتیناز (1/12 درصد) غربالگری شدند و درصد سویههای تولیدکننده آنزیم پکتیناز این دریاچه از هر سه دریاچه بررسیشده در پژوهش حاضر بیشتر بود (17). باباوالیان و همکاران در بررسی تنوع تولید آنزیمهای هیدرولازی در دریاچههای ارومیه و آران و بیدگل دریافتند که سویههای نمکدوست جداشده از دریاچه آران و بیدگل توانایی زیادی برای تولید این آنزیم دارند. همچنین، آنان در بررسی سویههای نمکدوست نسبی جداشده از دریاچه آران و بیدگل، در مجموع 23 مولد آنزیم پکتیناز جدا کردند که به جنسهای هالوباسیلوس[xii]، تالازوباسیلوس[xiii]، سالینیکوکوس[xiv]، هالوموناس[xv] و سالیکولا[xvi] تعلق داشتند (18). مخدومی و همکاران (2011)، 293 سویه آرکی نمکدوست برای تولید آنزیمهای هیدرولازی متنوع غربالگری کردند، هرچند در نتایج آنها هیچ آرکی نمکدوستی آنزیم پکتیناز تولید نمیکرد (19). در پژوهشی در مکزیک (2014)، 8 جدایه کوهیولای مکزیک[xvii] از نظر چند آنزیم هیدرولازی ارزیابی شدند و 6 جدایه مولد پکتیناز بودند؛ در پژوهش یادشده نیز از روش هالهسنجی برای غربالگری استفاده شد (20).
در مطالعه کمی پژوهش حاضر روی بررسی همزمان فعالیت آنزیمهای پکتیناز در سویه R2S25 و رشد باکتری، میزان تولید آنزیمها همزمان با پیشرفت فاز لگاریتمی افزایش یافت و بیشترین مقدار آنها در پایان فاز لگاریتمی و شروع فاز سکون بود. در این سویه، میزان تولید آنزیم پکتیناز در فاز سکون تقریباً ثابت شد. در پروژهای که رفعت اسماعیل و همکاران (2013) روی سویههای باسیلوس جداشده از نمونههای خاک در کشور سوریه انجام دادند، بیشترین میزان تولید در 72 ساعت پس از تلقیح و شروع فاز لگاریتمی به میزان 3/1 واحد آنزیمی بر میلیلیتر بود (21).
با توجه به بررسیهای مولکولی در مطالعه حاضر، برای نخستین بار ژن پکتاتلیاز در جنسهای مارتللا، آئروموکروبیوم، پلنوکوکوس، مارینوباکتر، ویرجیباسیلوس، کوکوریا و میکروکوکوس گزارش شد. اگرچه در گذشته، این ژن در جنس باسیلوس گونههای هالودورانس، لیکنیفورمیس و پامیلوس گزارش شده است (22-24)، در مطالعه حاضر ژن پکتاتلیاز برای نخستین بار در جنس باسیلوس و گونههای سیرکولنس[xviii]، کوهنی[xix]، هوریکوشی[xx]، هاجینپورنزیز[xxi]، سافنزیز[xxii]، سونورنزیز[xxiii] و والیسمورتیزو[xxiv] گزارش شد.
[1]-Sigma-Aldrich
[2]-Merck
[3]-Moderate Halophile
[4]-Bromothymol blue
[5]-Dinitrosalicylic acid
[6]-http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
[7]-http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/
[8]-Bacillus halodurans
[9]-Macrogen Korea
[x]-Bacillus licheniformis
[xi]-Bacillus pumilus
[xii]-Halobacillus
[xiii]-Thalassobacillus
[xiv]-Salinicoccus
[xv]-Halomonas
[xvi]-Salicola
[xvii]-Coahuila Mexico
[xviii]-circulans
[xix]-cohnii
[xx]-horikoshii
[xxi]-hwajinpoensis
[xxii]-safensis
[xxiii]-sonorensis
[xxiv]-Vallismortis
)