همسانه‌سازی و بررسی بیوانفورماتیکی توالی رمزگردان (CDS) ژن دلتا 6 دسچوراز از قارچ مورتیرلا آلپینا سویه CBS 754.68

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه صنعتی شاهرود، شاهرود، ایران

2 استادیار ژنتیک مولکولی و مهندسی ژنتیک، دانشگاه صنعتی شاهرود، شاهرود، ایران

چکیده

مقدمه: دسچورازهای غشایی و آنزیم‌های وابسته به آنها نقشی اساسی در بیوسنتز اسیدهای چرب غیراشباع ایفا می‌کنند. دلتا 6 دسچوراز، آنزیمی کلیدی در بیوسنتز اسیدهای چرب غیراشباع است. قارچ مورتیرلا آلپینا، گونه‌ای روغنی و دارای دلتا 6 دسچوراز فعال است و در سال‌های اخیر مورد توجه پژوهشگران قرارگرفته است.
مواد و روش‏‏ها: پس از استخراج RNA و سنتز cDNA از قارچ مورتیرلا آلپینا سویه CBS 754.68، ژن دلتا 6 دسچوراز توسط آغازگرهای اختصاصی حاوی توالی کوزاک تکثیر و قطعه تکثیرشده در ناقل همسانه‌سازی pBlueScriptSK+ حاوی پروموتور اختصاصی بذر ناپین درج شد. پلاسمید نوترکیب با استفاده از روش شیمیایی به باکتری اشریشیا کلی سویه DH5α ترانسفورم شد. سازه حاصل در ناقل دوگانه pBI121 همسانهسازی و برای انتقال به گیاه، به آگروباکتریوم سویه LBA4404 ترانسفورم شد. ویژگی‌های بیوانفورماتیکی ژن موردنظر با سرورهای TMHMM، ProtParam و Psipred بررسی شد.
نتایج: درستی همسانه‌سازی با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز توسط آغازگرهای اختصاصی، هضم آنزیمی و توالی‌یابی تأیید شد. تکثیر قطعه 830 جفت نوکلئوتیدی با استفاده از آغازگر داخلی پروموتور ناپین و ژن دلتا 6 دسچوراز، الحاق ژن در امتداد پروموتور ناپین را تأیید کرد. نتایج توالی‌یابی نوکلئوتیدی نشان دادند که توالی نوکلئوتیدی این ژن، 1374 جفت باز است و پروتئینی با 457 آمینواسید را رمز می‌کند. وجود دمین سیتوکروم b5، سه موتیف جعبه هیستیدین، دمین‌های تراغشایی و حفاظت‌شده از طریق بررسی بیوانفورماتیک تأیید شدند.
بحث و نتیجه‏گیری: با استناد به نتایج بلاست پروتئینی و تأیید حضور دمین‌های کارکردی، پیش‌بینی می‌شود که توالی همسانه‌سازی‌شده از این قارچ دارای فعالیت آنزیمی مدنظر است. تأیید این نتایج به بررسی بیان این ژن در سیستم گیاهی مناسب و بررسی کارکرد آن در سطح آنزیمی نیازمند است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Cloning and bioinformatics analyses of the coding DNA sequence (CDS) of Delta 6 Desaturase gene from Mortierella alpina (CBS 754.68)

نویسندگان [English]

  • Esmat Ashaar ghadim 1
  • Shahrokh Gharanjik 2
1 MSc. in Agricultural Biotechnology, Shahrood University of Technology, Shahrood, Iran
2 Assistant Professor in Molecular Genetics & Genetics Engineering, Shahrood University of Technology, Shahrood, Iran
چکیده [English]

Introduction: Membrane-bound desaturases and related enzymes play a pivotal role in the biosynthesis of unsaturated fatty acids. Delta6 desaturase is a key enzyme in the biosynthesis of the unsaturated fatty acids. Mortierella alpina is an oleaginous fungus with active Delta 6 desaturase which hasbeengreatly considered recently.
Materials and methods: In order to isolate and clone Δ6D gene from Mortierella alpina, after extraction of total RNA and synthesis cDNA, PCR amplification has been done using gene specific primers. The amplified fragment was cloned into the pBlueScriptSK+ containing seed specific promoter napin. Then the recombinant plasmid was transformed into E.coli DH5a by freezing and thawing method. The confirmed gene construct was cloned into the binary vector pBI121 and transformed into Agrobacterium LBA4404 in order to transform canola plants. Bioinformatics characterization of target gene was investigated by servers TMHMM, ProtParam and Psipred.
Results: Correctness of cloning was confirmed by PCR with specific primers, enzymatic digestion and sequencing. The proliferation of a fragment with 830 bp using internal primer of napin promoter and Delta6 desaturase primer confirmed insertion of the gene along with napin promoter. Nucleotide sequencing results showed that cloned CDS includes 1374 nucleotides that will translate to a protein with 448 amino acids. Using bioinformatics analysis, presence of cytochrome b5 domain, three His-box, secondary and spatial structures, transmembrane and conserved domains were confirmed.
Discussion and conclusion: Based on the results of BLAST analysis using nucleotide and protein sequences, and also presence of functional domains in the protein, it can be predicted that cloned CDS will show proper enzyme activity after transformation into plants. Confirming these results requires expression analysis of the gene in appropriate plant system and studying its function in the enzyme level.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Cloning
  • Unsuturated Fatty acid
  • Delta 6 Desaturase
  • Mortierella alpina

مقدمه

امروزه نقش اسیدهای چرب غیراشباع[1] در جلوگیری ازگسترش بیماری‌های قلبی- عروقی اثبات شده است (1). اسیدهای چرب غیراشباع از اجزای اصلی تشکیل‌دهنده غشاهای زیستی در موجودات زنده هستند و به همین دلیل خصوصیات ویژه­ای به آن می­بخشند. این اسیدهای چرب باعث قابلیت انعطاف، سیالیت و نفوذپذیری انتخابی غشاها می‌شوند و در انتقال پیام سلولی نقش دارند (2 و 3).

اسیدهای چرب غیراشباع بر اساس موقعیت نخستین پیوند دوگانه به سه گروه امگا 9، امگا 6 و امگا 3 تقسیم می‌شوند. اسیدهای چرب امگا 3 و امگا 6 جزو اسیدهای چرب ضروری هستند و باید به میزان مناسب و متعادلی در رژیم غذایی وجود داشته باشند. اسیدهای چرب امگا 6 به‌وفور در روغن‌های مایع مانند روغن دانه آفتابگردان، ذرت و روغن‌هایی یافت می‌شود که برای تهیه غذاهای بسته‌بندی‌شده و آماده استفاده می‌شوند و از این رو، میزان مصرف این روغن در عامه مردم بیش از حد مطلوب است. همچنین، مصرف ماهی یا کپسول روغن ماهی و دیگر غذاهای دریایی به‌عنوان اصلی‌ترین منابع تأمین اسیدهای چرب امگا 3 در رژیم غذایی با بهره‌برداری بیش از اندازه ذخایر در طولانی‌مدت پاسخگوی نیاز رشد جمعیتی نخواهد بود (4). این امر همراه با خطرسازبودن آلودگی‌های محیطی مانند دیوکسین‌ها و فلزهای سنگین مانند جیوه که ماهی‌ها جذب می‌کنند و در کبد و سایر اندام‌های آنها تجمع می‌یابد (5)، باعث شده است که پژوهشگران در سال‌های اخیر به جستجوی منابع مناسب دیگری برای تهیه این اسیدهای چرب و نیز مهندسی متابولیک مسیر بیوسنتزی آنها در ریزموجودات و گیاهان موردتوجه فراوانمحققین قرارگیرد.

سنتز اسیدهای چرب غیراشباع به کمک آنزیم دلتا 6 دسچوراز با ایجاد پیوند دوگانه بین کربن‌های 6 و 7 لینولئیک‌اسید (LA 18:2 Δ9,12)[2]و آلفالینولنیک‌اسید (ALA 18:3 Δ9,12,15)[3] آغاز و به‌ترتیب باعث تولید گامالینولنیک‌اسید (GLA 18:3 Δ6,9,12)[4] و استئاریودونیک‌اسید (SDA 18:4 Δ6,9,12,15)[5]می‌شود. بنابراین دلتا 6 دسچوراز، آنزیم کلیدی برای ورود به مراحل بعدی غیراشباع‌سازی، طویل‌سازی و بیوسنتز اسیدهای چرب غیراشباع بلندزنجیره مانند آراشیدونیک‌اسید [6] (ARA 20:4 Δ5,8,11,14)، اکزاپنتانوئیک‌اسید [7](EPA 20:5 Δ5,8,11,14,17)و دکزاهگزانوئیک‌اسید [8] (DHA 22:6 Δ4,7,10,13,16,19) است (6).

قارچ مورتیرلا آلپینا[9] متعلق بهزیرشاخهماکورمیکوتینا[10]، قارچی روغنی است که لیپید به‌شکل تری‌اسیل‌گلیسرول، حدود 50 درصد وزن خشک آن را تشکیل می‌دهد. این قارچ با داشتن دلتا 6 دسچوراز فعال، منبع غنی تولید آراشیدونیک‌اسید است و در سال­های اخیر مورد توجه فراوان بشر قرارگرفته است (7). هدف پژوهش حاضر، تکثیر و همسانه‌سازی ژن دلتا 6 دسچوراز از قارچ مورتیرلا آلپینا سویه CBS 754.68، دسترسی به توالی رمزگردان این ژن و بررسی درصد همسانی توالی ژنی و آمینواسیدی با گونه‌های مشابه، تعیین ساختار دوم و جایگاه دمین‌های کارکردی آن است. دستاورد پژوهش حاضر، علاوه بر انتقال ژن یادشده به گیاهان دانه روغنی برای تولید اسیدهای چرب غیراشباع بلندزنجیره، اطلاعات مفیدی را برای مطالعات بعدی آنزیم‌های دلتا 6 دسچوراز در متابولیسم اسیدهای چرب و اطلاعات پایه تعیین ساختار سه بعدی آنها را نیز فراهم می‌کند.

 

مواد و روش‌ها

باکتری‌های استفاده‌شده در پژوهش حاضر شامل اشریشیا کلی[11] سویه DH5α و آگروباکتریوم تومیفاسینس[12] سویه LBA4404 بودند. باکتری اشریشیا کلی به‌عنوان میزبان برای نگهداری و تکثیر سازه‌های ساخته‌شده و آگروباکتریوم برای انتقال ژن مدنظر به گیاه استفاده شدند. ناقل‌های استفاده‌شده شامل pBlueScriptSK+ برای همسانه‌سازی اولیه و ارسال برای توالی‌یابی، pSK+ حاوی پروموتور ناپین و وکتور دوگانه pBI121 برای انتقال سازه ژنی مدنظر به گیاه بودند.

استخراج RNA و سنتز cDNA: نمونه قارچی در محیط [13]YPD کشت و به مدت دو شبانه‌روز در انکوباتور با سرعت 150دور در دمای 28 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. استخراج RNA کل با استفاده از کیت RNX-Plus (شرکت سیناژن[14]) انجام و برای سنتز cDNA از آغازگر عمومی الیگو (dt) و آنزیم نسخه‌بردار معکوس[15] (شرکت فرمنتاز[16]Cat No. (PR911658 استفاده شد. کمیت و کیفیت RNA استخراجی با الکتروفورز روی ژل آگارز 2/1 درصد و اسپکتروفتومتر بررسی شد. برای شناسایی و اطمینان از حضور ژن دلتا 6 دسچوراز در سطح DNA ژنومی، استخراج DNA به روش CTAB[17] (ستیل‌تری‌متیل‌آمونیوم‌بروماید) انجام و از آغازگرهای داخلی به‌عنوان الگو در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز استفاده شد.

.طراحی آغازگرها و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز: آغازگرهای ژن دلتا 6 دسچوراز از ناحیه CDS ژن مدنظر قارچ مورتیرلا آلپینا با شماره دسترسی AF110510 ثبت‌شده در بانک اطلاعاتی NCBI طراحی شدند. در طراحی آغازگرها، پس از تحلیل نقشه برشی ژن دلتا 6 دسچوراز، توسط نرم‌افزار NEB Cutter سایت برشی XbaI همراه با توالی افزایش‌دهنده بیان گیاهی کوزاک در آغازگر مستقیم و سایت برشی SacI در آغازگر معکوس اضافه شدند. برای افزایش کارایی برش آنزیم‌های برشی، دو توالی اضافی به‌عنوان لنگرگاه آنزیم به دو سمت آغازگرها افزوده شدند. همچنین برای اطمینان از درستی جهت قرارگیری ژن در ابتدای پروموتور ناپین، یک جفت آغازگر دیگر با استفاده از نواحی داخلی پروموتور ناپین و ژن دلتا 6 دسچوراز طراحی شد (جدول 1). سنتز آغازگرها به سفارش شرکت تکاپوزیست توسط شرکت بایونیر[18] (کره جنوبی)، انجام شد.

 

 

جدول 1- آغازگرهای استفاده‌شده در پژوهش حاضر

TM

اندازه قطعه تکثیری

توالی

نام آغازگر

62˚C

1396 bp

5´-aaTCTAGAccaccatggctgctgctcccag-3´

D6D-F

 

 

5´-gcGAGCTCttactgcgccttacccatcttg-3´

D6D-R

54˚C

830 bp

5´-AGTAAGGATGACCTACCC-3´

Pro.N –F

 

 

5´-AGAACATCTCCAACGCA-3´

D6D- R

 


cDNA سنتز‌شده به‌عنوان الگو در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، برای سنتز DNA دو رشته‌ای و تکثیر ژن با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن توسط آنزیم تک‌پلیمراز[19] (شرکت سیناژن) استفاده شد. شرایط بهینه برای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به‌شکل واسرشت‌سازی اولیه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه و سپس 35 چرخه (واسرشت‌سازی 1 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد، اتصال 1 دقیقه در دمای62 درجه سانتی‌گراد، بسط 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد) و بسط نهایی در دمای 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه بود. محصول واکنش پلیمراز روی ژل آگارز 1 درصد برده و خالص‌سازی قطعه DNA تکثیرشده توسط کیت استخراج از ژل آگارز (شرکت ویوانتس[20]، مالزی) انجام شد.

.همسانه‌سازی در ناقل پلاسمیدی و انجام توالی‌یابی: محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از کیت استخراج از ژل، خالص‌سازی و توسط آنزیم‌های برشی XbaIو SacI برش داده شد؛ هم‌زمان، وکتور pBlueScriptSK+ نیز با این آنزیم‌ها هضم شد. برای ساخت پلاسمید نوترکیب، عمل اتصال محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز و وکتور هضمشده با استفاده از آنزیم لیگاز انجام شد. برای تهیه باکتری‌های مستعد اشریشیا کلی و انتقال پلاسمید نوترکیب به آنها به‌ترتیب از روش کلریدکلسیم سرد و شوک حرارتی استفاده شد (8). باکتری‌‌های ترانسفورم‌شده در محیط‌کشت LB جامد حاوی آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین، [21]X-gal (ایزوپروپیلβ-1-D-تیوگالاکتوپیرانوزید) و [22]IPTG (5 برمو-4 کلرو-3 ایندول-β-D-گالاکتوپیرانوزید)کشت شدند. با توجه به قرارگیری قطعه همسانه‌سازی‌شده در ناحیه ژن بتا-گالاکتوزیداز، غربال‌گری سلول‌های حاوی DNA نوترکیب با ناتوانایی آنها در ساخت این آنزیم همراه بود و کلنی‌های سفید‌رنگ، نوترکیب بودند. بنابراین، چند کلنی سفید انتخاب و پس از تأیید اولیه با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز توسط آغازگرهای اختصاصی این ژن، استخراج پلاسمید به روش لیز قلیایی (9) انجام و ابتدا و انتهای ژن با آنزیم‌های برشی هضم شد. برای اطمینان از درستی همسانه‌‌سازی و تأیید نهایی توالی ژن مدنظر، توالی‌یابی با استفاده از آغازگرهای T7 و T3 به سفارش شرکت فزابیوتک[23] انجام شد.

پس از اطمینان از درستی توالی قطعه همسانه‌سازی‌شده، همسانه‌سازی در پلاسمید pSK+ حاوی پروموتور اختصاصی بذر ناپین از طریق هضم آنزیمی پلاسمید و محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با آنزیم‌های برشی XbaIو SacI و اتصال نواحی انتهای چسبنده ایجادشده با آنزیم T4 DNA لیگاز انجام شد (شکل 1). انتقال به باکتری‌های مستعد انجام و باکتری‌های ترانسفورم‌شده در محیط کشت LB جامد حاوی آنتی‌بیوتیک آمپی‌سیلین به‌شکل شبانه کشت شدند. تأیید همسانه‌سازی با استفاده از کلنی- PCR و هضم آنزیمی انجام و برای اطمینان از درستی جهت قرارگیری پروموتور ناپین در ابتدای ژن، آغازگر داخلی بر اساس نواحی داخلی پروموتور ناپین و ژن دلتا 6 دسچوراز به طول 830 جفت نوکلئوتید طراحی و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز انجام شد (جدول 1).

همسانه‌سازی در ناقل دوگانه pBI121: برای همسانه‌سازی سازه در ناقل دوگانه pBI121، پلاسمید نوترکیب از جایگاه‌های برشی ابتدای پروموتور و انتهای ژن (HindIII و SacI) برش داده شد. هضم دوگانه ناقل pBI121 با این آنزیم‌ها موجب حذف ژن بتاگلوکورونیداز (GUS) شد. برای افزایش احتمال اتصال صحیح قطعه‌های مدنظر، قطعه حاوی پروموتور ناپین- ژن دلتا 6 دسچوراز و پلاسمید برش‌یافته pBI121، از روی ژل خالص‌سازی و سپس انتهاهای چسبنده ایجادشده با آنزیم T4 DNA لیگاز به هم متصل شدند. سلول‌های مستعد آگروباکتریوم تهیه و انتقال پلاسمیدهای نوترکیب به روش ذوب و انجماد انجام شد. باکتری‌های ترانسفورم‌شده در محیط‌کشت LB جامد حاوی کانامایسین به‌شکل شبانه کشت و کلنی‌های حاوی پلاسمید نوترکیب با استفاده از کلنی- PCR و هضم آنزیمی شناسایی شدند.

  

شکل 1- سازه نوترکیب پروموتور ناپین- دلتا 6 دسچوراز. قطعه ناپین-دلتا 6 دسچوراز با حذف ژن GUS، بین دو جایگاه برشی HindIII-SacI پیش از ترمیناتور NOS همسانه‌سازی شده است.

 

بررسی بیوانفورماتیکی: توالی نوکلئوتیدی حاصل از توالی‌یابی cDNA ژن دلتا 6 دسچوراز، در سایت Expasy[24] به پروتئین ترجمه شد. ویژگی‌های بیوشیمیایی پروتئین حاصل با برنامه ProtParam[25]تعیین و وجود دمین‌های احتمالی با سرور Interpro[26]بررسی شد. اطلاعات بیشتر درباره ساختار دوم پروتئین با سرور (psipred[27] پیش‌بینی شدند. پروفایل هیدروپاتی توالی با ابزار TopPred[28] تحلیل و وجود دمین‌های تراغشایی[29] با سرور TMHMM[30] تأیید شد. برای تعیین میزان قرابت توالی پروتئینی ژن دلتا 6 دسچوراز همسانه‌سازی‌شدهبا توالی این ژن در گونه‌های دیگر، درختچه فیلوژنتیکی با نرم‌افزار مگا7[31]، روش Neighbor-Joining رسم شد. به علت قرارگرفتن دلتا 6 دسچوراز و دلتا 8 اسفنگولیپید در یک خانواده و شباهت زیاد آنها به یکدیگر، از توالی پروتئینی چند ژن دلتا 8 اسفنگولیپید و دلتا 5 دسچوراز علاوه بر دلتا 6 در رسم درختچه فیلوژنتیکی استفاده شد.

 

نتایج

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای داخلی، وجود ژن دلتا 6 دسچوراز را روی DNA ژنومی اثبات کرد. انجام واکنش RT-PCR روی cDNAسنتزشده موجب تکثیر قطعه‌ای با طول تقریبی 1390 جفت نوکلئوتید شد که معادل طول کامل منطقه کدکننده ژن دلتا 6 دسچوراز است (شکل 2).

پس از اتصال این ژن به پلاسمید pBlueScriptSK+، رشد کلنی‌ها در محیط حاوی آنتی‌‌بیوتیک آمپی‌سیلین نشان‌دهنده وجود پلاسمید در باکتری و وجود کلنی‌های سفید نشان‌دهنده نوترکیب‌بودن باکتری‌های حامل آنها بود. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز روی پلاسمیدهای نوترکیب سفید برای تأیید وجود ژن انجام شد که طول کامل ژن در پلاسمید نوترکیب حاصل شد (شکل 3).

 

شکل 2- محصول تکثیر ژن دلتا 6 دسچوراز با واکنش RT-PCR روی ژل آگارز 1 درصد. چاهک M: نشانگر وزن مولکولی 1Kb (شرکت سیناژن)، چاهک 1: محصول تکثیر ژن دلتا 6 دسچوراز توسط آغازگرهای اختصاصی به طول تقریبی 1390 جفت باز

 شکل 3- تأیید حضور ژن دلتا 6 دسچوراز در ناقل pSK+ توسط کلنی PCR. چاهک M: نشانگر وزن مولکولی 1Kb (شرکت سیناژن)، چاهک‌های 1، 2 و 3: تکثیر قطعه‌ای با طول تقریبی 1390 جفت باز، چاهک 4: کنترل مثبت با استفاده از آغازگرهای اختصاصی این ژن روی cDNA

شکل 4- نتایج هضم آنزیمی pSK+ نوترکیب. چاهک M: نشانگر وزن مولکولی bp100 (شرکت سیناژن)، چاهک 1: هضم آنزیمی pSK+ نوترکیب و ایجاد قطعه‌هایی با طول تقریبی bp2900 وکتور و bp1390 قطعه همسانه‌سازی‌شده

 شکل 5- محصول PCR آغازگر داخلی پروموتور ناپین و ژن دلتا 6 دسچوراز. چاهک M: نشانگر وزن مولکولی 1Kb (شرکت سیناژن)، چاهک‌های 1، 2 و 3: تکثیر قطعه با استفاده از آغازگر داخلی پروموتور ناپین و ژن دلتا 6 دسچوراز به طول bp830

 پس از استخراج پلاسمیدهای نوترکیب، نتایج هضم آنزیمی با آنزیم‌های برشی و ایجاد قطعه‌ای با طول تقریبی ژن مدنظر،درستی همسانه‌سازی در پلاسمید را تأیید کردند (شکل 4).

نتایج توالی‌یابی که برای تأیید نهایی و یافتن توالی ناحیه کدکننده ژن دلتا 6 دسچوراز با استفاده از آغازگرهای عمومی T7 و T3 انجام شد، همسانه‌سازی ناحیه CDS با طول 1374 جفت نوکلئوتید از ژن مدنظر را تأیید کرد. پس از اطمینان از درستی قطعه cDNA سنتزشده، این قطعه در ناحیه MCS وکتور pBlueScriptSK+ از طریق برش در جایگاه های XbaIو SacI در پایین‌دست پروموتور ناپین، که یک پروموتور اختصاصی بذر بوده و باعث بیان اختصاصی ژن در این بافت خواهد شد، همسانه‌سازی شد. پس از ترانسفورم‌کردن پلاسمید نوترکیب حاصل در باکتری اشریشیا کلی، کلنی-PCRروی کلنی‌های سفید با آغازگرهای اختصاصی، درستی همسانه‌سازی و تکثیر طول کامل ژن را تأیید کرد. تکثیر قطعه 830 جفت نوکلئوتیدی با استفاده از آغازگرهای داخلی پروموتور و ژن دلتا 6 دسچوراز، جهت درست قرارگیری این ژن در امتداد پروموتور ناپین را تأیید کرد (شکل 5).

پس از همسانه‌سازی سازه حاوی پروموتور ناپین و ژن مدنظر در ناقل دوگانه pBI121 و انتقال آن به آگروباکتریوم LBA4404 برای انتقال بعدی به گیاه، درستی همسانه‌سازی با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ابتدای پروموتور ناپین و انتهای ژن دلتا 6 دسچوراز و تکثیر قطعه‌ای با طول تقریبی 2500 جفت باز اثبات شد (شکل 6).

شکل 6- محصول PCR آغازگر ابتدای پروموتور ناپین و انتهای ژن دلتا 6 دسچوراز. چاهک M: نشانگر وزن مولکولی 1Kb (شرکت سیناژن)، چاهک‌های 1، 2 و 3: تکثیر قطعه به طول تقریبی bp2500، چاهک 4: کنترل مثبت

 نتایج توالی‌یابی ژن مدنظر نشان دادند که قطعه همسانه‌سازی‌شده در وکتور pSK+، 1374 نوکلئوتید دارد و پروتئینی با طول 457 آمینواسید را کد می‌کند. این پروتئین بیشترین شباهت با میزان 98درصد را به ژن دلتا 6 دسچوراز مورتیرلا آلپینا با شماره دسترسی BAA85588.1 و ABN69090.1 داشت که حفاظت زیاد ژن در این قارچ را نشان می‌دهد. بررسی ویژگی‌های بیوشیمیایی پروتئین حاصل با ProtParam، وزن مولکولی این توالی را 2/51969 دالتون و نقطه ایزوالکتریک (IP) آن را 69/5 تعیین کرد. شاخص ناپایداری پروتئین 68/30 محاسبه شد، اما با توجه به وجود توالی متیونین در انتهای N این پروتئین، نیمه‌عمر برآوردی در شرایط آزمایشگاه 30 ساعت است که پایداری این پروتئین را نشان می‌دهد. از مجموع کل آمینواسیدها، 34 آمینواسید دارای بار مثبت (آرژنین و لیزین) و 49 آمینواسید دارای بار منفی (آسپارتات و گلوتامات) تعیین شدند. با انجام  بلاست در پایگاه Interpro روی توالی همسانه‌سازی‌شده و خانواده­های دمینی شناسایی‌شده و با توجه به بررسی‌های پیشین روی این ژن، دمین‌های سیتوکروم b5 و اسیدچرب دسچوراز شناسایی شدند. پایگاه [32]CDD، این نتایج را تأیید کرد. سه موتیف حفاظت‌شده غنی از هیستیدین در پایگاه CDD به‌عنوان ناحیه اتصال آهن تعیین شدند؛ نخستین موتیف غنی از هیستیدین از آمینواسید 171 تا 175، دومین موتیف از آمینواسید 208 تا 212 و سومین موتیف در جایگاه 396 تا 399 قرار گرفته است (شکل 7).

نتایج سرور Psipred نشان دادند که ساختار دوم این توالی دارای 18 مارپیچ آلفا[33] و بیش از 15 عدد سوپرکویل است. طول 5 عدد از مارپیچ‌های آلفا بیش از20 آمینواسید است و بنابراین ژن دلتا 6 دسچوراز در درجه اول از مارپیچ آلفا تشکیل شده که از ویژگی‌های پروتئین‌های غشایی و دسچورازهاست (شکل 8).

شکل 7- دمین‌های شناسایی‌شده توسط پایگاه CDD و تعیین موتیف‌های حفاظت‌شده هیستیدین. دمین‌های سیتوکروم b5 و اسید چرب دسچوراز شناسایی شده‌اند. محل موتیف‌های هیستیدین به‌شکل نشانه‌های مثلثی با عنوان putative di-iron ligands مشخص شده است.

 شکل 8- تعیین ساختارهای دوم توالی پروتئینی (α-helices، Strand و Supercoil) توسط سرور psipred. مناطق تراغشایی با کادرهای مستطیلی مشخص شده‌اند.

 

نمودار هیدروپاتی این ژن با نرم‌افزار TopPred، 5 قطعه گذرنده از غشا را نشان داد. این مناطق، موقعیت‌های آب‌گریز را مشخص می‌کنند. نواحی آب‌گریز، مارپیچ‌های تراغشایی هستند که در بیشتر دسچورازهای غشایی وجود دارند و به‌عنوان دمین‌های حفاظت‌شده بین تمام هومولوگ‌های این ژن بیان شده‌اند (شکل 9).

نتایج سرور TMHMM نیز احتمال مارپیچ‌های غشایی را در 5 منطقه تأیید کردند (شکل 10).

شکل 9- نمودار هیدروپاتی ژن دلتا 6 دسچوراز با نرم‌افزار TopPred. 5 قطعه گذرا از غشا در موقعیت آمینواسیدهای 125 تا 145، 185 تا 205، 266 تا 286، 305 تا 325 و 239 تا 349 قرار دارند.

 شکل 10- تعیین مناطق تراغشایی با سرور TMHMM

 

بر اساس نتایج درختچه فیلوژنتیکی رسم‌شده با نرم‌افزار مگا7، توالی پروتئینی ژن مدنظر هم‌ردیف سایر توالی‌های ژن دلتا 6 دسچوراز مورتیرلا آلپینای گزارش‌شده قرار گرفت، اما با دلتا 8 و دلتا 5 دسچورازها هم‌گروه نشد. این نتایج، حفاظت زیاد ژن دلتا 6 دسچوراز را در این قارچ نشان می‌دهند (شکل 11).

شکل 11- درختچه فیلوژنتیکی با استفاده از نرم‌افزار مگا7. شماره دسترسی توالی‌های پروتئینی:

Mortierella alpina D6-desaturase(MoralA-d6D) (▲); Mortierella alpina D6-desaturase MoralB-d6D(BAA85588.1); Mortierella alpina D6-desaturase(MoralII-d6D) (BAC82359.1); Umbelopsis isabellina D6-desaturase (Umis-d6D) (AAL73948.1); Echium plantagineum D6-desaturase (Ehpl-d6D) (AAZ08559.1); Borago officinalis D6-desaturase (Boof-d6D) (AAC49700.1); Helianthus annuus D8-desaturase (Hean-d8D) (Q43469.1); Micromonas pusilla CCMP1545 D6-desaturase (Mipu-d6D) (EEH58637.1); Mortierella alpina D5-desaturase (Moal-d5D)(AAR28035.1); Marchantia polymorpha D5-desaturase (Mapo-d5D)  (AAT85663.1); Dictyostelium discoideum D5-desaturase (Didi-d5D) (BAA37090.1); Arabidopsis thalianaD8-desaturase (Arth-d8D) (AAO30042.1); Rhizopus oryzae D6-desaturase(Rhor-d6D) (AAS93682.1); Ceratodon purpureus D6-desaturas(Cepu-d6D) (CAB94993.1); Phaeodactylum tricornutum D6-desaturase (Phtr-d6D) (AAL92563.1); Thalassiosira pseudonan D6-desaturase (Thps-d6D) (AAX14505.1); Marchantia polymorpha D6-desaturase(Marp-d6D) (AAT85661.1); Caenorhabditis elegans D6-desaturase (Cael-d6D) (AAC15586.1).

 

بحث و نتیجه‌گیری

دسچورازهای غشایی و آنزیم‌های وابسته، نقشی اساسی در بیوسنتز اسیدهای چرب غیراشباع ایفا می‌کنند. دلتا 6 دسچوراز، آنزیمی غشایی است که دارای نقشی کلیدی در بیوسنتز اسیدهای چرب غیراشباع و دروازه‌ای برای ورود اسیدهای چرب به مراحل بعدی غیراشباع‌سازی و طویل‌سازی است. قارچ مورتیرلا آلپینا گونه‌ای روغنی است که برای تولید تجاری اسیدهای چرب غیراشباع به کار می‌رود. در پژوهش حاضر پس از کشت قارچ مورتیرلا آلپینا، استخراج RNA و سنتز cDNA برای ژن دلتا 6 دسچوراز انجام و پس از تأیید توالی، برای انتقال این ژن به گیاه در ناقل دوگانه pBI121 حاوی پروموتور ناپین همسانه‌سازی شد. در طراحی آغازگرها، توالی افزایش‌دهنده سیستم بیان گیاهی کوزاک (CCACCAUGG) به‌شکل همپوشان با جایگاه برشی XbaI وکدون آغاز، برای افزایش بیان این ژن استفاده شد. ریبوزوم، توالی کوزاک در مولکول‌های mRNA یوکاریوتی را جایگاه آغاز ترجمه شناسایی می‌کند و هرچه مشابهت آن با توالی توافق‌شده بیشتر باشد، سیگنال قوی‌تری برای ترجمه است (10). بر اساس نتایج توالی‌یابی، توالی نوکلئوتیدی این ژن 1374 جفت باز است و پروتئینی با 457 آمینواسید را رمز می‌کند. در بررسی درصد همسانی و مشابهت قطعه همسانه‌سازی‌شده با سایر توالی‌های GeneBank در سطح نوکلئوتیدی و پروتئینی، بیشترین همسانی توالی نوکلئوتیدی (98 درصد) با ژن دلتا 6 دسچوراز مورتیرلا آلپینا با شماره دسترسی AB020032.1 و در سطح پروتئینی به میزان 98درصد با BAA85588.1 حاصل شد. در بررسی فیلوژنتیکی، ژن استخراج‌شده با دلتا 6 دسچوراز پروکاریوت‌ها و گیاهان در یک ‌خانواده قرار گرفت. نتیجه هم‌ردیفی در سطح نوکلئوتیدی و پروتئینی، تغییری در توالی‌های حفاظت‌شده این ژن نشان نداد.

بر اساس نتایج بررسی‌های بیو انفورماتیک، وجود دمین سیتوکروم b5، سه موتیف جعبه هیستیدین، پیش‌بینی ویژگی‌های پروتئینی، دمین‌های تراغشایی و حفاظت‌شده تأیید شدند. نتایج پژوهش‌ها نشان داده‌اندکه ایجاد پیوند دوگانه در زنجیره اسید چرب توسط آنزیم‌های دسچوراز به واسطه دهنده اکسیژن و الکترون کاتالیز می‌شود (11). سریع‌ترین دهنده الکترون برای بسیاری از دسچورازها، سیتوکروم b5، هموپروتئین کوچک واکنش‌های اکسیداسیون و کاهش است (12). دمین سیتوکروم b5 ردوکتاز در مورتیرلا آلپینا، مونومری از 298 آمینواسید است که مطابق با طول دیگر سیتوکروم‌اکسیدازها است. دمین FAD در انتهای Nو دمین NADH در انتهای C، شباهت زیاد توالی با دیگر سیتوکروم‌اکسیدازها را نشان می‌دهند. این دمین شامل موتیف سیتوکروم b5 (HPGG) (هیستیدین- پرولین- گلایسین- گلایسین) است که هسته دمین متصل به گروه هِم را تشکیل می‌دهد. همچنین آنزیم‌های دسچوراز غشایی، سه موتیف حفاظت‌شده غنی از هیستیدین شامل Hxx(x)H، HxxxH و Q/HxxHH دارند؛ این موتیف‌ها از نظر کاتالیتکی ضروری و لیگاندهایی برای اتم آهن هستند که برای دسترسی به یون‌های آهن و تشکیل بخش فعال در حدفاصل غشا و سیتوپلاسم پس از اتصال به غشا ضروری هستند (13). بر اساس نتایج پژوهش‌های پیشین، حضور این موتیف‌ها برای فعالیت آنزیم ضروری است و حذف یا جهش در هر یک از آمینواسیدهای کلیدی این موتیف‌ها، کارکرد آنزیم را مختل می‌کند. این دمین‌ها بدون هیچ تغییری در توالی ترجمه‌شده شناسایی شدند. ویژگی‌های شیمیایی، ساختار ثانویه و مارپیچ‌های تراغشایی تعیین‌شده این ژن، تطابق بسیار زیادی با توالی گزارش‌شده لی‌یو[xxxiv] و همکاران از این ژن داشت (7). با توجه به حضور اسیدهای چرب در غشای سلولی، تولید اسیدهای چرب غیراشباع در فرآیندهای غشایی تأثیرگذار است. در مطالعه حاضر، پروموتور اختصاصی بذر مربوط به پروتئین ذخیره‌ای بذر ناپینجداسازی‌شده از کلزا، در ناحیه بالادست ژن دلتا 6 دسچوراز اضافه شد. استفاده از پروموتور اختصاصی بذر در مسیر تولید این اسیدهای چرب، بیان ژن را به بخش‌های ویژه‌ای از گیاه محدود کرده و علاوه بر ممانعت از تأثیر بر فرآیندهای غشایی سبب استحصال آسان‌تر روغن از این بافت‌ها می‌شود (14).

با استناد به نتایج بلاست نوکلئوتیدی و پروتئینی و با توجه به عدم تغییر دمین‌های حفاظت‌شده، انتظار می‌رود که توالی همسانه‌سازی‌شده فعالیت آنزیمی مدنظر را داشته باشد. تأیید بیشتر درستی این ادعا مستلزم بیان آن در سیستم گیاهی مناسب، بررسی عملکرد آن در سطح آنزیمی و تولید محصول اسید چرب مدنظر است.



[1]- Unsaturated fatty acids

[2]- Linolenic acid

[3]- α-Linolenic acid

[4]- Gamma-linolenic acid

[5]- Stearidonic acid

[6]- Arachidonic acid

[7]- Eicosapentaenoic acid

[8]- Docosahexaenoic acid

[9]- Mortierella alpina

[10]- Mucoromycotina

[11]- Escherichia coli

[12]- Agrobacterium tumefaciens  

[13]- Yeast extract Peptone Dextrose

[14]- Cinnagen

[15]- M-MuLV Reverse transcriptas

[16]- Fermentaze

[17]- Cetyl tri methyl ammonium bromide

[18]- Bioneer

[19]- Taq DNA Polymerase

[20]- Vivantis

[21]- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto-yranoside

[22]- Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

[23]- Faza Biotech

[24]- http://web.expasy.org/translate

[25]- http://web.expasy.org/protparam

[26]- https://www.ebi.ac.uk/interpro

[27]- http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred

[28]- http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html

[29]- Transmembrane

[30]- http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM

[31]- MEGA.7

[32]- Conserved Domains Database

[33]- α-helix

[xxxiv]- Liu

 

 

 

 

Kew S., Mesa MD., Tricon S., Buckley R., Minihane AM., Yaqoob P. Effects of oils rich in eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids on immune cell composition and function in healthy humans. The American journal of clinical nutrition 2004; 79(4): 674-81.

(2( Ward OP., Singh A. Omega-3/6 fatty acids: alternative sources of production. Process Biochemistry 2005; 40(12): 3627-3652.

(3) Sakuradani E., Kobayashi M., Ashikari T., Shimizu S. Identification of Δ12‐fatty acid desaturase from arachidonic acid‐producing Mortierella fungus by heterologous expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae and the fungus Aspergillus oryzae. European journal of biochemistry 1999; 261(3): 812-820.

(4) Myers RA., Worm B. Rapid worldwide depletion of predatory fish communities. Nature 2003; 423 (6937): 280-283.

(5) Ruiz-López N., Sayanova O., Napier A., Haslam RP. Metabolic engineering of the omega-3 long chain polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathway into transgenic plants. Journal of experimental botany 2012; 63(7): 2397-2410.

(6) Tan Li C. Cloning and functional analysis of the genes from entomopathogenic fungi involved in the biosynthesis of eicosatetraenoic acid (ETA). [Dissertation]. Saskatoon: University of Saskatchewan; 2010.

 

(7) Liu J., Li D., Yin Y., Wang H., Li M., Yu L. Δ6-Desaturase from Mortierella alpina: cDNA cloning, expression, and phylogenetic analysis. Biotechnology letters 2011; 33(10): 1985-1991.

(8) Maniatis T., Fritsch E., Sambrook F. Molecular cloning. A laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 1995.

(9) Sambrook J., Russell DW. Molecular cloning. A Laboratory Manual. 3ra. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 2001.

(10) Wang XQ., Rothnagel JA. 5′‐Untranslated regions with multiple upstream AUG codons can support low‐level translation via leaky scanning and reinitiation. Nucleic acids research 2004; 32(4): 1382-1391.

(11) Chen YQ., Edwards IJ., Kridel SJ., Thornburg T., Berquin IM. Dietary fat’gene interactions in cancer. Cancer and Metastasis Reviews 2007; 26(3-4): 535-551.

(12) Smith MA., Cross AR., Jones OT., Griffiths WT., Stymne S., Stobart K. Electron-transport components of the 1-acyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Δ12-desaturase (Δ12-desaturase) in microsomal preparations from developing safflower (Carthamus tinctorius L.) cotyledons. Biochemical journal 1990; 272(1): 23-29.

(13) Shanklin J., Achim C., Schmidt H., Fox BG., Münck E. Mössbauer studies of alkane ω-hydroxylase: evidence for a diiron cluster in an integral-membrane enzyme. Proceedings of the National Academy of Sciences 1997; 94(7): 2981-2986.

(14) Petrie JR., Shrestha P., Liu Q., Mansour MP., Wood CC., Zhou XR., et al. Rapid expression of transgenes driven by seed-specific constructs in leaf tissue: DHA production. Plant Methods 2010; 6(1): 1-6.

 

Kew S., Mesa MD., Tricon S., Buckley R., Minihane AM., Yaqoob P. Effects of oils rich in eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids on immune cell composition and function in healthy humans. The American journal of clinical nutrition 2004; 79(4): 674-81.
(2( Ward OP., Singh A. Omega-3/6 fatty acids: alternative sources of production. Process Biochemistry 2005; 40(12): 3627-3652.
(3) Sakuradani E., Kobayashi M., Ashikari T., Shimizu S. Identification of Δ12‐fatty acid desaturase from arachidonic acid‐producing Mortierella fungus by heterologous expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae and the fungus Aspergillus oryzae. European journal of biochemistry 1999; 261(3): 812-820.
(4) Myers RA., Worm B. Rapid worldwide depletion of predatory fish communities. Nature 2003; 423 (6937): 280-283.
(5) Ruiz-López N., Sayanova O., Napier A., Haslam RP. Metabolic engineering of the omega-3 long chain polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathway into transgenic plants. Journal of experimental botany 2012; 63(7): 2397-2410.
(6) Tan Li C. Cloning and functional analysis of the genes from entomopathogenic fungi involved in the biosynthesis of eicosatetraenoic acid (ETA). [Dissertation]. Saskatoon: University of Saskatchewan; 2010.
 
(7) Liu J., Li D., Yin Y., Wang H., Li M., Yu L. Δ6-Desaturase from Mortierella alpina: cDNA cloning, expression, and phylogenetic analysis. Biotechnology letters 2011; 33(10): 1985-1991.
(8) Maniatis T., Fritsch E., Sambrook F. Molecular cloning. A laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 1995.
(9) Sambrook J., Russell DW. Molecular cloning. A Laboratory Manual. 3ra. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 2001.
(10) Wang XQ., Rothnagel JA. 5′‐Untranslated regions with multiple upstream AUG codons can support low‐level translation via leaky scanning and reinitiation. Nucleic acids research 2004; 32(4): 1382-1391.
(11) Chen YQ., Edwards IJ., Kridel SJ., Thornburg T., Berquin IM. Dietary fat’gene interactions in cancer. Cancer and Metastasis Reviews 2007; 26(3-4): 535-551.
(12) Smith MA., Cross AR., Jones OT., Griffiths WT., Stymne S., Stobart K. Electron-transport components of the 1-acyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Δ12-desaturase (Δ12-desaturase) in microsomal preparations from developing safflower (Carthamus tinctorius L.) cotyledons. Biochemical journal 1990; 272(1): 23-29.
(13) Shanklin J., Achim C., Schmidt H., Fox BG., Münck E. Mössbauer studies of alkane ω-hydroxylase: evidence for a diiron cluster in an integral-membrane enzyme. Proceedings of the National Academy of Sciences 1997; 94(7): 2981-2986.
(14) Petrie JR., Shrestha P., Liu Q., Mansour MP., Wood CC., Zhou XR., et al. Rapid expression of transgenes driven by seed-specific constructs in leaf tissue: DHA production. Plant Methods 2010; 6(1): 1-6.