ارزیابی تجزیه زیستی آفت‌کش دیازینون توسط باکتری‌های بومی جداشده از خاک‌های آلوده

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد حشره‌شناسی گیاهی، دانشگاه ولی‌عصر(عج) رفسنجان، ایران

2 استادیار حشره‌شناسی گیاهی، دانشگاه ولی‌عصر (عج) رفسنجان، ایران

3 دانشیار بیماری‌شناسی گیاهی، دانشگاه ولی‌عصر(عج) رفسنجان، ایران

چکیده

مقدمه: آفت‌کش‌ها، ابزار قدرتمندی هستند که برای تأمین نیاز‌های غذایی جمعیت در حال رشد جهان، توسعه و کاربرد فراوانی یافته‌اند. مصرف بی‌رویه، این مواد را به تهدیدی جدی برای محیط‌‌زیست تبدیل کرده است دیازینون یکی از آفت‌کش‌های فسفره آلی است که برای کنترل طیف وسیعی از آفت‌ها استفاده می‌شود. بررسی‌های بسیاری درباره آثار سمیت این آفت‌کش در محیط‌زیست انجام شده است. استفاده از باکتری‌های تجزیه‌کننده یکی از راهکارهای حذف آفت‌کش‌ها از محیط‌های مختلف است.
مواد و روش‏‏ها: برای غربال‌گری باکتری‌های بومی تجزیه‌کننده این آفت‌کش از خاک‌های مناطق مختلف صنعتی و کشاورزی نمونه‌برداری و جداسازی باکتری‌ها در محیط پایه معدنی انجام شد. پس از غنی‌سازی نمونه‌ها در محیط‌کشت پایه معدنی، 10 جدایه متفاوت از نظر شکل ظاهری با کشت روی محیط‌کشت جامد جداسازی، خالص‌سازی و در حد جنس شناسایی شدند. میزان غلظت آفت‌کش دیازینون در حضور این جدایه‌ها در محیط‌کشت با دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی زیاد تعیین شد.
نتایج: در پژوهش حاضر، جدایه‌ها‌ی S1 و S2 از بین 10 جدایه تجزیه‌کننده دیازینون، ، غلظت آفت‌کش دیازینون را از غلظت اولیه 50 میلی‌گرم بر لیتر طی 15 روز پس از کشت به‌ترتیب به 18/3 و 21/5 میلی‌گرم بر لیتر رساندند؛ جدایه‌های یادشده نسبت به سایر جدایه‌ها بیشترین توان کاهش غلظت را داشتند. با توجه به رشد باکتری‌ها در محیط‌های‌کشت‌ فقیر استنباط می‌شود این جدایه‌ها از آفت‌کش دیازینون به‌عنوان منبع انرژی برای رشد خود استفاده می‌کنند. بر اساس نتایج تکثیر و تعیین توالی 16SrDNA، جدایه‌های S1 و S2 به‌ترتیب بیشترین شباهت را به جنس‌های Paenibacillus و Pseudomonas داشتند.
بحث و نتیجه‏گیری: نتایج پژوهش حاضر نشان دادند باکتری‌های تجزیه‌کننده آفت‌کش دیازینون در مناطق آلوده به این آفت‌کش و در فاضلاب‌های مناطق صنعتی وجود دارند. انتظار می‌رود با استفاده از این باکتری‌ها و روش‌های احیای زیستی، مشکلات زیست‌محیطی ناشی از آثار این آفت‌کش کاهش یابند و پس از بررسی در سطح میدانی و تعیین فرمولاسیون، از این جدایه‌ها برای پاکسازی زیستی استفاده شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Evaluation of diazinon pesticide biodegradation by isolated indigenous bacteria from contaminated soil

نویسندگان [English]

  • Arezoo Alipour 1
  • Ali Alizadeh 2
  • Pejman Khodaygan 3
1 M.Sc. Student of Entomology, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Vali-e-Asr University of Rafsanjan, Iran
2 Assistant professor of Entomology, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Vali-e-Asr University of Rafsanjan, Iran
3 Associate professor of Pathology, Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, Vali-e-Asr University of Rafsanjan, Iran
چکیده [English]

Introduction:Pesticides have been developed as powerful tools that apply for population feeding needs, all over the world. Pesticides’ overuse has become a serious issue about the environment. Among pesticides, diazinon is one of the organophosphorus inceticides that is used to control many different kinds of pests. There are a lot of researches about the toxicity effects of pesticides on the environment. However, one of the strategies to remove them from different environments is using degradation bacteria.
Materials and methods: For screening vernacular bacterium that are able to degrade the pesticide the sampling has been done from different soils of agriculture and industrial places, and the mineral salt medium was used for extvation of bacteria. After enrichment of samples in the mineral salt media, the isolation was done in the soild medium and 10 different sterains were based on morphology characters extracted and were identified to species level. The concentration of diazinon in the presence of bacteria was determined as a high performance liquid chromatography (HPLC).
Results: Among diazinon degradetion isolates S1 and S2 reduced the concentration of diazinon from 50 mg.l to 3.18 mg.l and 5.21 mg.l after 15 days, respectivly. The results indicated that S1 and S2 have higher efficiency to decreasing the amount of pesticide. Based on growing bacteria in the poor medium it’s shown that bacteria used diazinon as an energy source. Results indicated that amplification and sequencing of 16S rDNA of S1 and S2 isolated have the highest similarity with Paenibacillus and Pseudomonas, respectively.
Discussion and conclusion: Results of this study revealed that degradation bacteria of diazinon exist in the places that used this insecticide and in the waste of industrial zone. It is expected that using these bacteria and biological resuscitation, it is possible to reduce some environmental hazardus issues of diazinon and also field application and determining the best formulation for bioramidation are essential in the future.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bacteria
  • Biodegradation
  • Diazinon
  • Pseudomonas

مقدمه

آفت‌کش‌ها، ابزار قدرتمندی هستند که برای تأمین نیاز‌های غذایی جمعیت در حال رشد جهان، توسعه و کاربرد فراوانی یافته‌اند. توسعه کشاورزی و تنوع آفت‌ها از مهم‌ترین عوامل مصرف روزافزون آفت‌کش‌ها در سراسر جهان به‌ویژه کشورهای در حال توسعه هستند. مصرف بی‌رویه، این مواد را به تهدیدی جدی برای محیط‌زیست تبدیل کرده است. این مواد در شمار مهم‌ترین آلاینده‌های آب‌های سطحی، زیرزمینی و همچنین خاک هستند (1). حشره‌کش‌های آلی فسفره از مهم‌ترین آفت‌کش‌های دارای فسفر هستند؛ در این گروه، آفت‌کش‌هایی با ویژگی تماسی، گوارشی، نفوذی، تدخینی و سیستمیک وجود دارند. امروزه، این ترکیبات به دلایلی همچون ویژگی حشره‌کشی و کنه‌کشی شدید، اثرگذاری سریع، قابلیت متابولیسم سریع در بدن موجودات زنده، ویژگی نفوذی و سیستمیک برخی از آنها و همچنین تجزیه در خاک، آب و ایجاد آلودگی محیطی به‌طور گسترده به‌عنوان آفت‌کش و حشره‌کش استفاده می‌شوند (2). ازجمله آفت‌کش‌های فسفره آلی، دیازینون است که به‌طور گسترده در کشاورزی به کار برده می‌شود. ، از بین بردن پرندگان، آلودگی آب‌های سطحی و آثار مخرب روی گونه‌های آبزی مدنظر از نگرانی‌های زیست‌محیطی اولیه درباره استفاده از دیازینون هستند. به دیازینون و متابولیت‌های آن در مطالعه‌های هشداردهنده درباره سیستم‌های آبزی مختلف در سراسر جهان توجه شده است. دیازینون حلالیت محدودی در آب از 8/68 میلی‌گرم بر لیتر در 20 درجه سلسیوس دارد؛ این مقدار نشان می‌دهد دیازینون به خاک محدود نمی‌شود و به‌طور متوسط تحرک زیادی در خاک دارد (3). اگرچه این آفت‌کش به‌‌ندرت از طریق پوست جذب می‌شود، به‌راحتی از راه شش‌ها جذب و در سرتاسر بدن بدون تجمع در بافت‌ها پخش می‌شود. از آنجا که دیازینون محلول در چربی است، چنانچه مقادیر چشمگیری از آفت‌کش در بافت چربی ذخیره شود، سمیت تأخیری ایجاد می‌کند. مالاتیون، فورات، بروموفوس و متیل‌پاراتیون ازجمله حشره‌کش‌های فسفره (4) و حشره‌کش‌های فسفره آلی، استرهایی از نمک‌های آلی، فسفریک‌اسید و مشتق‌های آنها هستند. این حشره‌کش‌ها از مواد شیمیایی بسیار سمی برای انسان و حیوان محسوب می‌شوند و پایداری زیادی در محیط‌زیست دارند (5). از متداول‌ترین روش‌های استفاده‌شده برای حذف دیازینون عبارتند از: جذب حرارتی، شستشوی خاک‌های آلوده، حذف‌زیستی، تصفیه در زمین، فرآیندهای شیمیایی و فرایندهای اکسیداسیون مستقیم (6). حذف زیستی، روشی کم‌هزینه و بدون آسیب به زیست‌شناسی خاک و بوم‌سازگار است. ریزموجودات نقش حیاتی در تخریب و تجزیه ‌زیستی ترکیبات آلی دارند و از این آلاینده‌ها به‌عنوان منبع اصلی تغذیه خود استفاده و آنها را به مواد حل‌شدنی تبدیل می‌کنند؛ این فرایند با عنوان حذف ‌زیستی شناخته شده است (7). از اواخر دهه‌ 1960 میلادی، به تجزیه میکروبی آفت‌کش‌ها و پاکسازی محیط‌های آلوده با باکتری‌ها توجه شده است. برخی باکتری‌ها مانند گونه‌های فلاوباکتریوم (Flavobacterium sp.) و سودوموناس (Pseudomonas sp.)، ترکیبات فسفره آلی را با تولید آنزیم‌های فسفریک‌تری‌استرهیدرولاز تخریب می‌کنند (8). در روش حذف ‌زیستی، امکان حذف یک یا چند آلاینده محیطی در بستر آلودگی با هزینه‌ای بسیار کمتر از روش‌های تصفیه فیزیکی و شیمیایی وجود دارد و محصول باقیمانده، اثر مخربی بر اکوسیستم محل آلوده ندارد (9). در سال‌های اخیر، این رویکرد به دلایل ارزانی، سادگی، نداشتن تأثیر سو بر ویژگی‌های فیزیکی، شیمیایی و زیستی خاک در حال گسترش است. از آنجا که آفت‌کش دیازینون به‌طور وسیعی در بیشتر کشورها استفاده می‌شود، بر اثر استفاده مکرر باعث آلودگی محیط‌زیست ازجمله منابع خاک می‌شود (10). در پژوهش حاضر با نمونه‌برداری از مناطق مختلف آلوده به آفت‌کش‌ها و مناطق صنعتی دارای آلاینده‌های کربنی، چند جدایه از باکتری‌های بومی تجزیه‌کننده آفت‌کش دیازینون جدا‌سازی شدند‌ و غلظت دیازینون در حضور سویه‌های جداسازی‌شده با دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی زیاد (HPLC) اندازه‌گیری شد. جدایه‌هایی که توانایی بیشترین کاهش غلظت آفت‌کش دیازینون در محیط‌کشت را داشتند، به‌عنوان قوی‌ترین جدایه‌ها در تجزیه آفت‌کش دیازینون انتخاب، شناسایی و بیشتر بررسی شدند.

 

مواد روش‌ها

نمونه‌برداری: از زمین‌های کشاورزی آلوده به آفت‌کش دیازینون واقع در استان گلستان با مختصات "42 '4 °54 طول شرقی و "51 '44 °36 عرض شمالی در 39 کیلومتری جنوب‌غربی شهرستان گرگان و مناطق صنعتی ازجمله پساب کارخانه فولاد در شهرستان زرند و پساب مجتمع مس در شهرستان رفسنجان با مختصات "۲۰ '۵۲ °۵۵ طول شرقی و "۴۰ '۵۶° ۲۹ عرض شمالی در ۱۶۰ کیلومتری جنوب‌غربی کرمان و ۵۰ کیلومتری شهرستان رفسنجان نمونه‌برداری شد. با استفاده از دستکش، لایه رویی خاک (کاه و کلش) کنار زده شد و نمونه‌ها از عمق 0 تا10 سانتی‌متری خاک جمع‌آوری و داخل کیسه‌های پلاستیکی استریل ریخته شدند. در کیسه‌ها به‌خوبی بسته شد و تا زمان رسیدن به آزمایشگاه در دمای 4 درجه سلسیوس نگهداری شدند.

ترکیبات شیمیایی استفاده‌شده:آفت‌کش دیازینون لازم با درجه خلوص 95 درصد از کارخانه تولید فرآورده‌های شیمیایی ایران با فرمولاسیون امولسیون 60 درصد تهیه و استفاده شد. استاندارد آفت‌کش‌های دیازینون از شرکت سیگما آلدریچ خریداری شد. حلال‌های استونیتریل با درجه خلوص 99/99 درصد، نمک‌های منیزیم‌سولفات و سدیم‌کلرید با درجه خلوص 5/99 درصد تهیه شدند. از گاز نیتروژن با خلوص 99/99 درصد برای تبخیر حلال نهایی استفاده شد.

محیط‌کشت‌های استفاده‌شده:محیط نوترینت آگار طبق دستورعمل از پودر تجاری NA به میزان 20 گرم در لیتر تهیه شد.

محیط کینگز ب، طبق دستورعمل از پودر تجاری KB به میزان 5/33 گرم در لیتر و 10 میلی‌لیتر گلیسرین تهیه شد.

محیط‌کشت پایه معدنی معدنی[1] (MSM)

تهیه محیط‌کشت پایه معدنی: ترکیب محیط‌کشت نمک معدنی (MSM)، پتاسیم‌دی‌‌هیدروژن‌فسفات (1 گرم)، دی‌پتاسیم‌هیدروژن‌فسفات (1 گرم)، دی‌آمونیوم‌سولفات (1 گرم)، سولفات‌منیزیم (4/0 گرم)، کلرید‌آهن‌III (0004/0 گرم)، کلرید‌کلسیم (02/0 گرم) در هر لیتر محیط و اسیدیته محیط 7 است. پس از همگن‌کردن، محیط به مدت 15 دقیقه در دمای 121 درجه سلسیوس اتوکلاو شد. آفت‌کش دیازینون (تنها منبع کربن) با غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر جداگانه تهیه و به محیط اضافه شد (11)

تهیه سوسپانسیون خاک و جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کننده آفت‌کش‌ دیازینون: ابتدا محیط‌کشت پایه معدنی در آب مقطر ساخته و سپس اتوکلاو شد. پس از آن، 50 میلی‌گرم بر لیتر آفت‌کش دیازینون استریل‌شده (تنها منبع کربن) با فیلتر میلی‌پور به محیط اضافه شد. 100 میلی‌لیتر محیط داخل ارلن‌های 250 میلی‌لیتری ریخته شد. 10 گرم از هر نمونه‌ خاک در ارلن مایر ریخته و با محیط‌کشت آماده‌سازی‌شده به حجم 100 میلی‌لیتر رسانده شد. سپس 10 روز در گرمخانه دوار و دمای 28 تا 30 درجه سلسیوس با 150 دور در دقیقه قرار گرفت. پس از گذشت 10 روز، سری‌های رقت در آب مقطر استریل از نمونه تهیه شدند. 100 میکرولیتر از هر یک از رقت‌ها با میکروپیپت روی پلیت‌های حاوی محیط‌کشت کینگز ب کشت داده شد و پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در انکوباتور و دمای 25 درجه سلسیوس قرار داده شدند. پس از 24 ساعت، کلنی‌های رشدکرده روی هر یک از محیط‌کشت‌ها بررسی شدند.

خالص‌سازی باکتری‌ها:کلنی‌های متمایز از نظر رنگ یا شکل برای خالص‌سازی انتخاب شدند. جدایه‌ها در محیط لوریا برتانی حاوی 50 درصد گلیسرول سوسپانسیون و در دمای منفی 80درجه سلسیوس نگهداری شدند.

.استخراج DNA برای شناسایی مولکولی باکتری‌ها:نوکلئیک‌اسید جدایه‌ها به روش معمول فنل-کلروفرم با اندکی تغییر استخراج شد. جدایه‌ها در محیط آگار مغذی کشت و به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای 28 درجه سلسیوس نگهداری شدند. سوسپانسیونی از سلول‌های خالص باکتری (cfu/ml1012) در 500 میکرولیتر آب مقطر استریل تهیه و با افزودن سدیم‌دودوسیل‌سولفات 10 درصد تحت حرارت‌ پاره شد. سپس NaCl غلیظ (5/2 مولار) افزوده شد و محلول حاصل با دست تکان داده شد تا به‌خوبی مخلوط شود. پس از افزودن یک حجم کلروفرم و مخلوط‌کردن، 20 دقیقه در 6000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. فاز رویی به‌آرامی به لوله فالکن جدید منتقل و یک حجم فنل- کلروفرم به آن اضافه شد. پس از مخلوط‌کردن، سانتریفیوژ تکرار و دوباره به لایه رویی کلروفرم افزوده شد. پس از سانتریفیوژ، فاز رویی به میکروتیوپ منتقل و 1/0 حجم استات‌سدیم با غلظت 5/3 مولار به همراه یک حجم ایزوپروپانول سرد به آن اضافه شد. نمونه‌ها یک شب در دمای منفی 20 درجه سلسیوس نگهداری شدند. رسوب نوکلئیک‌اسید با 10 دقیقه سانتریفیوژ در 13000 دور در دقیقه حاصل و پس از شستشو با الکل 75 درصد و تبخیر کامل آن، 100 میکرولیتر آب مقطر استریل به هر میکروتیوپ اضافه شد. نمونه‌های DNA ژنومی تهیه‌شده تا زمان کاربرد در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، در دمای منفی 20 درجه سلسیوس نگهداری شدند. نمایندگان جدایه‌ها که قدرت تجزیه‌کنند‌گی مناسبی داشتند، پس از تعیین واکنش گرم، اکسیداز، کاتالاز، رشد در شرایط بی‌هوازی و توانایی تولید رنگدانه فلورسنت در محیط‌کشت کینگز ب، برای شناسایی مقدماتی انتخاب شدند. بخشی از ناحیه 16s rDNA از اپران ریبوزمی آنها به وسیله آغازگرهای عمومی تکثیر شد. مخلوط واکنش حاوی 20 پیکومول از آغازگرهای

 63Forward: 5ʹ AGCGGCGGACGGGTGA GTA ATGCAGCAGCCGCG 3ʹ و

 1387Revwrs: 5ʹ- AAGGAGGGGATCCAG CCGCAGGGTTG 3ʹ،

 2/0 میلی‌مولار مخلوط dNTPs (10 میلی‌مولار)، 2میلی‌مولار کلرورمنیزیم (50 میلی‌مولار)، 5/2 میکرولیتر بافر 10 برابر غلظت، 5/0 واحد Taq polymerase و 200 تا 300 نانوگرم DNA الگو در لوله‌های 200 میکرولیتری تهیه شد (12). شرایط زمانی و دمایی واکنش شامل مرحله واسرشت‌سازی اولیه در دمای 95 درجه سلسیوس به مدت 5 دقیقه، 30 چرخه شامل واسرشته‌سازی در دمای 95 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه، چسبیدن آغازگر به DNA ژنومی در دمای اتصال 55 درجه سلسیوس به مدت 1 دقیقه و تکثیر DNA در دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 5/1 دقیقه انجام شد. چرخه تکثیر نهایی در دمای 72 درجه سلسیوس به مدت 5 دقیقه انجام شد. الکتروفورز محصولات واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در ژل آگارز به همراه نشانگر مولکولی 100 جفت بازی (Fermentas. SM0323) انجام شد. برای تهیه ژل آگارز، پودر آگارز با حرارت در بافر TBE(1X) حل و پس از بستن ژل در محفظه ژل استفاده شد. الکتروفورز محصول PCR ویژه روی ژل آگارز 1 تا 5/1 درصد انجام شد. 5 میکرولیتر از محصول PCR با 2 میکرولیتر محلول رنگ بارگذاری مخلوط و در چاهک ژل ریخته شد. الکتروفورز در اختلاف پتانسیل ثابت 100 ولت انجام و با رسیدن رنگ به 1 سانتی‌متری انتهای ژل پایان یافت. ژل‌ها با  red safeرنگ‌آمیزی و با دستگاه ژل‌داکیومنت مدل Kiagene مشاهده و عکس‌برداری شدند.

بررسی میزان کارایی حذف دیازینون توسط سویه‌های شناساییشده:آماده‌سازی نمونه‌ها بر اساس روش اصلی کچرز[2]، استخراج با استونیتریل و خالص‌سازی با گاز ازت انجام شد (13). به این منظور، 100 میلی‌لیتر از محیط‌کشت پایه معدنی استریل با غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر از آفت‌کش دیازینون تهیه و به ارلن‌های 100 میلی‌لیتری منتقل شد. سپس، از هر باکتری مدنظر کشت‌شده روی محیط نوترینت آگار، سوسپانسیونی در آب مقطر استریل تهیه و پس از آنکه جذب نوری سوسپانسیون یادشده در طول موج 600 نانومتر به 1/0 رسید، 1 میلی‌لیتر از آن به هر ارلن حاوی 100 میلی‌لیتر محیط‌کشت مایه‌زنی و به مدت 10 روز داخل انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجه سلسیوس و 150 دور در دقیقه قرار داده شد. برای آماده‌سازی نمونه، 4 میلی‌لیتر از محیط داخل هر ارلن برداشته و داخل لوله فالکن 50 میلی‌لیتری ریخته شد و 2 میلی‌لیتر حلال آلی استونیتریل به آن اضافه شد. سپس برای آب‌گیری طبق استاندارد کچرز، 6/1 گرم سولفات‌منیزیم بدون آب به هر لوله فالکن اضافه و به مدت 10 دقیقه در 600 دور در دقیقه سانتریفیوژ و فاز آلی از فاز آبی جدا شد. سپس 1 میلی‌لیتر از فاز رویی با استفاده از گاز ازت خشک و 1 میلی‌لیتر استونیتریل به حجم رسید و به دستگاه HPLC تزریق شد. میزان تجزیه آفت‌کش‌ دیازینون توسط جدایه‌های باکتریایی از طریق مقایسه زمان بازداری پیک‌های مشاهده‌شده در کروماتوگرام حاصل از نمونه با کروماتوگرام حاصل از تزریق محلول‎های استاندارد انجام شد. غلظت آفت‌کش‌ نیز با استفاده از عدد سطح زیر پیک نمونه‌ها و قراردادن آن در رابطه منحنی کالیبراسیون استاندارد آفت‌کش‌ها (رابطه 1) محاسبه شد.

ویژگی‌های دستگاه HPLC برای شناسایی و تعیین مقدار دیازینون: فاز متحرک دستگاه آب و استونیتریل به نسبت20 به 80، شدت جریان 5/1میلی‌لیتر بر دقیقه، دمای ستون 30 درجه سلسیوس و طول موج 254 نانومتر بود. برای استفاده از دستگاه، ابتدا چند محلول با غلظت‌های معین دیازینون در استونیتریل تهیه و به دستگاه تزریق شدند تا زمان بازیابی دیازینون یافت و با داشتن غلظت‌های مشخص سطح زیر پیک منحنی استاندارد دیازینون مشخص شود. نمونه‌های حاصل از مرحله استخراج با سرنگ به دستگاه تزریق شدند، نرم‌افزار دستگاه غلظت ماده مجهول را بر مبنای نسبت مساحت‌ها محاسبه کرد.

تزریق و رسم خط کالیبراسیون: پیش از تزریق نمونه‌ها، ابتدا باید خط کالیبراسیون مربوط به آفت‌کش رسم شود. منظور از این آزمایش، یافتن زمان دقیق بازداری و همچنین تهیه رابطه شیب خط برای محاسبه میزان غلظت آفت‌کش در نمونه‌هاست. به این منظور، 20 میکرولیتر از استاندارد آفت‌کش‌ دیازینون تهیه‌شده از شرکت سیگما آلدریج با غلظت‌های 1، 5، 10، 15 میلی‌گرم بر لیتر در حلال مناسب (استونیتریل) تهیه و به دستگاه تزریق شد، سپس منحنی کالیبراسیون مربوط به آنها رسم شد. شناسایی آفت‌کش‌ موجود در نمونه‌ها از طریق مقایسه زمان بازداری پیک‌های مشاهده‌شده در کروماتوگرام حاصل از نمونه با کروماتوگرام حاصل از تزریق محلول‎های استاندارد انجام شد. غلظت آفت‌کش دیازینون نیز با استفاده از عدد سطح زیر پیک نمونه‌ها و قراردادن آن در (رابطه 1) منحنی کالیبراسیون استاندارد آفت‌کش‌ها محاسبه شد:

رابطه 1

Y=MC+I

در این رابطهY، M، C و I به‌ترتیب پاسخ دستگاه، غلظت، شیب خط و عرض از مبدأ را نشان می‌دهند (14)

محاسبه حد تشخیص و درصد بازیابی آفت‌کش‌ دیازینون:برای مشخص‌شدن میزان تشخیص و درستی دستگاه، آزمایشی با ‌عنوان محاسبه حد تشخیص و درصد بازیابی انجام شد. با تعیین درصد بازیابی نتیجه گرفته می‌شود روش خالص‌سازی تا چه حد صحیح انجام شده و حد تشخیص دستگاه مدنظر چند درصد از غلظت آفت‌کش موجود در نمونه را بروز داده است. حد تشخیص[3] برای آفت‌کش‌ دیازینون از رابطه 2 محاسبه شد:

رابطه 2

 

در اینجا، Sy/x خطای برگشت x به y و m شیب منحنی کالیبراسیون است.

 Sy/xنیز از رابطه 3 محاسبه شد:

رابطه 3

Sy/x=

در این رابطه yiنقاط انفرادی خط کالیبراسیون، yj مقدار y منطبق‌شده روی خط کالیبراسیون و x تعداد نقاط منحنی کالیبراسیون است.

در این روش، برای اندازه‌گیری باقیمانده آفت‌کش و تجزیه آفت‌کشی که ریزموجودات در محیط‌کشت انجام می‌دهند، 100 درصد باقیمانده‌ موجود در محیط‌کشت به دلیل وجود ماتریس‌ها و ترکیبات مزاحم و همچنین وجود مقداری آب در محیط‌کشت استخراج نمی‌شود. از این رو، در روش‌های جدید برای استخراج آفت‌کش از محیط آبی توصیه می‌شود از روش کروماتوگرافی ستونی استفاده شود. پیش از انجام عملیات روی نمونه‌های اصلی، ابتدا باید آزمایش بازیابی ((Recovery انجام شود؛ به این شکل که مقداری از محیط‌کشت مدنظر با غلظت معین آفت‌کش، انتخاب و با اضافه‌کردن غلظت‌های مشخص آفت‌کش و انجام عمل استخراج و خالص‌سازی مطابق روش‌های یادشده به دستگاه تزریق و مقدار باقیمانده‌ هر آفت‌کش اندازه‌گیری شد. با توجه به مقدار آفت‌کش اضافه‌شده و باقیمانده‌ای که دستگاه به دست می‌آورد،درصد بازیابی روش استخراج محاسبه شد. محاسبه درصد بازیابی برای هر آفت‌کش جداگانه و از طریق اضافه‌کردن مقادیر متفاوتی از غلظت هر آفت‌کش (بنا بر غلظت آن در نمونه) به محیط‌کشت آماده‌شده انجام شد (رابطه 4)

 

رابطه 4

 

 


.استفاده از الگوی سینتیکی برای بررسی روند کاهشی آفت‌کش‌ها و محاسبه DT50:پس از محاسبه غلظت نمونه‌ها در 3، 6، 9 و 15روز پس از کشت، غلظت‌های حاصل از طریق الگوی سینتیکی مرتبه اول (First-order kinetics model) برازش شدند. نیمه‌عمر (DT50) در این الگو از رابطه‌های 5 و 6 محاسبه می‌شود:

رابطه 5

[C]t = [C]1 e-kt

رابطه 6

DT50 = Ln (2) × K-1

[C]t غلظت ترکیب (میلی‌گرم برلیتر) در زمان t، [C]1 غلظت اولیه ترکیب در زمان صفر که از طریق رابطه‌ کینتیک مرحله اول تجزیه می‌شود، K ثابت سرعت تجزیه و t زمان برحسب روز (15)

تجزیه و تحلیل داده‌ها:برای تجزیه و تحلیل آماری داده‌های حاصل در پژوهش حاضر، از نرم‌افزار (SPSS21) استفاده شد. برای بررسی تأثیر سویه‌های باکتریایی بر کاهش غلظت آفت‌کش، آزمایش در سه تکرار و قالب طرح کاملأً تصادفی انجام شد. مقایسه میانگین داده‌ها با آزمون چنددامنه‌ای دانکن در سطح احتمال 5 درصد انجام شد. از آزمون کولموگروف- اسمیرنوف در سطح اطمینان 95 درصد برای بررسی توزیع و آزمون نرمال‌بودن داده‌ها استفاده شد. جدایه‌ها با توالی‌یابی ناحیه 16S rDNA شناسایی شد.

 

نتایج

جداسازی و خالص‌سازی باکتری‌های تجزیه‌کننده دیازینون:پس از انتقال نمونه‌های خاک و رسوبات از مناطق مختلف کشاورزی و صنعتی به آزمایشگاه و تهیه‌ سوسپانسیون در محیط‌کشت پایه معدنی حاوی50 میلی‌گرم بر لیتر آفت‌کش‌ دیازینون و سپس کشت آنها روی محیط‌کشت جامد، 10 کلنی مختلف از نظر شکل ظاهری در محیط‌های حاوی این آفت‌کش‌ها رشد کردند که با نام‌های  S1تا S10 کدگذاری شدند جدایه S1 دارای واکنش گرم، اکسیداز و کاتالاز مثبت و بی‌هوازی اختیاری بود و در بررسی تطابقی انجام‌شده با نرم‌افزار بلاست، 99 درصد به جنس Paenibacillusشباهت داشت (شکل 1). جدایه S2 باکتری گرم منفی با توان تولید رنگدانه فلورسنت روی سطح محیط‌کشت KB، واکنش گرم منفی و واکنش اکسیداز و کاتالاز مثبت بود؛ این باکتری در آزمون بررسی نیاز به اکسیژن، هوازی ارزیابی شد. نتیجه بررسی تشابه در ناحیه 16s rDNAنشان داد این باکتری 99 درصد به گونه Pseudomonas stutzeri شباهت دارد (شکل 2).

منحنی کالیبراسیون آفت‌کش دیازینون: پس از تزریق محلول استاندارد 1، 5، 10، 15 میلی‌گرم بر لیتر آفت‌کش دیازینون به دستگاه کروماتوگرافی مایع، منحنی کالیبراسیون آن رسم شد (شکل 3).

محاسبه حد تشخیص و درصد بازیابی آفت‌کش‌ دیازینون:برای تعیین میزان تشخیص و درستی دستگاه، آزمایش محاسبه حد تشخیص و درصد بازیابی انجام شد. نتایج تعیین درصد بازیابی نشان دادند روش خالص‌سازی تا درصد زیادی به‌درستی انجام شده و درصد بازیابی دیازینون برابر با 102درصد است. حد تشخیص دستگاه مدنظر نیز حد زیادی از غلظت آفت‌کش موجود در نمونه را جداسازی کرد و برابر با 004/0میلی‌گرم بر کیلوگرم نشان داد.

 

شکل 1- درخت فیلوژنتیکی ترسیم‌شده به روش ML، نشان‌دهنده‌ ارتباط ژنتیکی توانمندترین جدایه (S1) تجزیه‌کننده‌ آفت‌کش دیازینون در مقایسه با تعدادی از استرین‌های موجود در بانک ژن بر اساس تشابه توالی ناحیه 16s rDNA

شکل 2- درخت فیلوژنتیکی ترسیم‌شده به روش ML، نشان‌دهنده‌ ارتباط ژنتیکی توانمندترین جدایه S2) ( تجزیه‌کننده‌ آفت‌کش دیازینون در مقایسه با تعدادی از استرین‌های موجود در بانک ژن بر اساس تشابه توالی ناحیه 16s rDNA

 شکل 3- منحنی کالیبراسیون آفت‌کش دیازینون


بررسی میزان مصرف و کاهش دیازینون توسط جدایه‌ها:مقدار باقیمانده آفت‌کش دیازینون در محیط‌کشت MSM که جدایه‌های S1 و S2 در آن به‌طور جداگانه کشت داده شده بودند، در روزهای 3، 6، 9، 12و 15 پس از کشت از طریق آماده‌سازی هر نمونه با روش کچرز و تزریق به دستگاه محاسبه شد. غلظت‌های محاسبه‌شده با غلظت نمونه‌های شاهد مقایسه شدند که در آنها هیچ جدایه باکتری تلقیح نشده بود. غلظت آفت‌کش در هر نمونه با توجه به سطح زیر پیک مشخص شد، به‌طوری که پیش از تزریق نمونه‌ها، استاندارد آفت‌کش دیازینون به دستگاه تزریق و زمان بازداری آن محاسبه شد. منحنی کالیبراسیون بر اساس زمان بازداری و سطح زیر پیک استاندارد در غلظت‌های متفاوت رسم و غلظت آفت‌کش بر اساس رابطه خط حاصل محاسبه شد. زمان بازداری برای آفت‌کش دیازینون در زمان 567/2 دقیقه بود (شکل 4). شکل 5، کروماتوگرام نمونه شاهد و میزان تجزیه آفت‌کش با غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر بدون حضور باکتری است که تمام مراحل استخراج روی آن انجام شده است؛ غلظت آفت‌کش 15 روز پس از تلقیح به59/15 میلی‌گرم بر لیتر رسید، در حالی که غلظت آفت‌کش درحضور جدایه‌های S1 (شکل 6) و S2 (شکل 7) به‌ترتیب به 18/3 و 21/5 میلی‌گرم بر لیتر کاهش یافت. این نشان می‌دهد کاهش غلظت آفت‌کش در نمونه‌ها در اثر فعالیت باکتری و استفاده آفت‌کش موجود در محیط به‌عنوان منبع کربن و فسفر توسط جدایه‌هاست. همچنین نتایج مربوط به برازش الگوی سینتیکی (رابطه‌های 5 و 6) مقادیر باقیمانده دیازینون در حضور جدایه‌های تجزیه‌کننده S1 و S2 و پارامترهای برآورده‌شده در این الگو معنادار هستند. جدول 1، شاخص‌های نیمه‌عمر حشره‌کش دیازینون در حضور جدایه‎های S1 و S2 و مقایسه آن با شاهد را نشان می‌دهد. بر اساس این، نیمه‌عمر دیازینون در حضور جدایهS1 و S2 به‌ترتیب برابر 79/3 و 87/3 روز محاسبه شد، در حالی که نیمه‌عمر آفت‌کش دیازینون در نمونه شاهد برابر 9/8 روز است.

 

 شکل 4- کروماتوگرام مربوط به استاندارد آفت‌کش دیازینون (علامت پیکان مربوط به پیک دیازینون است)

 

شکل 5- نمودار دیازینون شاهد ( میزان تجزیه آفت‌کش دیازینون با غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر بدون حضور باکتری است که تمام مراحل استخراج روی آن انجام شده است) و علامت پیکان به پیک دیازینون مربوط است.

 

شکل 6- نمودار تجزیه دیازینون توسط باکتری S1 ( میزان تجزیه آفت‌کش دیازینون با غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر با حضور باکتری S1 است که تمام مراحل استخراج روی آن انجام شده است) و علامت پیکان به پیک دیازینون مربوط است.

 

شکل 7- نمودار تجزیه دیازینون توسط باکتری  S2(میزان تجزیه آفت‌کش دیازینون با غلظت 50 میلی‌گرم بر لیتر با حضور باکتری S2 است که تمام مراحل استخراج روی آن انجام شده است) و علامت پیکان به پیک دیازینون مربوط است.

 

جدول 1- شاخص‌های نیمه‌عمر حشره‌کش دیازینون در حضور جدایه‎های S1 و S2 و مقایسه آن با شاهد

زمان (روز)

شاهد

S1

S2

0

50

50

50

3

27/48

11/44

54/25

6

54/43

10/35

05/36

9

53/34

27/15

23/15

12

35/24

20/9

21/10

15

59/15

18/3

21/5

K

0773/0

1839/0

179/0

DT50

9/8

79/3

87/3

P<.05

....

03/0

048/0

بحث و نتیجه‌گیری

تاکنون پژوهشگران، باکتری‌های تجزیه‌کننده آفت‌‌کش‌های کشاورزی را در محیط‌های مختلف و اکوسیستم‌های خاکی و آبی متفاوت بررسی کرده‌اند. همچنین، پژوهشگران بسیاری باکتری‌های بومی جداشده از خاک‌های آلوده به آفت‌کش‌های فسفره مانند دیازینون را بررسی کرده‌اندY ازجمله تام[iv] و همکاران (2000) گزارش کردند تعداد باکتری‌های تجزیه‌کننده آفت‌کش دیازینون در خاک‌‌های آلوده هند بسیار زیاد است و توان درخور توجهی برای تجزیه آفت‌کش دیازینون دارند و این تعداد، با اضافه‌شدن دیازینون به خاک افزایش می‌یابد (16). در پژوهش‌های دیگر، باکتری‌های متنوعی به‌عنوان باکتری‌های توانا در تجزیه آفت‌کش دیازینون و سایر ترکیبات جداسازی شدند که برخی از آنها مشابه باکتری‌های جداشده در پژوهش حاضر هستند؛ ازجمله تیان[v]و همکاران (2008) باکتری‌های تجزیه‌کننده آفت‌کش دیازینون از جنس‌های سودوموناس و باسیلوس را از مناطق آلوده در مصر جداسازی کردند. در کل، باکتری‌های سودوموناس پوتیدا و سودوموناس آئروژینوزا توانایی زیادی در تجزیه آفت‌کش‌های فسفره ازجمله دیازینون و برخی ترکیبات نفتی دارند. باکتری‌های متعلق به جنس‌های مختلف، آفت‌کش‌ها را تجزیه می‌کنند. در سراسر جهان، افزایش آگاهی از ماندگاری و سمیت آفت‌کش‌های فسفره آلی و آثار جبران‌ناپذیر آنها بر انسان و اکوسیستم‌های مختلف زمین سبب توجه بیشتر به تجزیه میکروبی این آفت‌کش‌ها شده است (17). در سال 1973، روزنبرگ و الکساندر[vi] شکاف میکروبی را عامل اصلی تجزیه حشره‌کش‌های فسفره آلی دانستند (18). در سال 2004، کانکار[vii] با بررسی گسترده تجزیه میکروبی 10 نمونه خاک در هند، 22 سویه باکتری متعلق به جنس‌های Planococcus، Bacillus، Arthrobacter، Pseudomonas و Stomatocucus را از خاک‌هایی جداسازی کرد که مدت زیادی در معرض حشره‌کش‌های فسفره آلی بودند (19). در سال 2009، کیکن[viii] و همکاران با بررسی خاک‌های کشاورزی هند که مدت زیادی در معرض آفت‌کش‌های فسفره آلی از‌جمله دیازینون بودند، باکتری‌های تجزیه‌کننده‌ای را از جنس‌های مختلف Pseudomonas sp. و Flavobacterium sp. شناسایی کردند (11). پژوهشگران مختلف بارها توانایی این گونه‌ها در تجزیه زیستی آلاینده‌ها را گزارش کرده‌اند و بسیاری از مطالعه‌های پیشین به جداسازی این گونه‌ها از محیط‌های آبی و خاکی منجر شده‌اند. در تمام این مطالعه‌ها، توانایی گونه‌های باکتریایی در استفاده از آلاینده‌های آلی و همچنین هیدروکربن‌های نفتی به‌عنوان تنها منبع کربن و انرژی تأیید شده است و امروزه در مهندسی ژنتیک استفاده می‌شوند؛ به‌ویژه جنس سودوموناس‌ها که به زیررده گاما از پروتوباکترها تعلق و نقش بسیار مهمی در فعالیت متابولیکی محیط‌زیست مانند چرخه عناصر و تجزیه‌ آلاینده‌های ناشی از فعالیت‌های زیستی و غیر زیستی دارند. به توانایی سودوموناس‌ها در فعالیت‌های زیست‌فناوری به‌ویژه در زمینه تجزیه زیستی نیز بسیار توجه شده است (20). مشخص شده است باکتری‌های جنس سودوموناس، توانایی بسیار زیادی در استفاده از ترکیبات سمی، آلایندهای آلی و همچنین ترکیبات نفتی و آروماتیک دارند و از این رو، این باکتری‌ها بارها از انواع اکوسیستم‌های آلوده به ترکیبات مختلف جدا شده‌اند و علاوه بر، تجزیه آفت‌کش‌ها، توانایی تجزیه ترکیبات پلی‌آروماتیک حلقوی ازجمله نفتالن و سایر ترکیبات نفتی را دارند (21). این باکتری‌ها، مواد آلی را در حضور اکسیژن (پذیرنده الکترونی) و از راه‌های بیوشیمیایی تجزیه هوازی تجزیه می‌کنند. چرخه‌ تنفسی باکتری‌های تجزیه‌کننده ازجمله سودوموناس‌ها شامل سیتوکروم‌های مختلف و انواع گوناگون اکسیدازهای انتقالی متصل به اکسیژن است. جنس سودوموناس از معمول‌ترین باکتری‌هایی است که در بیشتر گزارش‌های مربوط به تجزیه زیستی وجود دارد (22). گونه‎های بسیاری در تجزیه ترکیبات فسفره و سایر آفت‌کش‌ها جداسازی شده‌اند ولی گونه‌های باسیلوس و سودوموناس، توانمندترین گونه‌های شاخص شناخته شده‌اند و حضور آنها در بیشتر شرایط محیطی، عامل مهمی است که استفاده از آنها را در بیشتر محیط‌ها ممکن می‌کند (23). نتایج پژوهش حاضر نشان دادند در فلور باکتریایی خاک‌های آلوده به آفت‌کش دیازینون، باکتری‌هایی با قابلیت سازگا‌رشدن با دیازینون وجود دارند؛ به این معنا که آلودگی با ترکیبات سمی آفت‌کش‌ها مانع رشد باکتری‌های خاک در محیط‌های آلوده نیست. همچنین نتایج سنجش باقیمانده آفت‌کش‌ دیازینون با کروماتوگرافی مایع با کارایی زیاد نشان داد که باکتری‌های جداسازی‌شده از نمونه‌های خاک، توانایی استفاده از این آفت‌کش‌ها را به‌عنوان منبع کربن در شرایط آزمایشگاهی دارند. این باکتری‌ها از آفت‌کش موجود در محیط‌کشت‌های فقیر برای رشد خود استفاده می‌کنند و سبب کاهش غلظت آفت‌کش در محیط‌کشت می‌شوند. داده‌های پژوهش حاضر نشان می‌دهند باکتری‌های موجود در خاک آلوده که جداسازی و کشت شده‌اند، دیازینون را تجزیه و از آفت‌کش دیازینون به‌عنوان منبع غذایی استفاده می‌کنند. با توجه به سمیت زیاد آفت‌کش‌های فسفره و حضور غلطت‌های بحرانی آنها در خاک و آب‌های زیرزمینی، ریزموجودات موجود در رسوبات و خاک‌ها به علت سازگارشدن، توانایی زیادی در تجزیه این ترکیبات دارند. باکتری‌های موجود در مناطق آلوده که در پژوهش حاضر جداسازی و کشت شدند، آفت‌کش فسفره دیازینون را تجزیه می‌کنند. باکتری‌های یادشده این آفت‌کش را به‌عنوان منبع غذایی کربن و فسفر استفاده می‌کنند و باعث تجزیه و کاهش غلظت این ترکیب می‌شوند. نتایج HPLC در پژوهش حاضر نیز قدرت زیاد باکتری‌های جداشده را در تجزیه این آفت‌کش‌ها نشان دادند. از این رو، این باکتری‌ها باکتری‌های بومی منطقه در نظر گرفته می‌شوند و با توجه به اینکه حذف‌ زیستی آلاینده‌ها رویکردی برای حفظ محیط‌زیست است، پیشنهاد می‌شود از ریزموجودات جداشده که توانایی خوبی در تجزیه این آفت‌کش نشان داده‌اند به شرط آزمایش در شرایط خاک و آب، برای کاربرد نهایی رفع آلودگی‌های زیست‌محیطی ناشی از این آفت‌کش استفاده شود.



[1]- Mineral Salt Medium

[2]- QUEChERS

[3]- Limit of detection

[iv]- Tam

[v]- Tiyan

[vi]- Rosenberg and Alexander

[vii]- Kanekar

[viii]- Cycon

(1)  Singh BK., Walker A., Morgan JAW., Wright, DJ. Biodegradation of chlorpyrifos by Enterobacter strain B-14 and its use in bioremediation of contaminated soils. Applied and Environmental Microbiology 2004; 70: 4855-4863.
(2)  Casida JE., Quistad GB., Organophosphate Toxicology: safety aspects of nonacetylcholinesterase secondre tragets. Recerch Toxicology 2004; 17(8): 983-988.
(3)  Hward PH. Hand Book of Enviromental Fate and Exposare Data for organic chemicals pesticides. Environ Micbiology; 1989; 14: 926-930.
(4)  Yang Y., Yang J., Zhao J., Song Y., Gao L., Yang R., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Journal of Basic and Applied Sciences 2015; 79: 502-510.
(5)  Massoud M., Abdel-Megeed A., Saad A., Khalil DH. Bacterial Strains from the Rhizosphere for Remediation of Certain Pesticides. Advanced Materials Research 2011; 70: 1143-1150.
(6)  Zeinat Kamal M., Nashwa A., Mohamed AI., Sherif EN. Biodegradation and detoxification of malathion by of Bacillus thuringiensis MOS-5. Australian Journal of Basic and Applied Sciences 2008; 2: 724-732.
(7)  Liu ZY., Chen X., Shi Y., Su ZC. Bacterial degradation of chlorpyrifos by Bacillus cereus. Advanced Materials Research 2012. 37; 676-680.
(8)  Ewida AY. Biodegradation of alachlor and Endosulfan Using environmental bacterial strains. World Applied Sciences Journal 2014; 32: 540-547.
(9)  Agamuthu P., Tan YS., Fauziah SH. Bioremediation of Hydrocarbon Contaminated Soil Using Selected Organic Wastes. Procedia Environmental Sciences 2013; 18: 694-702.
(10)             Jabeen H., Iqbal S., Anwar S. Biodegradation of chlorpyrifos and 3, 5, 6‐trichloro‐2‐pyridinol by a novel rhizobial strain Mesorhizobium sp. HN3. Water and Environment Journal 2014; 15: 300-306
(11)             Cycon M., Wojcik M., Piotrowska-Seget, Z. Biodegradation of the organophosphorus insecticide diazinon by Serratia sp. and Pseudomonas sp. and their use in bioremediation of contaminated soil. Journal of Chemosphere 2009; 76: 494-501.
(12)             Marchesi JR., SatoT., Weightman AJ., Martin TA., Fry JC., Hiom SJ., et al. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology 1998; 64(2): 795-799.
(13)             Anastassiades M. Determination of Pesticide Residues Using GC-MS and/or LC-MS (/MS) following acetonitrile extraction/ paratitioning and cleanup by dispersive  SPE- QUChERS method. Journal of Agricultural and food chemistry 2007; 48: 2987-2995.
(14)             Chakrabraty AM., Chou G., Gumsalus IC. Genetic regulation of octane dissimilation plasmid in Pseudomonas. Applied Enviromental Microbiology 1973; 62: 1137-1140.
(15)             Focus S. Guidance document on estimating persistence and degradation kinetics from environmental fate studies on pesticides in EU registration. Journal of Agricultural and Food chemistry 2006; 48: 3095-3097.
(16)             Tam NF., Guo CL., Yau C., Wong Y.S. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by microbial cocsortia enriched from mangrove sediments. Journal of Water Scince Technology 2003; 48(8): 177-183.
(17)             Tian Y., Liu HJ., Zheng TL., Kwon K.K., Kim SJ. The biochemistry and uses of pesticides. Journal of Biotechnology 2008; 8(22): 6301-6303.
(18)             Rosenberg A., Alexander M. Microbial cleavage of various organophosphorus insecticides. Applied and Environmental Microbiology 1979; 37: 886-891.
(19)             Kanekar P., Bhadbhade B., Deshpande M. Biodegreadtion of Organophosphorus pseticides, International conference on Harmonisation (ICH) 2004; 12: 400-403.
(20)             Nelson KE., Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Journal of Einvironmental Microbiology 2002; 4(12): 799-808.
(21)             Nnamchi CI., Obeta JNA., Ezeogu LI. Isolation and characterization of some poly aromatic hydrocarbon degrading from Nsukka soils in Nigeria. International Journal of Environmental 2006; 3(2): 181-190.
(22)             Minoui S. Effect of heavy crude oil on the pattern of respiratory chain of Pseudomonas sp. International Journal of Environmental 2008; 47: 760-765.
(23)           Okoh AI. Biodegradation of Bonny light crude oil in soil microcosm by bacterial strains isolated from crude oil flow stations saver pits in Nigeria. International Journal of Environmental Research Public Health 2003; 6: 278-309.