نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی کارشناسی ارشد ژنتیک، دانشکده علوم، دانشگاه شهرکرد، ایران
2 دانشیار ژنتیک، دانشکده علوم، دانشگاه شهرکرد، ایران
3 استاد میکروبیولوژی، دانشکده دامپزشکی، دانشگاه شهرکرد، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction: Microorganisms in response to drug development, acquire resistance through a variety of mechanisms. The prevalence of resistance to fluoroquinolones (FQ), such as ciprofluxacin in Escherichia coli has increased markedly in recent years. Mutagenesis induced by SOS catalyzes the evolution of resistance to fluoroquinolones. A member of the SOS regulon is the dinI gene. Protein encoded by the gene DinI acts as positive and negative modulator of RecA performance. Previous studies showedrecA gene expression in ciprofloxacin resistant Escherichia coli dinI+ in which mutants increased. The aim of this study was to investigate recA gene expression in dinI-mutant resistant to ciprofloxacin
Materials and Methods: For this purpose, dinI- mutant became ciprofloxacin resistant by encountering to increase amount of ciprofloxacin via stepwise method and be evaluated for MIC. Then, the expression of recA gene was determined in wild type, dinI- and a dinI+ mutants by real time PCR.
Results: The results showed that a dinI- mutant acquired low level of resistance to ciprofloxacin and its MIC was 0.3 µg/ml. recA gene expression in the dinI- mutant was increased in comparison with wild type strain. However, the amount of increase was about one fourth of increase in dinI+ mutant.
Discussion and conclusion: In conclusion, inactivation of dinI gene does not inhibit increase in recA gene expression and regulation of RecA activity is possibly complex and could be conducted in the absence of dinI by other regulatory proteins.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
مقاومت آنتیبیوتیکی یکی از نگرانیهای جهانی در پزشکی است؛ با وجود گونههای بیماریزای بسیار مقاوم، درمان بیماریهای ناشی از آنها مشکل است و در این زمینه، دارویهای جدید در حال توسعه هستند. باکتریها به آنتیبیوتیکهای فلوروکینولون مقاوم میشوند و پیشرفتهایی در درک مقاومت به این عوامل حاصل شده است (1). کینولونها و فلوروکینولونها، گروه بهنسبت جدیدی از آنتیبیوتیکهای سنتتیک با فعالیت گسترده ضد باکتریایی قوی در برابر تعداد بسیاری از بیماریزاهای مهم بالینی مسئول بسیاری عفونتها مانند عفونتهای مجاری ادراری، عفونتهای دستگاه گوارش، عفونتهای دستگاه تنفس، بیماریهای منتقلشونده جنسی و عفونتهای پوست هستند (2). در حال حاضر، سیپروفلوکساسین شایعترین فلوروکینولون برای تجویز دارویی است (1). در سالهای اخیر، شیوع مقاومت به فلوروکینولونها در اشریشیا کلی بهطور چشمگیری افزایش یافته است (3). اشریشیا کلی عضو مهمی از میکروفلورهای روده انسان و دیگر پستانداران است و چند سویه مختلف آن به وسیله عوامل بیماریزا که بر تعداد وسیعی از فرآیندهای سلولی اثر میگذارند، باعث بیماریهای مختلف رودهای و خارج رودهای میشوند (4). پاسخ SOS، مسیرکلاسیک پاسخ به تنش باکتریایی است که هنگام آسیب DNA به دلیل محدوده وسیعی از عوامل تنشزا مانند آنتیبیوتیکها القا میشود. فلوروکینولونها، آنتیبیوتیکهای قوی و کشندهای هستند که DNA جیراز را مهار میکنند و باعث تثبیت شکست دو رشته، توقف چنگال همانندسازی و در نهایت مرگ سلولی میشوند. از آنجا که فلوروکینولونها باعث تثبیت شکست دو رشته میشوند، از القاکنندههای پاسخ SOS هستند و احتمالاً موتانزایی ناشی از SOS، توسعه مقاومت به فلوروکینولونها را القا میکند (5). در E.coli، پاسخ SOS به محض آسیب DNA القا میشود و در نتیجه، افزایش بیان مجموعهای از ژنهای درگیر در ترمیم DNA و دیگر عملکردها اتفاق میافتد (6). RecA، نقش اصلی را در نوترکیبی، ترمیم و القای SOS از راه شکلگیری فیلامنتهای RecA-DNA ایفا میکند (7). ژن dinI، یک ژن SOS است که روی موقعیت min 6/24 کروموزوم E.coli قرار دارد و پروتئین کوچکی با 81 آمینواسید را کد میکند (6). با استفاده از NMR اسپکتروسکوپی نشان داده شده است که DinI محکم به ناحیه –Cترمینال RecA متصل است و این برهمکنش به محض الیگومریزاسیون RecA افزایش مییابد (8). DinI در غلظت نزدیک به غلظت استوکیومتری، آثار تثبیتکنندهای روی فیلامنتهای RecA دارد و به میزان ناچیزی فعالیتهای RecA را محدود میکند (9). بررسیهایی که تاکنون انجام شدهاند با میانکنش پروتئین DinI با RecA و آثار تنظیمی این پروتئین مرتبط هستند و ضرورت حضور این پروتئین و یا میزان بیان آن در سویههای مقاوم به سیپروفلوکساسین مطالعه نشده است. میزان بیان ژن recA در سویههای +dinI پیش از این زیاد گزارش شده است (10). هدف پژوهش حاضر، بررسی بیان ژن recAدر سویههای dinI- بود.
مواد و روشها
در جدول 1، ویژگیهای ژنتیکی سویههای وحشی و موتان استفادهشده شرح داده شده است.
در جدول 2، ویژگیهای پرایمرهای استفادهشده آمده است.
جدول1- ویژگیهای ژنتیکی سویههای وحشی و موتان استفادهشده
سویه استفادهشده |
ویژگیهای ژنتیکی |
MG1655 |
E. coli K12 |
PM1 |
موتان مضاعف gyrA و marR |
SM1 |
F- ʎ- dinI::km |
جدول2- توالی پرایمرهای استفادهشده
نوع پرایمر |
ترتیب توالی |
طول توالی(جفت باز) |
اندازه محصول(جفت باز) |
Refrence |
recA F |
5′-ACA CGC TGC TGA TCT TCA TC-3′ |
20 |
202 |
(10) |
recA R |
5′-GCA GCG ATT TTG TTC TTC AC-3′ |
20 |
|
|
gapA F |
5′-ACT TAC GAG CAG ATC AAA GC-3′ |
20 |
170 |
(11) |
gapA R |
5′-AGT TTC ACG AAG TTG TCG TT-3′ |
20 |
|
|
تعیین MIC:موتان باکتریایی برای مقاومشدن در معرض غلظتهای افزایشی سیپروفلوکساسین (سیگما-آمریکا) از غلظت 20 نانوگرم در میلیلیتر تا 2 میکروگرم در میلیلیتر) به روش پلکانی قرار داده شد (11). برای تعیین MIC، از روش رقتهای متوالی در محیط مایع (LB) (12) و رقتهای متوالی سیپروفلوکساسین از غلظت 5 نانوگرم در میلیلیتر تا 2 میکروگرم در میلیلیتر استفاده شد. مایه تلقیح از کشت شبانه باکتری در محیط LB با تراکم CFU/ml 106 تهیه شد. کشتها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد گرمادهی شدند. آزمایش برای هر سویه، سه بار تکرار و کمترین غلظت عامل ضد میکروبی که پس از 24 ساعت در شرایط آزمایشگاهی مانع رشد درخور مشاهده ریزموجود شد، کمترین غلظت مهاری در نظر گرفته شد.
استخراج RNA: ابتدا کشت تازه از موتانها روی محیط LB (مرک- آلمان) آگار تهیه شد. کلنیهای تک سویههای کشتشده برای تلقیح در محیط مایع LB استفاده شدند. سپس، محیط مایع مربوط به مقاومت با غلظت کم سیپروفلوکساسین (سیگما-آمریکا) تیمار شد و درون انکوباتور شیکردار و دمای 37 درجه سانتیگراد با دور rpm 180 قرار گرفت. سپس، OD(optical Density) نمونهها در طول موج 650 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری شد که باید برابر 6/0 باشد.
برای استخراج RNA از کیت (کیاژن-آمریکا) استفاده شد. با استفاده از کیت (فرمنتاس- فنلاند) (RNase- free, DNaseI) روی نمونههایی که RNA آنها استخراج شده بود، تیمار DNase انجام شد تا DNA حذف شود و فقط RNA خالص در نمونه موجود باشد. آب DEPC (دیاتیلپیروکربنات) برای به حجم رساندن نمونه طی فرآیند تیمار DNase استفاده شد. برای اطمینان از اینکه نمونههای تیمارشده با DNase بدون DNA هستند، واکنش PCR برای هر یک از آنها انجام شد. پس از اطمینان از نبود آلودگی به DNA در نمونههای RNA، جذب و غلظت RNA و میزان خلوص آن در هر یک از نمونهها با دستگاه اسپکتروفتومتر UV/Visible اندازهگیری شد. بهطور معمول نسبت جذب 260 به 280 نانومتر نمونههای حاوی RNA، 2 و بیشتر است. چنانچه نسبت جذب 260 به 280 برابر 8/1 باشد، نمونه، DNA خالص دارد و نسبت کمتر از 8/1، وجود ناخالصی با ترکیبات حلقوی و پروتئینها را نشان میدهد.
سنتز cDNA:برای سنتز cDNA از کیت (یکتا تجهیز- آلمان) استفاده و تمام مراحل کار مطابق کیت انجام شد. از آنجا که برای سنتز cDNA باید مقدار RNA هر یک از نمونهها برابر و یکسان باشد، حجم مشخصی از نمونه با توجه به غلظت محلول RNA برداشت شد. طبق بروشور کیت، پس از اضافهکردن حجم معینی از RNA که عاری از DNA است، پرایمر هگزامر تصادفی به هر نمونه اضافه شد. dNTP با غلظت 1 میلیمولار، آنزیم ترانسکریپتاز معکوس 200 واحد و بافر 5X استفاده شد. در مرحله آخر، نمونهها برای سنتز cDNA در دستگاه PCR قرار گرفتند. شرایط دمایی برای واکنش PCR برای سنتز cDNA در جدول 3 آمده است. سپس نمونههای سنتزشده در منفی 20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
جدول 3- شرایط دمایی واکنش PCR برای سنتز cDNA
درجه حرارت |
مدت زمان |
تعدادچرخه |
25 |
10 دقیقه |
1 |
42 |
60 دقیقه |
1 |
70 |
10 دقیقه |
1 |
نمونههای cDNA سنتزشده بهعنوان الگویی برای واکنش Real time PCR و بررسی میزان بیان ژن استفاده شدند. در این مرحله، نمونه cDNA در شرایط دمایی بهینه برای ژن مدنظر، PCR شد تا درستی سنتز cDNA با مشاهده باند ویژه حاصل از تکثیر cDNA روی ژل آگارز تأیید و از مطلوببودن شرایط دمایی برای به کار بردن آن در واکنش Real time PCR اطمینان حاصل شود. سپس، بررسی بیان با کمک روش Real time PCR انجام شد. در این بررسی، میزان بیان ژن با روش فافل بررسی و از ژن خانهزاد gapAبرای تعیین بیان نسبی ژن استفاده شد. بررسی آماری نتایج بیان نسبی ژن با استفاده از آزمون تی[i] و نرمافزار SPSS نسخه 16 و برنامه اکسل انجام شد. حدود اطمینان برای همه آزمایشها 95 درصد در نظر گرفته و 05/0p< معنادار محسوب شد.
نتایج.
نتایج تعیین MIC:مقاومت به سیپروفلوکساسین به سه سطح کم ٬متوسط و زیاد تقسیم میشود (13). نتایج MIC سویهها تعیین شد (جدول 4). نتایج برای سویه تیپ وحشی MG1655 و PM1 مشابه با پژوهشهای پیشین بود (14 و 15). مقاومت PM1 و SM1 به سیپروفلوکساسین بهترتیب زیاد و کم بود.
جدول4- نتایج تعیین MIC
نام سویه |
ژنوتیپ |
فنوتیپ |
MIC سیپروفلوکسازین (µg/ml) |
MG1655 |
dinI+ |
مقاومت کم به سیپروفلوکساسین |
008/0 |
PM1 |
dinI+ |
مقاومت زیاد به سیپروفلوکساسین |
100 |
SM1 |
dinI - |
مقاومت کم به سیپروفلوکساسین |
3/0 |
نتایج بررسی کمیت و کیفیت RNA استخراجشده: برای بررسی نبود آلودگی DNA در RNA استخراجشده از روش PCR و ژل الکتروفورز استفاده شد. در نمونههای RNA تیمارشده با DNase، هیچ باندی مشاهده نشد که حاکی از نبود آلودگی نمونهها به DNA ژنومی باشد. بررسی غلظت RNAهای استخراجشده با دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 260 نانومتر انجام شد. کل RNAهای استخراجشده از سویههای مدنظر دارای غلظت مناسب بودند و نسبت A260/A280 (Absorption) برای تمام نمونهها مناسب و بیش از 8/1 بود.
بررسی حضور cDNA در کتابخانهcDNA: پس از سنتز cDNA با استفاده از کیت یکتا تجهیز، برای اطمینان از سنتز cDNA، واکنش PCR در تمام نمونهها برای ژن dinI انجام شد. با توجه به نتایج PCR و شدت رنگ باند میتوان از سنتز cDNA بهشکل کیفی مطمئن شد و دمای بهینه اتصال پرایمر برای Real time PCR را تعیین کرد. نتیجه PCR ژن recA در شکل 1 نشان داده شده است.
نتایج بررسی بیان ژن با روش PCRReal time:ارزیابی کمی تغییرات بیان ژنهای gapAو recA در سویه تیپ وحشی و نمونههای جهشیافته با روش Real time PCR انجام شد. پس از تنظیم و بهینهکردن شرایط، منحنی تکثیر نمونهها بررسی شد که افزایش علامتهای فلورسانس ساطعشده از رنگ سایبرگرین را هنگام پیشروی چرخههای واکنش مشخص میکند و با ترسیم خط آستانه، چرخه آستانه برای هر یک از نمونهها مشخص شد. منحنی تکثیر برای ژنهای gapA و recA بهترتیب در شکلهای 2 و 3 نشان داده شده است.
هر قطعه DNA دو رشتهای دارای دمای ذوب منحصربهفردی است که 50 درصد مولکول DNA، تک رشتهای میشود. منحنی ذوب، تکثیر محلول ویژه را مشخص میکند و نشان میدهد که آیا پرایمر دایمر تشکیل شده است که در واکنش تداخل ایجاد کرده باشد. در واکنش Real time PCR برای ژنهای مدنظر، تنها یک قله وجود دارد که آلودگینداشتن به DNA ژنومی و تکثیر اختصاصی ژن مدنظر را نشان میدهد. منحنی ذوب برای ژنهای gapA و recAبهترتیب در شکلهای 4 و 5 نشان داده شده است.
شکل1- نتیجه PCR ژن recA (سمت راست) و gapA(سمت چپ) بهترتیب پس از لدر 100 جفت بازی و 1 کیلو بازی
شکل2- منحنی تکثیر واکنش PCR Real time ژنgapA سویههای تیپ وحشی و موتانت؛ رنگ آبی، سویه تیپ وحشی و رنگهای زرد و بنفش نمونههای موتانت هستند.
شکل 3- منحنی تکثیر واکنش PCR Real time ژنrecAسویههای تیپ وحشی و موتانت؛ رنگهای قرمز و کرم، دو غلظت از سویه تیپ وحشی و رنگهای آبی تیره و روشن، نمونههای موتانت هستند.
شکل4- منحنی ذوب Real time PCR ژن gapA سویههای تیپ وحشی و موتانت؛ رنگ آبی، سویه تیپ وحشی و رنگهای زرد و بنفش، نمونههای موتانت هستند.
شکل5- منحنی ذوبReal time PCR ژن recA سویههای تیپ وحشی و موتانت؛ رنگهای قرمز و کرم، دو غلظت از سویه تیپ وحشی و رنگهای آبی تیره و روشن، نمونههای موتانت هستند.
جدول5- بیان نسبی ژن recA
نام سویه |
میزان بیان نسبی ژن recA |
مقدار P |
تیپ وحشی |
1 |
- |
PM1 |
4/9 |
02/0 |
SM1 |
12/2 |
01/0 |
بیان ژن مدنظر با روش فافل بررسی شد (جدول 5).
نتایج Real time PCR نشان دادند که میزان بیان ژن recA در سویه (dinI-) SM1 افزایش یافته است، هرچند میزان افزایش بیان به اندازه PM1(dinI+) نبود و بنابراین غیرفعالسازی dinI مانع از افزایش بیان ژن recA نمیشود.
بحث و نتیجهگیری.
درمان عفونتها با داروهای ضد میکروبی مزایای بسیاری برای سلامتی انسان دارد (16(. مقاومت باکتریایی همگام با استفاده از عوامل ضد میکروبی ظهور کرده است. درمان طولانیمدت با آنتیبیوتیک به توسعه مقاومت در ریزموجوداتی منجر میشود که در ابتدا به آنتیبیوتیک حساس بودهاند (17). در سالهای اخیر، شیوع مقاومت به فلوروکینولونها در میان اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه بهطورچشمگیری افزایش یافته است (3 و 18). در بین کینولونها، سیپروفلوکسازین دارای بیشترین تأثیر بهعنوان آنتیبیوتیک نسل دوم روی باکتریهای گرم منفی و مثبت است و به این ترتیب، مقاومت نسبت به این عوامل باعث نگرانیهایی در انتخاب درمان مناسب میشود (13). از آنجا که فلوروکینولونها باعث تثبیت شکست در دو رشته میشوند، از القاکنندههای پاسخ SOS هستند و نشان داده شده است که موتانزایی ناشی از SOS شاید توسعه مقاومت به فلوروکینولونها را القا کند (5 و 19). LexA (رپرسور) و RecA (القاگر)، دو پروتئین کلیدی در پاسخSOSهستند. به محض آسیب DNA، RecA با اتصال به DNA تک رشته (ssDNA) برای شکلدهی فیلامنت نوکلئوپروتئینی فعال میشود. RecA فعال، خودبرشی LexA را تحریک میکند و سبب از سرگیری بیان ژنهای SOS میشود. ژن dinI کدکننده پروتئین DinI با 81 آمینواسید، عضو تنظیمی پاسخ SOS است (6). DinI بهعنوان تعدیلکننده مثبت عملکرد RecA فعالیت میکند (8 و 19). در سال 2004، لوستی[ii] و همکاران با بررسی نقش DinI در تنظیم نوترکیبی و پاسخ SOS کشف کردند که DinI در غلظت نزدیک به غلظت استوکیومتری دارای آثار تثبیتکننده روی فیلامنتهای RecA است و به میزان ناچیزی فعالیتهای RecA را محدود میکند، در حالی که در غلظت زیاد باعث بیثباتی فیلامنتها میشود. آنها نشان دادند که C- ترمینال RecA، میانکشن DinI وRecA را تعدیل میکند (9). غلظت زیادی از DinI برای این فعالیتهای بیوشمیایی و همچنین مهار فعالیت کوپروتئازی RecA در خودبرشی پروتئین UmuD نیاز است. مقدار پروتئین DinI طی فاز نرمال رشد سلولهای باکتریایی ناچیز است و با آغاز پاسخ SOS، تولید آن القا میشود. میانکنش DinI و RecAدر اواخر پاسخ SOS پس از ترمیم DNA آسیبدیده و زمانی افزایش مییابد که سلولها برای بازگشت به حالت غیر القا آماده میشوند و DinI بهعنوان تنظیمکننده پاییندست پاسخ SOS عمل میکند (20). در پژوهش پوراحمد[iii] و پسند[iv] (2016) مشخص شد که بیان ژن recAدر موتانهای مقاوم به سیپروفلوکساسین + dinI E.coli افزایش مییابد (10). تاکنون میزان بیان ژن recA در سطح mRNA و پروتئین در سویه dinI- پس از تیمار با سیپروفلوکساسین بررسی نشده است و در مطالعه حاضر، بیان ژن recA در سویههای موتان- dinI بررسی شد تا تأثیر غیر فعالسازی ژن dinI بر میزان بیان ژن recA مشخص شود. پژوهش حاضر برای نخستین بار نشان داد که در سویههای مقاوم به سیپروفلوکساسین،بیان ژن recA در نبودdinIافزایش مییابد. نتایج Real time PCR مشخص کردند که میزان بیان ژن recA در سویه جهشیافته (dinI-) SM1 افزایش مییابد، هرچند این میزان افزایش بیان، حدود یکچهارم میزان افزایش بیان در سویه PM1(dinI+) است. این مسئله، ضرورت افزایش فعالیت recA برای رفع آسیبهای ناشی از حضور سیپروفلوکساسین را نشان میدهد. انتظار میرود که پروتئینهای تنظیمی دیگری مانند RecF، UvrD و CRdg، RecA را در نبود dinI تنظیم کنند.
تشکر و قدردانی .
از دانشگاه شهرکرد برای حمایت مالی از پژوهش حاضر تشکر میشود.