تهیه نانوذره‌های poly lactic-co-glycolic acid (PLGA) حاوی آلژینات، لیپوپلی‌ساکارید و اگزوتوکسین A سودوموناس آئروژینوزا به‌عنوان نانو‌واکسن

مقدمه.

سودوموناس آئروژینوزا، باسیلی گرم منفی، متحرک و دارای سازوکار اکسیداتیو است. این باکتری در خاک وجود دارد و عامل عفونت‌هایی در انسان و گیاه است. این باکتری‌ها نقش مهمی در اکولوژی خاک دارند و به علت توانایی تجزیه انواع مواد آلی مانند برخی مواد زائد سمی، در زیست‌درمانی مفید هستند (1-3).

سودوموناس، بیماری‌زای فرصت‌طلبی است که اهمیت بالینی دارد و باعث ایجاد عفونت‌های دستگاه ادراری، تنفسی، آماس پوست، عفونت‌های بافت‌های نرم، باکتریمی، عفونت استخوان و مفصل، عفونت‌های گوارشی وعفونت‌های سیستمیک به‌ویژه در افراد دارای نقص ایمنی نظیر سوختگی‌های شدید، مبتلایان به سرطان، ایدز و غیره می‌شود (4-6) .

عواملی که در بیماری‌زایی سودوموناس آئروژینوزا نقش دارند، به دو گروه دسته‌بندی می‌شوند: عوامل بیماری‌زایی سطح باکتری و عوامل بیماری‌زایی ترشحی (7). عوامل بیماری‌زای سطح باکتری شامل لیپوپلی‌ساکارید، فلاژل، پیلی، آلژینات و عوامل بیماری‌زای ترشحی شامل پیوسیانین، پیووردین، آلکالین‌پروتئاز، الاستاز، فسفولیپاز C و اگزوتوکسینA هستند (8 و 9).

لیپوپلی‌ساکارید، ساختار ویژه سطح باکتری‌های گرم منفی است و در اتصال میکروب به سطوح و سلول نقش دارد. این ترکیب حاوی لیپیدی به نام لیپید A است که به ساختمان پلی‌ساکاریدی ویژه‌ای متشکل از هسته مرکزی و تعدادی واحدهای تکراری انتهایی به نام آنتی‌ژن O متصل است. لیپوپلی‌ساکارید با پیوندهای آبگریز به غشای خارجی متصل می‌شود. لیپید A، مولکولی متشکل از واحدهای دی‌ساکارید گلوکزآمین فسفریله شده است که به تعدادی اسید چرب بلندزنجیره اتصال یافته‌اند (10) . ازجمله عملکردهای لیپوپلی‌ساکارید عبارتند از: حفاظت سلول‌های باکتریی در برابر اپسونیزاسیون، فاگوسیتوز و مقاومت نسبت به عمل میکروب‌کشی کمپلمان در سرم و ممانعت از نفوذپذیری غشای خارجی است (11 و 12).

آلژینات، پلیمری خطی و آنیونی از گلورونیک‌اسید و مانورونیک‌اسید است که ژل چسبناکی را در اطراف باکتری ایجاد می‌کند. تولید آلژینات اغلب حالت مخاطی ایجاد می‌کند و کلنی‌ها ظاهری مرطوب و براق دارند (13 و 14). این باکتری پس از اتصال به سلول‌های اپی‌تلیال با تولید ماتریکسی پلی‌ساکاریدی از آلژینات، بیوفیلم تشکیل می‌دهد که از باکتری در برابر دفاع میزبانی و اثر آنتی‌بیوتیک‌ها محافظت می‌کند (15).

افزایش تولید آلژینات به‌ویژه در بیماران مبتلا به سیستیک فیبروزیس (CF) باعث کاهش عملکرد ریوی و کاهش شانس زنده‌ماندن بیماران می‌شود. از دیگر عملکردهای بیماری‌زایی آلژینات در سویه‌های موکوئیدی، مهار و تداخل مستقیم با فاگوسیتوز، مقاومت آنتی‌بیوتیکی و تشکیل بیوفیلم است (16). به علت ویژگی چسبندگی آلژینات، این ساختار در اتصال باکتری و ایجاد بیوفیلم نقش مهمی دارد و با تولید بیوفیلم، فعالیت ضدمیکروبی و فاگوسیتوز مهار می‌شود (17).

این باکتری، اگزوتوکسین A را به‌شکل پروآنزیم تولید می‌کند. این توکسین از 613 آمینواسید با وزن مولکولی 66 کیلودالتون تشکیل شده است و سیستم ترشحی تیپ دو، آن را به فضای خارج سلولی ترشح می‌کند (18). این توکسین زیرواحدهای اتصالی، آنزیمی و انتقالی دارد و دارای سه ناحیه است که ناحیه یک برای اتصال به گیرنده‌های میزبان، ناحیه دو برای انتقال توکسین به سیتوزول سلول میزبان و ناحیه سه برای اتصال آمیدآدنین‌دی فسفات‌ریبوز به عامل طویل‌شدن و کاتالیزکردن آن استفاده می‌شود. سازوکار عملکرد این سم مشابه توکسین دیفتری است و سبب مهار مرحله طویل‌سازی طی فرآیند سنتز پروتئین می‌شود (19 و 20). این توکسین با ایجاد آسیب‌‎های بافتی و کاهش فعالیت فاگوسیتوزی، نقش مستقیمی در ایجاد عوارض پوستی در سوختگی‌ها، آسیب قرنیه در عفونت چشم و آسیب بافت در عفونت‌های مزمن ریوی دارد (21).

عفونت سودوموناسی به علت سه عامل بیماری‌زای یادشده، مشکلی جدی در بیماران بستری مبتلا به سرطان، فیبروز سیستیک و سوختگی است. همچنین افزایش مقاومت آنتی‌بیوتیکی، باکتری را نسبت به درمان مقاوم می‌کند (22). نانوذره پلی‌دی‌–‌ال لاکتید‌–‌کو‌–‌گلیکولاید با قابلیت درهم‌کنش و ادغام بیشتر در سلول‌های ایمنی، لیگاندشدن اختصاصی با مولکول هدف و افزایش تیتر ایمونوگلوبولین‌ها و افزایش معنادار پاسخ‌های ایمنی، دارای انتهاهای اتصالی بسیاری است و ویژگی ترکیب‌پذیری قوی با داروی مبدأ و سلول هدف دارد (23). هدف مطالعه حاضر، استفاده از نانوذره پلی‌لاکتیک‌کو‌گلیکولیک‌اسید در ساخت و معرفی نامزدی برای واکسن علیه سه آنتی‌ژن مهم و بیماری‌زای این باکتری فرصت‌طلب برای ایجاد حفاظت و مصونیت در برابر این عامل بیماری‌زاست. در این پروژه، از آنتی‌ژن پروتئینی برای تولید ایمنی بلندمدت در کنار دو آنتی‌ژن پلی‌ساکاریدی استفاده شده است.

مواد و روش‌ها.

از سویه PAO1 باکتری سودوموناس آئروژینوزا برای خالص‌سازی و جداسازی سه آنتی‌ژن آلژینات، لیپوپلی‌ساکارید و اگزوتوکسین A استفاده شد.

جداسازی آنتی‌ژن آلژینات: سویه یادشده از محیط نوترینت آگار (مرک آلمان) به محیط سنتتیک(تمام ترکیبات استفاده‌‌شده در ساخت این محیط، مرک آلمان هستند) حاوی1/10 میلی‌لیتر در لیتر گلیسرول، 5/0 گرم در لیتر دکستروز، 37/0 گرم در لیتر ال- گلوتامین، 6/0 گرم در لیتر Na₂HPO₄، 12/0 گرم در لیتر K₂HPO₄ و 13/0 گرم در لیتر MgSo₄.7H₂O منتقل شد و به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای 37 درجه سیلیسیوس با دور rpm40 درون انکوباتور شیکردار قرار داده شد. سپس، 5/4 میلی‌لیتر فنل 90 درصد برای غیرفعال‌سازی باکتری اضافه و به مدت 45 دقیقه در دمای 60 درجه سیلیسیوس درون بن‌ماری قرار داده شد. سپس، به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سیلیسیوس با rpm2500 سانتریفوژ شد. مایع رویی برای جداسازی آلژینات استفاده و سه برابر حجم مایع رویی، اتانول خالص اضافه و به مدت 24 ساعت در یخچال گذاشته شد. پس از سپری‌شدن زمان یادشده، به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سیلیسیوس با rpm2500 سانتریفوژ و به مدت 3 ساعت درون بن‌ماری قرار داده شد. در نهایت، سانتریفوژ برای تغلیظ نهایی آلژینات با اتانول خالص انجام و از فیلتر 22/0 میکرومتر عبور داده شد و در دمای منفی 20 درجه سیلیسیوس نگهداری شد (24).

جداسازی لیپوپلی‌ساکارید:سویه یادشده از محیط نوترینت آگار(مرک آلمان) به محیط نوترینت براث (مرک آلمان) منتقل و به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سیلیسیوس با rpm2500 درون انکوباتور شیکردار قرار داده شد. پس از افزودن 5/1 میلی‌لیتر فنل 90 درصد برای غیرفعال‌سازی باکتری، به مدت 1 ساعت در دمای 60 درجه سیلیسیوس درون بن‌ماری قرار داده شد و سپس به مدت 30 دقیقه در دمای 4 درجه سیلیسیوس با دور rpm2500 سانتریفوژ شد. رسوب حاصل اندازه‌گیری و به ازای هر 16 گرم رسوب، 75 میلی‌لیتر آب دیونیزه اضافه و 20 دقیقه در دمای 66 درجه سیلیسیوس دوباره درون بن‌ماری قرار داده شد. سپس، 75 میلی‌لیتر فنل 90 درصد اضافه و به مدت 30 دقیقه در دمای 66 درجه سیلیسیوس درون بن‌ماری قرار داده شد. برای تولید مرحله سه فازی (روئی، فنلی و رسوب)، به مدت 125 دقیقه در دمای 4 درجه سیلیسیوس با دور rpm2500 سانتریفوژ شد. فاز روئی برای جداسازی لیپوپلی‌ساکارید به کار رفت؛ به میزان یک‌سوم آن متانل اشباع با سدیم استات اضافه و به مدت 4 ساعت در دمای 4 درجه سیلیسیوس قرار داده شد. سپس، 20 دقیقه در دمای 4 درجه سیلیسیوس با دور rpm2500 سانتریفوژ شد. رسوب حاصل برای سم‌زدایی در کمترین مقدار NaOH 2/0 نرمال حل و به مدت 3 ساعت در دمای 80 درجه سیلیسیوس قرار داده شد. پس از شوک سرمایی به مدت 10 تا 15 دقیقه، سه برابر حجم، اتانول اضافه و به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سیلیسیوس قرار داده شد و در نهایت، به مدت 45 دقیقه در دمای 4 درجه سیلیسیوس با دور rpm2500 سانتریفوژ شد (24).

جداسازی اگزوتوکسین A: سویه یادشده از محیط بروسلا آگار (مرک آلمان) به محیط مولر هینتون براث (مرک آلمان) منتقل و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سیلیسیوس با دور rpm150 درون انکوباتور شیکردار قرار داده شد. سپس انتقال به محیط سنتتیک TSBD (تمام مواد استفاده‌شده در ساخت این محیط سنتتیک، مرک آلمان هستند) حاوی 1 میلی‌لیتر گلیسرول 1 درصد، 5/2 گرم در لیتر دکستروز، 49/1 گرم در لیتر KCl، 141/1 گرم در لیتر K₂HPO₄، 49/2 گرم در لیتر NaCl، 198/0 گرم در لیتر Na₂HPO₄، 499/0 گرم در لیتر MgSo₄.7H₂O، 0078/0 گرم در لیتر EDTA، 00027/0 گرم در لیتر FeCl₃، 0049/0گرم در لیتر MnCl₂.H₂O، 14/0 گرم ال-آرژنین، 63/0 گرم ال-آلانین، 34/0 گرم ال-گلوتامین و 5/0 گرم عصاره مخمر انجام و سپس به مدت 24 ساعت در دمای 32 درجه سیلیسیوس با دور rpm2500 درون انکوباتور شیکردار قرار گرفت و به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سیلیسیوس با دور rpm10000 سانتریفوژ شد. برای جداسازی سم، سولفات‌آمونیوم 60 تا 80 درصد متناسب با حجم مایع روئی اضافه و به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سیلیسیوس قرار داده شد. از ستون ژل فیلتراسیون سفاکریل HRs200 برای خالص‌سازی نهایی استفاده شد. برای تبدیل توکسین به توکسوئید، گرماگذاری در حضور فرمالین 2/0 درصد به مدت 7 روز در دمای 37 درجه سیلیسیوس انجام و از دیالیز برای خارج‌سازی بقایای فرمالین از نمونه استفاده شد (18).

.کونژوگاسیون نمونه‌های آلژینات، لیپوپلی‌ساکارید دتوکسیفای شده و .اگزوتوکسین A به‌شکل جداگانه با پلی‌لاکتیک‌کو‌گلیکولیک‌اسید:درون سه بالن ژوژه 100 میلی‌لیتری واجد مگنت، 15 میلی‌گرم پلی‌لاکتیک‌کو‌گلیکولیک‌اسید (شرکت سیگما) ریخته و برایحل‌شدن آن، از4 تا 5 میلی‌لیتر دی‌متیل‌فرمامید (شرکت سیگما) استفاده شد. به سوسپانسیون حاصل، 150 میلی‌گرم N-3، دی‌متیل‌آمینو‌پروپیل ‌ان-اتیل‌هیدرو‌کید (شرکت سیگما) افزوده و برای بهبود عملکرد آن نیز 50 میلی‌گرم N-هیدروکسی‌سوکسینیمیدکاربودیمید (شرکت سیگما) اضافه شد. سپس داخل هر بالن ژوژه، 25 میلی‌گرم آنتی‌ژن مربوطه ریخته شد. برای انجام استریفیکاسیون و تشکیل پیوند استری، نمونه به مدت 7 روز در محیط آزمایشگاه روی همزن الکتریکی قرار داده شد. سپس برای خالص‌سازی هر سه کونژوگه یادشده، ابتدا در حضور آب دیونیزه با سه بار تعویض در روز دیالیز شد (24) و برای خالص‌سازی ثانویه هر سه کونژوگه، روش کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون سفاکریل HRs200 انجام و با استفاده از زتا سایزر، FT-IR و تصویر سه بعدی به‌ترتیب اندازه و شارژ هر سه کونژوگه و نانوذره به همراه ترکیبات آلی، گروه‌های عاملی و پیوندهای کووالانسی موجود در هر سه کونژوگه و نانوذره و نیز جذب سطحی سه آنتی‌ژن در سایت‌های اتصالی نانوذره ارزیابی شد (25-28)..

برای بررسی سمی‌نبودن نانوواکسن، پنج سر موش سوری ماده انتخاب شدند و 10 میکروگرم واکسن کونژوگه یادشده به‌شکل داخل عضلانی به هر کدام از الگوهای موشی تزریق شد. پس از گذشت 7 روز، مرگ‌ومیر در گروه موشی بررسی و نتایج ایمنی‌سنجی در گروه موشی با آزمون آنالیز واریانس یک‌طرفه با نرم‌افزار SPSS نسخه 21 بررسی شد (29-32).

برای تعیین تب‌زایی کونژوگه تهیه‌شده، خرگوش‌ها در گروه‌های سه‌تایی انتخاب و دمای بدن آنها بررسی شد. به این شکل که پس از ثبت نخستین دما از راه قراردادن رکتومتر در مقعد حیوان، دماهای بعدی هر 15 دقیقه طی 1 ساعت اندازه‌‌گیری شدند. آخرین دمای ثبت‌شده پیش از تزریق، دمای اولیه محسوب شد. سپس نمونه از راه ورید مارژینال گوش تزریق و دمای بدن حیوان طی 3 ساعت و هر ساعت یک‌بار پس از تزریق ثبت شد. دماهای ثبت‌شده با هم جمع شدند و میانگین آنها در نظر گرفته شد. چنانچه افزایش دما در هر خرگوش از 6/0 درجه سیلیسیوس و در هر سه خرگوش از 4/1 درجه سیلیسیوس کمتر بود، ماده تزریقی غیرتب‌زا محسوب شد (33-36).

در مطالعه حاضر، تمام آزمایش‌ها، نگهداری و تغذیه الگوهای حیوانی موش با استفاده از کتاب Guide for the care and use of laboratory animals انجام شد؛ این کتاب بر مبنای پروتکل NIH است (37).

نتایج

. خالص‌سازی کونژوگه سه آنتی ژن آلژینات، LPS  دتوکسیفای شده و .اگزو توکسین A با نانوذره PLGA به وسیله .کروماتوگرافی با روش ژل فیلتراسیون با استفاده از سفاکریل HRs200:برای خالص‌سازی کونژوگه سه آنتی‌ژن آلژینات، لیپوپلی‌ساکارید و اگزوتوکسین A با نانوذره PLGA از کروماتوگرافی با روش ژل فیلتراسیون با ژل سفاکریل HRs200 استفاده شد. در کروماتوگرافی کونژوگه Alg-PLGA ، بررسی فرکشن‌ها با توجه به پلی‌ساکاریدی‌بودن آلژینات در طول موج 210 نانومتر انجام شد. پیک‌های موجود، انجام کونژوگاسیون را در فرکشن‌های 21 با OD= 0.91 و 22 با OD= 1.53 و انجام‌نشدن کونژوگاسیون را در فرکشن 30 با OD= 0.66 نشان دادند. در کروماتوگرافی کونژوگه PLGA-D-LPS، بررسی فرکشن‌ها با توجه به پلی‌ساکاریدی‌بودن لیپوپلی‌ساکارید در طول موج 210 نانومتر انجام شد. پیک‌های موجود، انجام کونژوگاسیون را در فرکشن‌های 20 با OD= 0.86 و 21 با OD= 1.67 و انجام‌نشدن کونژوگاسیون را در فرکشن 30 با OD=0.72 نشان دادند.

در کروماتوگرافی کونژوگه Exotoxin A-PLGA ، بررسی فرکشن‌ها با توجه به پروتئینی‌بودن اگزوتوکسین A در طول موج 280 نانومتر انجام شد. پیک‎های موجود، انجام کونژوگاسیون را در فرکشن‌های 16 با OD= 0.97 و 17 با OD= 1.34 و انجام‌نشدن کونژوگاسیون را در فرکشن 29 با OD= 0.89 نشان دادند.

نتایج اندازه‌گیری اندازه و شارژ هر سه مولکول کونژوگه و نانوذره PLGA:برای اطمینان بیشتر از درستی تشکیل کونژوگه، از دستگاه Zetasizer مدل Nanovizard II شرکت Malvern انگلستان برای اندازه‌گیری اندازه و شارژ مولکول PLGA و PLGA-ALg استفاده شد (شکل‌های 1 و 2). طبق شکل 1، اندازه نانوذره PLGA، 105 نانومتر (نمودار a) و اندازه مولکول کونژوگه، 5/465 نانومتر (نمودار b) است و با وجود افزایش اندازه نسبت به PLGA، اندازه مولکول کونژوگه باز هم در حد نانومتر است و موفقیت‌ کونژوگاسیون و حفظ اندازه نانو را نشان می‌دهد. طبق شکل 2، منفی‌ترشدن شارژ کونژوگه (نمودار b) نسبت به PLGA (نمودار (a نیز موفقیت کونژوگاسیون را نشان می‌دهد.

برای اطمینان بیشتر از درستی تشکیل کونژوگه، از دستگاه یادشده برای اندازه‌گیری اندازه و شارژ مولکول PLGA و D-LPS-PLGA  استفاده شد (شکل‌های 3 و 4). طبق شکل 3، اندازه نانوذره PLGA، 105 نانومتر (نمودار a) و اندازه مولکول کونژوگه، 332 نانومتر (نمودار b) است و با وجود افزایش اندازه نسبت به PLGA، مولکول کونژوگه باز هم در حد نانومتر است و موفقیت‌ کونژوگاسیون و حفظ اندازه نانو را نشان می‌دهد. طبق شکل 4، منفی‌شدن شارژ کونژوگه )نمودار b) نسبت به PLGA (نمودار (a نیز موفقیت‌ کونژوگاسیون را نشان می‌دهد.

برای اطمینان بیشتر از درستی تشکیل کونژوگه، از دستگاه یادشده برای اندازه‌گیری اندازه و شارژ مولکول PLGA و ETA-PLGA استفاده شد (شکل‌های 5 و 6(. طبق شکل 5، اندازه نانوذره PLGA، 105 نانومتر (نمودار a) و اندازه مولکول کونژوگه، 852 نانومتر (نمودارb) است و با وجود افزایش اندازه نسبت به PLGA، مولکول کونژوگه باز هم در حد نانومتر است و موفقیت کونژوگاسیون و حفظ اندازه نانو را نشان می‌دهد. طبق شکل 6، مثبت‌شدن شارژ کونژوگه )نمودار b) نسبت به PLGA (نمودار (a نیز موفقیت‌ کونژوگاسیون را نشان می‌دهد.

شکل 4- شارژ کونژوگه LPS-PLGAD-و نانوذره PLGA به روش زتا شارژر. نمودارهای a و b به‌ترتیب به شارژ نانوذره PLGA و کونژوگه PLGA-D-LPS مربوط و به‌ترتیب 21/4- و 14/2- هستند.

شکل 5- قطر کونژوگه ETA-PLGA و نانوذره PLGA به روش زتا سایزر. نمودارهای a و  b به‌ترتیب به قطر نانوذره PLGA و کونژوگه PLGA-ETAمربوط و به‌ترتیب 105 و 852 نانومتر هستند.

 شکل 6- شارژ کونژوگه ETA-PLGA و نانوذره PLGA به روش زتا شارژر. نمودارهای a و b به‌ترتیب به شارژ نانوذره PLGA و کونژوگه ETA-PLGA مربوط و به‌ترتیب 21/4- و 52/5 هستند.

تأیید انجام کونژوگاسیون هر سه آنتی‌ژن با طیف‌‌سنجی مادون قرمز (مدل Jasco FT-IR-6300): از طیف‌سنجی IR برای تعیین گروه‌های عاملی موجود در کونژوگه و آنتی‌ژن استفاده شد. با توجه به نتایج، حضور گروه‌های عاملی آنتی‌ژن در ساختار نانو‌ذره و تشکیل پیوند استری تأیید می‌شود. در شکل 7، نمودار a به نانوذره PLGA و نمودار b به آلژینات مربوط است. در شکل 8، نمودار b1 به LPS و شکل 9، نمودار b2 به ETA مربوط است. با توجه به شکل، پیک‌های مربوط به اعداد موجی cm^-110/1004، cm^-141/1067 وcm^-181/1260 به گروه‌های اتری مربوط هستند که در نمودار کونژوگه، تقویت آنها نشان‌دهنده حضور پیوندهای استری است (در آلژینات، ETA ,LPS و نیز کونژوگه‌ها دیده می‌شود). پیک‌ cm^-1 88/1647 به گروه C=O-OH آلژینات، پیک cm^-1 66/1653 به گروه OH-C=O لیپوپلی‌ساکارید دتوکسیفای شده و پیک cm^-1 81/1541 به گروه OH-C=O اگزوتوکسین A مربوط است. با توجه به طیف مربوط به کونژوگه آلژینات (شکل 7)، پیک موجود در عدد موجی cm^-141/1660 به PLGA و پیک موجود در عدد موجی cm^-106/1385 به آلژینات مربوط است و پیک اعداد موجی cm^-123/1099، cm^-147/1173 و cm^-147/1263 نشان‌دهنده حضور پیوندهای استری هستند. با توجه به طیف مربوط به کونژوگه در نمودارc1، پیک موجود در عدد موجی cm^-1/81/1460 به PLGA و پیک موجود در عدد موجی cm^-1 66/1653 به D-LPS مربوط است و پیک اعداد موجی cm^-123/1099، cm^-1 47/1173 و cm^-1 75/1273 نشان‌دهنده حضور پیوندهای استری هستند. همچنین طیف مربوط به کونژوگه در نمودارc2، پیک موجود در عدد موجی cm^-1 73/1759 به PLGA و پیک موجود در عدد موجی cm^-1 14/1398 به ETA مربوط است و پیک اعداد موجی cm^-1 40/1092، cm^-1 47/1173 و cm^-1 51/1261 نشان‌دهنده حضور پیوندهای استری هستند. همچنین در Alg، اعداد موجی cm^-153/3382 و cm^-173/3372 به‌ترتیب به گروه‌های OH قندی و گروه‌های OH نانوذره PLGA مربوط هستند. پیک موجود در عدد موجی cm^-152/2951 به CH قندی و پیک موجود در عدد موجی cm^-1 62/2866 به PLGA مربوط است. عدد موجی cm^-192/3425 به گروه‌های OH قندی، cm^-172/3300 به CH قندی و پیک موجود در عدد موجی cm^-1 52/2951 به PLGA مربوط است (D-LPS). عدد موجی  cm^-192/3425 به گروه‌های OH قندی و cm^-112/3315 به CH قندی و پیک موجود در عدد موجی cm^-1 27/2958 به PLGA مربوط است (ETA) که با توجه به توضیحات،کونژوگاسیون موفق Alg، D-LPS، ETA و PLGA تأیید می‌شود.بررسی جذب سطحی هر سه آنتی ژن با میکرسکوپ نیروی اتمی (مدل Nanowidard) ساخت شرکت آلمان (AFM): تصاویر به دست آمده a، b، c، d، e، f، g و h توسط نرم‌افزار jpk به‌ترتیب توپوگرافی سه بعدی کونژوگه و نانوذره را پیش و پس از کونژوگاسیون به‌ترتیب با سه آنتی‌ژن آلژینات، لیپوپلی‌ساکارید و اگزوتوکسین A نشان می دهند (شکل 10(. تصاویر a و c، تصویر سه بعدی نانوذره و کونژوگه هستند؛ در تصویر a، ارتفاع سایت‌های اتصالی PLGA بین 12 تا 24 نانومتر در برش 5 میکرومتری تهیه‌شده مشخص شده است؛ این ارتفاع‌ها پس از انجام کونژوگاسیون به 160 تا 198 نانومتر در آلژینات (تصویر c)، 4/247 نانومتر در لیپوپلی‌ساکارید دتوکسیفای شده (تصویر e) و 48 نانومتر در اگزوتوکسین A (تصویر g) افزایش یافته است. میزان برجستگی و فرورفتگی‌ها، قابلیت جذب سطحی زیاد PLGA را نشان می‌دهد. در تصاویر b، d، f و h تغییر شکل سایت‌های اتصالی PLGA پیش و پس از کونژوگاسیون به‌خوبی نمایش داده شده است و مشاهده می‌شود که پس از جذب سطحی آلژینات، لیپوپلی‌ساکارید و اگزوتوکسین A توسط نانوذره پلی‌لاکتیک‌کوگلیکولیک‌اسید و انجام کونژوگاسیون، سایت‌ها از حالت تیزی به پفکی تغییر شکل یافته‌اند.

شکل7- نمودارهای تأیید کونژوگاسیون با طیف‌سنجی مادون قرمز(FT-IR). نمودارهای a ، b و c به‌ترتیب نمودارهای FT-IR نانوذره PLGA و آنتی‌ژن آلژینات و کونژوگه Alg-PLGA هستند و حضور پیوند استری در شکل c نشان‌دهنده موفق‌بودن کونژوگاسیون و تشکیل پیوند استری بین آنتی‌ژن آلژینات و نانوذره PLGA است.

به‌طور کلی تغییر اندازه سایت‌های اتصالی نانوذره از ارتفاع 12 نانومتر پیش از کونژوگاسیون به ارتفاع‌های 160، 4/247 و 48 نانومتر و تغییر شکل سایت‌های اتصالی پیش و پس از انجام کونژوگاسیون، جذب سطحی آنتی‌ژن را در سایت‌های اتصالی نانوذره و موفقیت انجام هر سه کونژوگاسیون را تأیید می‌کند.

هیچ نشانه ظاهری در اندام‌ها و مرگ‌ومیر در گروه‌های موشی تزریق‌شده پس از 7 روز مشاهده نشد. همچنین، با اندازه‌گیری دمای بدن یک خرگوش و سه خرگوش، دما به‌ترتیب کمتر از 6/0 و 4/1 درجه سیلیسیوس اندازه‌گیری شد. نتایج، غیرسمی و غیرتب‌زا بودن واکسن یادشده را نشان می‌دهند.

 شکل 9- نمودارهای تأیید کونژوگاسیون با طیف سنجی مادون قرمز(FT-IR). نمودار a (شکل7)، b2 و c2 به‌ترتیب نمودارهای FT-IR نانوذره PLGA، آنتی‌ژن ETA و کونژوگه PLGA-ETA هستند و حضور پیوند استری در نمودارc نشان‌دهنده موفق‌بودن کونژوگاسیون و تشکیل پیوند استری بین آنتی‌ژن ETA و نانوذره PLGA است.

 شکل 10- توپوگرافی سطحی نانوذره PLGA با آنتی‌ژن‌های آلژینات (Alg)، لیپوپلی‌ساکارید دتوکسیفای شده  (D-LPS) و اگزوتوکسین A (ETA) با میکروسکوپ نیروی اتمی (AFM). تصاویر a و b. مربوط به نانوذره قبل از کونژوگاسیون و c و d. مربوط به Alg-PLGA، e و f. مربوط به D-LPS-PLGA، g و h. مربوط به ETA-PLGA پس از کونژوگاسیون

بحث و نتیجه‌گیری.

سودوموناس آئروژینوزا پاتوژنی فرصت‌طلب و عامل اصلی مرگ‌ومیر در عفونت‌های ریوی و بیماران مبتلا به CF است. آلژینات، لیپوپلی‌ساکارید دتوکسیفای شده و اگزوتوکسین A مهم‌ترین شاخص‌های بیماری‌زایی این گونه هستندکه ایمنی ایجادشده علیه آنها در حذف کلنی‌های باکتری از ریه بیماران مبتلا مؤثر است. سویه‌های موکوئیدی واجد آلژینات، اصلی‌ترین عامل مرگ‌ومیر در عفونت‌های ریوی و بیماران مبتلا به CF هستند و بنابراین آلژینات، نخستین آنتی‌ژن انتخابی در مطالعه حاضر است. به علت سمیت لیپید A در LPS برای ایجاد شوک و تشدید بیماری‌زایی در بیماران مبتلا به سوختگی و CF و همچنین وجود زنجیره‌های جانبی آنتی‌ژن O در ساختار LPS، بهترین نامزد برای نانوواکسن محسوب می‌شود. ازسوئی سودوموناس آئروژینوزا به کانال پروتئینی یون کلر به نام CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) متصل می‌شود؛ ژن کدکننده این پروتئین در بسیاری از بیماران مبتلا به سیستیک فیبروسیس دچار جهش می‌شود. هسته مرکزی پلی‌ساکارید LPS باکتری به CFTR متصل می‌شود. باکتری یادشده با این آنتی‌ژن به سلول‌های ریه متصل می‌شود و سپس به آنها حمله می‌کند و از این رو، خالص‌سازی و جداسازی آن در ساخت واکسن کونژوگه به‌عنوان دومین آنتی‌ژن بررسی شد (12). با توجه به اینکه اگزوتوکسین A، عامل کشنده‌ای در ایجاد باکتریمی در قربانیان سوختگی محسوب می‌شود و به دنبال تولید عفونت در بیماران دارای نقص ایمنی، با تأثیر روی گلبول‌های سفید و تغییر عملکرد و تعداد آنها حائز اهمیت و یکی ازعوامل مرگ‌ومیر است (20)، سومین آنتی‌ژن استفاده‌شده در ساخت واکسن است.

هدف مطالعه حاضر، کونژوگاسیون آنتی‌ژن‌‌های آلژینات، لیپوپلی‌ساکارید دتوکسیفای شده و اگزوتوکسین A در سودوموناس آئروژینوزا با نانوذره زیست‌تخریب‌پذیر پلی‌لاکتید‌کو‌گلیکولاید با قابلیت جذب سطحی زیاد نامزدی برای نانوواکسن است..

در مطالعه دیگری که Suz و همکاران در سال 1994 انجام دادند، از توکسین حساس به حرارت باکتری E. coli و اگزوپروتئین A سودوموناس آئروژینوزا به‌عنوان حامل پروتئینی برای افزایش تیتر آنتی‌بادی علیه آلژینات و ایجاد ایمنی سلولی بهتر استفاده شد. ارزیابی ایمنی‌زایی با استفاده از تزریق به موش و سنجش تیتر آنتی‌بادی IgG با استفاده از رادیوایمونواسی (RIA) انجام شد (28). در مطالعه حاضر، برای سرعت‌بخشیدن به انجام واکنش از دو لینکر N-3، دی‌متیل‌آمینو‌پروپیل ‌ان-اتیل‌هیدروکید و N-هیدروکسی‌سوکسینیمید‌کاربودیمید استفاده شد. همچنین به‌جای استفاده از آنتی‌ژن پروتئینی دو باکتری مختلف، از دو آنتی‌ژن پلی‌ساکاریدی در کنار یک آنتی‌ژن پروتئینی استفاده شد. آزمون انجام‌شده در مطالعه Suz، بررسی تیتر آنتی‌بادی IgG بود و در مطالعه حاضر، علاوه بر بررسی تیتر آنتی‌بادی، بررسی سیتوکین‌های در ارتباط با ایمنی هومورال نیز انجام خواهد شد که جزو مطالعه‌های بعدی است.

Cryz و همکاران در سال 1991 روی بهبود ایمنی‌زایی آلژینات با استفاده از کونژوگاسیون آلژینات با پروتئین تتانی به‌عنوان حامل مطالعه کردند. نتایج آنها نشان دادند که آنتی‌بادی IgG بیشتری علیه آلژینات کونژوگه با حامل پروتئینی تولید می‌‌‌شود (29). در مطالعه حاضر، برای کونژوگاسیون از لینکرهای N-3، دی‌متیل‌آمینو‌پروپیل ان-اتیل‌هیدرو‌کید و N-هیدروکسی سوکسینیمیدکاربودیمید استفاده شد که در مقایسه با سایر مطالعه‌ها، کونژوگاسیون زیاد با موفقیت و بازده زیاد را نشان می‌دهد. همچنین به‌جای استفاده از آنتی‌ژن های دو باکتری متفاوت، از سه آنتی‌ژن مهم سودوموناس استفاده شد.

بر اساس مطالعه‌های پیشین، واکسن‌های کونژوگه به‌ویژه نانوواکسن‌ها که کلاس جدیدی از واکسن‌ها هستند، کارآمدتر و مقرون‌به‌صرفه‌تر از واکسن‌های معمولی هستند و قادرند به‌شدت سیستم ایمنی هومورال را القا کنند. بنابراین، پلی‌ساکارید‌هایی مانند آلژینات و LPS به‌تنهایی قادر به تحریک ایمنی هومورال و القای تولید آنتی‌بادی‌ها توسط لنفوسیت‌های B هستند، هرچند قادر به فعال‌کردن لنفوسیت‌های T (T-helper) نیستند. دوام پاسخ ایمنی کوتاه خواهد بود و ایجاد سلول‌های خاطره‌ای و تکامل میل ترکیبی آنتی‌بادی به آنتی‌ژن توسط این نوع از آنتی‌ژن‌‌ها رخ نمی‌دهد. از این رو، اگزوتوکسین A در کنار دو آنتی‌ژن پلی‌ساکاریدی به منظور فعال‌شدن لنفوسیت‌های T برای تولید سلول‌های خاطره‌ای برای تولید و تحریک ایمنی بلند‌مدت انتخاب شد.

نانوذره پلی‌لاکتید ‌کو‌گلیکولاید قابلیت خارق‌العاده‌ای در کپسوله‌کردن پروتئین 278 غشای خارجی کلامیدیا تراکوماتیس، آزادسازی کنترل‌شده و حامل هدفمند در رهایش داروی دوستاکسل (با نام تجاری تاکسوتر که به‌تازگی برای درمان سرطان پستان استفاده می شود) و رهایی آن به محل هدف و افزایش ماندگاری دارو در برابر تجزیه توسط آنزیم‌ها و تحریک سیستم ایمنی هومورال و سلولی و همچنین افزایش جذب و نفوذ دارو از خود نشان داد. بنابراین، یکی از مهم‌ترین مسائل در واکسیناسیون، نیاز به ادجوانت جدید و سیستم‌های تحویل واکسن است که امن‌تر، مفیدتر و مقرون‌به‌صرفه‌تر از واکسن‌های قدیمی باشند و بتوانند هر دو بازوی سیستم ایمنی هومورال و سلولی را به نحو مطلوبی تحریک کنند که در این میان، تحویل نانوسیستمی با نانوذره‌های زیست‌تخریب‌پذیر PLGA مناسب به نظر می‌رسد (30) .

از سال 1999، اداره غذا و داروی آمریکا (FDA) استفاده از PLGA را در داروهای مختلف و به‌ویژه داروهای ضد سرطانی تأیید کرده است (33). در مطالعه حاضر سعی شد آنتی‌ژن‌های کونژوگه‌ای از آلژینات، لیپوپلی‌ساکارید دتوکسیفای شده و اگزوتوکسین A سودوموناس آئروژینوزا طراحی شوند که میزان آنتی‌بادی اختصاصی تولیدشده در میزبان را افزایش دهند و برای این منظور، از نانوذره PLGA با قابلیت جذب سطحی زیاد استفاده شد. کونژوگه تهیه‌شده، سیستم ایمنی را با تولید سلول‌های خاطره‌ای به میزان زیادی تحریک می‌کند و به ایمنی‌زایی زیاد منجر می‌شود. در مطالعه حاضر، نبود مرگ‌ومیر در موش و نبود تب‌زایی در خرگوش بر سمی‌نبودن واکسن یادشده دلالت داشت. در نتیجه تحویل نانوسیستمی به‌ویژه با استفاده از پلیمرهای زیست‌تخریب‌پذیر مانند پلی‌لاکتید‌کو‌گلیکولاید به علت وجود مزایایی نظیر داشتن مجوز از آمریکا، روش تهیه و خالص‌سازی آسان، سمی‌نبودن، تخریب‌نکردن بافت اندام‌های حیاتی، تحریک چشمگیر سیستم ایمنی و القای حفاظت و ایمنی بهتر و پایدارتر نسبت به سایر حامل‌های رایج الویت دارد و با پژوهش‌های بیشتر، جایگزین حامل‌های رایج می‌شود. در پژوهش حاضر بر اساس فرکشن‌های حاصل از دو کونژوگه آلژینات و لیپوپلی ساکارید در طول موج 260 نانومتر و اگزوتوکسین A در 280 نانومتر، میزان خلوص سه کونژوگه یادشده تأیید شد. همچنین برای تکمیل بررسی میزان خلوص کونژوگاسیون در اگزوتوکسین A به‌عنوان مهم‌ترین آنتی‌ژن انتخابی در مطالعه حاضر، از ژل فیلتراسیون HRs200 استفاده شد. با توجه به آزمون‌های زتا سایزر، FT-IR و تصویر سه بعدی توسط میکروسکوپ اتمی، به‌ترتیب اندازه وشارژ هر سه کونژوگه، وجود گروه‌های عاملی دخیل در تشکیل پیوند استری در سه کونژوگه و جذب سطحی هر سه آنتی‌ژن روی نانوذره پلی‌لاکتیک‌کوگلیکولیک‌اسید تأیید شد. از طرفی نانوذره پلی‌لاکتیدکوگلیکولاید با ویژگی سمی‌نبودن و زیست‌تخریب‌پذیری، قابلیت مناسبی برای استفاده به‌عنوان حامل و عرضه‌کننده آنتی‌ژن در واکسن‌های کونژوگه دارد. بنابراین در صورت موفقیت کونژوگه‌های نانوذره‌شده در آزمایش‌های سنجش ایمنی‌زایی الگوی حیوانی که جزو مراحل بعدی مطالعه حاضر هستند، می‌توان گفت که ترکیبات آنتی‌ژنی تهیه‌شده نامزد مناسبی برای پیشگیری و مقابله در برابر عفونت‌های ناشی از سودوموناس در الگوی حیوانی هستند.

در جمع‌بندی کلی، سیستم تحویل با اندازه نانو قادر به افزایش جذب آنتی‌ژن‌ها یا محرک‌ها توسط سلول‌های ارائه‌کننده آنتی‌‌ژن یا APCs (Antigen presenting cells) است و واکنش‌های ایمنی بهتری نسبت به مشابهان محلول خود دارد. به‌طور کلی با استفاده از نانوذره پلیمری با آنتی‌ژن محبوس یا جذب‌شده در آنها از طریق هدف قرار‌دادن ارائه گزینشی آنتی‌ژن به سلول‌های دندریتیک (DCs) می‌توان رهاسازی آنتی‌ژن و پاسخ ایمنی مد نظر را بهبود بخشید (32). همچنین این نانوذره‌ها به‌طور گسترده به‌عنوان حامل در رهایی واکسن و برای تحویل کنترل‌شده عوامل مختلف ازجمله پروتئین‌ها، DNA، پلاسمید و ترکیبات با وزن مولکولی کم استفاده می‌شوند. از دیگر مزیت‌های روش نانو‌سیستمی، کاهش عوارض جانبی و امکان همکاری کپسوله‌ سازی اپی‌توپ‌های آنتی‌ژن‌های مختلف و یا هر دو آنتی‌ژن و ادجوانت در یک حامل است. از سوی دیگر، راهبردهای اخیر برای توسعه پیشگیرانه و درمانی واکسن در توانایی ارائه آنتی‌ژن به سلول‌های دندریتیک، بر شیوه‌ای هدفمند و طولانی‌مدت با استفاده از نانوذره‌ها متمرکز است، زیرا نانوذره‌ها موجب افزایش طول عمر آنتی‌ژن دست‌نخورده و افزایش دستیابی به آن و فرصت به DC برای جذب و پردازش آنتی‌ژن می‌شوند. سلول‌های دندریتیک، سلول‌های عرضه‌کننده آنتی‌ژن هستند و نقش مهمی در شروع پاسخ ایمنی سلولی دارند. این سلول‌ها در ایجاد ایمنی سلولی از طریق سیستم‌های MHC کلاس یک و دو  نقش دارند و پس از آن، ارائه پپتیدهای آنتی‌ژنی به سلول‌های CD4⁺ و CD8⁺ را برعهده دارند. بنابراین هدف‌گرفتن سلول‌های دندریتیک با سیستم ارائه آنتی‌ژن، پتانسیل فوق‌العاده‌ای در تولید واکسن‌های جدید فراهم می‌کند. جذب آنتی‌ژن به وسیله نانوذره‎های پلیمریک توسط سلول‌های دندریتیک مزیت بیشتری دارد و از همه مهم‌تر، ذره‌های آنتی‌ژنی نسبت به آنتی‌ژن‌های محلول در القای پاسخ‌های ایمنی مؤثرتر هستند و با استفاده از تغییر اندازه ذره‌ها، ساختار شیمیایی، آبگریزی سطح و ادجوانت استفاده‌شده، تحویل واکسن به وسیله نانوذره‌ها هدفمند می‌شود.