نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دکترای بیولوژی و بیوتکنولوژی خاک، دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران
2 استاد بیولوژی و بیوتکنولوژی خاک، دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران
3 دانشیار بیولوژی و بیوتکنولوژی خاک، دانشگاه تبریز، ایران
4 استاد بیولوژی و بیوتکنولوژی خاک، دانشگاه تبریز، ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Phosphate solubilizing bacteria play roles in phosphate solubilizing from mineral sources. These bacteria with different mechanisms make it soluble, some parts of solubilized P were absorbed in their biomass and the other parts, released in the soluble form which can be used by other organisms.
Materials and methods: In this study, 24 bacterial isolates belonged to different genera such as Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium, Beijerinckia, Klebsiella, Agrobacterium, Alcaligenes, Sphingomnas, Microbacterium and Citrobacter were examined to determine solubilized P from two sources of phosphate (TCP and RP) in Sperber medium. This research was carried out in a complementary random design with three replications. At the end of incubation time, solubilized P in supernatant, amount of P in biomass and total solubilized P were measured.
Results: The results showed that isolates are efficient in solubilizing P from TCP than RP. By decreasing pH, solubilized P was increased (r=0.775, p<0.01) and it followed by increasing EC (r=0.789, p<0.01). Highest P in supernatant was measured in media inoculated with Pseudomonas, Azotobacter and Agrobacterium. Maximum absorbed P in biomass was determined in Agrobacterium and Citrobacter isolates. However, total solubilized P including (phosphorus in supernatant and phosphorus in biomass) were the highest in Agrobacterium and Citrobacter (527.4 and 460.8 mg/l, respectively). Highest bio-absorption percent (P biomass/ P added) was recorded in Klebsiella sp. 4A-1 (44.44%) and Agrobacterium sp. 22SP-1 (42.33%), and maximum P solubilization rate (P supernatant/ P solubilized total) was observed in Pseudomonas sp. 34SPIII (0.51) and Azotobacter chroococcum 44SP-2 (0.5).
Discussion and conclusion: In most researches, solubilized P which is present in supernatant takes more attention but phosphorus in biomass is ignored which can be mineralized and available with a delay. This study showed that most parts of solubilized P were measured in microbial biomass. Hence, attention to this criterion could help us to select efficient PSB.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
پس از نیتروژن، فسفر دومین و مهم‌ترین عنصر غذایی لازم برای رشد و نمو گیاهان و ریزجانداران است. فسفر، عنصر غذایی کاهش‌دهنده رشد گیاه به‌ویژه در خاک‌های آهکی است و همانند نیتروژن در اتمسفر یافت نمی‌شود تا با فرایندهای زیستی برای گیاهان فراهم و سبب رشد و گسترش ریشه، ساقه و بذر گیاهان شود. فسفر در فرایندهای ویژه یاخته‌ای مانند فتوسنتز، تنفس، تقسیم یاخته‌ها و چندین فرایند مهم دیگر در گیاه زنده کارایی دارد (1). به هر حال، بیشترین میزان فسفر خاک (95 تا 99 درصد) به شکل فسفر نافراهم است و گیاهان از آن بهره‌مند نمی‌شوند. ویژگی‌هایی مانند آب و نمناکی خاک، سوخت‌وساز گیاه و اسیدیته محلول خاک بر جذب فسفر ریشه مؤثر هستند (2). بنابراین، کشاورزان برای برآوردن نیاز فسفر گیاهان از کودهای شیمیایی بهره‌گیری میکنند که ته‌نشستی به شکل نافراهم تری‌کلسیم‌فسفات و سنگ فسفات هستند (3). فسفر به میزان بسنده‌ای در خاک یافت میشود ولی دسترسی و زیست‌فراهمی آن به شکل فسفات‌های آهن و آلومینیوم در خاک‌های اسیدی و فسفات‌کلسیم در خاک‌های آهکی بسیار کم و میزان آنها به دلیل ظرفیت تثبیت زیاد آنها در خاک کم است (4) بنابراین باکتری‌های حل‌کننده فسفات از راه‌های گوناگون اندوخته‌های فسفری خاک را برای گیاهان فراهم‌تر میکنند. پرداختن به راهکارهای زیستی با نگاه به آلودگی‌های زیست‌محیطی و گران‌بودن کودهای شیمیایی در سال‌های گذشته سبب جلب توجه بیشتر شده است. بنابراین از ریزجانداران خاک که توانایی انجام فرایندهای زیستی گوناگون را دارند و در همه گام‌های دگرگونی چرخه عناصر غذایی در خاک سودمند و کارا هستند، در این زمینه بهره‌گیری میشود. باکتری‌های حل‌کننده فسفات [1](PSB) به حل فسفات معدنی نامحلول کمک و آن را به‌شکل فراهم برای گیاه دگرگون میکنند.
باکتری‌های حل‌کننده فسفات، گروه توانمندی برای هیدرولیز فسفات‌های آلی و حل فسفات‌های معدنی نامحلول هستند (3). سوخت‌و ساز ریزجانداران در راستای حل فسفات نامحلول عبارتند از: ساخت اسیدهای آلی، واکنش‌های تبادلی و کلاته‌کردن (1). مجموعه این دگرگونی بیوشیمیایی سبب باروری خاک و بهبود کارکرد ریزجانداران میشود (5). رهاسازی فسفر از شکل‌های نامحلول فسفر با کمک باکتری‌های حل‌کننده فسفات در برآورد فسفر در دسترس گیاهان اهمیت بسیاری دارد. یافته‌های بسیاری توانایی باکتریها برای حل فسفات را نشان می‌دهند (6). ریزوباکترهای افزاینده رشد گیاه توانایی حل فسفات از ترکیبات فسفر نامحلول همانند تری‌کلسیم‌فسفات، دی‌کلسیم‌فسفات، هیدروکسی‌آپاتیت و سنگ فسفات را دارند (7). گزارش شده است که از میان باکتریها، جنس‌های سودوموناس، باسیلوس، ریزوبیوم، بورخولدریا، پانتوا، اکروموباکتر، اگروباکتریوم، میکروکوکوس، فلاووباکتریوم و اروینیا همانند باکتری‌های افزاینده رشد گیاه دارای توانایی حل فسفات آلی و کانی در خاک هستند (8 و 9). بهره‌گیری از باکتری‌های حل‌کننده فسفات سبب افزایش جذب فسفر در گیاهان میشود و عملکرد را افزایش می‌دهد (10 و 11).
دو روش کیفی و کمی برای بررسی توانایی حل‌کنندگی فسفات ریزجانداران بهره‌گیری می‌شوند. در بررسی کیفی، ساخت هاله شفاف و یا نسبت قطر هاله شفاف به قطر کلنی در کشتگاه جامد شناسه توانایی حل فسفات باکتری‌هاست (12 و 13). در بررسی کمی که در کشتگاه آبکی و درون شیشه انجام میشود، اندازه فسفر در بخش روشناور که همانند فسفر محلول است، اندازهگیری و میزان آن به‌عنوان توانایی باکتری در حل فسفات معدنی گزارش میشود (14). باکتری‌های حل‌کننده فسفات، میزانی از فسفر آزادشده را در ساختار خود جذب و انباشته میکنند که فسفر بی‌جنبش‌شده در زیتوده است. افزون بر کارکرد ریزجانداران در کانی‌شدن فسفر مواد آلی خاک، فسفر زیتوده میکروبی کارکرد بسیار مهمی در چرخه فسفر دارد و به شکل فراهم و در دسترس برای گیاهان در می‌آید (15). این بخش فسفر به شکل آلی در ساختار یاخته ریزجانداران است و با کمک آنزیم‌های فسفاتاز کانی میشود و دوباره به شکل کانی و محلول در می‌آید (16 و 17). کارکرد فسفر زیتوده میکروبی در برآورد نیاز فسفر گیاهان در سال چشمگیر است و تندی دگرگونی فسفر زیتوده میکروبی به فسفر فراهم بسیار بیشتر از دیگر عناصر آلیشده در زیتوده است، در مقایسه با دیگر عناصر، بیشترین میزان فسفر زیتوده میکروبی موجود در بخش‌های گوناگون یاخته، ناپایدار هستند و تنها بخش کوچکی از فسفر در دیواره یاخته‌ای ریزجاندار است (17، 18 و 19). در پژوهش حاضر، افزون بر بررسی فسفر حل‌شده در آبگونه رویی، به این بخش از فسفر انباشته‌شده در ساختار یاخته‌ای نیز پرداخته شده است. بررسی و اندازهگیری این بخش از فسفر نیز توان ریزجانداران در گشودن فسفات‌های نامحلول و افزایش زیست‌فراهمی فسفر در زیستگاه‌های گوناگون را نشان می‌دهد. از این رو، 24 جدایه باکتری بهره‌گیری و توان حل‌کنندگی فسفات آنها در کشتگاه اسپربر مایع درون‌شیشه با بهره‌گیری از دو کانی فسفری (تری‌کلسیم‌فسفات و سنگ فسفات) بررسی شد. اندازه فسفر محلول در روشناور و فسفر انباشته‌شده در ساختار میکروبی و درصد جذب زیستی و نسبت فسفر روشناور به فسفر زیتوده جدایه‌ها اندازهگیری شدند؛ فرض بر این است که جدایه‌ای با اندازه فسفر روشناور بالا و درصد جذب زیاد، کارایی ویژه‌ای در افزایش زیست‌فراهمی فسفر در زیستگاه‌ها دارد.
مواد و روش‌ها.
باکتری‌های آزمون شده:در مطالعه حاضر از 24 جدایه باکتریایی (2A-1، 2SP-5، 3A-1S، 4A-1، 12A-3، 14A-4، 14SPI، 14SPIII، 16SP-2، 16SP7-2، 16SP8-2، 22SP-1، 34A-3، 34SPIII، 35SP-2، 35SP-3، 35A، 36A-2M، 37SP، 43SP-2، 44A-AS، 44A-AZ، 44SP-2 و 47A1-3) متعلق به جنس‌های سودوموناس، ازتوباکتر، اگروباکتریوم، کلبسیلا، اسفینگوموناس، ریزوبیوم، میکروباکتریوم، اکروموباکتر و بیجرینکیا استفاده شد. باکتری‌های یادشده از بانک میکروبی گروه علوم و مهندسی خاک دانشگاه همدان و تبریز دریافت و یافته‌های شناسایی مولکولی در جدول 1 آورده شده است.
جدول1- جدایه‌های آزمون‌شده و یافته‌های شناسایی مولکولی آنها
|
جدایه |
شناسایی مولکولی |
جدایه |
شناسایی مولکولی |
|
2A-1 |
شناسایی‌نشده |
34A-3 |
شناسایی‌نشده |
|
2SP-5 |
بیجرینکیا |
34SPIII |
سودوموناس |
|
3A-1S |
کلبسیلا |
35SP-2 |
سودوموناس |
|
4A-1 |
کلبسیلا |
35SP-3 |
شناسایی‌نشده |
|
12A-3 |
ریزوبیوم |
35A |
اکروموباکتر |
|
14A-4 |
اگروباکتریوم |
36A-2M |
سودوموناس |
|
14SPI |
ازتوباکتر |
37SP |
اسفینگوموناس |
|
14SPIII |
اکروموباکتر |
43SP-2 |
بیجرینکیا |
|
16SP-2 |
ازتوباکتر |
44A-4S |
سیتروباکتر |
|
16SP7-2 |
سودوموناس |
44A-AZ |
میکروباکتریوم |
|
16SP8-2 |
شناسایی‌نشده |
44SP-2 |
ازتوباکتر |
|
22SP-1 |
اگروباکتریوم |
47A1-3 |
کلبسیلا |
ساخت کشتگاه و اندازهگیری فسفر محلول[2] (روشناور) و زیتوده:کشت تازه (یک‌شبه) باکتریها در کشتگاه نوترینت براث انجام شد تا در آزمایش‌های پژوهش حاضر بهره‌گیری شود. برای بررسی توان حل‌کنندگی فسفات جدایه‌ها، هر جدایه با سه تکرار در کشتگاه اسپربر مایع (10 گرم گلوکز، 5/2 گرم کانی فسفر نامحلول، 5/0 گرم عصاره مخمر، 1/0 گرم کلرید‌کلسیم و 25/0 گرم سولفات‌منیزیم در لیتر) با بهره‌گیری از دو کانی فسفری نامحلول (تری‌کلسیم‌فسفات و سنگ فسفات) کشت شد (20). اسیدیته کشتگاه پیش از سترون‌شدن و مایه‌زنی باکتریها، 7 تنظیم شد. ارلن‌های حاوی کشتگاه مایع اسپربر با 5/0 میلی‌لیتر سوسپانسیون جوان باکتریها (کشت‌شده در نوترینت براث با چگالی نوری 8/0) مایه‌زنی شدند. در پژوهش حاضر، تیمار شاهد تنها با 5/0 میلی‌لیتر کشتگاه نوترینت براث سترون مایه‌زنی شد. نمونه‌های دارای باکتری و شاهد (بدون باکتری) برای یک هفته در شیکر انکوباتور، تاریکی و دمای 26 درجه سلسیوس نگهداری و با دور rpm120 تکان داده شدند. برای برداشت نمونه از کشتگاه، ابتدا کشتگاه خوب هم زده و سپس 5 تا 10 دقیقه آرام رها شد تا دانه‌های آب‌آویز فسفات کانی در کشتگاه ته‌نشین شوند. سپس از بخش رویی آن نمونه‌برداری شد. ممکن است برخی از دانه‌های کانی فسفره و یاخته‌های باکتری آب‌آویز در روشناور نمونه باشند و از نمونه شاهد آزمایش (بدون باکتری) برای اندازهگیری و برآورد دانه‌های آب‌آویز کانی نمونه بهره‌گیری شد. برای این کار، 2 میلی‌لیتر از سوسپانسیون‌های یادشده برداشته و 10 دقیقه در دور rpm13000 سانتریفیوژ شد؛ در این گام، یاخته‌های باکتری، دیگر دانه‌های آب‌آویز و فسفات کانی به کمک سانتریفیوژ ته‌نشین و از آبگونه رویی جدا شدند. سپس فسفر محلول یا روشناور در آبگونه روشن رویی به روش وانادات-مولیبدات اندازهگیری شد (14 و 21). از آنچه ته میکروتیوپ است برای اندازهگیری فسفر زیتوده بهره‌گیری شد. برای این کار، 2 میلی‌لیتر سولفوریک‌اسید 3 نرمال روی هر نمونه و شاهد آزمایش ریخته و 5 الی 10 دقیقه گرما داده شد تا ته‌نشست باکتری و کانی مانده در ته لوله سانتریفوژ به‌خوبی گوارش و فسفر زیتوده و فسفر کانی مانده در آنها آزاد شوند. پس از سردشدن، چند قطره معرف فنل‌فتالئین و 5/2 میلی‌لیتر هیدروکسید‌سدیم 3 نرمال ریخته شد تا اسید بهره‌گیری‌شده خنثی شود و سپس به حجم 10 میلی‌لیتر رسانده شد (22 و 23). در این گام، فسفر به روش آبی (روش آسکوربیک‌اسید- مولیبدات) اندازهگیری شد که پاسخ‌دهنده‌تر از روش وانادات-مولیبدات است. این روش برای اندازه‌های کم فسفر محلول به کار می‌رود. در پایان، 5/2 میلی‌لیتر عصاره آماده‌شده برداشته و با 4 میلی‌لیتر محلول کاری آمونیوم‌هپتامولیبدات، 5 میلی‌لیتر آب مقطر و 5/0 میلی‌لیتر آسکوربیک‌اسید آمیخته شد و هم‌زمان، استانداردها نیز آماده شدند. پس از 15 دقیقه از پیدایش رنگ آبی، شدت رنگ در طول موج 730 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. همان‌طور که یاد شد در کنار نمونه‌های فسفر آبگونه رویی و بخش ته‌نشین‌شده، شاهد آزمایش نیز اندازه گیری شد (24). پس از اندازهگیری فسفر روشناور و بخش ته‌نشین‌شده در نمونه‌های مایه‌زنی‌شده با جدایه‌ها و شاهد، همه فسفر رهاشده از کانی بر پایه میلی‌گرم بر لیتر برآورد شد. در پژوهش حاضر، همه فسفر رهاشده از کانی‌های بهکاررفته در کشتگاه‌ها، مجموع فسفر روشناور و فسفر زیتوده در هر کشت باکتری‌هاست. گذشته از این، در پژوهش حاضر نسبت فسفر روشناور به فسفر زیتوده در هر کشت جدایه‌ها نیز برآورد و آزمون شد؛ این نسبت نشان می‌دهد که باکتری تا چه اندازه فسفر رهاشده را به شکل محلول و چه اندازه در یاخته خود انباشته می‌کند. درصد جذب زیستی فسفر هم شناسه دیگری است که در پژوهش حاضر برآورد و آزمون شد؛ برای برآوردکردن آن، فسفر زیتوده در کشت هر جدایه به همه فسفر بهکاررفته در کشتگاه تقسیم و در 100 ضرب شد که توان انباشتگی زیستی[3] فسفر هر جدایه را نشان می‌دهد. افزون بر این ویژگی‌ها، اسیدیته و رسانایی الکتریکی کشتگاه‌های مایه‌زنی‌شده با باکتریها و شاهد آزمایش به کمک دستگاه‌های pHسنج و ECسنج در پایان آزمایش اندازهگیری شدند تا پس از بررسی دگرگونی آنها در کشت هر جدایه، هم‌بستگی دگرگونی آنها با میزان فسفر روشناور، فسفر زیتوده، همه فسفر رهاشده از کانی‌ها، نسبت فسفر روشناور به فسفر زیتوده و درصد جذب فسفر بررسی شود..
تجزیه و تحلیل آماری:در پژوهش حاضر، آزمایش فاکتوریل بود و با طرح کاملاً تصادفی در سه تکرار انجام شد. فاکتور نخست، جدایه باکتری (24 جدایه باکتری، 1 نمونه شاهد و در مجموع، 25 تیمار) و فاکتور دوم کانی فسفری بهکاررفته در کشتگاه اسپربر (تری‌کلسیم فسفات و سنگ فسفات) بود. تجزیه داده‌ها با نرم‌افزار MSTATC انجام و آزمون میانگین‌ها با آزمون چنددامنه‌ای دانکن در پایه آماری 5 درصد انجام شد. هم‌بستگی میان ویژگی‌های بررسی‌شده به کمک نرم‌افزار SPSS انجام شد.
نتایج.
فسفر محلول: تجزیه واریانس داده‌های اندازهگیری فسفر در بخش روشناور و زیتوده و نیز همه فسفر رهاشده از کانی‌ها نشان داد که جدایه باکتری، کانی فسفری بهکاررفته و برهم‌کنش آنها، پیامد چشمگیری از دیدگاه آماری بر ویژگی‌های یادشده دارند (جدول 2).
آزمون میانگین‌های ویژگی‌های یادشده نشان داد که اندازه فسفر روشناور در کشت سودوموناس جدایه 35SP-2 ( mg.l-15/263) و ازتوباکتر جدایه 44SP-2 ( mg.l-12/257) در کشتگاه دارای تری‌کلسیم‌فسفات، بیشترین است و از دیدگاه آماری ناهمانندی چشمگیری با شاهد آزمایش ( mg.l-166/57) دارد. فسفر روشناور در مایه‌زنی کشتگاه دارای تری‌کلسیم‌فسفات با این باکتریها در مقایسه با شاهد آزمایش، افزایشی نزدیک به 5/3 برابر را در پی داشت. پس از آن، جدایه‌های 35SP-3، 34SPIII، 14A-4 و 35A به‌ترتیب با میانگین 1/229، 9/224، 8/224 و 3/206 میلی‌گرم بر لیتر، بیشترین میانگین را در کشتگاه دارای تری‌کلسیم‌فسفات داشتند (شکل 1). کانی‌های گوناگون فسفری مانند هیدروکسی آپاتیت، فسفات‌آهن، فسفات‌کلسیم و مانند آنها از دیدگاه انحلال‌پذیری شیمیایی و زیستی، رفتار ناهمانندی دارند؛ خان[4] و همکاران (6) نشان دادند سودوموناس فلورسنس از کانی‌های تری‌کلسیم‌فسفات، فسفات‌آلومینیوم و فسفات‌آهن به‌ترتیب 100، 92 و 51 میکروگرم بر میلی‌لیتر فسفر آزاد می‌کند. انحلال بیشتر فسفر از کانی تری‌کلسیم‌فسفات در برابر سنگ فسفات را رودریگز و فراگا[5] (10) نیز گزارش کرده‌اند. به هر حال، تری‌کلسیم‌فسفات و هیدروکسی‌آپاتیت در مقایسه با سنگ فسفات ناپایدارتر هستند. آیودیپودی[6] و همکاران (25) میزان حل‌کنندگی فسفات را در باکتری‌هایجنس‌های باسیلوس، سودوموناس و ازتوباکتر 80 تا 100 میلی‌گرم بر لیتر گزارش کردند. علاوه بر باکتریها، قارچ‌ها نیز توانایی انحلال فسفات‌کلسیم را دارند همانند قارچ‌های دیواره‌تاریک. مشابه پژوهش یادشده را اسپاگنولتی[7] و همکاران (26) روی قارچ دیواره‌تاریک جداسازی‌شده از گیاه گندم در کشتگاه مایع و جامد و در شرایط درون‌شیشه انجام دادند. یافته‌های آنها نشان دادند که تمام جدایه‌ها در کشتگاه جامد قادر به انحلال فسفات‌کلسیم بودند اما جدایه‌ها دارای توانمندی‌های متفاوتی نسبت به هم در کشتگاه مایع بودند.
جدول 2- تجزیه واریانس (میانگین مربعات) فسفر روشناور، فسفر زیتوده و همه فسفر رهاشده از کانی‌های بهکاررفته
|
میانگین مربعات |
||||
|
منابع تغییر |
درجه آزادی |
فسفر روشناور |
فسفر زیتوده |
همه فسفر رهاشده از کانی |
|
جدایه باکتری |
24 |
**917/6580 |
**716/14513 |
**007/21424 |
|
کانی فسفری |
1 |
**553/645396 |
**624/283689 |
**913/1785054 |
|
جدایه باکتری× کانی فسفری |
24 |
**990/5980 |
**058/7926 |
**098/16155 |
|
خطا |
100 |
932/104 |
111/524 |
187/786 |
|
درصد ضریب دگرگونی |
|
86/12 |
12/20 |
49/14 |
** چشمگیر در پایه آماری 1 درصد
اندازهگیری اسیدیته و رسانایی الکتریکی کشتگاه پس از مایه‌زنی باکتریها و گذشت یک هفته انکوباسیون،دگرگونی چشمگیر آنها را نشان داد (جدول 3)؛ اسیدیته کشتگاه مایه‌زنی‌شده با باکتریها به شکل چشمگیری تا 58/3 برابر اسیدیته شاهد آزمایش کاهش و شوری کشتگاه بسته به حل‌شدن کانی‌ها افزایش یافت. بررسی هم‌بستگی این دو ویژگی، پیوستگی وارونه و چشمگیر آنها را نشان داد (**706/0-r= ) (شکل‌های 4 و 5). کاهش اسیدیته کشتگاه‌های مایه‌زنی‌شده به دلیل رهاسازی اسیدهای ساخته‌شده از باکتری‌های مایه‌زنی‌شده در کشتگاه است. همان‌طور که در بسیاری از یافته‌های پژوهشگران نیز آمده است، بهره‌گیری از قندها به‌ویژه گلوکز در کشتگاه و اکسیداسیون آن سبب ساخت اسیدهای آلی میشود (10). کاهش اسیدیته وابسته به ساخت اسیدهای آلی، کارایی ویژه‌ای در حل کانی‌های فسفری دارد (15) و در بررسی‌های گوناگون، هم‌بستگی منفی این دو ویژگی گزارش شده است (27). بهرا[8] و همکاران (28)، توان حل‌کنندگی فسفات گونه‌ای از جنس سراشیا را در کشتگاه جامد NBRIP و کشتگاه مایع NBRIP-BPB بررسی کردند؛ تری‌کلسیم‌فسفات تنها منبع فسفر در این کشتگاه بود و یافته‌ها نشان دادند که بیشینه فعالیت حل‌کنندگی جدایه برابر 84/44 میکروگرم بر میلی‌لیتر است. میزان اسیدیته کشتگاه از 7 به 15/3 کاهش یافت که ساخت انواع اسیدهای آلی مانند مالیک‌اسید، لاکتیک‌اسید و استیک‌اسید را نشان می‌دهد. میانگین اسیدیته اندازه‌گیری‌شده برای جدایه سودوموناس 35SP-2 برابر 68/3 بود؛ این جدایه، کاراترین باکتری در افزایش فسفر روشناور در کشتگاه‌های بهکاررفته بود که شاید به توان اسیدزایی آن وابسته باشد. در پژوهش حاضر، هم‌بستگی منفی چشمگیری (**775/0-r=) میان فسفر بخش روشناور با اسیدیته کشتگاه‌ها و هم‌بستگی مثبت و چشمگیری با اندازه رسانایی الکتریکی (**789/0r=) کشتگاه‌ها دیده شد. رشید[9] و همکاران (25) با بررسی توانایی ساخت اسیدهای آلی در کشتگاه جامد و مایع پیکوفسکایا با دستگاه HPLC، گزارش کردند که در کشت چند باکتری و قارچ جداشده از ریزوسفر برنج پس از 7 روز انکوباسیون، اسیدیته محلول با ساخت اسیدهای آلی کاهش چشمگیری یافت. ایشان نشان دادند که جدایه‌های حل‌کننده فسفات با گذشت زمان در کشتگاه جامد، گلوکونیک‌اسید، فوماریک، سوکسینیک و استیک‌اسید و برخی اسیدهای ناشناخته را با غلظت کمتری می‌سازند و در کشتگاه مایع، اگزالیک و سیتریک‌اسید با غلظت بیشتری ساخته می‌شوند. اسیدهای آلی ساخته‌شده باکتری‌های حل‌کننده فسفات سبب کاهش اسیدیته و کلاته‌کردن کاتیون‌ها می‌شوند. همچنین یافته‌ها نشان داده‌اند که اسیدهای آلی، کمپلکس‌های محلولی را با یون‌های فلزی همراه فسفر در کانی‌های فسفری (آهن، آلومینیوم و کلسیم) می‌سازند که سبب رهاسازی فسفر به شکل محلول میشود (29 و 30). پژوهشگران دیگری نیز کاهش اسدیته کشتگاه مایع باکتری‌های حل‌کننده فسفات را گزارش کرده‌اند (31، 32 و 33). ایلمر و شینر[10] (34) بیان کردند که گاهی در زیستگاه دارای اسیدیته زیاد نیز حل کانی‌های فسفری رخ می‌دهد و این به کلاته‌شدن اسیدهای آلی با یون کلسیم در تری‌کلسیم فسفات وابسته است. آسا[11] و همکاران (35) و ویتلا[12] و همکاران (36) هم‌بستگی مثبتی میان حل‌شدن فسفات و اسیدیته گزارش کردند. اگرچه یافته‌های پژوهشگران نشان می‌دهند که اسیدهای آلی سبب حل فسفات می‌شوند، چنین رابطه‌ای درباره حل فسفر از سنگ فسفات به روشنی دیده نشده و در یافته‌های برخی پژوهشگران، هم‌بستگی بسیار کمی میان اسیدیته و میزان حل فسفات در کشتگاه ریزجانداران گزارش شده است (37).
در پژوهش حاضر، میانگین فسفر رهاشده در کشتگاه حاوی تری‌کلسیم‌فسفات، 257/145 میلی‌گرم بر لیتر و در کشتگاه حاوی سنگ فسفات، 078/14 میلی‌گرم بر لیتر بود. گوانگ- کن[13] (38)، میزان فسفر محلول آزادشده در کشتگاه مایع دارای تری‌کلسیم‌فسفات مایه‌زنی‌شده با برخی باکتری‌های گرم منفی را 8/78 میلی‌گرم در 100 میلی‌لیتر کشتگاه گزارش کرد. رفیعی و اسدی رحمانی[14] (39)، با بررسی توانایی انحلال فسفر جدایه‌های فلاووباکتریوم در کشتگاه اسپربر نشان دادند که از 44 جدایه آزمایش‌شده، 34 جدایه توانایی حل‌کنندگی فسفر از تری‌کلسیم‌فسفات را از صفر تا 48/37 میکروگرم بر میلی‌لیتر دارند.
فسفر زیتوده:فسفر اندوخته‌شده در زیتوده میکروبی از جذب یون فسفات محلول در کشتگاه و به‌کارگیری آن در زیتوده میکروبی پدید می‌آید. اگرچه این بخش از فسفر در یاخته باکتریها بی‌جنبش‌شده[15] و برای گیاهان فراهم نیست، پس از زمان کوتاهی با مرگ باکتریها از شکل بی‌جنبش‌شده و آلی به شکل کانی دگرگون میشود و برای گیاه فراهم و در دسترس خواهد شد. تجزیه واریانس داده‌های فسفر زیتوده باکتریها نشان داد که پیامد دو فاکتور گونه باکتری و کانی فسفری و همچنین برهم‌کنش آنها بر فسفر زیتوده در پایه آماری 1 درصد چشمگیر است (جدول 2).
آزمون میانگین فسفر زیتوده نشان داد که جدایه‌های Klebsiela sp. 4A-1 (mg l-12/222) و Agrobacterium sp. 22SP-1 ( mg l-16/211) بیشترین میانگین فسفر زیتوده را داشتند که به میزان چشمگیری بیشتر از شاهد بود. پس از آن، بیشترین میانگین‌ها را جدایه‌های 14A-4 و 3A-1S به‌ترتیب با میانگین 6/185 و 3/179 میلی‌گرم بر لیتر در دو کشتگاه بهکاررفته داشتند. در بررسی فسفر زیتوده در برهم‌کنش تیمارها (شکل 2) دیده شد که جدایه Agrobacterium sp. 22SP-1، بیشترین میانگین (میانگین 2/372 میلی‌گرم بر لیتر) فسفر زیتوده را در کشتگاه دارای تری‌کلسیم‌فسفات داشت و پس از آن، جدایه‌های 14A-4 و 44A-4S به‌ترتیب با 6/302 و 0/283 میلی‌گرم بر لیتر قرار داشتند. دو جدایه 4A-1 و 3A-1S در کشتگاه‌های دارای دو کانی فسفری، فسفر زیتوده خوبی را انباشته کردند و در کشت این دو جدایه، بیشترین فسفر زیتوده در کشتگاه دارای سنگ فسفات دیده شد.
ایلمر و شینر (34) گزارش کردند که میزان فسفر زیتوده برای جنس‌های Pseudomonas sp.وP. aurantiogriseumبه‌ترتیب 4/0 و 8/0 درصد بود. همانند این یافته‌ها را بیور و بورنز[16] (40) نیز گزارش و بیان کرده‌اند که سیستم جذب و آلی‌شدن[17] فسفر با گرفتن فسفر محلول از کشتگاه سبب حل بیشتر کانی‌های این عنصر از فاز جامد میشود؛ این یافته‌ها را ایلمر و شینر (41) نیز گزارش کرده‌اند؛ آنها هم‌بستگی چشمگیر و بسیاری میان فسفر آلیشده و زیتوده میکروبی در پژوهش خود دیدند. همچنین جورینک[18] و همکاران (42) بیان کردند که سازوکار حلالیت به ساخت زیتوده میکروبی وابسته است؛ در این پژوهش، هم‌بستگی میان اندازه فسفر زیتوده میکروبی و اسیدیته کشتگاه بررسی و آزمون و هم‌بستگی منفی و ناچشمگیری میان این دو دیده شد (ns012/0-r= ). گفتنی است که فسفر محلول اندازه‌گیری‌شده در روشناور کشتگاه‌ها با اسیدیته هم‌بستگی چشمگیر و وارونه‌ای داشت. بنابراین حل، واکنشی زیست‌شیمیایی و وابسته به کارکرد ریزجانداران در کشتگاه است ولی فسفر زیتوده به اسیدیته زیستگاه وابستگی چندانی ندارد و تنها فرایندی زیستی است.
شکل 1- میانگین فسفر روشناور جدایه‌های باکتری در کشتگاه‌های دارای تری‌کلسیم فسفات و سنگ فسفات
جدول 3- تجزیه واریانس (میانگین مربعات) اسیدیته و شوری کشتگاه اسپربر پس از مایه‌زنی جدایه‌ها
|
میانگین مربعات |
||||
|
منابع تغییر |
درجه آزادی |
pH کشتگاه |
EC کشتگاه |
|
|
گونه باکتری |
24 |
**341/3 |
**498/0 |
|
|
کانی فسفری |
1 |
**892/5 |
**938/9 |
|
|
گونه باکتری× کانی فسفری |
24 |
**319/1 |
**401/0 |
|
|
خطا |
100 |
027/0 |
006/0 |
|
|
درصد ضریب دگرگونی |
|
52/3 |
01/8 |
|
** چشمگیر در پایه آماری 1 درصد
شکل 2- فسفر زیتوده جدایه‌های باکتری در کشتگاه‌های دارای تری‌کلسیم‌فسفات و سنگ فسفات
همه فسفر رهاشده از کانی: پس از بررسی یافته‌های فسفر محلول و فسفر زیتوده میکروبی، همه فسفر رهاشده از کانی محاسبه شد تا میزان فسفر آزادشده از کانی‌های فسفر بهکاررفته بررسی شود. همه فسفر رهاشده از کانی، از مجموع فسفر محلول در بخش روشناور و اندازه فسفر آلیشده در زیتوده میکروبی برآورد شد. تجزیه واریانس داده‌های اندازهگیری همه فسفر رهاشده از کانی (روشناور و زیتوده) نشان داد که همه فاکتورهای آزمایش‌شده پیامد چشمگیری در پایه آماری 1 درصد داشته‌اند (جدول 2). انجام آزمون میانگین همه فسفر رهاشده از کانی‌ها در کشت هر یک از جدایه‌ها در کشتگاه‌های دارای کانی‌های تری‌کلسیم‌فسفات و سنگ فسفات در شکل 3 گزارش شده است. این بخش از پژوهش نشان داد که همه فسفر رهاشده از کانی بیشتر به فسفر زیتوده وابسته است تا فسفر روشناور و جدایه‌هایی که میزان فسفر زیتوده آنها بیشتر بود، فسفر رهاشده بیشتری از کانی‌ها داشتند و از دیدگاه آماری، میانگین‌های آنها به شکل چشمگیری بیشتر از دیگر گونه‌ها و شاهد آزمایش بود. بنابراین، بیشترین میانگین همه فسفر رهاشده در کشت جدایه‌های Agrobacterium sp. 14A-4 و Agrobacterium sp. 22SP-1 به‌ترتیب با میانگین 4/527 و 2/504 میلی‌گرم بر لیتر فسفر در کشتگاه دارای تری‌کلسیم‌فسفات حاصل شد و پس از آنها، جدایه 44A-4S با میانگین 8/460 میلی‌گرم بر لیتر قرار داشت. از همه فسفر رهاشده از کانی، بیشترین فسفر آلیشده در ساختار یاخته‌ای جدایه‌های 44A-4S، 22SP-1 و 14A-4 یافت شد و در مجموع، بیشترین میزان همه فسفر رهاشده از کانی در کشت جدایه‌های 22SP-1، 14A-4 و 44A-4S اندازهگیری شد. در بررسی هم‌بستگی میان همه فسفر رهاشده از کانی و اسیدیته، هرچند هم‌بستگی منفی و چشمگیری در پایه آماری 5 درصد دیده شد (*444/0-r= )، هم‌بستگی چشمگیری با رسانندگی الکتریکی کشتگاه دیده نشد. بنابراین از میان جدایه‌های بررسی‌شده، جدایه‌های 22SP-1، 14A-4 و 44A-4S که به‌ترتیب به جنس‌های اگروباکتریوم، اگروباکتریوم و سیتروباکتر متعلق بودند، توانایی بیشتری در حل فسفات از کانی تری‌کلسیم‌فسفات داشتند.
شکل 3- همه فسفر رهاشده از دو کانی فسفری (تری‌کلسیم‌فسفات، سنگ فسفات) در کشت جدایه‌های باکتری در کشتگاه اسپربر مایع
شکل 4- چگونگی دگرگونی اسیدیته (pH) و رسانندگی الکتریکی (EC) کشتگاه اسپربر دارای تری‌کسیم‌فسفات و سنگ فسفات پس از مایه‌زنی جدایه‌های باکتری
شکل 5- رگرسیون خطی میان فسفر روشناور و فسفر زیتوده با اسیدیته (pH) و رسانندگی الکتریکی (EC) کشتگاه، همچنین میان اسیدیته (pH) و رسانندگی الکتریکی (EC) کشتگاه
درصد جذب زیستی و نسبت فسفر روشناور به فسفر زیتوده:یافته‌های تجزیه واریانس در بررسی درصد جذب زیستی (فسفر زیتوده به میزان فسفر افزوده‌شده به کشتگاه) و نسبت فسفر روشناور به فسفر زیتوده نشان دادند که گونه باکتری و کانی بهکاررفته در کشتگاه و همچنین برهم‌کنش آنها پیامد چشمگیری در پایه آماری 1 درصد بر ویژگی‌های یادشده دارند (جدول 4). بالاترین درصد جذب زیستی در میان جدایه‌های بررسی شده در کشت جدایه 34A-3 با میانگین 45/74 درصد و به دنبال آن جدایه‌های 14SPI و 44A-4Z به ترتیب با میانگین 51/60 و 59/56 درصد در کشتگاه دارای تری کلسیم فسفات به دست آمد که 36/2 برابر کنترل آزمایش بود و با آن ناهمانندی چشمگیری داشت (شکل6). این جدایه‌ها توانسته بودند از همه فسفر افزوده شده به کشتگاه بیشترین اندازه جذب زیستی را در یاخته‌های خود داشته باشند که پس از مرگ باکتری و کانی شدن فسفر آلی آن فراهم‌کننده فسفر برای گیاه خواهند بود. از سوی دیگر در بررسی نسبت فسفر روشناور به فسفر زیتوده نیز بالاترین این نسبت در کشت جدایه 35SP-2 و 47A1-3 به ترتیب با اندازه‌های 13/3 و 91/2 در کشتگاه دارای تری‌کلسیم فسفات به دست آمد (شکل7). روی‌هم‌رفته کشتگاه این باکتریها اسیدی‌تر بوده (شکل 4) و بخش بزرگی از فسفر رها شده از کانی‌ها در بخش محلول مانده است. این فراسنجه می‌تواند همانند شناسه‌ای کارا در شناسایی توانایی و سودمندی باکتری در افزایش زیست فراهمی فسفر برای گیاهان باشد (43). بنابراین جدایه‌های 34A-3، 14SPI و 44A-4Z پس از مرگ باکتری و جدایه‌های 35SP-2 و 47A1-3 در زمان زندگی باکتری می‌توانند دسترسی به فسفر را برای گیاهان آسان کنند. در بررسی این فراسنجه‌ها با توجه به شکل‌ها، جدایه‌هایی دیده شدند که کمترین میانگین را در مقایسه با شاهد آزمایش داشتند اما در یک کلاس آماری قرار گرفتند؛ این موضوع به علت خطای ممکن در نمونه‌برداری از رویه سوسپانسیون میکروبی است و شاید برخی دانه‌های آب‌آویز فسفات معدنی در تیمار شاهد آزمایش موجود باشند که باعث برآورد میزان زیاد فسفر شده‌اند. گذشته از این خطا، باکتریی مانند جدایه 34A-3 که بتواند بخش بزرگی از فسفر محلول را جذب کند و در یاخته خود انباشته کند، گزینه شایسته‌ای برای جذب زیستی فسفر از آبهای آلوده می‌تواند باشد و در زیست بهسازی آبهای آلوده به فسفر می‌تواند کارایی داشته باشد.
در بررسی هم‌بستگی میان اسیدیته و رسانندگی الکتریکی کشتگاه، اگرچه هم‌بستگی چشمگیری میان درصد جذب زیستی با اسیدیته و رسانندگی الکتریکی کشتگاه دیده نشد؛ هم‌بستگی چشمگیری در پایه آماری 1 درصد میان اسیدیته و رسانندگی الکتریکی کشتگاه با نسبت فسفر روشناور به فسفر زیتوده دیده شد. همانند آنچه در بررسی فسفر روشناور دیده شد، با کاهش اسیدیته کشتگاه نسبت فسفر روشناور به فسفر زیتوده در کشتگاه افزایش (**524/0- r=) و با افزایش این نسبت، رسانندگی الکتریکی کشتگاه افزایش یافت (**619/0r=).
یافته‌های همانندی نیز در بررسی چن[19] و همکاران (32) گزارش شده است. ایشان توانایی انحلال 36 جدایه شامل جنس‌های باسیلوس، رودوکوکوس، آرتروباکتر، کریزوباکتریوم و سراشیا را در کشتگاه مایع حاوی تری‌کلسیم‌فسفات بررسی کردند. یافته‌ها پس از 72 ساعت انکوباسیون در 30 درجه سانتی‌گراد، توانایی انحلال فسفات جدایه‌ها را با ساخت اسیدهای آلی و کاهش اسیدیته تأیید کردند. قادری[20] و همکاران (43)، به بررسی توان رهاسازی فسفات چند سویه سودوموناس (P. putida, P. fluorescens Chao, P. fluorescens Tabriz) از رویه کانی هیدروکسیدآهن III پرداختند. اندازه فسفر رهاشده در بخش محلول و زیتوده میکروبی اندازهگیری و دیده شد که سودوموناس پوتیدا، بیشترین میزان فسفر رهاشده در بخش محلول (mgP/ 50ml 74/0) و سویه P. fluorescens Tabriz، بیشترین اندازه فسفر زیتوده (mgP/ 50ml 7/3) را داشتند. آنها گزارش کردند که بیشترین آزادسازی فسفر (6/61 درصد) در سویه سودوموناس فلورسنس در برابر سودوموناس پوتیدا (5/50 درصد) است. یافته‌های آنها نشان دادند که فسفر زیتوده کارایی ویژه‌ای در انحلال فسفر دارد و اگرچه فسفر روشناور در گونه پوتیدا بیشتر بود، بیشتر بودن فسفر زیتوده در گونه فلورسنس نشان داد که این باکتری سهم بیشتری در رهاسازی فسفر داشته است.
جدول4- تجزیه واریانس (میانگین مربعات) نسبت فسفر روشناور به فسفر زیتوده و درصد جذب زیستی آن در کشت جدایه‌های گوناگون باکتریها در کشتگاه‌های دارای تری‌کلسیم‌فسفات و سنگ فسفات
|
میانگین مربعات |
|||
|
منابع تغییر |
درجه آزادی |
نسبت فسفر روشناور به فسفر زیتوده |
درصد جذب زیستی |
|
گونه باکتری |
24 |
**053564/0 |
**447/568 |
|
کانی فسفری |
1 |
**3935/3 |
**063/11347 |
|
گونه باکتری× کانی فسفری |
24 |
**037421/0 |
**024/317 |
|
خطا |
100 |
0015/0 |
965/20 |
|
درصد ضریب دگرگونی |
|
81/11 |
06/20 |
** چشمگیر در پایه آماری 1 درصد
شکل6- درصد جذب زیستی (فسفر زیتوده به فسفر افزوده‌شده به کشتگاه) در کشت جدایه‌های باکتری در کشتگاه دارای تری‌کلسیم‌فسفات و سنگ فسفات
شکل 7- نسبت فسفر روشناور به فسفر زیتوده در کشت جدایه‌های باکتری در کشتگاه اسپربر دارای تری‌کلسیم‌فسفات و سنگ فسفات
بحث و نتیجه‌گیری
بررسی توان حل فسفر برخی از جدایه‌های باکتریایی در کشتگاه‌های دارای دو کانی‌تری‌کلسیم‌فسفات و سنگ فسفات با ارزیابی چگونگی پخش فسفر رهاشده در دو بخش محلول در کشتگاه (روشناور) و بخش آلی اندوخته‌شده در زیتوده میکروبی آزمون شد. یافته‌ها نشان دادند که با کاهش اسیدیته کشتگاه، فسفر محلول افزایش می‌یابد و سبب زیادشدن رسانندگی الکتریکی کشتگاه میشود. همچنین جدایه‌ها توانایی بیشتری در حل فسفات از کانی تری‌کلسیم‌فسفات در برابر سنگ فسفات داشتند. بررسی سنجش فسفر زیتوده در برابر فسفر روشناور نشان داد که بخش زیادی از فسفر رهاشده از کانی‌های بهکاررفته به شکل فسفر زیتوده در می‌آید و از فسفر روشناور نیز فزونی می‌گیرد. بنابراین هنگام گزینش جدایه‌های برتر باکتری‌های حل‌کننده فسفات، شاید اندازهگیری و آزمون فسفر زیتوده بهتر از فسفر حل‌شده در روشناور باشد، هرچند در گزینش باکتریها برای کاربردهایی مانند ساخت کود زیستی بیشتر بر فسفر روشناور یا محلول آنها کار شده است. برخی از جدایه‌ها با اندوختن فسفر بیشتر در زیتوده، نامزدهای شایسته‌ای برای زیست‌بهسازی زیستگاه‌های آلوده به فسفر هستند. بهره‌گیری از آنها همراه با روش‌هایی مانند پالایش یاخته‌ها و یا بی‌جنبش‌سازی یاخته‌ها بر نگهدارنده‌های جامد است تا جداسازی و گرد‌آوری آنها را از زیستگاه‌های آلوده آسان‌تر کند. بر پایه یافته‌های پژوهش حاضر، باکتری‌هایی که کارایی بیشتری در رهاسازی فسفر کانی‌های فسفاتی داشتند و میزان بیشتری از آن را در زیتوده خود انباشته می‌کردند از جنس‌های اگروباکتریوم 14A-4، اگروباکتریوم 22SP-1 و سیتروباکتر 44A-4S بودند و این با نتایج بررسی فسفر محلول در روشناور بسیار ناهمانند است. بنابراین پیشنهاد میشود که در بررسی توان باکتریها در افزایش زیست‌فراهمی فسفر برای گیاه، فسفر زیتوده آنها نیز اندازهگیری و آزمون شود.
[1]- Phosphate Solubilizing Bacteria
[2]- Supernatant
[3]- Bioaccumulation
[4]- Khan
[5]- Rodriguez and Fraga
[6]- Audipudi
[7]- Spagnoletti
[8]- Behera
[9]- Rashid
[10]- Illmer and Schinner
[11]- Asea
[12]- Whitelaw
[13]- Guang- Can
[14]- Rafiei and Asadi Rahmani
[15]- Immobilized
[16]- Beever and Burns
[17]- Immobilization
[18]- Jurinak
[19]- Chen
[20]- Ghaderi
)