نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشجوی دکتری گیاهپزشکی، دانشگاه لرستان، ایران
2 استادیار گیاهپزشکی، دانشگاه لرستان، ایران
3 دانشجوی دکتری گیاهپزشکی، دانشگاه فردوسی، مشهد، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:The bean common blight caused by Xanthomonas axonpodis pv. phaseoli is one of the most important pathogens of bean, which is a serious problem to produce this crop in western regions of the country. Due to the severe damage of this pathogen, using fungal and bacterial bio-control agents can be as an efficient way to reduce the damage of disease on bean. The aim of this study was to evaluate the controller effects of fungal and bacterial biological agents including Trichoderma harzianum, T. virens, Bacillus subtillis and Pseudomonas fluorescence in laboratory and greenhouse conditions on bacteria of bean common blight.
Materials and methods: In order to study the effects of biological agent against Xap, in the first stage, was to investigate the percentage growth inhibition of Xapby biological agents under laboratory conditions. In the next step, the interaction of biological agent and pathogenesis bacteria on bean plant was evaluated in a completely randomized design, four replications and biological agent’s treatments are under the greenhouse conditions. Indices such as root and shoot fresh weight, root and shoot dry weight, height roots and stems of beans and disease severity were measured to analyse the control power of the biological agents.
Results: In laboratory conditions, fungal biological agents of T. harzianum with an average diameter of inhibitor halo of 42 mm and inhibiting 56.67% of the growth had highest controller effect on pathogenesis bacteria. However, in greenhouse conditions, P. fluorescence bacteria had better performance and all plant indices under this treatment showed a significant growth. The combined treatment of P. fleurescence + T. virens was the best treatment in this experiment with reducing 79.4% of disease symptoms. Treatments P. fleurescence+T. harzianum and B. subtillis+P. fleurescence with amount of 69.6 and 55.9% reduced the symptoms, respectively, and are in following levels.
Discussion and conclusion: Therefore, the use of biological agents can largely reduce the bean common blight, so that it can be an efficient and environmentally friendly method used.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
لوبیا گیاهی از تیره بقولات، با بیش از 100 گونه و قدمتی در حدود 8 هزار سال است که در بیشتر بخشهای دنیا کشت میشود و بیشترین سطح زیرکشت در دنیا را در بین حبوبات دارد. ایران از نظر سطح زیرکشت این محصول با 92 هزار هکتار پس از هند در رتبه دوم و از نظر میزان تولید لوبیا در جهان نیز در رتبه دوم قرار دارد (1). این گیاه با داشتن 20 تا 25 درصد پروتئین و 50 تا 65 درصد کربوهیدرات، باارزشترین حبوبات از نظر خوراکی در سرتاسر دنیاست (2). بیشترین میزان تولید لوبیای کشور با سهم 2/30 درصد به استان فارس تعلق دارد و استانهای خوزستان با سهم 7/15 درصد و لرستان با سهم 5/13 درصد تولید لوبیا در کشور بهترتیب در رتبههای دوم و سوم قرار دارند (3). این گیاه در افزایش ازت خاک نقش مؤثری ایفا میکند (4).
هر ساله بیمارگرهای قارچی، باکتریایی، نماتودی و ویروسی به گیاه لوبیا حمله میکنند. در میان بیماریهای باکتریایی لوبیا، بیماری سوختگی معمولی لوبیا اهمیت بسیاری دارد (5) و از استانهای مرکزی، لرستان، اصفهان و زنجان در ایران گزارش شده است (6 و 7). خسارت بیماری یادشده در مناطق مرطوب و مزارع با آبیاری بارانی بسیار زیاد و در شهرستان اراک تا 80 درصد گزارش شده است (8). بذر و بقایای گیاهی آلوده، زندگی اپیفیتی روی گیاهان غیرمیزبان و علفهای هرز ازجمله راههای مهم انتقال بیماری سوختگی معمولی لوبیا هستند. راهکارهای کنترل بیماری شامل استفاده از بذر سالم، تناوب زراعی و روشهای مبارزه شیمیایی تأثیری در کنترل بیماری و افزایش عملکرد گیاه نداشتهاند (8). استفاده از سموم شیمیایی نیز با وجود کاهش مؤثر بیماریها، باعث آلودگیهای زیستمحیطی و ایجاد مقاومت در بیمارگر میشوند و از نظر اقتصادی مقرون بهصرفه نیستند (9). باتوجه به محدودیتهای یادشده، استفاده از کنترل زیستی بیماریهای گیاهی یکی از روشهای جایگزین مناسب در این زمینه است (9).
ریزموجودات زیستی استفادهشده در کنترل زیستی با اثر متقابل بر بیماریزاهای گیاهی مختلف، نقش عمدهای در کنترل بیماریها بازی میکنند. در این بین، عوامل بیوکنترل باکتریایی جایگاه ویژهای در کنترل زیستی عوامل بیماریزا دارند؛ گونههای باسیلوس سابتیلیس[1]و سودوموناسهای فلورسنت[2] موجود در ریزوسفر بهعنوان عوامل بیوکنترل باکتریایی، نامزدهای ایدهآلی برای افزایش رشد گیاه و کاهش بیماریهای گیاهی در شرایط مزرعه و گلخانه هستند (10). همچنین قارچهای تریکودرما در بیشتر خاکها و زیستگاهها وجود دارند و به علت توانایی تولید آنتیبیوتیک، کنترلکننده زیستی بسیاری از بیماریهای گیاهی شناخته میشوند (11). باکتریهای باسیلوس و سودوموناس فلوئروسنس نشانههای بیماری سوختگی معمولی لوبیا را بهطور معناداری کاهش داده (12) و این عوامل بیوکنترلی همراه با قارچ تریکودرما هارزیانوم[3]روی باکتری اروینیا کاراتوورا[4]نیز تأثیر کنترلکنندگی بسیاری داشتهاند (13).
با توجه به آثار کنترلکنندگی عوامل بیوکنترلی باسیلوس سابتیلیس، سودوموناس فلوئروسنس، تریکودرما هارزیانوم و تریکودرما ویرنس[5]روی بیماریزاهای بیمارگر گیاهی، استفاده از روشهای غیرشیمیایی و سالم در کنترل بیماریهای گیاهی ضروری است. پژوهش حاضر با هدف بررسی ویژگی کنترلکنندگی عوامل زیستی موجود در برابر باکتری زانتوموناس آکسانوپودیس پتوار فازئولی (Xap)[6] عامل سوختگی معمولی لوبیا انجام شده است.
مواد و روشها
تهیه باکتریهای بیمارگر و عوامل بیوکنترل: در پژوهش حاضر، باکتری زانتوموناس آکسانوپودیس پتوار فازئولی (Xap) تهیهشده از مجموعه بخش گیاهپزشکی دانشکده کشاورزی شیراز و عوامل زیستی باکتریایی باسیلوس B7، سودوموناس فلوئروسنس CHAO و قارچی تریکودرما هارزیانوم T.BIو تریکودرما ویرنس T65 موجود در مجموعه بخش گیاهپزشکی دانشکده کشاورزی دانشگاه لرستان استفاده شدند.
آزمون اثبات و برآورد شدت بیماریزایی: برای اثبات بیماریزایی باکتری Xap، از لوبیا چیتی رقم صدری استفاده شد. ابتدا بذرها با هیپوکلریتسدیم[7] 5/1 درصد ضدعفونی سطحی و سپس در گلدانهای پلاستیکی حاوی خاک مزرعه، کود دامی و شن (به نسبت 1:1:2) کاشته شدند. پس از 10 روز رشد در شرایط گلخانه و ظهور برگهای حقیقی، سه برگچه دوم بوتهها با باکتری Xap مایهزنی شدند. برای مایهزنی گیاهان، از کشت 24 ساعته باکتری Xap روی محیطکشت مصنوعی مواد غذایی[8] استفاده و سوسپانسیون 108 واحد تشکیلدهنده کلنی در میلیلیتر[9] به روش رقیقکردن متوالی[10] در آب مقطر سترون تهیه شد. سپس برگهای انتخابشده برای مایهزنی با سوزن استریل زخمی و سوسپانسیون باکتری روی آنها اسپری شد. تیمار شاهد با آب مقطر استریل مایهزنی شد. بوتههای مایهزنیشده برای حفظ رطوبت به مدت 72 ساعت زیر پوشش پلاستیکی قرار گرفتند. این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی شامل تیمارهای گیاه آلوده به باکتری Xap و گیاه سالم غیر آلوده (شاهد) و در 4 تکرار انجام شد. برای مقایسه میانگینها از آزمون دانکن[11] در سطح 1 درصد استفاده و شدت بیماری پس از ظهور نشانههای بیماری بر اساس مقیاس توصیهشده (جدول 1) تعیین شد (14).
برای بررسی شدت بیماری حاصل از باکتری Xap روی لوبیا در آزمون بیماریزایی و همچنین بر اثر عوامل زیستی، ابتدا بهطور تصادفی 8 برگ از هر گیاه انتخاب شد. سپس با سیستم نمرهدهی، شدت بیماری گیاه لوبیا در برابر بیمارگر Xap با مقیاس ICTA تعیین و شدت بیماری سوختگی معمولی لوبیا بر اثر باکتری برای گیاهان، تکرارها و تیمارها از رابطه زیر محاسبه شد (15).
جدول 1- سیستم نمرهدهی شدت بیماری گیاه لوبیا در برابر آلودگی به باکتری Xap با مقیاس [12]ICTA
|
نشانهها |
نمره |
|
بدون نشانههای بیماری |
1 |
|
لکههای کوچک تقریباً 2 درصد سطح برگ را پوشاندهاند، بیشتر غلافها بدون نشانههای بیماری هستند. |
3 |
|
لکههای کوچک تقریباً 5 درصد سطح برگ را پوشاندهاند و لکهها شروع به پیوستن کردهاند. |
5 |
|
لکههای متوسط و بزرگ تقریباً 10 درصد سطح برگ را پوشاندهاند و بهطور معمول با هاله زردرنگ و سوختگی همراه هستند. لکههای روی غلاف بزرگ و به هم ملحق شدهاند و ترشحات باکتری روی آن دیده میشود. |
7 |
|
لکههای بزرگ بیش از 25 درصد سطح برگ را پوشاندهاند، برگها سوختهاند و ممکن است ریزش کنند. |
9 |
بررسی تأثیر عوامل زیستی در شرایط آزمایشگاه روی باکتری Xap: برای بررسی اثر ضد باکتریایی عوامل زیستی باکتریایی از روشهای زیر استفاده شد:
الف) در این روش، ابتدا سوسپانسیون 108 واحد تشکیلدهنده کلنی در میلیلیتر Xap با محیطکشت M9 مخلوط و در تشتکهای پتری ریخته شد. پس از جامدشدن محیطکشت، باکتریهای زیستی باسیلوس سابتیلیس و سودوموناس فلوئروسنس بهشکل نقطهای کشت شدند و پس از 24 ساعت، قطر هاله بازدارنده از رشد Xap ایجادشده توسط دو باکتری زیستی اندازهگیری شد. در این آزمون برای تیمار شاهد از دیسکهای حاوی آب مقطر بهجای عوامل بیوکنترل استفاده شد (16).
ب) در این روش، باکتریهای باسیلوس سابتیلیس، سودوموناس فلوئروسنس بهشکل لکهای در تشتکهای حاوی محیطکشت تلقیح شدند. پس از ٤٨ ساعت نگهداری در دمای ٢٥ درجه سلسیوس، کلنیهای رشدکرده دو باکتری یادشده با پنبه استریل آغشته به الکل از سطح تشتک پتری پاک شدند. سپس روی در هر پتری دو قطره کلروفرم اضافه و ٢٠ دقیقه بهشکل وارونه نگهداری شد. سپس در شرایط استریل، در تشتک پتریها باز و ٣٠ دقیقه هوادهی شدند. پس از آن، از سوسپانسیون باکتری بیماریزا (Xap) با غلظت 108 واحد تشکیلدهنده کلنی در میلیلیتر در هر پتری اسپریپاشی و ٧٢ ساعت در دمای ٢٨ درجه سانتیگراد نگهداری شد. در نهایت، قطر هاله بازداری از رشد Xap اندازه گرفته شد. در این آزمایش، برای تیمار شاهد بهجای باکتریهای بیوکنترل از آب مقطر استریل استفاده شد (16).
برای بررسی اثر ضد باکتریایی عوامل قارچی، پرگنهای از کشت 3 تا 4 روزه قارچهای زیستی در وسط محیط NA قرار داده شد. سوسپانسیون باکتری بیماریزا باغلظت 108 واحد تشکیلدهنده کلنی در میلیلیتر روی محیطکشت موادغذایی[13] اسپریپاشی و هاله بازدارندگی آنها پس از 24 تا 48 ساعت ارزیابی شد. درصد بازدارندگی از رشد از رابطه زیر با تغییرات جزئی محاسبه شد (17):
بررسی تأثیر عوامل زیستی باکتریایی در شرایط گلخانه روی باکتری Xap: در این آزمایش، از گیاهچههای لوبیا رقم صدری در مرحله ظهور برگهای حقیقی استفاده شد. برای بررسی تأثیر عوامل بیوکنترل بر شدت بیماریزایی باکتری سوختگی معمولی لوبیا (Xap) در شرایط گلخانه، سوسپانسیونی از باکتریهای زیستی به غلظت 108 واحد تشکیلدهنده کلنی در میلیلیتر و سوسپانسیون قارچ تریکودرما به غلظت 106 اسپور در میلیلیتر تهیه شد. ابتدا عوامل آنتاگونیست تا مرحله جاریشدن آب از سطح برگها (مرحله سه برگچه دوم بوتهها) روی گیاه اسپری شدند. در تیمار شاهد از آب مقطر استریل بهجای سوسپانسیون عوامل بیوکنترل استفاده شد. پس از گذشت ٧٢ ساعت، سوسپانسیون باکتری بیماریزا روی گیاه اسپری و روی آنها به مدت 72 ساعت برای تأمین رطوبت پلاستیک کشیده شد. این آزمایش در قالب طرح کاملاً تصادفی با 16 تیمار (جدول 2) و در 4 تکرار (هر تکرار شامل 4 گیاه لوبیا در یک گلدان) انجام شد. پس از پایان دوره رشدی گیاه و عبور از مرحله حساس، شاخصهای گیاهی ازجمله شدت بیماریزایی بیماریزا روی گیاه، وزنتر و خشک، ارتفاع ریشه و ساقه برای تعیین تأثیر عامل بیماریزا روی گیاه لوبیا اندازهگیری و با نرمافزار SPSS 19 تحلیل آماری شدند.
جدول 2- نقشه طرح آماری کنترل زیستی بیماری Xap با استفاده از باکتریهای بیوکنترل
|
کد تیمار |
ویژگیهای تیمار |
کد تیمار |
ویژگیهای تیمار |
|
-A |
شاهد منفی |
Th |
تریکودرما هارزیانوم |
|
+A |
شاهد مثبت |
Tv |
تریکودرما ویرنس |
|
Abs |
باسیلوس سابتیلیس (شاهد) |
Th+Tv |
تریکودرما هارزیانوم+ تریکودرما ویرنس |
|
APf |
سودوموناس فلوئروسنس (شاهد) |
Th+Pf |
تریکودرما هارزیانوم+ سودوموناس فلوئروسنس |
|
ATh |
تریکودرما هارزیانوم (شاهد) |
Th+Bs |
تریکودرما هارزیانوم+باسیلوس سابتیلیس |
|
ATv |
تریکودرما ویرنس (شاهد) |
Tv+Pf |
تریکودرما ویرنس+ سودوموناس فلوئروسنس |
|
Bs |
باسیلوس سابتیلیس |
Tv+Bs |
تریکودرما ویرنس+باسیلوس سابتیلیس |
|
Pf |
سودوموناس فلوئروسنس |
Bs+Pf |
باسیلوس سابتیلیس+ سودوموناس فلوئروسنس |
نتایج
بیماریزایی باکتری Xapروی گیاه لوبیا: نتایج بیماریزایی باکتری Xap روی گیاه لوبیا، ظاهرشدن نشانههای بیماری سوختگی معمولی لوبیا بر اثر این باکتری را بهشکل لکههای آبسوخته 10 روز بعد از مایهزنی نشان دادند. از نخستین نشانههای بیماری روی گیاه، پیدایش لکههای آبسوخته بود که این لکهها بهتدریج گسترش یافتند، به هم پیوستند و سطح وسیعی از برگ را در بر گرفتند و برگ حالت سوخته پیدا کرد. هالهای زردرنگ اطراف نواحی آبسوخته 21 روز بعد از مایهزنی باکتری عامل بیماری ظاهر شد (شکل 1). نشانههای بیماری روی ساقه بهشکل لکههای تیره و روی غلاف بهشکل لکههای مدور قرمز تا قهوهای تیره مشاهده شدند (شکل 2). بیشترین نشانهها در مرحله گلدهی ظاهر شدند؛ در این مرحله (پس از 21 روز) شدت نشانههای بیماری تا سطح 80 درصد نیز رسید و سپس نشانهها با ظهور برگهای جدیدتر به مرور کاهش یافتند.
شکل 1- نشانههای بیماری سوختگی معمولی لوبیا؛ الف. سوختگی برگهای گیاه لوبیای آلوده به Xap، ب. کلروز شدید روی برگ با هاله زردرنگ، ج. نشانههای بیماری سوختگی معمولی لوبیا روی غلاف بهشکل لکههای مدور قرمز تا قهوهای تیره
تأثیر عوامل زیستی باکتریایی و قارچی بر رشد باکتری Xapروی محیطکشت: تجزیه واریانس، تأثیر عوامل زیستی باکتریایی و قارچی بر رشد باکتری Xap را روی محیطکشت نشان داد. رشد باکتری Xap در حضور عوامل زیستی در سطح 1 درصد کاهش معناداری یافت. عامل بیوکنترلی تریکودرما هارزیانومبا میانگین قطر هاله بازدارنده 42 میلیمتر و به میزان 67/56 درصد، بیشترین آثار بازدارندگی از رشد را در بین عوامل زیستی استفادهشده داشت و تفاوت معناداری در سطح 1 درصد با دیگر عوامل زیستی بجز تریکودرما ویرنس نشان داد. اگرچه تیمارهای زیستی باکتریایی تأثیر بازدارندگی معناداری ایجاد کردند، نسبت به عوامل زیستی قارچی تأثیر کمتری در بازدارندگی از رشد باکتری Xap روی محیطکشت داشتند (شکل 2).
عوامل بیوکنترل قارچی طی 48 ساعت پس از رشد، هاله بازدارنده از رشد باکتری Xap را در اطراف پرگنه خود تشکیل دادند که قطر این هاله بیشتر از عوامل زیستی باکتریایی بود. به مرور قارچ تریکودرما رشد کرد و با افزایش جمعیت و رشد پرگنه خود روی محیطکشت و کلنیهای باکتری Xap، این باکتریها را پوشش داد و از بزرگشدن و رشد کلنی باکتری بیمارگر در ناحیه هاله بازدارنده جلوگیری کرد. طی 3 تا 4 روز، پرگنههای قارچ تریکودرما سرتاسر محیطکشت را فرا گرفتند (شکلهای 3 و 4).
تأثیر عوامل زیستی بر شدت بیماری سوختگی معمولی در لوبیا: تجزیه واریانس نتایج تأثیر عوامل زیستی قارچی و باکتریایی روی گیاه لوبیا آلوده به باکتری Xap نشان داد که شدت بیماری و شاخصهای گیاهی شامل ارتفاع بوته، وزن تر و خشک اندام هوایی در سطح 1 درصد، ارتفاع و وزن خشک ریشه در سطح 5 درصد تفاوت معناداری نسبت به یکدیگر نشان میدهند و اثر تیمارها بر طول ریشه تفاوت معناداری ندارد (جدول 3).
شکل 2- تأثیر عوامل بیوکنترل قارچی و باکتریایی در رشد باکتری Xap روی محیط کشت مواد غذایی
شکل3- تأثیر عوامل بیوکنترل قارچی روی باکتری Xap؛ الف. پتری شاهد ب. هاله بازدارنده قارچ تریکودرما هارزیانوم، پ. پوششدادن کلنی باکتری Xap با پرگنههای قارچ تریکودرما هارزیانوم، ت. هاله بازدارنده قارچ تریکودرما ویرنس، ث و ج. پوششدادن کلنی باکتری Xap با پرگنههای قارچ تریکودرما ویرنس
شکل 4- تأثیر باکتریهای زیستی روی باکتری بیمارگر گیاهی Xap؛ الف. کلنی باکتری سودوموناس فلوئروسنس، ب. کلنی باکتری باسیلوس سابتیلیس، پ. کلنی باکتری Xap، ت. پتری شاهد، ث. هاله بازدارنده باسیلوس سابتیلیس، ج. هاله بازدارنده سودوموناس فلوئروسنس
جدول 3- تجزیه واریانس تأثیر عوامل زیستی مختلف بر گیاه لوبیای آلوده به باکتری Xap
|
منابع تغییرات |
|
طول |
وزن تر |
وزن خشک |
شدت بیماری |
|||
|
درجه آزادی |
ریشه |
ساقه |
ریشه |
ساقه |
ریشه |
ساقه |
||
|
تیمار |
15 |
*47/18 |
**47/100 |
ns07/0 |
**72/7 |
*006/0 |
**23/0 |
**61/2905 |
|
تکرار |
3 |
71/3 |
87/98 |
05/0 |
15/1 |
002/0 |
03/0 |
46/81 |
|
خطا |
45 |
57/7 |
21/12 |
04/0 |
09/1 |
003/0 |
03/0 |
73/49 |
|
ضریب تغییرات |
- |
47/13 |
83/10 |
31/18 |
93/18 |
79/9 |
14/21 |
52/21 |
**سطح معناداری P<01/0، *سطح معناداری 05/ >P>01/0، معنادارنشدن <P05/0
مقایسه میانگین طول ساقه و ریشه گیاه لوبیای آلوده به باکتری Xap بر اثر عوامل زیستی قارچی و باکتریایی نشان داد که طول ریشه و ساقه گیاه لوبیا بر اثر این باکتری بیمارگر بهترتیب 16/29 و 98/33 درصد کاهش یافته است و نسبت به تیمار شاهد سالم تفاوت معناداری در سطح 1 درصد نشان میدهد. کاربرد عوامل زیستی تأثیر بسزایی در افزایش دو شاخص گیاهی یادشده دارند و همه ترکیبهای استفادهشده در پژوهش حاضر باعث افزایش طول ریشه و ساقه گیاه لوبیای آلوده به Xap شدند. در بین عوامل زیستی، کاربرد ترکیبی تریکودرما هارزیانوم به اضافه باسیلوس سابتیلیس با 66/21 سانتیمتر طول ریشه لوبیای آلوده به Xap، بیشترین اثر را بر افزایش این شاخص گیاهی داشت و تفاوت معناداری در سطح 5 درصد با تیمار آلوده نشان داد. این تیمار با شاهد غیر آلوده (سالم) تفاوت معناداری در سطح 1 درصد نشان نداد. ارتفاع ساقه لوبیای آلوده به باکتری Xap در حضور تیمارهای زیستی ترکیبی باسیلوس سابتیلیس به اضافه سودوموناس فلوئروسنس افزایش درخور توجهی نشان داد. ارتفاع ساقه در گیاهان آلوده بر اثر این تیمار بهطور میانگین 5/38 سانتیمتر بود و بیش از 65 درصد ارتفاع ساقه گیاه آلوده به باکتری Xap را افزایش داد و بهترین تیمار در افزایش این شاخص گیاهی بود. این تیمار زیستی در سطح 1 درصد نسبت به تیمار شاهد سالم تفاوت معناداری نشان نداد ولی با تیمار شاهد آلوده تفاوت معناداری ایجاد کرد (شکل 5).
شکل 5- تأثیر عوامل زیستی بر طول ریشه و ساقه بوتههای لوبیای آلوده به باکتری Xap
تأثیر کاربرد عوامل زیستی بر وزن ریشه گیاهان آلوده به باکتری سوختگی معمولی لوبیا نشان داد که بیشتر تیمارهای استفادهشده در پژوهش حاضر باعث افزایش وزن تر ریشه شدهاند ولی این افزایش به اندازهای نبوده است که تفاوت معناداری با تیمار آلوده نشان دهد. در بین تیمارهای زیستی، تیمار ترکیبی سودوموناس فلوئروسنس به اضافه تریکودرما هارزیانوم افزایش رشد بیشتری در شاخص گیاهی یادشده نشان داد و با میانگین وزن 27/1 گرم، تفاوت معناداری در سطح 5 درصد با تیمار شاهد آلوده نشان داد (شکل 6).
مقایسه میانگین دادههای وزن تر اندامهای هوایی در مقایسه با اندام زمینی بر اثر تیمارهای زیستی، تغییرات بیشتری را نشان دادند و تیمارهای سودوموناس فلوئروسنس به اضافه تریکودرما هارزیانوم، سودوموناس فلوئروسنس به اضافه تریکودرما ویرنس و سودوموناس فلوئروسنس به اضافه باسیلوس سابتیلیس بیشترین تأثیر را بر افزایش این شاخص گیاهی داشتند. این تیمارها بهترتیب با میانگین 27/6، 14/6 و 84/5 گرم وزن تر ریشه، بهترین تیمارهای آزمایش حاضر بودند که با تیمار شاهد آلوده تفاوت معناداری در سطح 1 درصد ایجاد کردند (شکل 6).
شکل 6- تأثیر عوامل زیستی بر وزن تر ریشه و ساقه گیاه لوبیای آلوده به باکتری عامل سوختگی معمولی
تأثیر تیمارها بر وزن خشک ریشه گیاه لوبیای آلوده به باکتری بیمارگر Xapهمانند وزن تر ریشه تغییرات زیادی نشان نداد. اگرچه برخی تیمارهای عوامل زیستی باعث افزایش این شاخص گیاهی شدند، تأثیر معناداری نداشتند. تنها نکته شایان توجه در تغییرات این شاخص، افزایش معنادار وزن خشک ریشه تیمارهای غیر آلوده آغشتهشده با عوامل زیستی نسبت به گیاهان آلوده به بیماری سوختگی معمولی بود. وزن خشک ریشه گیاه لوبیا بر اثر باکتری بیماریزای Xap در شاهد سالم و آلوده در سطح 5 درصد تفاوت معناداری نشان نداد، هرچند در سطح 5 درصد بین تیمار شاهد آلوده با تیمارهای سالم تلقیحشده با عوامل زیستی تریکودرما ویرنس، سودوموناس فلوئروسنس و تریکودرما هارزیانوم تفاوت معنادار مشاهده شد.
تأثیر عوامل زیستی بر افزایش وزن خشک اندامهای هوایی لوبیا بیشتر مشهود بود. تیمارهای ترکیبی سودوموناس فلوئروسنس به اضافه تریکودرما هارزیانوم، سودوموناس فلوئروسنس به اضافه تریکودرما ویرنس و سودوموناس فلوئروسنس به اضافه باسیلوس سابتیلیس بهترتیب با میانگین 82/0، 79/0 و 77/0 گرم وزن خشک اندام هوایی، برترین تیمارهای استفادهشده در بهبود این شاخص گیاهی بودند و در سطح 1 درصد با تیمار شاهد آلوده تفاوت معناداری داشتند، هرچند با تیمار شاهد غیر آلوده تفاوت معناداری نشان ندادند (شکلهای 7 و 8 و جدول 4).
شکل 7- تأثیر عوامل زیستی مختلف بر وزن خشک گیاه لوبیای آلوده به باکتری عامل سوختگی معمولی
شکل 8- تأثیر عوامل زیستی بر گیاه لوبیای آلوده به باکتری عامل سوختگی معمولی؛ الف. شاهد غیر آلوده، ب. شاهد آلوده، پ. تیمار باسیلوس سابتیلیس، ت. تیمار سودوموناس فلوئروسنس، ث. تیمار تریکودرما هارزیانوم، ج. تیمار تریکودرما ویرنس
جدول 4- تأثیر عوامل زیستی بر گیاه آلوده به باکتری عامل سوختگی معمولی لوبیا
|
شدت بیماری (درصد) |
وزن خشک (گرم) |
وزن تر (گرم) |
طول (سانتیمتر) |
تیمارهای مختلف زیستی |
|||
|
ساقه |
ریشه |
ساقه |
ریشه |
ساقه |
ریشه |
||
|
83/70e |
40/0f |
14/0b |
45/3e |
32/1b |
06/25d |
91/16d |
شاهد آلوده |
|
00/0a |
03/1abc |
22/0 |
38/7a |
30/2a |
96/37ab |
38/23a |
شاهد سالم |
|
00/0a |
29/1a |
22/0 |
41/7a |
62/1ab |
50/39a |
25/20abcd |
باسیلوس سابتیلیس (شاهد) |
|
00/0a |
97/0abcd |
25/0a |
71/6ab |
31/2a |
81/31bcd |
19/20abcd |
سودوموناسفلوئروسنس (شاهد) |
|
00/0a |
96/0abcd |
25/0a |
58/6ab |
89/1ab |
69/36abc |
25/23ab |
تریکودرما هارزیانوم (شاهد) |
|
00/0a |
07/1ab |
24/0a |
32/7a |
31/2a |
85/40a |
23/24a |
تریکودرما ویرنس (شاهد) |
|
17/54d |
49/0ef |
15/0b |
51/3e |
55/1ab |
12/29d |
25/18cd |
باسیلوس سابتیلیس |
|
61/48d |
55/0ef |
16/0ab |
76/3de |
47/1ab |
18/29d |
60/17cd |
سودوموناسفلوئروسنس |
|
42/60de |
70/0cdef |
18/0ab |
70/4bcde |
78/1ab |
00/32bcd |
69/18bcd |
تریکودرما هارزیانوم |
|
72/59de |
60/0ef |
17/0ab |
25/4cde |
85/1ab |
56/31bcd |
04/21abcd |
تریکودرما ویرنس |
|
39/51d |
73/0bcdef |
15/0ab |
68/5abcde |
88/1ab |
75/25d |
67/21abc |
تریکودرما هارزیانوم+باسیلوس سابتیلیس |
|
86/54d |
66/0def |
13/0b |
74/4bcde |
72/1ab |
06/32bcd |
00/19bcd |
تریکودرما ویرنس+باسیلوس سابتیلیس |
|
53/21bc |
82/0bcde |
20/0ab |
26/6abc |
11/2a |
45/30cd |
17/20abcd |
تریکودرما هارزیانوم+ سودوموناسفلوئروسنس |
|
59/14ab |
80/0bcde |
16/0b |
14/6abc |
74/1ab |
94/27d |
17/21abcd |
تریکودرما ویرنس+سودوموناسفلوئروسنس |
|
25/31c |
77/0bcde |
18/0ab |
84/5abcd |
80/1ab |
50/38ab |
06/17abcd |
باسیلوس سابتیلیس+سودوموناسفلوئروسنس |
|
94/56de |
55/0ef |
14/0b |
62/4bcde |
50/1ab |
44/27d |
09/19bcd |
تریکودرما هارزیانوم+تریکودرما ویرنس |
نتایج تأثیر عوامل زیستی روی شدت بیماری Xap نشان دادند که بهطور کلی عوامل بیوکنترل استفادهشده در پژوهش حاضر از شدت نشانههای سوختگی معمولی لوبیا میکاهند. بهترین تیمار در کاهش شدت بیماری، تیمار ترکیبی سودوموناس فلوئروسنس به اضافه تریکودرما ویرنس است؛ گیاه آلوده بر اثر این عوامل زیستی بهطور میانگین، 59/14 درصد نشانهها را نشان داد و این تیمار باعث کاهش 4/79 درصدی شدت نشانهها شد. تیمارهای ترکیبی سودوموناس فلوئروسنس به اضافه تریکودرما هارزیانوم و سودوموناس فلوئروسنس به اضافه باسیلوس سابتیلیس بهترتیب با میانگین 53/21 و 25/31 درصد شدت بیماری در رتبههای بعدی قرار دارند. این سه تیمار با تیمار شاهد آلوده از نظر شدت بیماری در سطح 1 درصد اختلاف معناداری نشان دادند. تیمار ترکیبی سودوموناس فلوئروسنس به اضافه تریکودرما ویرنس در سطح 1 درصد با تیمار شاهد سالم تفاوت معناداری نشان نداد در حالی که دیگر تیمارهای زیستی استفادهشده در این آزمایش تفاوت معناداری با تیمار شاهد سالم ایجاد کردند (شکل 9).
شکل 9- تأثیر عوامل زیستی بر شدت بیماری سوختگی معمولی لوبیا
بحث و نتیجهگیری
بیماری سوختگی معمولی لوبیا با عامل Xap یکی از بیماریهای مهم لوبیاست که عملکرد این محصول را تا حد زیادی کاهش میدهد. نخستین نشانههای این بیماری بهشکل لکههای ریز و مدور قهوهای تا سیاهرنگ هستند و با پیشرفت بیماری، لکههای آبسوختهای اطراف برگ ظاهر میشوند و بهمرور هالهای زردرنگ اطراف این لکهها را فرا میگیرد. این باکتری در مرحله گلدهی بیشترین خسارت را به گیاه لوبیا میزند و نشانههای بیماری در آزمون بیماریزایی تا 80 درصد نیز گزارش شد؛ این نتایج با پژوهشهای اخوان و همکاران[xiv]مطابقت دارد (18).
اگرچه در محیط آزمایشگاه، همه عوامل زیستی قارچی و باکتریایی استفادهشده در پژوهش حاضر روی باکتری Xap اثر کنترلکننده داشتند، اثر کنترلکننده قارچهای زیستی تریکودرما هارزیانوم و تریکودرما ویرنس بهنسبت باکتریهای زیستی بهتر بود. ظهور هاله بازدارنده از رشد در اطراف کلنی باکتریها و پرگنه عوامل بیوکنترل قارچی نشاندهنده ترشح برخی مواد در محیطکشت با ویژگی بازدارندگی از رشد باکتری Xap توسط این عوامل زیستی است. باکتری باسیلوس سابتیلیس با تولید ترکیبات آنتیبیوتیکی، لیپوپپتیدی و پلیکتیدی مانند لیتئرین[xv]، سورفاکتین[xvi]، فنگایسین[xvii]، باسیلین[xviii]، دیفیسیدین[xix] و ماکرولاکتین[xx] روی عوامل میکروبی اثر بازدارنده دارد (19). همچنین قارچ تریکودرما هارزیانوم با تولید آنتیبیوتیکهای ویریدین[xxi]، ویریدیوفانجین[xxii]، هپتلیدیک اسید[xxiii] و ترکیباتی مانند هارزیاتیکاسید[xxiv] و پتیبولها[xxv] اثر باکتریکشی دارد (16 و 20). ازجمله ویژگیهای پرگنه قارچهای تریکودرما سرعت رشد زیاد آنهاست؛ این عوامل زیستی قارچی در مراحل نخستین رشد، هالهای بازدارنده روی پتری حاوی باکتری Xap ایجاد کردند که مانع رشد باکتری Xap شد و سپس با گذشت زمان و رشد سریع خود، کلنیهای باکتری Xap را فرا گرفتند و روی این باکتری رشد کردند. گانگوار و سینا[xxvi] نیز در پژوهشهای خود با اشاره به سرعت رشد زیاد قارچ تریکودرما بیان کردند که قطر پرگنه این قارچهای زیستی طی 72 ساعت روی محیطکشت مواد غذایی به بیش از 6 سانتیمتر میرسد (21). بنابراین، علاوه بر تولید ترکیبات آنتیبیوتیکی[xxvii]، لیپوپپتیدی[xxviii] و پلیکتیدی[xxix]، رشد سریع قارچهای تریکودرما یکی از مکانیسمهای کنترلی آنهاست که با اشغال فضا و محدودکردن منابع غذایی، نقش مهمی در سرکوب عوامل میکروبی دارد.
در پژوهشی مشابه، فعالیت بیوکنترلی سویههای سودوموناس فلوئروسنس روی باکتری Xap بررسی شد و برخی سویهها با 50/62 درصد بازدارندگی از رشد و 17/5 میلیمتر هاله بازدارنده، اثر کنترلکنندگی بسیار زیادی روی این باکتری بیمارگر گیاهی نشان دادند (22) که تا حد زیادی با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد. همچنین گونههای سودوموناس فلوئروسنس بهطور عمده با تولید ترکیبات فنولی و فعالیت پراکسیدازی تا 39 درصد باعث کنترل مؤثر بیماری Xap میشوند (23). در پژوهش دیگری مشخص شد که عوامل بیوکنترلی سودوموناس فلوئروسنس، باسیلوس سابتیلیس، تریکودرما هارزیانوم و تریکودرما ویرنس روی محیطکشت آگار در آزمایشگاه، ناحیه بازدارندهای علیه باکتری زانتوموناس سیتری پتوار سیتری[xxx] تشکیل میدهند؛ دو باکتری سودوموناس فلوئروسنس و باسیلوس سابتیلیس بهترتیب هاله بازدارندهای به قطر 7/14 و 9/13 میلیمتر تشکیل دادند ولی قارچهای زیستی از طریق ازدحام جمعیت و اشغال محیطکشت مانع رشد باکتری بیماریزا شدند (24) که با نتایج پژوهش حاضر مطابقت دارد.
نتایج تأثیر عوامل زیستی روی گیاهان لوبیای آلوده به بیماری سوختگی معمولی نشان دادند که این عوامل بیشترین تأثیر را روی افزایش شاخصهای اندامهای هوایی گیاه دارند و با محافظت اندامهای هوایی باعث بهبود رشد شاخصهایی مانند وزن تر و خشک و ارتفاع ریشه میشوند؛ علت اصلی این، به شیوه کاربرد عوامل زیستی بهشکل برگکاربرد علیه باکتری Xap مربوط است. اگرچه عوامل زیستی قارچی ویژگی کنترلکنندگی بیشتری در شرایط مصنوعی روی محیطکشت نشان دادند، باکتری سودوموناس فلوئروسنس بیشترین تأثیر بازدارنده را در شرایط طبیعی و روی گیاه زنده دارد. بهترین حالت در کنترل بیماری Xap با عوامل زیستی موجود زمانی بود که این عوامل با هم ترکیب شدند، بهویژه در ترکیبی که یکی از عوامل زیستی باکتری سودوموناس فلوئروسنس بود. هنگامی که عوامل بیوکنترل باکتریایی و قارچی بهتنهایی استفاده شدند، اثر کمی روی کاهش شدت بیماری و افزایش شاخصهای گیاهی داشتند ولی هنگامی که با سودوموناس فلوئروسنس ترکیب شوند، تأثیر مثبت آنها بر کنترل این بیماری بیشتر میشود. عوامل زیستی سودوموناس فلوئروسنس و تریکودرما هارزیانوم با تحریک تولید ترکیبات فنولی در گیاه باعث ایجاد مقاومت گیاه در برابر بیماریزاها میشوند، همانطور که در پژوهشی که روی میزان تولید مواد فنولی در گیاه برنج آلوده به سوختگی زانتوموناسی بر اثر عوامل زیستی مشخص شد، ترکیبات فنولی گیاه آلوده در حضور این دو عامل زیستی بیش از 40 درصد افزایش یافتند و تأثیر سودوموناس فلوئروسنس روی افزایش غلظت ترکیبات فنولی بیشتر از تریکودرما هارزیانوم بود (25).
سودوموناسها، گونههایی از باکتریهای محرک رشد گیاه هستند که با تولید سیدروفور، اندولاستیکاسید، -ACC دآمیناز و بهویژه انحلال فسفاتهای نامحلول باعث تقویت رشد گیاه و بازدارندگی از رشد عوامل بیماریزا میشوند (26). همچنین، مشخص شده است که سویههای سودوموناس و باکتریهای محرک رشد در گیاهان به جذب عناصر کممصرف، مقاومت در برابر تنشها و افزایش سرعت رشد گیاهان کمک میکنند (27). باکتریهای سودوموناس بر میزان کلروفیل نیز تأثیر معناداری دارند و این افزایش کلروفیل به افزایش فعالیت آنزیمهایی مانند کاتالاز و پراکسیداز نسبت داده شده است (28). در پژوهش دیگری اثبات شد که گونههای زیستی باکتریهای جنس سودوموناس با افزایش میزان کلروفیل در گیاه باعث افزایش فتوسنتز و در نهایت میزان تثبیت و کربوهیدرات در گیاه برنج میشوند که به تجمع مواد خشک تولیدی در گیاه منجر میشود (29)
در پژوهش حاضر مشخص شد هنگامی که عوامل زیستی با باکتری باسیلوس سابتیلیس ترکیب شوند، ویژگی کنترلکنندگی آنها بهنسبت کاربرد با سودوموناس فلوئروسنس و حتی کاربرد جداگانه عوامل زیستی کاهش مییابد؛ باکتری باسیلوس سابتیلیس در ترکیب با قارچهای تریکودرما باعث کاهش رشد و جلوگیری از رشد این عوامل زیستی قارچی و در نهایت کاهش تأثیر مثبت آنها روی گیاه میشود. این عوامل زیستی در نبود باکتری Xap نیز تأثیر مثبتی روی ویژگیهای رشدی گیاه دارند و تا حدی باعث افزایش شاخصهای گیاهی میشوند. بنابراین، یکی از مکانیسمهای کنترلی این عوامل زیستی تقویت گیاه است که به ایجاد مقاومت گیاه در برابر شرایط نامساعد محیطی و غیر محیطی منجر میشود.
در پژوهشهای مختلف مشخص شده که اثر بیوکنترلی قارچ تریکودرما به علت سازوکارهایی نظیر رقابت، تحریک رشد گیاه، آنتیبیوز، فعالکردن واکنشهای دفاعی گیاه، تنظیم و القای عوامل رشدی گیاه مانند اکسین[xxxi]، سیتوکینین[xxxii] و اتیلن[xxxiii] است (16). همچنین، اثر بیوکنترلی باکتری باسیلوس شاید به علت استفاده از سازوکارهایی نظیـر تولیدآنتیبیوتیک، افزایش رشد گیاه و مقاومت القایی است (16). باکتری باسیلوس سابتیلیس با تولید موادی ازجمله جیبرلین[xxxiv] و اندولاستیکاسید، رشد گیاه را افزایش میدهد (30). تولید 6-پنتیل-آلفا-پیرون[xxxv] یکی از مهمترین متابولیتهای تریکودرما هارزیانوم و محرک رشد گیاهی در غلظتهای کم شناخته شده است (31). در پژوهش دیگری ثابت شده است که گونه تریکودرما ویرنس باعث افزایش سرعت فتوسنتز در گیاه ذرت میشود و از این راه باعث افزایش شاخصهای رشدی در این گیاه میشود (32). همچنین جدایههای تریکودرما باعث القای افزایش کارایی استفاده از نیتروژن در گیاهان میشوند (33 و 34).
در پژوهشی مشابه، شدت بیماری شانکر مرکبات که بر اثر باکتری زانتوموناس ایجاد میشود بر اثر عوامل زیستی باسیلوس سابتیلیس، سودوموناس فلوئروسنس، تریکودرما ویرنس و تریکودرما هارزیانوم بهترتیب 9/61، 1/50، 4/48 و 9/41 درصد کاهش یافت (24). همچنین تریکودرما هارزیانوم و تریکودرما ویرنس نشانههای بیماری زانتوموناسی گیاه برنج را با 76/37 و 03/39 درصد شدت نشانهها بهترتیب 96/58 و 89/56 درصد کاهش میدهند (35). گیاه برنج آلوده به باکتری زانتوموناس هنگامی که با باکتری زیستی سودوموناس فلوئروسنس تیمار شود، بیش از 58 درصد کاهش نشانهها را نسبت به تیمار آلوده نشان میدهد (36). باکتری سودوموناس فلوئروسنس بهطور میانگین 8/63 درصد و گونههای مختلف باسیلوس بهطور متوسط بین 49 تا 63 درصد نشانههای ایجادشده زانتوموناسی روی سطح برگ فلفل را کاهش میدهند (37). همچنین لکههای باکتریایی که باکتری زانتوموناس روی خیار ایجاد میکند بهطور معناداری با عوامل زیستی سودوموناس ازجمله سودوموناس فلوئروسنس و سویههای باسیلوس سابتیلیسکاهش مییابند (38).
[1]- Bacillus subtillis
[2]- Pseudomonas fluorescence
[3]- Trichoderma harzianum
[4]- Erwinia carotovora subsp. carotovora
[5]- Trichoderma virens
[6]- Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli(Xap)
[7]- Sodium hypochlorite (NaClO)
[8]- Nutrient agar
[9]- Colony forming units per milliliter (cfu/ml)
[10]- Serial dilution
[11]- Duncan Test
[12]- International Center for Tropical Agriculture (ICTA)
[13]- Nutrient Agar
[xiv]- Akhavan et al
[xv]- Leiterin
[xvi]- Surfactin
[xvii]- Fengycin
[xviii]- Bacillin
[xix]- Difficidin
[xx]- Macrolactin
[xxi]- Viridin
[xxii]- Viridiofungin
[xxiii]- Heptanoic acid
[xxiv]- harzianic acid
[xxv]- petibols
[xxvi]- Gangwar and Sinha
[xxvii]- Antibiotics
[xxviii]- Lipopeptide
[xxix]- Polyketide
[xxx]- Xanthomonas compestris pv. citri
[xxxi]- Oxine
[xxxii]- Cytokinin
[xxxiii]- Ethylene
[xxxiv]- Gibberellins
[xxxv]- 6-pentyl-α-pyrone
)