نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 استادیار میکروبیولوژی، گروه زیست شناسی، واحد گچساران، دانشگاه آزاد اسلامی، گچساران، ایران
2 استادیار میکروبیولوژی، گروه میکروبیولوژی، واحد یاسوج، دانشگاه آزاد اسلامی، یاسوج، ایران
3 دانشجوی کارشناس ارشد میکروبیولوژی، گروه میکروبیولوژی، واحد یاسوج، دانشگاه آزاد اسلامی، یاسوج، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Diseases caused by opportunistic pathogen Candida albicans are usually treated with antifungal drugs, but treatment failure is not uncommon especially in profoundly immunocompromised hosts. The aim of this study was to compare erg gene expression profiles of Candida albicans treated with Thymus vulgaris extracts alone and in combination with Mentha spicata.
Materials and methods: In this cross- sectional study, using volume based analyses we have conducted a gene expression profiling of ERG11 gene in C. albicans treated with Thymus vulgaris extracts alone and in combination with Mentha spicata.
Results: Analysis of gene expression profiles revealed the decrease of ERG11 in C. albicans treated with Thymus vulgaris extracts in combination with Mentha spicata. Incubation with Thymus vulgaris and Mentha spicata extracts alone, however, resulted in a decrease in ERG11 RNA levels less than combination.
Discussion and conclusion: These data suggest a common mechanism to find the probable targets e.g., in response to ergosterol depletion in C. albicans treated with Thymus vulgaris extracts alone and in combination with Mentha spicata.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
مخمر کاندیدا آلبیکانس[1] عفونت دورهای کاندیدیازیس[2] را ایجاد میکند. تعداد محدودی داروی ضد قارچ برای درمان بیماریهای ناشی از گونههای کاندیدا وجود دارند و استفاده بیش از حد این داروها به پیدایش سوشهای مقاوم منجر شده است (1-3). همچنین، بیشتر داروهای ضد قارچی آثار جانبی بسیاری را نشان میدهند (4).
کاندیدا آلبیکانس[3] عوامل بیماریزای بسیاری دارد؛ ازجمله چسبندگی به سلولهای اندوتلیال و اپیتلیال انسان، توانایی ترشح آنزیمهای هیدرولیزکننده که بیشتر پروتئینازها و فسفولیپازها هستند، تغییر فنوتیپی و همچنین فرار از فاگوسیتوزشدن توسط سلولهای ایمنی میزبان. علاوه بر این، از عوامل مهم بیماریزایی کاندیدا آلبیکانس چندشکلیبودن با توانایی تغییر برگشتپذیر شکلهای مخمری، ریسه حقیقی، ریسه کاذب و تشکیل بیوفیلم هستند. شکل ریسهای و بیوفیلم کاندیدا آلبیکانس قادر به نفوذ به درون بافت میزبان، فرار از سیستم ایمنی و ایجاد عفونت است(5-7).
ارگوسترول، از اجزای حیاتی غشای سلولی قارچهاست. ژنهای بسیاری در تولید آنزیمهای لازم برای سنتز ارگوسترول دخالت میکنند؛ ازجمله ژنهای دخیل در سنتز ارگوسترول کاندیدا آلبیکانس، ERG1-11وERG25-27 هستند و ژنهای دیگری مانند CYB5 و NCP1 آنزیمهای سیتوکروم را سنتز میکنند (8).
ثابت شده است که مواد مشتقشده از گیاهان دارویی حتی پس از استفاده طولانیمدت، عوارض جانبی ندارند. خانواده نعناعیان[4] یکی از معروفترین گیاهان طبیعی هستند که برای چای گیاهی، تونیک، ضد نفخ، ضد سرفه، ضدعفونیکننده، ضد التهاب و درمان سرماخوردگی استفاده میشود. تیموس ولگاریس[5] حاوی ترکیبات تیمول و دارای ویژگیهای ضد میکروبی است. منتا اسپیکاتا[6] دارای ترکیبات پلیفنلی است و از این رو، ویژگیهی آنتی اکسیدانی بسیاری دارد (9-13).
مقاومت به داروهای ضد قارچ به جهشهای نقطهای و سطوح بالای بیان ژن ERG11 ربط داده شدهاند (14). مطالعهها نشان دادهاند که فلوکونازول بر بیان ژنهای ERG11، ERG1،ERG7، ERG25و ERG9 در کاندیدا آلبیکانس تأثیر درخور توجهی دارد (15).
در مطالعه حاضر، میزان بیان ژن ERG11 در کاندیدا آلبیکانس تیمارشده با رقتهای مختلف عصارههای آبی و متانولی تیموس ولگاریس و منتا اسپیکاتا بهتنهایی و در ترکیب با همسنجیده شد.
مواد و روشها
تهیه گیاهان: گیاهان تیموس ولگاریس (آویشن باغی) و منتا اسپیکاتا (نعناع) در فصل بهار از فروشگاهای یاسوج تهیه شدند و شرکت دارویی زرد بند یاسوج آنها را تأیید علمی کرد.
عصارهگیری: اندام هوایی گیاهان یادشده با آب مقطر استریل شسته و قطعهقطعه شدند. سپس در هوای آزاد و سایه خشک شدند تا بهراحتی در آسیاب برقی خرد شوند. مقدار 1 گرم از پودر الکشده (الک شماره 80) اندامهای مختلف گیاهان مطالعهشده به 5 میلیلیتر آب مقطر و یا متانول 96 درصد اضافه و به مدت 72 ساعت در دمای 30 درجه سلیسیوس گرمخانه گذاری شد. پس از سوکسیلهکردن عصارهها، از کاغذ صافی واتمن شماره 42 عبور داده شدند. برای استریلکردن عصارهها از میلیپور فیلتر(0.22 μm durapore, Millipore) استفاده شد (16) .
ریزموجودات:ریزموجودات استفادهشده در پژوهش شامل9 جدایه بالینی بودند که از افراد دچار ضعف سیستم ایمنی بدن (افراد مبتلا به سرطان خون، تومور مغزی، ایدز و دیابت) جمعآوری شده بودند. نمونهها با سواب از ترشحات مخاطی دهان و واژن 40 بیمار جمعآوری و بیدرنگ روی محیطکشت سابوراد دکستروز آگار[7] حاوی کلرامفنیکل
(Difco Laboratories, Detroit, Michigan) کشت داده شدند. جدایهها با توجه به شکل ظاهری کلنی (ماهوارهای کرمرنگ) روی محیطکشت SDA، مشاهدههای میکروسکوپی مخمر، تولید لوله زایا، هیدرولیز اوره و کشت روی محیطکشت کــروم آگــار کاندیــدا (CHROMagar Company, France)، شناسایی و در سابوراد دکستروز مایع[8] (Difco Laboratories) حاوی کلرامفنیکل ذخیره شدند. همچنین، از سویه استاندارد کاندیدا آلبیکانس ATCC 10231 بهعنوان منبعی برای کنترل کیفیت استفاده شد (17).
آزمون حساسیتسنجی ضد کاندیدیایی به روش دیسک دیفیوژن: برای اطمینان از فاز لگاریتمی رشد، از جدایههای کاندیدا آلبیکانس و سویه استاندارد دو بار کشت مجدد تهیه و سوسپانسیونی به کدورت معادل نیم مک فارلند 106 ×(1-5 CFU/ml) در سرم فیزیولوژی تهیه شد. بهطور خلاصه، تعداد 5 کلنی به قطر تقریبی 1 میلیمتر به 5 میلیلیتر سرم فیزیولوژی استریل اضافه، ورتکس و یک بار شسته شدند. تراکم سلولها با استفاده از اسپکتروفتومتر (UNICO 2150-UV, USA) در طول موج 530 نانومتر حدود CFU/ml 106 × 1-5 برای دستیابی به کدورت معادل 5/0 مک فارلند تنظیم و با روش ویبل کانت[9] تأیید شد. پس از تهیه سوسپانسیون مخمری، 100 میکرولیتر سوسپانسیون بهشکل کشت چمنی، 3 بار بهطور کامل با زاویه 60 درجه و یکنواخت در سطح پلیت 9 سانتیمتری حاوی محیطکشت SDA تلقیح شد. سپس پلیتها 15 دقیقه زیر هود میکروبیولوژی قرار داده شدند تا مایع اضافی آنها جذب شود و به درون آگار نفوذ کند. سپس دیسکهای خالی با حجمهای مختلف (20، 50 و 100 میکرولیتر) عصارههای استریل گیاهان تیموس ولگاریس و منتا اسپیکاتا و نسبت مساوی از هر دو گیاه آغشته و پس از خشکشدن در فاصله 5/2 تا 3 سانتیمتر قرار داده شدند. پلیتها به مدت 24 ساعت در 37 درجه سلیسیوس گرمخانهگذاری شدند و سپس، قطر هاله عدم رشد در اطراف دیسک با خطکش میلیمتری بررسی شد. در این آزمایش، از دیسکهای حاوی 10 میکروگرم بر میلیلیتر آمفوتریسین بی (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO USA) برای شاهد مثبت و دیسکهای خالی استریل برای شاهد منفی استفاده شد. آزمایشها در دو تکرار سهتایی انجام شدند (18).
آزمون حساسیتسنجی ضد کاندیدیایی به روش میکرودایلوشن براث[10]: برای تهیه سوسپانسیون میکروبی، ابتدا مطابق دستورعمل CLSI، سوسپانسیون تهیهشده معادل 5/0 مک فارلند به میزان 1:100 با سرم فیزیولوژی رقیق و در مرحله بعد به میزان 1:20 در محیطکشت استریل RPMI-1640 حاوی ال-گلوتامین (Sigma) رقیق شد. در پایان، سوسپانسیون حاصل 103×5/2-5/0 سلول مخمر در میلیلیتر داشت که با روش ویبل کانت تأیید شد (19).
تهیه رقت از عصارهها: دامنه رقت عصارههای آبی و الکلی اندامهای برگ، ساقه و گیاهان مطالعهشده 102/0 تا 102 میلیگرم در میلیلیتر بود. عصارههای گیاهان در ظروف تیرهرنگ شیشهای، در یخچال و دمای منفی 4 درجه سلسیوس ذخیره شدند. اسیدیته عصارهها 7 در نظر گرفته شد.
تعیین کمترین رقت ممانعتکنندگی از رشد[11]: کمترین رقت ممانعتکنندگی عصارهها در میکروپلیتهای 96 چاهکی
(Brand 781660, Wertheim, Germany) تعیین شد. 100 میکرولیتر از هر رقت عصاره در محیطکشت RPMI-1640 حاوی ال-گلوتامین بهتنهایی و یا ترکیب 50:50 به 100 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی درون چاهک میکروپلیت اضافه و بهخوبی مخلوط شد. در میکروپلیتهای حاوی سوسپاسیون میکروبی و عصارهها بسته و با پارافیلم پوشانده شد. پس از 2 ساعت انکوباسیون در یخچال (برای یکسانسازی وضعیت چاهکها)، به مدت 24 ساعت در دمای 35 درجه سلیسیوس گرمخانهگذاری شدند. چاهکهای حاوی 100 میکرولیتر محیطکشت و 100 میکرولیتر سوسپانسیون میکروبی، شاهد مثبت در نظر گرفته شدند. در این روش، شاهد مثبت برای بررسی نتایج بسیار مهم و معیار سنجش MIC است و باید کاندیدا در چاهک شاهد مثبت بهخوبی رشد کرده باشد. علاوه بر این، چاهک حاوی 100 میکرولیتر عصاره در محیطکشت به 100 میکرولیتر محیطکشت، شاهد منفی در نظر گرفته شد. پس از گرمخانهگذاری، ابتدا محتویات هر چاهک بهخوبی مخلوط و میزان جذب نوری نمونهها با الیزا ریدر در طول موج 530 نانومتر اندازهگیری شد. نقطه پایانی برای تأثیر عصارهها بر مخمر، کمترین رقت هر ترکیب ضد قارچی تعریف شد که از 50 و 90 درصد رشد در مقایسه با شاهد ممانعت میکند. آزمایشها در دو تکرار سهتایی انجام شدند (3 و 14).
سنجش بیان ژن ERG11 کاندیدا آلبیکانس:برای سنجش میزان بیان ژن ERG11 در کاندیدا آلبیکانس، رقتهای مختلف بر اساس نتیجه MIC از رقتهای معادل دو برابرMIC ، MIC و نصف MICبا
106 × 1 سلول در میلیلیتر کاندیدا آلبیکانس مخلوط و 24 ساعت در دمای 35 درجه سلسیوس گرمخانهگذاری شدند. سوسپانسیون تهیهشده به مدت 10 دقیقه در دور rpm3000 سانتریفیوژ و پلت سه بار با سرم فیزیولوژی شسته شد. استخراج RNA کل با کیت RNeasy Mini ویژه سلولهای مخمری (Qiagen, Hilden, Germany) مطابق دستورعمل شرکت سازنده و با اندکی تغییر انجام شد. پس از استخراج RNA، کیفیت و کمیت آن با اسپکتروفتومتری و ژل آگارز بررسی و سپس کیفیت RNA استخراجی پس از سنتز cDNA با استفاده از پرایمرهای اختصاصی طراحیشده برای ژن اکتین:
(F: 5'ACCGAAGCTCCAATGAATCCAAAATCC3'،
R: 5'GTTTGGTCAATACCAGCAGCTTCCAAA3')
سنجیده شد (6). برای حذف احتمال هر نوع آلودگی DNA، از تیمار با آنزیم RNase free DNase set (Qiagen) استفاده شد. 5/0 میکروگرم از RNA کل با استفاده از آنزیم ترانس کریپتاز معکوس و پرایمرهای هگزامر تصادفی موجود در کیت سنتز cDNA (Fermentas, USA) به cDNA سنتز شد. آزمایش ها در دو تکرار سهتایی انجام شدند (2 و 6).
ژن ERG11 کاندیدا آلبیکانس با استفاده از پرایمر (F: 5'TTGGTGGTGGTAGACATA3'،R: 5'TCTGCTGGTTCAGTAGGT3') که خداوندی[12] و همکاران (6) طراحی کردهاند از cDNA سنتزشده تکثیر شد. علاوه بر این، از ژن اکتین بهعنوان ژن مرجع استفاده شد. برای اطمینان از اینکه محصولات واکنش زنجیرهای پلیمراز ناشی از DNA ژنومی نباشند، برای هر نمونه شاهد منفی داخلی بدون آنزیم ترانس کریپتاز معکوس تهیه شد. واکنش زنجیرهای پلیمراز شامل 5 میکرولیتر بافر Taq X10 (Fermentas)، 1 میکرولیتر dNTP 10 میلیمولار (Fermentas)، 5/0میکرولیتر از هر یک از پرایمرهای بالادست و پاییندست (Bioneer, Korea)، 5/0 میکرولیتر آنزیم Taq DNA پلیمراز (Fermentas)، 1 میکرولیتر cDNA و مقدار مناسبی آب دیونیزه (سیناژن، ایران) تا حجم 25 میکرولیتر آماده شد. شرایط تکثیر مطابق دستور زیر انجام شد: چرخه 1 (X1): مرحله 1. 94 درجه سلیسیوس به مدت 5 دقیقه؛ چرخه 2 (X26): مرحله 1. 94 درجه سلیسیوس به مدت 30 ثانیه، مرحله 2. 56 درجه سلیسیوس به مدت 45 ثانیه و مرحله 3. 72 درجه سلیسیوس به مدت 45 ثانیه؛ چرخه 3 (X1): مرحله 1. 72 درجه سلیسیوس به مدت 7 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر (Techno, Germany) انجام شد. آزمایشها در دو تکرار سهتایی انجام شدند (2 و 6).
مطابق روش خداوندی و همکاران (17)، سنجش نسبی میزان بیان ژن مطالعهشده بر اساس حجم باندهای ایجادشده در الکتروفورز محصول واکنش زنجیرهای پلیمراز انجام شد. با استفاده از تصویرساز ژل داک (Bio-Rad, USA)، تصویر ژل آگارز کالیبره ثبت و میزان بیان ژن با نرمافزار Quantity One 1-D Analysis (Bio-Rad, USA, version 4.6) ارزیابی شد.
طرح مطالعه و تحلیل آماری:مطالعه حاضر بهشکل طرح کاملاً تصادفی و آزمایشها در دو تکرار سهتایی انجام شدند. نتایج مطالعه پس از نرمالکردن دادهها با آزمون آنالیز واریانس یکطرفه، با نرمافزار آماری SPSS نسخه 20(SPSS Inc., Chicago, IL) تجزیه و تحلیل شدند. ارزش p<0.05 سطح معناداری در نظر گرفته شد.
نتایج
نتایج آزمون حساسیتسنجی ضد کاندیدیایی انتشـار دیسک نشان دادند که در مقایسه با داروی ضد قارچی آمفوتریسین بی، عصارههای گیاهان تیموس ولگاریس و منتا اسپیکاتا روی جدایههای بالینی و سویه استاندارد ATCC کاندیدا آلبیکانس مؤثر بودهاند. عصارههای مطالعهشده هاله ممانعت از رشدی ایجاد کردند که نشان داد حجم 100 میکرولیتر دارای پتانسیل ضد قارچی بیشتری بوده است. در همه تیمارهای مطالعهشده، عصارههای آبی و متانولی تفاوت درخور توجهی نشان ندادند. نتایج، تأثیر بیشتر عصاره تیموس ولگاریس در ترکیب با منتا اسپیکاتا علیه کاندیدا آلبیکانس را در مقایسه با عصارههای دیگر نشان دادند. همچنین، گیاه تیموس ولگاریس بهتنهایی تأثیر ضد کاندیدیایی بیشتری در مقایسه با منتا اسپیکاتا داشت (جدول 1). نتایج آزمون حساسیتسنجی ضد کاندیدیایی میکرودایلوشن براث، نتایج آزمون انتشـار دیسک را تأیید کردند؛ کمترین میزان رقت ممانعت از رشد (MIC) به عصاره تیموس ولگاریس در ترکیب با منتا اسپیکاتا تعلق داشت (جدول 2).
جدول 1- نتایج آزمون حساسیتسنجی ضد کاندیدیایی به روش دیسک دیفیوژن (میلیمتر) عصارههای آبی و متانولی اندام هوایی گیاهان تیموس ولگاریس و منتا اسپیکاتا بهتنهایی و در ترکیب با هم علیه کاندیدا آلبیکانس
|
جدایه 9 |
جدایه 8 |
جدایه 7 |
جدایه 6 |
جدایه 5 |
جدایه 4 |
جدایه 3 |
جدایه 2 |
جدایه 1 |
کاندیدا آلبیکانس ATCC 10231 |
حجم عصاره (میکرولیتر) |
عصارههای آزمایششده/جدایهها |
|
|
95/0±03/7 |
50/0±50/7 |
00/0±90/6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
30/0±10 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
100 |
عصاره آبی |
تیموس ولگاریس |
|
46/0±26/6 |
45/0±62/6 |
34/0±70/6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
20/0±30/9 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
50 |
|
|
|
51/0±30/6 |
34/0±10/7 |
00/0±90/6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
70/0±50/8 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
20 |
|
|
|
20/0±9 |
20/0±9 |
36/0±70/6 |
17/0±90/7 |
00/0±7 |
00/0±7 |
00/0±6 |
17/0±8 |
25/0±50/7 |
00/0±90/6 |
100 |
عصاره متانولی |
|
|
52/0±20/8 |
52/0±20/8 |
26/0±30/6 |
50/0±50/7 |
50/0±50/6 |
00/0±7 |
00/0±6 |
55/0±20/7 |
00/0±7 |
00/0±90/6 |
50 |
|
|
|
34/0±50/6 |
34/0±50/6 |
00/0±6 |
00/0±50/7 |
50/0±50/6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
50/0±7 |
00/0±7 |
00/0±90/6 |
20 |
|
|
|
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
20/0±20/7 |
00/0±6 |
50/0±50/7 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
100 |
عصاره آبی |
منتا اسپیکاتا |
|
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±7 |
00/0±6 |
25/0±40/7 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
50 |
|
|
|
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±7 |
00/0±6 |
00/0±7 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
20 |
|
|
ادامه جدول 1- نتایج آزمون حساسیتسنجی ضد کاندیدیایی به روش دیسک دیفیوژن (میلیمتر) عصارههای آبی و متانولی اندام هوایی ...
|
جدایه 9 |
جدایه 8 |
جدایه 7 |
جدایه 6 |
جدایه 5 |
جدایه 4 |
جدایه 3 |
جدایه 2 |
جدایه 1 |
کاندیدا آلبیکانس ATCC 10231 |
حجم عصاره (میکرولیتر) |
عصارههای آزمایششده/جدایهها |
|
|
00/0±6 |
00/0±6 |
17/0±10/8 |
00/0±6 |
36/0±50/7 |
00/0±7 |
36/0±70/6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
100 |
عصاره متانولی |
|
|
00/0±6 |
00/0±6 |
34/0±30/7 |
00/0±6 |
00/0±7 |
00/0±7 |
34/0±70/6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
50 |
|
|
|
00/0±6 |
00/0±6 |
52/0±60/6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
26/0±20/6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
20 |
|
|
|
00/0±6 |
00/0±50/7 |
00/0±50/6 |
00/0±6 |
40/0±50/7 |
43/0±10 |
30/0±80/7 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
100 |
عصاره آبی |
تیموس ولگاریس +منتا اسپیکاتا+ منتا اسپیکاتا |
|
00/0±6 |
26/0±80/6 |
00/0±50/6 |
00/0±6 |
36/0±30/7 |
04/1±20/9 |
00/0±50/7 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
50 |
|
|
|
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±7 |
45/0±50/8 |
00/0±50/7 |
00/0±6 |
00/0±6 |
00/0±6 |
20 |
|
|
|
00/0±9 |
00/0±6 |
34/0±60/10 |
30/0±8 |
00/0±50/9 |
36/0±20/9 |
26/0±90/6 |
20/0±8 |
00/0±6 |
00/0±50/7 |
100 |
عصاره متانولی |
|
|
43/0±50/8 |
00/0±6 |
17/0±60/9 |
00/0±50/7 |
30/0±9 |
36/0±90/8 |
43/0±50/6 |
26/0±70/7 |
00/0±6 |
00/0±50/7 |
50 |
|
|
|
40/0±50/7 |
00/0±6 |
26/0±80/7 |
00/0±7 |
30/0±20/8 |
36/0±8 |
17/0±10/6 |
00/0±7 |
00/0±6 |
00/0±7 |
20 |
|
|
|
11/0±31/23 |
41/0±81/23 |
00/0±61/23 |
00/0±11/22 |
00/0±11/22 |
11/0±11/22 |
55/0±01/23 |
59/0±02/22 |
16/0±11/22 |
01/0±01/22 |
آمفوتریسین بی |
||
جدول 2- نتایج آزمون حساسیتسنجی ضد کاندیدیایی به روش میکرودایلوشن براث عصارههای آبی و متانولی اندام هوایی گیاهان تیموس ولگاریس و منتا اسپیکاتا بهتنهایی و در ترکیب با هم علیه کاندیدا آلبیکانس
|
جدایه 9 |
جدایه 8 |
جدایه 7 |
جدایه 6 |
جدایه 5 |
جدایه 4 |
جدایه 3 |
جدایه 2 |
جدایه 1 |
ATCC 10231 |
MIC (میلیگرم بر میکرولیتر) |
عصاره های آزمایش شده/جدایه ها |
|
|
15/12 |
55/11 |
24/12 |
44/11 |
80/11 |
82/11 |
27/12 |
24/12 |
26/11 |
28/11 |
MIC90 |
عصاره آبی |
تیموس ولگاریس |
|
75/6 |
42/6 |
80/6 |
36/6 |
55/6 |
57/6 |
82/6 |
80/6 |
25/6 |
27/6 |
MIC50 |
|
|
|
50/13 |
84/12 |
60/13 |
72/12 |
10/13 |
14/13 |
64/13 |
60/13 |
51/12 |
54/12 |
MFC |
|
|
|
21/12 |
28/11 |
25/12 |
07/11 |
25/11 |
25/11 |
42/12 |
79/11 |
30/11 |
20/12 |
MIC90 |
عصاره متانولی |
|
|
23/6 |
27/6 |
25/6 |
15/6 |
25/6 |
25/6 |
90/6 |
55/6 |
30/6 |
78/6 |
MIC50 |
|
|
|
46/12 |
54/12 |
50/12 |
30/12 |
50/12 |
50/12 |
80/13 |
10/13 |
56/12 |
56/13 |
MFC |
|
|
|
57/22 |
11/23 |
32/23 |
31/23 |
95/22 |
04/23 |
22/23 |
25/23 |
31/23 |
57/22 |
MIC90 |
عصاره آبی |
منتا اسپیکاتا |
|
54/12 |
84/12 |
96/12 |
95/12 |
75/12 |
80/12 |
90/12 |
92/12 |
90/12 |
54/12 |
MIC50 |
|
|
|
68/25 |
92/25 |
90/25 |
50/25 |
60/25 |
80/25 |
84/25 |
80/25 |
90/25 |
08/25 |
MFC |
|
|
|
48/22 |
77/22 |
41/22 |
59/22 |
77/22 |
41/22 |
14/22 |
23/22 |
12/22 |
12/22 |
MIC90 |
عصاره متانولی |
|
|
49/12 |
65/12 |
45/12 |
55/12 |
65/12 |
45/12 |
30/12 |
35/12 |
30/12 |
29/12 |
MIC50 |
|
|
|
98/24 |
30/24 |
90/24 |
10/24 |
30/24 |
90/24 |
60/24 |
70/24 |
58/24 |
58/24 |
MFC |
|
|
|
14/8 |
02/8 |
22/8 |
13/9 |
22/8 |
22/7 |
31/7 |
04/7 |
32/8 |
20/8 |
MIC90 |
عصاره آبی |
تیموس ولگاریس +منتا اسپیکاتا |
|
86/6 |
79/6 |
90/6 |
85/6 |
90/6 |
90/6 |
95/6 |
80/6 |
95/6 |
89/5 |
MIC50 |
|
|
|
72/8 |
58/8 |
80/8 |
70/9 |
80/9 |
80/7 |
90/8 |
60/7 |
91/8 |
78/8 |
MFC |
|
|
|
41/8 |
05/8 |
26/8 |
77/8 |
59/8 |
41/8 |
41/8 |
60/8 |
48/8 |
04/8 |
MIC90 |
عصاره متانولی |
|
|
45/6 |
25/6 |
37/6 |
65/6 |
55/6 |
45/6 |
45/6 |
56/6 |
45/6 |
78/5 |
MIC50 |
|
|
|
90/9 |
50/9 |
74/8 |
30/8 |
10/8 |
90/9 |
90/8 |
12/8 |
98/8 |
56/8 |
MFC |
|
|
شکل 1، نتایج تکثیر قطعه 313 جفت بازی ژن ERG11 و قطعه 516 جفت بازی برای ژن مرجع را نشان میدهد. دادهها نشان دادند که میزان بیان ژن مرجع در کاندیدا آلبیکانس شاهد و تیمارشده با عصاره یکسان بود و میزان بیان ژن ERG11 در رقتهای معادل دو برابرMIC ، MIC و نصف MICدر تیمارهای مختلف تفاوت معناداری (p≤0.05) داشته است. در مقایسه با شاهد، بیان ژن ERG11 کاندیدا آلبیکانس تیمارشده با عصاره تیموس ولگاریس، منتا اسپیکاتا بهتنهایی و در ترکیب با هم کاهش نشانداده است.
شکل 1- مقدار نسبی بیان ژن ERG11 در کاندیدا آلبیکانس تیمارشده با رقتهای مختلف بر اساس MIC. عصاره: الف. تیموس ولگاریس، ب. منتا اسپیکاتا، ج. ترکیب تیموس ولگاریس با منتا اسپیکاتا پس از 24 ساعت همراه با نتایج بیان ژن ERG11 کاندیدا آلبیکانس تیمارشده با رقتهای مختلف عصارههای مطالعهشده بر اساس MIC پس از 24 ساعت روی ژل آگارز: M. نشانگر، C+. شاهد مثبت و حاوی DNA ژنومی، C-. نمونه بدون تیمار (شاهد منفی)، ستون 1. رقت دو برابر MIC عصاره، ستون 2. رقت برابر MIC عصاره، ستون 3. رقت نصف MIC عصاره، ستون 4. شاهد داخلی واکنش زنجیرهای پلیمراز معکوس
بحث و نتیجهگیری
مدت زمانی طولانی است که عفونتهای قارچی مشکلات بسیاری را برای سلامت انسانها و بهویژه افراد دچار نقص ایمنی ایجاد کردهاند. با وجود تلاش پیدرپی پژوهشگران، نبرد علیه کاندیدیازیس همچنان ادامه دارد و تا حد زیادی ناموفق بوده است. با در نظر گرفتن اثر درمانهای ضد قارچی رایج و محدود فعلی و ظهور مقاومت در برابر داروها توسط سویههای مختلف کاندیدا، نیاز شدید به روش ضد قارچ ضروری به نظر میرسد و به اﺳﺘﻔﺎده از توان ﺿﺪ ﻣﯿﮑﺮوﺑﯽ گیاهانی مانند تیموس ولگاریس و منتا اسپیکاتا، مولکولهای زیستی با طیف گستردهای از فعالیتهای زیستی و دارویی جایگزین داروهای شیمیایی توجه شده است (6 و 11-13).
گزارشهای بسیاری نشان دادهاند که تیموس ولگاریس و منتا اسپیکاتا فعالیت ضد قارچی قوی علیه کاندیدا آلبیکانس دارند (17 و 20-23). در مطالعه حاضر، عصارههای تیموس ولگاریس و منتا اسپیکاتا بهتنهایی و در ترکیب با هم علیه کاندیدا آلبیکانس سنجیده شدند و مکانیسم مولکولی احتمالی عصارههای آبی اندام هوایی این گیاهان با سنجش میزان بیان ژن ERG11، از مهمترین ژن های دخیل در بیوسنتز ارگوسترول غشای سلولی قارچ، ارزیابی شد.
نتایج مطالعه حاضر، تأثیر عصارههای اندامهای هوایی گیاهان تیموس ولگاریس و منتا اسپیکاتا راعلیه کاندیدا آلبیکانس نشان دادند و با مطالعههای پیشین همخوانی داشتند (17و 20-23). در مطالعه حاضر، ترکیب عصاره تیموس ولگاریس با منتا اسپیکاتا بیشترین تأثیر ضد قارچی را علیه کاندیدا آلبیکانس نشان داد. مطالعهها نشان دادهاند که تیموس ولگاریس حاوی ترکیبات مونوترپن فنلی مانند تیمول و کارواکرول و منتا اسپیکاتا نیز دارای ترکیبات پلیفنلی است (9 و 10). بنابراین، وجود ترکیبات مؤثره در گیاهان، نقش مهمی در افزایش تأثیر ترکیبی عصارههای تیموس ولگاریس با منتا اسپیکاتا دارد.
ارگوسترول جزو اصلی استرول غشای سلولی و فرآیندهای غشایی سلول مخمر و همچنین مسئول حفظ عملکرد و یکپارچگی سلول است. مکانیسم اولیه عملکرد برخی داروهای ضد قارچی ازجمله آزولها و پلیانها، مهار رشد سلول مخمر از طریق اختلال در بیوسنتز استرول طبیعی است که به کاهش در بیوسنتز ارگوسترول منجر میشود (24). یکی از مهمترین ژنهای دخیل در بیوسنتز ارگوسترول غشای سلولی کاندیدا آلبیکانس ERG11 است و جهش در ژنهای بیوسنتز ارگوسترول موجب مقاومت قارچ به برخی داروهای ضد قارچی شده است (25).
نتایج مطالعه حاضر تفاوت معنادار میزان بیان ژن ERG11 در تیمارهای مختلف را نشان دادند و در مقایسه با شاهد، بیان ژن ERG11 کاندیدا آلبیکانس تیمارشده با عصاره تیموس ولگاریس، منتا اسپیکاتا بهتنهایی و در ترکیب با هم کاهش یافت. ERG11 تولید لانوسترول 14-α دمیتلاز را کدگذاری میکند و بیان بیشتر ERG11 موجب تولید مقدار زیادی آنزیم لانوسترول 14-α دمیتلاز و در نتیجه سنتز بیشتر ارگوسترول و نگهداری یکپارچگی غشای سلولی کاندیدا میشود؛ برعکس، کاهش بیان ژن ERG11 موجب سنتز ارگوسترول کمتر و از بین رفتن یکپارچگی غشای سلولی کاندیدا میشود (26). مطالعهها نشان دادهاند که افزایش بیان ژن ERG11یا جهش در این ژن موجب مقاومت به داروهای ضد قارچی مؤثر بر غشای سلولی شده است (27-29).
اصلانی[xiii] و همکاران (30)، تأثیر ضد میکروبی اکینوفورا پلتیلوبا[xiv] (خوشاریزه) و ساتورجا بختیاریکا[xv] (مرزه بختیاری) را در مهار رشد جدایههای بالینی مقاوم به فلوکونازول کاندیدا آلبیکانس با ارزیابی میزان بیان ژنهای ERG11و MDR1سنجیدند. نتایج نشان دادند که اکینوفورا پلتیلوبا موجب کاهش بیان ERG11 شد در حالی که گیاه ساتورجا بختیاریکا روی بیان ژن ERG11 تاثیری نداشت.
نتایج مطالعههای خداوندی و همکاران (16)، کاهش بیان ژنهای ERG1, 3, 11 کاندیدا آلبیکانس تیمارشده با ترکیب فلوکونازول و تربینافین را نشان دادند.در مطالعهای دیگر، خداوندی و همکاران (17) تأثیر ضد بیوفیلم کاندیدیایی عصاره آبی ریشه تیموس ولگاریس رابا ارزیابی تغییرات نسبی میزان بیان ژنHWP1 سنجیدند. نتایج نشان دادند که گیاه یادشده موجب کاهش بیان ژن HWP1در رقتهای مختلف MIC شده است.
موسوینژاد[xvi]، تأثیر ضد کاندیدیایی گیاهان آویشن شیرازی[xvii] و وشا[xviii] را ارزیابی (31) و تأثیر عصارههای الکلی گیاهان یادشده را بر میزان بیان ژنهای MDR1 و ERG11 بررسی کرد. نتایج نشان دادند که MICعصاره الکلی آویشن شیرازی و وشا در جدایههای بالینی کاندیدا آلبیکانس بهترتیب 256 و 64 میلی گرم در میلیلیتر و MFC عصاره الکلی آویشن شیرازی و وشا در جدایههای بالینی کاندیدا آلبیکانس بهترتیب 512 و 128 میلیگرم در میلیلیتر بوده است. گیاه آویشن شیرازی، ژنهای MDR1 و ERG11 را مهار کرد و عصاره وشا روی هر دو ژن تأثیری نداشت.
در دهههای اخیر به دلیل مقاومتهای دارویی، عوارض جانبی داروهای شیمیایی و الزامهای زیستمحیطی، گرایش به استفاده از گیاهدرمانی رو به افزایش است.مطالعه حاضر نشان داد که میزان بیان ژن ERG11 در تیمارهای مختلف تفاوت معناداری داشته است. از آنجا که ژن ERG11 یکی از مهمترین ژنهای دخیل در بیوسنتز ارگوسترول غشای سلولی کاندیدا آلبیکانس است، هدف مؤثری برای تأثیر عوامل ضد کاندیدیایی محسوب میشود. با توجه به نتایج پژوهش حاضر و با انجام آزمایشهای تکمیلی، ترکیب تیموس ولگاریس و منتا اسپیکاتا میتواندجایگزین داروهای شیمیایی شود.
سپاسگزاری
نویسندگان مقاله حاضر از مسئولان محترم دانشگاه آزاد اسلامی واحد یاسوج برای همکاری صمیمانه در اجرای این طرح و از شرکت دارویی زرد بند یاسوج برای همکاری در شناسایی و تهیه عصاره گیاهی، کمال امتنان را دارند.
[1]- Candida albicans
[2]- Candidiasis
[3]- Candida albicans
[4]- Lamiaceae
[5]- Thymus vulgaris
[6]- Mentha spicata
[7]- Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
[8]- Sabouraud Dextrose Broth (SDB)
[9]- Viable count
[10]- Broth microdilution
[11]- Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
[12]- Khodavandi
[xiii]- Aslani
[xiv]- Echinophora platyloba
[xv]- Satureja bachtiarica
[xvi]- Mosavinejad
[xvii]- Zataria multiflora
[xviii]- Dorma ammoniacum
)