نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 دانشآموخته کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه پیامنور، ایران
2 استادیار بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه پیامنور ، ایران
3 استاد میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:From an industrial application or commercial point of view, glutamic acid is one of the most important amino acids and its microbial production has been reported from some bacteria. Regarding the role of probiotics to modulate human health and the ever-increasing demand of prebiotics in the food industry, in the current study, production of glutamic acid and folic acid from three probiotic bacteria (Bifidobacterium, Bifidobacterium bifidum, Sporolactobacillus) was evaluated for the first time.
Materials and methods: MRS broth and exclusive media was used for probiotic culture. The glutamic acid was identified using thin-layer chromatography and folic acid production was measured by folate kit. Each bacterium in terms of quality and quantity were measured by high pressure liquid chromatography.
Results: Production of glutamic acid confirmed is based on the thin layer chromatography analysis and high pressure liquid chromatography results. In addition, it was observed that all three probiotics produce folic acid. The prevalence of folate in Bifidobacterium was measured as 315 mg/ml that was more than two other bacteria.
Discussion and conclusion: To the best of our knowledge, this is the first report of microbial production of glutamic acid and folate from the probiotic bacteria. These beneficial bacteria can be used as a good source for mass production of these valuable compounds.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
واژه «پروبیوتیک» از دهه 1960 میلادی استفاده شد و به معنای «برای حیات» است (1 و 2). سازمان جهانی غذا و کشاورزی (FAO) و سازمان بهداشت جهانی (WHO) در سال 2001 تعریف مشترکی برای پروبیوتیکها منتشر کردند و آنها را ریزموجودات زندهای دانستند که مصرف مقادیر کافی آنها موجب بروز آثار مفیدی بر سلامت میزبان خواهد شد (3). این مکملهای غذاییمیکروبی با بهبودبخشیدن به تعادل میکروبی روده، آثار سودمندی بر افزایش توان دفاعی میزبان در برابر عوامل بیماریزا دارند (4-6). معمولترین ریزموجودات پروبیوتیک جزو باکتریها و مخمرها هستند؛ برخی از این ریزموجودات، سویههای انتخابی لاکتوباسیلوس[1] و بیفیدوباکتریوم[2] هستند و سویههایی از اسپورولاکتوباسیلوس[3]، انتروکوکوس[4]، استرپتوکوکوس[5] و اشرشیاکلی[6] نیز به این منظور استفاده میشوند (1و 7). با وجود این، بیشتر باکتریهایی که بهعنوان پروبیوتیک انتخاب میشوند، از جنس بیفیدوباکتریوم و لاکتوباسیلها هستند (5 و 8).
آثار مفیدی از بیفیدوباکتریومها گزارش شدهاند که ازجمله آنها عبارتند از: جلوگیری از بروز اسهال و کاهش آن (9 و 10)، کمکردن آثار عدم تحمل لاکتوز (10 و 11)، کاهش میزان کلسترول (12 و 13)، فعالیت ضد میکروبی (14 و 15)، فعالسازی سیستم ایمنی بدن (16)، فعالیت ضد سرطانی (17 و 18)، تولید ویتامین و آمینواسیدها (19 و 20). از سال 1950، تولید تجاری آمینواسیدها از ریزموجودات استفاده شده است (21 و 22)؛ برای نمونه، از باکتریهای متفاوتی مانند کورینهباکتریوم[7]، بریویباکتریوم[8]، باسیلوس، اینتروباکتریوم[9]و میکوباکتریوم[10] برای تولید آمینواسیدها استفاده شده است و اسیدهای آمینه L–گلوتامات، L–والین، L–آلانین، L–گلوتامین و L–پرولین تولید شدهاند (22 و 23). با وجود این، گلوتامیکاسید به علت اهمیتی که دارد، بیشتر از سایر آمینواسیدها بررسی شده است. گلوتامیکاسید، آمینواسید چندمنظورهای است که در حس چشایی، تحریکی، انتقال عصبی و متابولیسم نقش واسطه دارد (24)، پیشماده ویژه سایر آمینواسیدها (25 و 26) و انتقالدهنده عصبی تحریکی اصلی در مغز و ماده مهم در سوختوساز بدن است (26).
باکتریهای لاکتیکاسید بسیاری سنتزکننده ویتامینهای گروه B گزارش شدهاند (27 و 28)؛ برای نمونه، باکتریهای لاکتوکوکوس و لاکتوباسیلوس برای تولید فولیکاسید مطالعه شدهاند (28 و 29). فولیکاسید (PGA[11]) شامل P-آمینوبنزوئیکاسید است که در یک انتها به حلقه پتریدین و در انتهای دیگر به L-گلوتامیکسید متصل شده است (شکل 1). فولیکاسید ویتامینی است که در انتقال گروههای یککربنه نقش و در بسیاری از مسیرهای بیوشیمیایی مانند بیوژنز گروه متیل، سنتز نوکلئوتیدها، ویتامینها و برخی آمینواسیدها شرکت دارد. وجود فولیکاسید و در دسترسبودن آن بر کارایی همانندسازی، ترمیم و متیلاسیون DNA تاثیر میگذارد (30-32).
با توجه به اهمیت پروبیوتیکها و کاربرد روزافزون این ریزموجودات در صنایع مختلف، در پژوهش حاضر امکان تولید دو ماده ارزشمند گلوتامیکاسید و فولیکاسید از سه باکتری پروبیوتیک بررسی شد.
شکل 1- ساختار فولیکاسید، برگرفته از لیبلنک و همکاران (39)
مواد و روشها
باکتریهای استفادهشده: در پژوهش حاضر، سه باکتری پروبیوتیک بیفیدوباکتریوم، اسپرولاکتوباسیلوس (جداشده از کپسول شکم باریک[12]) و باکتری استاندارد بیفیدوباکتریوم بیفیدوم (PTCC 1644)، استفاده شدند. کپسول شکم باریک از شرکت EAFIT Minceur Active فرانسه و باکتری استاندارد بیفیدوباکتریوم بیفیدوم (PTCC 1644) از سازمان پژوهشهای علمی و صنعتی ایران تهیه شدند.
محیطکشتهای استفادهشده: برای کشت باکتریها چند محیطکشت بیهوازی شامل محیطکشت انتخابی بیفیدوباکتریوم (33)، محیطکشت ویژه بیفیدوباکتریوم بیفیدوم (پپتونکازئین: 8 گرم/لیتر، عصاره مخمر: 10 گرم/لیتر، گلوکز: 10 گرم/لیتر، فسفاتپتاسیمدیبازیک: 3 گرم/لیتر، توئین 80: 1 میلیلیتر)، محیطکشت تلفیقی (نوترینت براث: 8 گرم/لیتر، عصاره مخمر:4 گرم/لیتر، استاتسدیم: 4 گرم/لیتر، سولفاتمنگنز: 04/0 گرم/لیتر، پپتونکازئین: 8 گرم/لیتر، سولفاتمنیزیم: 16/0 گرم/لیتر، فسفاتپتاسیمدیبازیک: 6/1 گرم/لیتر) و محیطکشت MRS آگار استفاده شد.
کشت باکتریهای پروبیوتیک و بررسی ترکیبات آنها: برای کشت کپسول پروبیوتیک (شکم باریک) از محیطکشت انتخابی بیفیدوباکتریومو محیطکشت MRS آگار به دو روش اورلی[13] و مخلوط استفاده شد. باکتری استاندارد بیفیدوباکتریوم بیفیدوم نیز طبق دستور سازمان پژوهشهای علمی صنعتی ایران کشت شد. سپس از کلنیها، لام گرفته شد و پس از رنگآمیزی با میکروسکوپ نوری بررسی شدند. نمونهها بهشکل مایع و جامد در دو محیط یادشده کشت شدند و رشد باکتریها با دستگاه اسپکتوفتومتری در طول موج 600 نانومتر و در سه تکرار اندازهگیری شد.
از آزمونهای فولیکاسید و کروماتوگرافی لایه نازک بهترتیب برای سنجش فولیکاسید و گلوتامیکاسید استفاده شد. سه باکتری بیفیدوباکتریوم، بیفیدباکتریوم بیفیدوم و اسپرولاکتوباسیوس جداگانه کشت و آزمونهای فولیکاسید و کروماتوگرافی لایه نازک برای هر نمونه انجام شدند. برای تأیید بیشتر، سنجش کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد استفاده شد.
نتایج
.تولید آمینواسید گلوتامیکاسید در باکتریهای پروبیوتیک مطالعهشده: بر اساس نتایج آزمون کروماتوگرافی کاغذ با لایه نازک، هر سه پروبیوتیک مطالعهشده در پژوهش حاضر، آمینواسید گلوتامیکاسید را تولید کردند. در کروماتوگرافی لایه نازک، آمینواسید استاندارد گلوتامیکاسید در 3/0= Rf[14] (R= مسافتی که جسم طی کرده است/ مسافتی که حلال طی کرده است)اندازهگیری شد که با Rfاندازهگیریشده در سه پروبیوتیک بیفیدوباکتریوم و اسپرولاکتوباسیلوس موجود در کپسول پروبیوتیک و بیفیدوباکتریوم بیفیدوم مطابقت داشت (3/0= Rf در باندهای اندازهگیریشده از کروماتوگرافی لایه نازک هر سه پروبیوتیک مشاهده شد.)
تولید آمینواسید گلوتامیکاسید از باکتریهای بسیاری گزارش شده است؛ برای نمونه، در بررسی کینوشیتا[15] و همکاران (34)، تولید گلوتامیکاسید از باکتری میکروکوکوس گلوتامیکوم و کورینهباکتریوم گزارش شده است. در بررسی دیگر، کویچا و فوستر (35)، تولید گلوتامیکاسید را از باکتری باسیلوس استرین14B22 گزارش کردند. امین[16] و همکاران (36) نیز تولید L–گلوتامیکاسید را از باکتری کورینهباکتریوم گلوتامیکوم ATCC گزارش کردند. در بررسی زلن[17] و همکاران (37)، تولید گلوتامیکاسید از باکتری لاکتوباسیلوس گزارش شده است. نتایج بررسیهای تارک و مصطفا[18] (38)، تولید گلوتامیکاسید را از گونههایLAB مانند باکتری لاکتوباسیلوس پاراماسی و گونههای دیگر نشان داده است. با وجود این، اگرچه تولید گلوتامیکاسید از باکتریهای متفاوتی گزارش شده است، تاکنون گزارشی از باکتریهای پروبیوتیک بررسیشده در پژوهش حاضر (بیفیدوباکتریوم و اسپرولاکتوباسیلوس موجود در کپسول پروبیوتیک و بیفیدوباکتریوم بیفیدوم) ارائه نشده است و از نوآوریهای پژوهش حاضر محسوب میشود.
نتایج آزمون کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد در پروبیوتیکهای مطالعهشده: مطابق نتایج دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی زیاد (HPLC)، باند آمینواسید استاندارد گلوتامیکاسید در دقیقه 91/2 قرار گرفت که در دو باکتری بیفیدوباکتریوم و اسپرولاکتوباسیلوس بهترتیب در دقیقههای 93/2 و 91/2 نیز اثبات شد. باند حاصل از باکتری استاندارد بیفیدوباکتریوم بیفیدوم در دقیقه 99/2 قرار گرفت و تقریباً تأیید میشود (شکلهای 2-5). گفتنی است با توجه به جداسازی و تهیه باکتری بیفیدوباکتریوم از کپسولهای آماده، در پژوهش حاضر تنها امکان تولید این آمینواسید بررسی و تولید آن با کروماتوگرافی تأیید شد.
شکل 2- باند ارائهشده آمینواسید استاندارد گلوتامیکاسید با دستگاه کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد، باند ارائهشده در دقیقه 91/2 نشان داده شده است.
شکل 3– باند ارائهشده آمینواسید گلوتامیکاسید در باکتری اسپرولاکتوباسیلوس با دستگاه کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد، باند ارائهشده در دقیقه 91/2 نشان داده شده است.
شکل 4– باند ارائهشده آمینواسید گلوتامیکاسید در باکتری بیفیدوباکتریوم بیفیدوم با دستگاه کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد، باند ارائهشده در دقیقه 99/2 نشان داده شده است.
شکل 5– باند ارائهشده آمینواسید گلوتامیکاسید در باکتری بیفیدوباکتریوم با دستگاه کروماتوگرافی مایع با فشار زیاد، باند ارائهشده دردقیقه 93/2 نشان داده شده است.
تولید فولیکاسید در باکتریهای پروبیوتیک مطالعهشده: بر اساس نتایج، باکتری بیفیدوباکتریوم جداشده از کپسول (شکم باریک) بیشترین مقدار فولیکاسید (315 میلیگرم/میلیلیتر) را تولید کرد. میزان فولیکاسیدی که باکتریهای اسپرولاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم بیفیدوم در پژوهش حاضر تولید کردند به ترتیب 252 و 147 میلیگرم/میلیلیتر اندازهگیری شد (جدول 1). این میزان تولید فولیکاسید از باکتریهای یادشده برای نخستین بار گزارش میشود.
باکتریهای لاکتیکاسید بسیاری سنتزکننده ویتامینهای گروه B گزارش شدهاند (27 و 28)؛ برای نمونه، باکتریهای لاکتوکوکوس و لاکتوباسیلوس برای تولید فولیکاسید بررسی شدهاند (28 و 29). تولید فولات از گونههای لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بهترتیب 45 و 1 میکروگرم/لیتر گزارش شده است (39). در بررسی دیگر، قبادیدانا و همکاران (32) بیشترین میزان فولیکاسیدی که گونههایی از جنس لاکتوباسیلوس تولید میکنند را 62 نانوگرم/گرم گزارش کردند. شن (40)، میزان تولید فولیکاسید از باکتری لاکتوباسیلوس کازئی را 96 نانوگرم/گرم گزارش کرد.
تولید فولیکاسید از باکتریهای دیگری نیز گزارش شده است؛ برای نمونه، هاگن هولتز[xix] و همکاران (41) بیشترین میزان تولید فولیکاسید در جنس پروپونیباکتریوم را از باکتری Propionibacterium. jensenii و به مقدار 17 تا 78 میکروگرم/لیتر گزارش کردند، در حالی که یانگ و لین[xx] (42) میزان فولیکاسید تولیدی از باکتری Streptococcus thermophilus را 62 نانوگرم/گرم گزارش کردند. بر اساس نتایج پژوهش سیمبسما و همکاران (43)، میزان تولید فولیکاسید از باکتری Leuconostoc lactis، 45 میکروگرم/لیتر گزارش شد.
در پژوهش حاضر، میزان تولید فولیکاسید از باکتری اسپرولاکتوباسیلوس، 252 میلیگرم/میلیلیتر اندازهگیری شد که بسیار بیشتر از میزان فولیکاسید تولیدشده از لاکتوباسیلوس و باکتریهای یادشده است. تاکنون تولید فولیکاسید از اسپرولاکتوباسیلوس گزارش نشده بود و یکی دیگر از نوآوریهای پژوهش حاضر است.
جدول 1- نتایج آزمون فولیکاسید سه پروبیوتیک مطالعهشده با روش ECLIA
میزان (میلیگرم/میلیلیتر) |
آزمون فولیک اسید |
315 |
بیفیدوباکتریوم |
252 |
اسپورولاکتوباسیلوس |
147 |
بیفیدوباکتریوم بیفیدوم (استاندارد) |
بحث و نتیجهگیری
پروبیوتیکها، ریزموجوداتی هستند که اگر به تعداد کافی و بهشکل زنده استفاده شوند، آثار سلامتبخشی بر میزبان خود به جا میگذارند. غذاهای پروبیوتیک، جزو غذاهای فراسودمند و بیشتر باکتریهای پروبیوتیک استفادهشده در غذاها جزو باکتریهای لاکتیکاسید هستند و عمده به دو جنس لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم تعلق دارند (44-46). در جهان، استفاده از بیشتر ریزموجودات پروبیوتیک به علت بیخطر و حتی مفیدبودن آنها بسیار گسترده است.
همانطور که گفته شد از سال 1950، تولید آمینواسیدها از ریزموجودات بهطور تجاری استفاده شده است (21 و 22). آمینواسیدها جزو مواد باارزش و مفید در طبیعت هستند و کاربردهای فراوانی در صنایع دارویی، شیمیایی، غذایی، بهداشتی و آرایشی دارند (47). فولات نیز یکی از مهمترین ویتامینهای گروه B است و تولید فولیکاسید از بیفیدوباکتریوم گزارش شده است.
با توجه به استفاده روزافزون پروبیوتیکها در صنایع مختلف و آثار این ریزموجودات بر سلامتی انسان، هدف پژوهش حاضر بررسی تولید گلوتامیکاسید و فولیکاسید از سه باکتری مفید پروبیوتیک (بیفیدوباکتریوم، بیفیدوباکتریوم بیفیدوم و اسپرولاکتوباسیلوس) بود. میزان فولیکاسید تولیدی از بیفیدوباکتریوم موجود در کپسول پروبیوتیک (شکم باریک)، 315 میلیگرم/میلیلیتر و در باکتری بیفیدوباکتریوم بیفیدوم استاندارد بررسیشده، 147 میلیگرم/میلیلیتر اندازهگیری شد که بیشتر از نتایج گزارششده در پژوهشهای دیگر بود.
هر سه پروبیوتیک مطالعهشده در پژوهش حاضر، گلوتامیکاسید تولید کردند. تولید گلوتامیکاسید از باکتریهای متفاوتی گزارش شده است اما تاکنون باکتریهای پروبیوتیک به این منظور استفاده نشده بودند. با توجه به تأیید توانایی تولید گلوتامیکاسید در هر سه باکتری و پروبیوتیکبودن این باکتریها، به نظر میرسد بهینهسازی و تولید آمینواسیدهای مدنظر از باکتریهای مفید یادشده در آینده امیدبخش باشد.
[1]- Lactobacillus
[2]- Bifidobacterium
[3]- Sporolactobacillus
[4]- Enterococcus
[5]- Streptococcus
[6]- Escherichiacoli
[7]- Corynebacterium
[8]- Brevibacterium
[9]- Enterobacterium
[10]- Mycobacterium
[11]- Pteroyl glutamic acid
[12]- Belly Slim
[13]- Overlay
[14]- Retardation factor (R)
[15]- Kinoshita
[16]- Amin
[17]- Zalán
[18]- Tarek and Mostafa
[xix]- Hugenholtz
[xx]- Lin and Young