نوع مقاله : پژوهشی- فارسی
نویسندگان
1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، علوم و تحقیقات خراسان رضوی، دانشگاه آزاد اسلامی، نیشابور، ایران
2 استادیار سلولی و مولکولی، گروه سلولی و مولکولی، پژوهشکده فناوری زیستی ، دانشگاه فردوسی مشهد، مشهد، ایران
3 استادیار ژنتیک مولکولی، پژوهشکده بیوتکنولوژی- سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران- تهران- ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Introduction:Biodiesel as a biofuel, with renewable, biodegradable and free of polycyclic aromatic hydrocarbons properties, could be derived from fatty acids of the cells of the animals, plants, algae and bacteria. So, a wide range of approaches have been considered to increase the oil production in biodiesel resources. In this regard, biotechnology approaches can provide new solutions based on application of molecular mechanisms.
Materials and methods: A comprehensive survey on molecular mechanisms and key enzymes which are involved in the production and accumulation of the lipids in biodiesel resources have been considered based on literature study and in-silico investigation. In-silico investigation has been performed via InterProScan 5، Motif scan، Conserved Domain، ProtParam، TMHMM، GC content calculator، NetNGlyc، NetPhos، Sulfinator، Protein Blastand MEGA6 programs for characterizing the structure, functions and homology survey of the selected sequences.
Results: Our survey led to the introduced diacyl glycerol acyl transferase (DGAT), waxester synthase/diacyl glycerol acyltransferase (WS/DGAT), oleosin, MLDP and TadA as the effective enzymes and proteins in lipid production and accumulation in selected biodiesel organisms. An investigation on the structure of the corresponding genes of the selected enzymes, led to reveal their various features in the length, GC content as well as in intronic properties. On the other hand, this characterizing on the selected enzymes and proteins disclosed post-translational modifications in all of them, as well as their localization in the cells. Moreover MBOAT, DAGAT, UPF0089, Oleosin and apolipo protein have been revealed in their context as critical domains. On the other hand, homology survey of the selected enzymes and proteins led to introduce the Verniciafordii, Ricinuscommunis, Dunaliella parva , Thalassiosira pseudonana, Saitoella complicata, Rhodococcus imtechensis and Rhodococcus wratislaviensis species, as new sources of biodiesel with possible capability for lipid production.
Discussion and conclusion: Overall, this survey provides a series of motifs and domains in biodiesel process, as well as introducing several organisms with potency in biodiesel production, which could be more examined in an experimental condition.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه.
براساس گزارش‌ها سوخت‌های فسیلی موجود در جهان، در آیندۀ نزدیک به‌طور کلی تمام خواهند شد؛ از طرفی استفاده از این نوع از سوخت‌ها عامل انتشار بیشترین میزان گازهای گلخانه‌ای و گرم‌شدن زمین است (1). علاوه بر مخاطرات زیست‌محیطی، محدودبودن منابع، تغییرات زیاد قیمت نفت در بازارهای جهانی و چالش‌های ناشی از آن بر اقتصاد جهانی از دیگر مشکلات استفاده از این نوع از سوخت‌ها است (2 و 3)؛ بنابراین نیاز مبرمی به سیاستگذاری‌های صحیح و برنامه‌ریزی‌های خرد و کلان در جهت کارهای پژوهشی و ارائۀ راهکارهای مناسب و جدید به‌منظور جایگزینی این نوع از سوخت‌ها است. در این راستا، سوخت‌های زیستی یکی از انتخاب‌های کلیدی برای جایگزینی هستند. برخلاف سوخت‌های فسیلی، احتراق این نوع از سوخت‌ها ترکیبات آلوده‌کننده مانند مونوکسیدکربن، اکسیدهای گوگرد، ذرات معلق و ترکیبات فرّار را تولید نمی‌کند؛ درنتیجه باعث کاهش آلودگی و پایین‌آمدن سطح CO2 اتمسفر و به دنبال آن، کاهش گرمی هوا می‌شوند (1)؛ از سوی دیگر، این نوع از سوخت‌ها زیست‌تخریب‌پذیر و تجدیدپذیر است و ضمن رفع آلودگی‌های زیست‌محیطی، محدودیت استفاده نخواهند داشت (1)؛ بنابراین با جایگزین‌کردن این نوع از سوخت‌ها می‌توان بر مشکلات ناشی از سوخت‌های فسیلی فائق آمد. بیودیزل، بیواتانول، بیوهیدروژن و بیوگاز از جمله سوخت‌های زیستی هستند که امروزه پژوهش‌های بسیار زیادی را به خود اختصاص داده و کارآمدی آنها نیز نشان داده شده است (4). در این میان بیودیزل، سوخت زیستی مشتق‌شده از اسیدهای چرب سلول‌های گیاهی، جانوری و یا باکتریایی جایگاه ویژه‌ای پیداکرده است (5). بیودیزل ضمن آنکه ویسکوزیته‌ای مشابه با دیزل نفتی دارد، نقطۀ اشتعالی بالاتر، خورندگی پایین‌تر و انرژی بسیار بیشتری نسبت به آنها دارد؛ بنابراین ضمن آنکه حمل و نقل و ذخیره‌سازی آن ایمن‌تر است، باعث افزایش عمر مفید موتور و قدرت آن در حجم کم سوخت‌گیری خواهد شد (6). حیوانات، گیاهان، جلبک‌ها، قارچ‌ها و باکتری‌ها منابع زیستی تأمین‌کنندۀ بیودیزل هستند (7 و 8). صرف‌نظر از ناکارآمدی سلول‌های حیوانی به عنوان منبع تولیدکنندۀ بیودیزل (9)، دانه‌های روغنی گیاهان، کارآمدی بالایی در تولید این نوع سوخت زیستی نشان داده‌اند (9). با وجود این، ناپایداری بیودیزل حاصله، سطح زیر کشت بالا، مخاطرات زیست‌محیطی ناشی از کشت و داشت گیاهی و همچنین صرف ذخایر آبی، استفاده از آنها را در بسیاری از کشورها که ازنظر آب و زمین با محدودیت‌هایی مواجه‌اند، به چالش کشیده است (10 و 11)؛ بنابراین میکروارگانیسم‌های روغنی مانند ریزجلبک‌ها، قارچ‌ها و باکتری‌ها گزینه‌های بسیار مطلوب‌تری برای تولید بیودیزل هستند که توجه زیادی را در سراسر جهان به خود جلب کرده‌اند. ریزجلبک‌ها رشد سریع‌تری نسبت به گیاهان دارند و نیازمند زمین‌های زراعی، آب و آفت‌کش‌ها همانند گیاهان نیستند و از سویی بازده تولید لیپید در آنها بالاتر است (12). مخمرها نیز زمان تکثیر کوتاه، تحمل‌پذیری بیشتر به شرایط آب‌وهوایی نسبت به گیاهان، رشد و گسترش آسان‌تر نسبت به ریزجلبک‌ها (13) و قابلیت تولید لیپید از منابع مختلف کربن (14) را دارند؛ با وجود این، باکتری‌ها برخلاف بازدهی کمتر در تولید لیپید به‌علت سرعت رشد بالا، روش کشت ساده و دست‌ورزی‌های ژنتیکی آسان برتری بیشتری در تولید بیودیزل نسبت به آنها دارند (8 و 15). صرف‌نظر از قابلیت منابع تولیدکنندۀ بیودیزل، مهندسی ژنتیک و مهندسی متابولیک ازجمله راهکارهای افزایش بازده تولید لیپید در سلول‌ها به‌منظور بهینه‌سازی عملکرد آنها در جهت تولید این محصول است (15 و 16) که این مهم مستلزم درک متابولسیم لیپید و مکانیسم‌های مولکولی مؤثر در جانداران تولیدکنندۀ بیودیزل است؛ بنابراین بررسی مکانیسم‌های مولکولی و آنزیم‌های مؤثر در فرایند، نظیر ویژگی‌های ساختاری، عملکردی، فیزیکوشیمیایی و نیز تعیین دامنۀ میزبانی، منجر به ارائۀ راهکارهایی در جهت طراحی سازه‌های نوین ژنی با قابلیت افزایش میزبان تولید و تجمع چربی خواهد شد؛ همچنین آشکارسازی منابع نوینی از جانداران روغنی را فراهم خواهد آورد که در این پژوهش در دستور کار قرار گرفته است.
مواد و روشها.
جمع‌آوری داده‌ها: با هدف آشکارسازی ژن‌های دخیل در تجمع لیپید، مکانیسم‌های مولکولی مرتبط با این فرایند در جانداران روغنی شامل Jatropha curcasاز گیاهان، Phaeodactylum tricornutumو Dunaliella salinaاز جلبک‌ها، Yarrowia lipolyticaاز مخمرها و Rhodococcus opacus PD630از باکتری‌ها بررسی و ژن‌های کلیدی مرتبط شاملDGAT1-1، oleosin1از Jatropha curcas،DGA1از Yarrowia lipolytica، DGAT1-2-از Phaeodactylum tricornutum، MLDPاز Dunaliella salina وatf1، TadA از Rhodococcus opacus PD630انتخاب شدند.
استحصال توالی‌ها: توالی نوکلئوتیدی ژن‌های انتخابی با شماره‌های شناسایی JQ319812.1، EU234462 مربوط بهJatropha curcas، HQ589265 مربوط به Phaeodactylum tricornutum، XM_504700 مربوط بهYarrowia lipolytica، JQ011391 مربوط به Dunaliella salina،HM625859، GQ923886 مربوط بهRhodococcus opacus PD630و شماره‌های دستیابی پروتئینیAFV61669.1، ABW90148.2 مربوط به Jatropha curcas، ADY76581.1 مربوط به Phaeodactylum tricornutum،XP_504700.1 مربوط به Yarrowia lipolytica، AEW43285.1 مربوط به Dunaliella salina،ACX81314.1، ADK91819.1 مربوط بهRhodococcus opacus PD630از پایگاه‌های اطلاعات ژنی و پروتئینیNCBI[1] استحصال شدند.
.تجزیه و تحلیل ویژگی‌های ساختاری و عملکردی توالی‌های انتخابی: پایش توالی‌های نوکلئوتیدی و پروتئینی ژن‌های انتخابی ازنظر اندازه با استفاده از داده‌های موجود در پایگاه اطلاعات ژنی و پروتئینی NCBI انجام شد. در همین راستا، آشکارسازی دمین‌های عملکردی این توالی‌ها با استفاده از برنامه‌های تحت شبکۀ InterProScan 5[2]، [3]Motif scan و پایگاه [4]Conserved Domain به‌طور جداگانه انجام شد؛ همچنین ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی این توالی‌ها با استفاده از برنامۀ ProtParam موجود در بانک اطلاعاتی [5]ExPASY تعیین شد. جهت تعیین و پیش‌بینی ویژگی‌های توپولوژی پروتئین‌ها برنامۀ TMHMM[6] استفاده شد. محتوی GC با استفاده از برنامۀ GC content calculator[7] تعیین گردید. تغییرات پس از ترجمه شامل گلیکوزیلاسیون، فسفوریلاسیون و سولفوریلاسیون به‌ترتیب با استفاده از برنامه‌های NetNGlyc[8]، [9]NetPhos و [10]Sulfinator انجام شد.
همگون‌یابی و قرابت‌یابی توالی‌ها: تعیین پراکنش دامنۀ میزبانی توالی آنزیم‌های انتخابی با استفاده از برنامۀ تحت شبکۀ Protein Blast[11] مبتنی بر ماتریکس‌های PAM250 و BLUSUM45 انجام شد. نتایج حاصل براساس ارزش E، درصد همسانی و هم‌پوشانی ارزیابی و قرابت توالی‌های انتخابی همگون با استفاده از نسخۀ 6 برنامۀ MEGA6 انجام و خوشه‌بندی توالی‌ها براساس الگوریتم Neighbor-Joining انجام شد.
نتایج.
.بررسی ویژگی‌های ساختاری آنزیم .دی‌آسیل‌گلیسرول‌آسیل‌ترانسفراز(DGAT) و پروتئین تجمعی در جانداران روغنی: نتایج حاصل از پایش ویژگی‌های ساختاری ژن‌های کدگذار آنزیم DGAT جانداران روغنی انتخابی، منجر به آشکارسازی طول متفاوت این ژن‌ها و پیوسته‌بودن آنها به‌جز در DGAT1-1شد. در همین راستا محتوی GC این ژن‌ها در محدودۀ 73 تا86 تعیین و بررسی تغییرات پس از ترجمۀ محصول پروتئینی آنها منجر به معرفی حضور جایگاه‌های گلیکوزیلاسیون و فسفوریلاسیون در تمامی موارد و جایگاه سولفوریلاسیون تنها در آنزیم DGA1شد (جدول 1). نتایج حاصل از بررسی ویژگی‌های ساختاری ژن‌های کدگذار پروتئین تجمعی جانداران روغنی انتخابی نیز طول متفاوت این ژن‌ها و پیوسته‌بودن آنها را مشخص کرد. در همین راستا محتوی GC این ژن‌ها در محدودۀ 73 تا83 تعیین شد و بررسی تغییرات پس از ترجمۀ محصول پروتئینی آنها منجر به آشکارسازی جایگاه فسفوریلاسیون در تمامی موارد و جایگاه سولفوریلاسیون تنها در پروتئین Oleosin1شد (جدول 2).
جدول 1- ویژگی‌های ساختاری ژن‌های آنزیمDGAT جانداران روغنی
|
PTM |
اندازۀ پروتئین (aa) |
محتوی GC% |
طول ژن (bp) |
نام ژن |
ردیف |
||
|
سولفوریلاسیون |
فسفوریلاسیون |
گلیکوزیلاسیون |
|||||
|
- |
+ |
+ |
504 |
73 |
1566 |
DGAT1-1 |
1 |
|
- |
+ |
+ |
564 |
76 |
1695 |
DGAT1-2 |
2 |
|
+ |
+ |
+ |
514 |
76 |
1545 |
DGA1 |
3 |
|
- |
+ |
+ |
462 |
86 |
1389 |
atf1 |
4 |
جدول 2- ویژگی‌های ساختاری ژن‌های پروتئین تجمعی جانداران روغنی
|
PTM |
اندازۀ پروتئین (aa) |
محتوی GC% |
طول ژن (bp) |
نام ژن |
ردیف |
||
|
سولفوریلاسیون |
فسفوریلاسیون |
گلیکوزیلاسیون |
|||||
|
+ |
+ |
- |
147 |
76 |
444 |
Oleosin1 |
1 |
|
- |
+ |
- |
282 |
73 |
849 |
MLDP |
2 |
|
- |
+ |
- |
276 |
83 |
831 |
TadA |
3 |
.بررسی ویژگی‌های عملکردی آنزیم (DGAT) و .پروتئین تجمعی در جانداران روغنی: پایش ویژگی‌های عملکردی آنزیم DGAT در جانداران انتخابی با آشکارسازی دمین‌های مستقر در طول آنها انجام شد. نتایج حاصل از این بررسی منجر به معرفی دمین‌های عملکردیMBOAT درJatrophacurcas و Phaeodactylumtricornutum،DAGAT درYarrowialipolyticaو UPF0089 درRhodococcusopacusPD630شد (جدول 3). تجزیه و تحلیل ویژگی‌های عملکردی پروتئین تجمعی در جانداران انتخابی نیز منجر به آشکارسازی دمین‌های عملکردی Oleosin در گیاه Jatrophacurcas، اپولیپوپروتئین در باکتری RhodococcusopacusPD630 شد؛ علاوه بر این، بررسی دمین‌ها و جایگاه‌های فعال مستقر در توالی پروتئینی ژن MLDPگونۀ Dunaliellasalina، حضور دمین‌ها و جایگاه‌های فعال مرتبط با فرایندهای آمیداسیون، گلیکوزیلاسیون، فسفوریلاسیون و مریستیلاسیون را در آنها باعث شد (جدول 4).
جدول3- ویژگی‌های عملکردی آنزیم DGAT جانداران روغنی.
|
ارزش E |
عملکرد |
نام دومین |
موقعیت |
نام |
ردیف |
|
1.5e-67 |
پروتئین‌های اسیل ترانسفرازی متصل به غشاء |
MBOAT |
153-474 |
DGAT1-1 |
1 |
|
1.1e-15 |
پروتئین‌های اسیل ترانسفرازی متصل به غشاء |
MBOAT |
275-552 |
DGAT1-2 |
2 |
|
7.2e-90 |
دی‌اسیل‌گلیسرول‌اسیل‌ترانسفراز |
DAGAT |
244-511/ 95-123 |
DGA1 |
3 |
|
4.4e-27 |
دومین اسیل-کوانزیم‌آاسیل‌ترانسفراز-واکس استرسنتتاز |
UPF0089 |
15-271 |
atf1 |
4 |
|
0.0029 |
دمین متراکم سازی |
Condensation |
109-139 |
جدول4- ویژگی‌های عملکردی پروتئین تجمعی در جانداران روغنی
|
ارزش E |
عملکرد |
نام دومین |
موقعیت |
نام |
ردیف |
|
8.1e-60 |
پایداری اجسام لیپیدی |
Oleosin |
24-141 |
Oleosin1 |
1 |
|
........ |
جایگاه امیداسیون |
امیداسیون |
53-56 |
MLDP |
2 |
|
........ |
جایگاهN-گلیکوزیلاسیون |
ASN-گلیکوزیلاسیون |
269-272 |
||
|
........ |
جایگاه فسفوریلاسیون کازئین کیناز2 |
جایگاه-فسفو-CK2 |
102-105/ 270-273 |
||
|
........ |
جایگاهN-مریستیلاسیون |
میریستیل |
191-196 |
||
|
2.5e-12 |
........ |
ALA-RICH |
140-276 |
TadA |
3 |
|
0.0024 |
........ |
اپولیپوپروتئین |
4-236 |
||
|
0.21 |
دخالت در ایمنی |
ITAM |
110-130 |
.ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی آنزیم‌های DGAT و پروتئین‌های تجمعی در جانداران روغنی: نتایج حاصل از ارزیابی ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی توالی پروتئینی ژن‌های آنزیم DGAT انتخابی، مبین وزن مولکولی آنها در محدودۀ 50 تا 65 کیلودالتون، pH ایزوالکتریک (pI) 68/8 تا 29/9، آبگریزی منفی115/0 تا مثبت215/0، نیمه عمر بیش از 10 ساعت در تمامی موارد، شاخص ناپایداری 9/43 تا 60/46 و نیز شاخص آلیفاتیک آنها بین 96/84 تا 33/99 بود (جدول 5). در همین راستا نتایج حاصل از ارزیابی ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی توالی پروتئین‌های تجمعی انتخابی، مبین وزن مولکولی آنها در محدودۀ 15 تا 31 کیلودالتون، PH ایزوالکتریک (pI) 91/4 تا 28/10، آبگریزی منفی355/0 تا مثبت266/0، نیمه عمر بیش از 10 ساعت در تمامی موارد و شاخص ناپایداری 66/33 تا 77/34 و نیز شاخص آلیفاتیک آنها بین 78/84 تا 91/98 بود (جدول 5).
جدول 5- برخی از ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی توالی پروتئینی ژن‌های آنزیم DGAT و پروتئین‌های تجمعی
|
ردیف |
نام |
وزن ملکولی |
pI |
آبگریزی |
نیمه عمر |
شاخص ناپایداری |
شاخص آلفاتیک |
|
1 |
DGAT1-1 |
59601.9 |
8.93 |
0.215 |
>10 h |
43.90 |
99.33 |
|
2 |
DGAT1-2 |
65222.1 |
9.21 |
0.097 |
>10 h |
44.27 |
96.19 |
|
3 |
DGA1 |
57789.0 |
8.68 |
-0.252 |
>10 h |
44.60 |
84.96 |
|
4 |
atf1 |
50705.0 |
9.29 |
-0.115 |
>10 h |
46.60 |
87.49 |
|
5 |
Oleosin1 |
15581.3 |
10.28 |
0.266 |
>10 h |
34.77 |
98.91 |
|
6 |
MLDP |
31171.2 |
6.05 |
-0.079 |
>10 h |
33.70 |
94.11 |
|
7 |
TadA |
28484.8 |
4.91 |
-0.355 |
>10 h |
33.66 |
84.78 |
.ویژگی‌های توپولوژی آنزیم‌های DGAT وپروتئین تجمعی در جانداران روغنی:بررسی موقعیت قرارگیری آنزیم‌های DGAT انتخابی، مبیّن غشایی‌بودن همۀ آنها بود (جدول 6). همان‌طور که در این جدول نشان داده شده است، هریک از این آنزیم‌ها چندین ناحیۀ گذرنده از غشاء در موقعیت مختلف دارند. بررسی موقعیت قرارگیری پروتئین‌های تجمعی انتخابی نیز مبیّن غشایی‌بودن همۀ آنها بود (جدول 6). همان‌طور که در این جدول نشان داده شده است، پروتئین Oleosin1 و TadA دارای یک ناحیۀ گذرنده از غشاء هستند وMLDPدارای چندین ناحیۀ گذرنده از غشاء در موقعیت‌های مختلف است.
جدول6- ویژگی‌های توپولوژی آنزیم DGAT و پروتئین‌های تجمعی
|
ردیف |
نام توالی |
موقعیت و تعداد دمین‌های گذرنده از غشاء |
||||
|
1 |
DGAT1-1 |
114-254 |
275-389 |
398-515 |
- |
- |
|
2 |
DGAT1-2 |
55-88 |
138-192 |
193-310 |
312-562 |
- |
|
3 |
DGA1 |
15-168 |
233-254 |
274-411 |
414-462 |
- |
|
4 |
atf1 |
15-33 |
43-68 |
210-238 |
244-289 |
338-462 |
|
5 |
Oleosin1 |
13-113 |
- |
- |
- |
- |
|
6 |
MLDP |
17-52 |
58-82 |
87-104 |
110-141 |
173-255 |
|
7 |
TadA |
6-39 |
- |
- |
- |
- |
.آشکارسازی دامنۀ میزبانی آنزیمDGAT1-1وپروتئین تجمعیOleosin1در Jatropha curcas: نتایج حاصل از آشکارسازی دامنۀ میزبانی DGAT1-1 و Oleosin1 در سطح نوکلئوتیدی نتایج مطلوبی را به دنبال نداشت. با وجود این، تشابه‌یابی پروتئینی آنها منجر به معرفی طیف گسترده‌ای از جانداران دارای توالی‌های پروتئینی با همسانی، هم‌پوشانی و ارزش E مناسب در گونه‌های دور و نزدیک شد. در میان توالی‌های آشکارشده توالی شبه‌پروتئینی DGAT1-1در گونه‌های گیاهی Vernicia fordii، Ricinus communis، Euphorbia lagascae،Linum usitatissimum، Populus trichocarpa(شکل 1)، و توالی شبه‌پروتئینی Oleosin1 در گونه‌های گیاهی Plukenetia volubilis، Populus trichocarpa، Populus euphratica وRicinus communis آشکار شدند (شکل 2). با وجود این، در بین این گونه‌ها Vernicia fordiiو Ricinus communis قرابت بیشتری با توالی‌های انتخابی نشان دادند.
شکل 1- قرابت توالی‌های پروتئینی شبه DGAT1-1در گونه‌های مختلف گیاهی
شکل2- قرابت توالی‌های پروتئینی شبه Oleosin1در گونه‌های مختلف گیاهی
.آشکارسازی دامنۀ میزبانی آنزیم DGAT1-2مشتق از Phaeodactylum tricornutum.و پروتئین تجمعیMLDPاز Dunaliella salina: نتایج حاصل از همگون‌یابی توالی نوکلئوتیدی آنزیم DGAT1-2و پروتئین تجمعیMLDP، هیچ توالی مشابهی را آشکار نکرد. با وجود این، همگون‌یابی توالی پروتئینی آنزیم DGAT1-2و پروتئین تجمعیMLDPمنجر به معرفی تنها یک توالی پروتئینی همگون به‌ترتیب در گونۀ جلبکی Thalassiosirapseudonana و Dunaliella parvaبا همسانی، هم‌پوشانی و ارزش E مناسب شد.
.آشکارسازی دامنۀ میزبانی آنزیمDGA1مشتق از .گونۀ قارچی Yarrowia lipolytica: نتایج حاصل از بررسی این آنزیم مانند سایر آنزیم‌های فوق در سطح نوکلئوتیدی نتایج مطلوبی را به دنبال نداشت؛ با وجود این، تشابه‌یابی پروتئینی آن منجر به معرفی طیف گسترده‌ای از جانداران دارای توالی‌های پروتئینی با همسانی، هم‌پوشانی و ارزش E مناسب در گونه‌های دور و نزدیک شد. در میان توالی‌های همگون‌شده، توالی شبه‌پروتئینی DGA1درگونه‌های قارچی Saitoella complicata، Saccharomyces cerevisiae، Bipolaris oryzae، Glarea lozoyensis آشکار شدند (شکل 3) که در بین آنها Saitoella complicata، قرابت بیشتری با توالی انتخابی نشان داد.
شکل3- قرابت توالی‌های پروتئینی شبه DGA1 در گونه‌های مختلف قارچی
شکل4- قرابت توالی‌های پروتئینی شبه atf1در گونه‌های مختلف باکتریایی
.آشکارسازی دامنۀ میزبانی آنزیم atf1و پروتئین .تجمعی TadA مشتق از Rhodococcus opacus PD630: نتایج حاصل از همگون‌یابی توالی نوکلئوتیدیatf1، منجر به معرفی توالی همگون با هم‌پوشانی و همسانی به‌ترتیب 100درصد و 90درصد و ارزش E معادل با صفر در سویۀ Rhodococcus. jostii RHA1 شد. در همین راستا همگون‌یابی توالی نوکلئوتیدی ژن TadA حضور 4 توالی ژنی با هم‌پوشانی و همسانی بالا را مشخص کرد. بررسی جانداران دارای این توالی، مبیّن حضور آنها در گونه‌هایRhodococcus sp.R7، Rhodococcus. jostii RHA1، Rhodococcus equi وMycobacterium tuberculosis بود؛ از سوی دیگر تشابه‌یابی پروتئینی آنها منجر به آشکارسازی طیف گسترده‌ای از جانداران دارای توالی‌های پروتئینی با همسانی، هم‌پوشانی و ارزش E مناسب در گونه‌های دور و نزدیک شد. در میان توالی‌های آشکارشده توالی شبه‌پروتئینیatf1در گونه‌های باکتریایی Rhodococcus wratislaviensis، Rhodococcus imtechensis،Rhodococcus sp. JVH1 و Rhodococcus jostii (شکل 4)، و توالی شبه‌پروتئینی TadA آشکارشده در گونه‌های باکتریایی Rhodococcus wratislaviensis، Rhodococcus imtechensis، Rhodococcus defluvii، Rhodococcus equi اهمیت بیشتری داشتند (شکل 5). با وجود این، Rhodococcus wratislaviensis و Rhodococcus imtechensis قرابت بیشتری با توالی‌های انتخابی را نشان دادند.
شکل5- قرابت توالی‌های پروتئینی شبه TadAدر گونه‌های مختلف باکتریایی
بحث و نتیجهگیری.
افزایش روزافزون نیاز به انرژی (17)، محدودیت منابع و مخاطرات ناشی از کاربرد سوخت‌های فسیلی، پیداکردن منابع کافی انرژی برای آیندۀ جهان را به یکی از مخاطرات و چالش‌های جوامع بشری تبدیل کرده که خود ارتباط تنگاتنگی با ثبات جهانی، اقتصاد موفق، رفاه و کیفیت زندگی دارد (18). بر این اساس، مراکز تحقیقاتی و تجاری بسیاری به دنبال یافتن جایگزین‌هایی مناسب، پاک‌تر و تجدیدپذیر برای منابع فعلی انرژی با حداقل آثار زیست‌محیطی و نیز با حداقل صرف هزینه هستند. یکی از فناوری‌های مهم در این زمینه تولید سوخت از منابع توده‌های زیستی شامل گیاهان و میکروارگانیسم‌های روغنی است (3). با این حال، مواد روغنی قابل‌استحصال از توده‌های زیستی گیاهی، به انرژی زیاد و زمین‌های وسیع برای تولید نیاز دارند (19) و به فاکتورهایی چون آب‌و‌هوا، اقلیم و حوادث طبیعی وابسته هستند (20)؛ بنابراین امروزه توجه زیادی به تولید سوخت از میکروارگانیسم‌های روغنی شده است؛ اما کاهش هزینه‌های تولید ازجمله چالش‌های این روش جایگزین است (20). در این راستا می‌توان با انتخاب میکروارگانیسم‌های توانا و افزایش قابلیت آنها در جهت بالابردن تولید روغن به‌عنوان یکی از راهکارهای کاهش هزینه‌ها اشاره کرد که این مهم مستلزم درک متابولسیم لیپید و مکانیسم‌های مولکولی مؤثر در این فرایند است. در سال‌های اخیر بسیاری از ژن‌های دخیل در بیوسنتز لیپید ازجمله در مسیر بیوسنتزی اسیدچرب و تری‌اسیل‌گلیسرول آشکار و استفاده از آنها در جهت بالابردن تولید چربی بررسی شده است (21). مطالعات انجام‌شده نشان‌دهندۀ بی‌نتیجه‌بودن بسیاری از تلاش‌ها در جهت افزایش تولید مبتنی بر بالابردن بیان ژن ACCaseو سایر ژن‌های مسیر سنتز اسیدهای چرب است (22). در این راستا می‌توان به بیان این ژن در دیاتومه و عدم‌تأثیرگذاری آن در افزایش تولید چربی در این جاندار اشاره کرد (23). در همین راستا عدم‌تغییر در محتوای چربی دانه‌های روغن آرابیدوبزیس و کلزا پس از بیان ژن مرتبط با آنزیم KASIII گزارش شده است (24). با وجود بی‌تأثیر‌بودن بیان بسیاری از ژن‌های مسیر سنتز اسیدهای چرب، افزایش بیان ژن‌های دخیل در بیوسنتز تری‌آسیل‌گلیسرول قابلیت بالایی در افزایش تولید چربی را نشان داده است (25)؛ بنابراین آنزیم‌های دخیل در این مسیر و به‌ویژه آنزیم DGAT که آخرین مرحله بیوسنتز تری‌آسیل‌گلیسرول را کاتالیز می‌کند، نامزدی مناسب با هدف افزایش ذخیره‌سازی محتوای لیپید مبتنی بر فناوری‌های زیستی است (26). DGAT، آنزیم کلیدی مسیر بیوسنتز TAG در یوکاریوت‌ها با سه ایزوفرم است. در میان ایزوفرم‌های این آنزیم، DGAT1 نقش اصلی در تجمع روغن در دانه‌ها را داشته و DGAT2 در تجمع اسیدهای چرب غیرمعمول نقش دارد (27). علاوه بر آنزیم‌های دخیل در بیوسنتز تری‌آسیل‌گلیسرول، پروتئین‌های ساختاری اجسام لیپیدی در متابولیسم، بیوسنتز و تجمع لیپید نقش کلیدی دارند و اندازۀ اجسام روغنی را تعیین می‌کنند (28)؛ به همین منظور در این پژوهش ارگانیسم‌های توانا در تولید بیودیزل انتخاب شد و مکانیسم‌های مولکولی مرتبط در آنها مورد ارزیابی قرار گرفت. بررسی مکانیسم‌های مولکولی سنتز لیپید منجر به انتخاب آنزیم کلیدی دی‌آسیل‌گلیسرول‌آسیل‌ترانسفراز در یوکاریوت‌ها و آنزیم واکس‌استرسنتتاز/دی آسیل‌گلیسرول‌آسیل‌ترانسفراز در پروکاریوت‌ها و نیز پروتئین‌های کلیدی دخیل در تجمع لیپید در آنها شد؛ بنابراین ژن‌های مرتبط در Jatropha curcas از گیاهان، Phaeodactylum tricornutumاز جلبک‌ها، Yarrowia lipolytica از مخمرها و Rhodococcus opacusاز باکتری‌ها، به‌عنوان جاندارانی با قابلیت تولید لیپید، انتخاب شدند و مورد بررسی‌های مولکولی قرار گرفتند. تجزیه و تحلیل ویژگی‌های ساختاری آنزیم‌های DGAT انتخابی، تغییرات پس از ترجمۀ متنوع این آنزیم‌ها ازجمله گلیکوزیلاسیون، فسفوریلاسیون، و در یک مورد سولفوریلاسیون آنها را آشکار کرد (جدول 1). در این میان گلیکوزیلاسیون که ممکن است محلولیت، فولدینگ، حساسیت به پروتئولیز، پایداری، اتصال به گیرنده و فعالیت را تحت تأثیر قرار دهد، فراوان‌ترین تغییر پس از ترجمۀ پروتئین‌ها است که در تمامی سلسله‌های موجودات زنده آشکار شده است (29 و 30) و در تمامی آنزیم‌های این پژوهش نیز اعمال می‌شود. پایش ویژگی‌های ساختاری پروتئین‌های تجمعی انتخابی نیز تغییرات پس از ترجمۀ این پروتئین‌ها ازجمله فسفوریلاسیون، و در یک مورد سولفوریلاسیون آنها را نمایان کرد (جدول 2)؛از سوی دیگر، بررسی عملکردی آنزیم‌های DGAT انتخابی، منجر به آشکارسازی دمین‌های عملکردی MBOATدر Jatropha curcas و Phaeodactylum tricornutu،DAGAT درYarrowia lipolyticaو UPF0089 و دمین متراکم‌سازی در Rhodococcus opacus PD630 شد (جدول 3). براساس گزارش‌ها دو نوع اصلی از ژن‌های DGAT به‌ترتیب DGAT1 وDGAT2در ژنوم بسیاری از گیاهان و حیوانات وجود دارد (32). در ساختار این آنزیم‌ها، MBOAT دمینی کلیدی در مسیر بیوسنتز چربی است (31). ژن مشابه MBOAT در مخمرها DGA1نامیده می‌شود که همولوگ ژن‌های DGAT2 بود و در سنتز تری‌آسیل‌گلیسرول مشارکت عمده‌ای دارد (27 و 33). دمین عملکردی این توالیDAGAT متعلق به فوق خانوادهLPLAT است که مرحلۀ نهایی تشکیل تری‌آسیل‌گلیسرول توسط آن کاتالیز می‌شود (34). LPLAT، نیز متعلق به فوق خانواده پروتئین‌های MBOAT یعنی اسیل ترانسفرازهای متصل به غشاء است (35). بررسی ساختاری توالی پروتئینی ژن atf1در Rhodococcus opacus منجر به آشکارسازی دمین متراکم‌سازی و نیز دمین UPF0089شد. دمین متراکم‌سازی تشکیل پیوندهای پپتیدی در بیوسنتز پپتیدهای غیرریبوزومی را کاتالیز می‌کند (36). دمین UPF0089، واکنش آسیل‌ترانسفرازی وابسته به کوانزیم‌آ با الکل‌های چرب را برای تشکیل لیپیدهای خنثی کاتالیز می‌کند (37)؛ از سوی دیگر، تجزیه و تحلیل ساختاری توالی‌های پروتئینی همگون با اولئوسین1، منجر به آشکارسازی توالی‌های مشابه با این دمین در آنها شد. بررسی دقیق‌تر این توالی حضور 3 ناحیۀ هیدروفوبیک N-ترمینال، هیدروفوبیک مرکزی و ناحیۀ آمفی پاتیک C-ترمینال در آنها را آشکار کرد (جدول 4). ناحیۀ هیدروفوبیک مرکزی برای تشکیل ساختار بتا و واکنش با لیپیدها پیشنهاد می‌شود و تنها ناحیه با ویژگی حفاظتی است (38)؛ علاوه بر این، تجزیه و تحلیل دمین‌ها و جایگاه‌های فعال مستقر در توالی پروتئینی ژن MLDP در Dunaliella salina، منجر به معرفی دمین‌ها و جایگاه‌های فعال مرتبط با فرایندهای آمیداسیون، گلیکوزیلاسیون، فسفوریلاسیون و مریستیلاسیون در آن شد (جدول4). این قابلیت‌های ساختاری در توالی‌های پروتئینی دخیل در سنتز تری‌آسیل‌گلیسرول نیز وجود دارد؛ بنابراین حضور این دمین‌ها و جایگاه‌های فعال در تمامی توالی‌های پروتئین‌های مؤثر در آسیله و تجمع لیپیدی می‌تواند دلالت بر اهمیت آنها باشد و در فرایندهای مهندسی ژنتیک مبتنی بر طراحی سازه مورد توجه قرار گیرند. برخلاف سایر پروتئین‌های مسیر سنتز و تجمع تری‌آسیل‌گلیسرول، بررسی ساختاری توالی پروتئینی ژن TadAمنجر به آشکارسازی منطقۀ غنی از آلانین، دمین‌های آپولیپوپروتئینی و ITAM در آن شد (جدول 4). در این راستا قابلیت منطقۀ غنی از آلانین به‌عنوان توالی راهنما (39)، دمین‌های آپولیپوپروتئینی در پایداری و حلالیت لیپیدهای آزاد (40)، و ITAM در اتصال و فعالیت Lyn و Syk تیروزین کیناز نشان داده شده است (41). بررسی خصوصیات بیوشیمیایی DGAT (جدول 5) ناپایداری آنها را آشکار کرد. با توجه به اینکه پروتئین‌هایی با شاخص کمتر از40، جزء پروتئین‌های پایدار تقسیم‌بندی می‌شوند (42)، پروتئین‌های تجمعی انتخابی، جزء پروتئین‌های پایدار طبقه‌بندی می‌شوند (جدول 5). همچنین بررسی شاخص آلیفاتیک که به‌عنوان یک عامل مهم به‌منظور برآورد مقاومت پروتئین‌ها در برابر حرارت است (43)، نشان‌دهندۀ مقاوم‌بودن حرارتی تمامی آنزیم‌ها و پروتئین‌های انتخابی بود. از سوی دیگر بررسی ویژگی‌های توپولوژی آنزیم‌های DGAT و پروتئین‌های تجمعی مبیّن غشایی‌بودن همۀ آنها بود (جدول 6) که این موضوع هم‌راستا با سایر گزارش‌ها است (31)؛ علاوه بر این، نتایج حاصل از فرایند همگون‌یابی توالی پروتئینی ژن DGAT1در Jatropha curcas منجر به معرفی طیف گسترده‌ای از جانداران دارای توالی پروتئینی همگون با آن شد که در این میان توالی پروتئینیDGAT در Vernicia fordii نزدیک‌ترین توالی به Jatropha curcas بود (شکل1). Vernicia fordii همان درخت تونگ است که از دانه‌های این درخت روغن تونگ مشتق می‌شود. این روغن که به آن روغن چوب چینی یا روغن گردو نیز گفته می‌شود، در گذشته در لامپ‌ها به کار برده می‌شده و امروزه به‌عنوان یک عنصر در رنگ، لاک الکل و آب‌بندی و بتونه‌کاری و همچنین پس از پردازش به‌عنوان سوخت موتور استفاده می‌شود (44)؛ از سوی دیگر همگون‌یابی توالی پروتئینی ژن Oleosin1نیز منجر به معرفی طیف گسترده‌ای از جانداران دارای توالی همگون با آن شد. نتیجۀ حاصل از قرابت‌یابی آن منجر به نزدیکی Ricinus communis شد (شکل 2). Ricinus communis، با توجه به ویژگی‌های متعدد به‌عنوان یک منبع بالقوه بیودیزلی شناخته شده است (45). این گیاه که از خانوادۀ یوفوربیاسه است، درخت کوچک چوبی است که در سراسر مناطق گرمسیری و نیمه‌گرمسیری رشد می‌کند (46). این گیاه در مقایسه با دیگر منابع بالقوه بیودیزلی مزایای مضاعفی همچون دورۀ رشد کوتاه‌تری نسبت به Jatropha دارد (47)؛ از سوی دیگر، روغن آن به‌دلیل داشتن پیوندهای غیراشباع، وزن مولکولی بالا (298)، نقطۀ ذوب پایین (5 درجه سانتیگراد)، نقطۀ انجماد بسیار پایین (12 تا 18 درجه سانتیگراد) و بیش از همه بالاترین و پایدارترین ویسکوزیته را نسبت به دیگر روغن‌های گیاهی با کاربری‌های مناسب صنعتی دارد (47)؛ به همین دلیل در ساخت تعدادی از مواد شیمیایی صنعتی و آرایشی مانند سورفاکتانت، گریس، روان‌کننده‌ها، صابون‌های خاص، پوشش‌های سطحی، مواد آرایشی، دارو و غیره کاربرد دارد (47). همچنین این گیاه مقاومت بیشتری به خشکسالی دارد و می‌تواند برای مقابله با بیابان‌زدایی استفاده شود. علاوه بر ویژگی‌های گفته‌شده دانه‌های کرچک حاوی 30-35درصد روغن هستند و محتوای بالای (بیش از 85درصد) اسید ریسینولئیک دارند (47)؛ درنتیجۀ همگون‌یابی توالی نوکلئوتیدی ژن DGAT1 ازPhaeodactylum tricornutum هیچ توالی مشابهی آشکار نشد که این ممکن است ناشی از این باشد که توالی‌های همگون تاکنون در بانک‌های اطلاعاتی ثبت نشده‌اند؛ با وجود این، نتایج همگون‌یابی پروتئینی آن منجر به معرفی Thalassiosira pseudonana به‌عنوان میکروارگانیسمی با توالی همسان و هم‌پوشانی مناسب شد. این جاندار مانند Phaeodactylum tricornutumیک دیاتومۀ دریایی است که محتوی لیپید آن 6/20درصد براساس وزن خشک سلولی است و بسیاری از مطالعات مربوط به دیاتومه‌ها محدود به این دو گونه است (48). همچنین همگون‌یابی توالی پروتئینی ژن MLDP از Dunaliella salina منجر به معرفی Dunaliella parva به‌عنوان میکروارگانیسمی با توالی همسان و هم‌پوشان مناسب شد. Dunaliella parva، جلبکی تک‌سلولی و نمک‌دوست است که در فشار اسمزی بالا یافت می‌شود. این میکروارگانیسم دیوارۀ سلولی محکم ندارد و نسبت به ساکارز و اینولین و حتی فسفات نفوذپذیر است و در طی فتوسنتز، آنها را به گلیسرول تبدیل می‌کند (49)؛ بنابراین نداشتن دیوارۀ سلولی محکم در این گونۀ جلبکی قابلیت استخراج کارآمد لیپید در آنها را نیز توجیه‌پذیرتر می‌کند. همگون‌یابی توالی نوکلئوتیدی ژن DGA1 از Yarrowia lipolytica، منجر به آشکارشدن نزدیکی آن با Saitoella complicataشد (شکل3). Saitoella complicate، قارچ نادری است که خویشاوندی نزدیکی به Saitoella pombeدارد (50)؛ علاوه بر این، نتایج حاصل از بررسی داده‌ها منجر به انتخاب آنزیم واکس‌استرسنتتاز/دی‌آسیل‌گلیسرول‌آسیل‌ترانسفراز (WS/DGAT) در باکتری Rhodococcus opacus PD630 به‌عنوان میکروارگانیسم باکتریایی روغنی شد. معرفی میکروارگانیسم‌های دارای این توالی مبتنی بر همگون‌یابی پروتئینی، منجر به جداسازی گونه‌های متفاوت با قرابت نزدیک به‌ویژه Rhodococcus wratislaviensis با آن شد (شکل4). این جاندار، سویه‌ای توانا در تجزیۀ ترکیبات نیتروآروماتیک است که می‌تواند در زیست‌تخریب‌پذیری آلودگی‌های محیطی استفاده شود (51)؛ بنابراین با آنکه محتوی لیپیدی سایر گونه‌های Rhodococcus کمتر از آپاکوس بود، حضور توالی همگون در آنها مهم است و باید مورد توجه قرار گیرد. قابلیت Rhodococcus opacus نیز می‌تواند در زیست‌تخریب‌پذیری آلاینده‌های نیتروز مورد توجه قرار گیرد، که کمتر به آن توجه شده است. در همین راستا، نتایج حاصل از همگون‌یابی توالی پروتئینی ژن TadA منجر به آشکارسازی قرابت نزدیک Rhodococcus imtechensis به Rhodococcus opacusشد (شکل 5).
نتایج حاصل از این پژوهش ضمن معرفی دمین‌ها و موتیف‌های عملکردی مؤثر در مسیر سنتز بیودیزل، منجر به آشکارسازی جانداران توانا با قابلیت احتمالی تولید بیودیزل شد که باید در شرایط آزمایشگاهی مورد آزمون‌های بیشتری قرار گیرند.
[2]- http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5/
[3]- http://www.motif scan
[4]- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/
[5]- http://web.expasy.org/protparam/
[6]- http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/
[7]- http://www.biologicscorp.com/tools/
[8]- http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/
[9]- http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/
[10]- http://web.expasy.org/Sulfinator/
[11]- http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast
)